KR101425716B1

KR101425716B1 - 신규의 락토바실러스 퍼멘텀 균주, 이를 이용한 화장료 조성물 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR101425716B1
Application number: KR1020120075523A
Authority: KR
Inventors: 옥민; 윤경훈; 박진철; 이성은; 강진; 이진아; 홍우종; 박지연
Original assignee: (주)미애부생명과학
Priority date: 2012-07-11
Filing date: 2012-07-11
Publication date: 2014-08-14
Also published as: KR20140008684A

Abstract

본 발명은 신규의 락토바실러스 퍼멘텀 균주, 이를 이용한 화장료 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 서열목록 제1서열의 염기서열을 포함하는 16S 라이보좀 DNA를 가지며, 콜라게네이즈 활성 억제 능력을 갖는 락토바실러스 퍼멘텀 균주, 그를 배양하여 수득한 배양액을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.
본 발명을 통하여 표피 세라마이드 합성 촉진, 피부 콜라겐 합성 촉진, 콜라게네이즈 활성 저해, 피부 주름 개선, 피부 재생 촉진, 피부 탄력 향상 및 피부 보습 향상력이 우수하면서도 부작용이 적은 화장료 조성물 및 그 제조방법을 제공한다.

Description

신규의 락토바실러스 퍼멘텀 균주, 이를 이용한 화장료 조성물 및 그 제조방법{Novel Strain of Lactobacillus fermentum spp., Cosmetic Composition Using the same and Preparation Method thereof}

본 발명은 신규의 락토바실러스 퍼멘텀 균주, 이를 이용한 화장료 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로는 서열목록 제1서열의 염기서열을 포함하는 16S 라이보좀 DNA를 가지며 콜라게네이즈 활성 억제 능력을 갖는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) 균주, 이를 배양하여 수득한 배양액을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.

최근 현대인들의 경제수준이 향상되고 사회생활의 참여도가 높아지면서 피부 미용 건강에 대한 관심이 다양한 연령층에서 높은 수준으로 증가하고 있다. 피부노화를 방지하고 피부 노화 과정을 지연시켜 건강한 피부를 유지하고자 하는 목적에 따라 많은 미용 관련 화장품 및 식품이 개발되고 있고 특히 피부 주름형성 완화와 개선을 위한 연구가 활발히 진행되고 있다.

피부 노화는 다양하고 복잡한 생물학적 과정을 거쳐 일어나는 현상으로 그 요인에 따라 크게 두 가지로 구분할 수 있다. 그 중 내적 노화(Intrinsic aging)는 피부의 구조와 생리적인 기능이 나이를 먹으면서 계속적인 감퇴를 일으키는 것이고, 다른 하나인 외적 노화(Extrinsic aging)는 태양광선 등 누적된 외부 스트레스로 인해 발생하는 것이다. 특히 태양광의 자외선(ultraviolet rays; UV)은 잘 알려진 노화 원인의 하나로 장시간 자외선에 노출된 피부는 각질층이 두꺼워지고 피부의 주요 구성요소인 콜라겐과 엘라스틴이 변성되어 피부의 탄력성을 잃어가게 된다(비특허문헌 1,2 참조).

피부의 탄력은 진피 조직의 세포외 기질(ECM; extracelluar matrix) 성분이 담당하게 되는데, ECM은 크게 두 가지 성분으로 구성되어 있다. 하나는 ECM 전체의 약 2∼4%를 차지하는 탄력섬유(elastic fiber)이며, 또 다른 하나는 ECM 전체의 약 70∼80%를 차지하고 있는 콜라겐이다. 탄력섬유는 엘라스틴(elastin)이라는 무정형의 기질에 미원섬유(microfibrils)들이 박혀 있는 형태를 띠고 있으며, 엘라스틴은 라이신에서 유래한 데스모신(desmosine)과 아이소데스모신(isodesmosine)이라는 탄력섬유에서만 발견되는 아주 톡특한 아미노산으로 구성된 단백질이다. 이러한 데스모신과 아이소데스모신 등은 긴 펩타이드 사슬 안에서 가교(cross-links)를 형성하고 있는데, 이러한 구조가 엘라스틴으로 하여금 고무와 같은 성질을 갖게 한다.

노화된 피부의 대표적 증상은 탄력 저하에 의해 유발된 잔주름 및 주름의 발생이다. 이는 피부 진피 조직의 교원질 중 피부 탄력 성분 단백질인 콜라겐의 현저한 감소에 의해서라고 할 수 있다. 콜라겐은 진피의 90%이상을 차지하면서 피부에 장력과 강도를 부여하기 때문에 외부로부터의 자극에 대해 피부를 보호하고 유지시킨다. 그러므로 콜라겐의 감소는 피부노화 및 주름생성과 매우 깊은 관계를 가지고 있다(비특허문헌 3,4,5 참조).

이러한 탄력감소의 원인이 되는 콜라겐 및 엘라스틴의 감소를 억제하려는 목적으로 여러 가지 물질들이 개발되어 사용되고 있는데, 그 중 레티놀과 레티노익산 등의 레티노이드 등이 탄력개선 효과를 나타내고(Dermatology therapy, 1998, 16, 357∼364), 레구미노사 종자(Leguminosae Seeds)에서 얻어진 단백질분획도 탄력증대 효과를 나타내며(미국특허 제5,322,839호), 맥아추출물(malt extract)등을 포함하는 조성물은 콜라게나제(collagenase)를 억제하는데 응용되고 있다(일본특제 제5,105,693호).

그러나, 이들 레티노이드들은 소량만을 피부에 적용하여도 자극이 나타난다는 단점을 갖는다. 또한 대부분의 천연물 유래의 원료들은 단순추출물의 형태로 사용되어 왔고, 그 추출물들이 보이는 효능이 정확하게 어떤 물질에 의한 것인지 밝혀지지 않아 그 추출물의 활성을 지속적으로 유지, 제어하기가 어려운 것이 현실이다.

그 외에도 비타민 A와 그 유도체, 비타민 C와 그 유도체, 그 외 많은 항산화제들이 주름개선의 치료제나 약물로 주로 이용되나 이들은 화장품에 적용시 피부에 대한 안전성에 문제가 있어 비교적 부작용이 적은 천연물로부터 주름개선 소재 개발이 시도되고 있다.

1. 미국특허 제5,322,839호 2. 일본특제 제5,105,693호

1. Li JJ, Dong Z, Dawson MI, Colburn NH. 1996. Inhibition of tumor promoter-induced transformation by retinoids the transrepress AP-1 without trasnsactivation retinoic acid response element. Cancer Res 56: 483-489. 2. Huang C, Ma WY, Dawson MI, Rincon M, Flavell RA, Dong Z. 1997. Blocking activator protein 1 activity, but not activation retinoic response effect of retinoic acid. Proc Acad Sci 94: 5826-5832. 3. Fantone JC, Ward PA. 1982. Role of oxygen-derived free radicals and metabolites in leukocyte dependent inflammatory reaction. Ann J Path 107: 397-418. 4. Davies KJA. 1987. Protein damage and degradation by oxygen radical. J Biol Chem 262: 9895-9906. 5. Foote CS. 1976. Photosensitized oxidation and singlet oxygen; consequences in biological systems. Pryor WA, ed. 2nd ed. Academic press, New York, USA. p 31.

본 발명은 콜라게네이즈 활성 억제 능력을 갖는 신규의 락토바실러스 퍼멘텀 균주를 분리하고, 그 최적 배양 조건을 규명하여, 이를 바탕으로 표피 세라마이드 합성 촉진, 피부 콜라겐 합성 촉진, 콜라게네이즈 활성 저해, 피부 주름 개선, 피부 재생 촉진, 피부 탄력 향상 및 피부 보습 향상력이 우수하면서도 부작용이 적은 화장료 조성물 및 그 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명에 따르면, 서열목록 제1서열의 염기서열을 포함하는 16S 라이보좀 DNA를 가지며, 콜라게네이즈 활성 억제 능력을 갖는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) Miev L1106(KCTC 12082BP) 균주를 제공한다.

본 발명에 따르면, 본 발명에 따른 락토바실러스 퍼멘텀 균주는 (ⅰ) 김치에서 분리됨, (ⅱ) 최적 배양 시간은 12시간 내지 48시간, (ⅲ) 최적 배양 온도는 25 내지 35℃, (ⅳ) 최적 초기 pH는 3.5 내지 4.5, (ⅴ) 배양 배지의 최적 탄소원으로서 수크로오스를 배지 총부피 대비 0.5 내지 3%(W/V) 포함, (ⅵ) 배양 배지의 최적 질소원으로서 소고기추출물을 배지 총부피 대비 3 내지 5%(W/V) 포함, 및 (ⅶ) 배양 배지의 최적 미량원소원으로서 염화나트륨을 배지 총부피 대비 0.15 내지 0.5%(W/V) 포함하는 특성 중에서 어느 하나 이상의 특성을 갖는 것을 특징으로 한다.

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본 발명에 따르면, 본 발명에 따른 락토바실러스 퍼멘텀 균주는 (ⅰ) 락토바실러스 퍼멘텀 Miev L1106(KCTC 12082BP), (ⅱ) 최적 배양 시간은 24시간, (ⅲ) 최적 배양 온도는 30℃, (ⅳ) 최적 초기 pH는 4.5, (ⅴ) 배양 배지의 최적 탄소원으로서 수크로오스를 배지 총부피 대비 0.5%(W/V) 포함, (ⅵ) 배양 배지의 최적 질소원으로서 소고기추출물을 배지 총부피 대비 3%(W/V) 포함, (ⅶ) 배양 배지의 최적 미량원소원으로서 염화나트륨을 배지 총부피 대비 0.3%(W/V) 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따르면, 상기 상술한 락토바실러스 퍼멘텀 균주를 배양하여 수득한 배양액을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 표피 세라마이드 합성 촉진, 피부 콜라겐 합성 촉진, 콜라게네이즈 활성 저해, 피부 주름 개선, 피부 재생 촉진, 피부 탄력 향상 및 피부 보습 향상으로부터 선택되는 어느 하나의 피부 상태 개선 효과를 얻는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따르면, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 스프레이 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 제형을 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따르면, 상기 상술한 락토바실러스 퍼멘텀 균주를 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 화장료 조성물 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 본 발명에 따른 화장료 조성물 제조방법에 사용되는 배지는 (ⅰ) 탄소원으로서 수크로오스를 배지 총부피 대비 0.5 내지 3%(W/V) 포함, (ⅱ) 질소원으로서 소고기추출물을 배지 총부피 대비 3 내지 5%(W/V) 포함, 및 (ⅲ) 미량원소원으로서 염화나트륨을 배지 총부피 대비 0.15 내지 0.5%(W/V) 포함하는 특성 중에서 어느 하나 이상의 특성을 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따르면, 본 발명에 따른 화장료 조성물 제조방법의 배양하는 단계는 12시간 내지 48시간 동안, 25 내지 35℃에서, 초기 pH 3.5 내지 4.5에서 수행되는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 콜라게네이즈 활성 억제 능력을 갖는 신규의 락토바실러스 퍼멘텀 균주를 제공하여, 이를 배양하여 표피 세라마이드 합성 촉진, 피부 콜라겐 합성 촉진, 콜라게네이즈 활성 저해, 피부 주름 개선, 피부 재생 촉진, 피부 탄력 향상 및 피부 보습 향상력이 우수하면서도 부작용이 적은 화장료 조성물 및 그 제조방법을 제공하는 효과를 갖는다.

도 1은 본 발명에 따른 락토바실러스 퍼멘텀 Miev L1106 균주의 배양 시간별 균체 성장 곡선 및 pH 변화를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명에 따른 락토바실러스 퍼멘텀 Miev L1106 균주의 배양 시간별 콜라게네이즈 활성 억제능을 나타낸 그래프이다. (AA : ascorbic acid, 양성대조군)
도 3은 본 발명에 따른 락토바실러스 퍼멘텀 Miev L1106 균주의 배양 온도별 콜라게네이즈 활성 억제능을 나타낸 그래프이다. (AA : ascorbic acid, 양성대조군)
도 4는 본 발명에 따른 락토바실러스 퍼멘텀 Miev L1106 균주의 초기 pH별 콜라게네이즈 활성 억제능을 나타낸 그래프이다. (AA : ascorbic acid, 양성대조군)
도 5는 본 발명에 따른 락토바실러스 퍼멘텀 Miev L1106 균주의 탄소원별 콜라게네이즈 활성 억제능을 나타낸 그래프이다. (AA : ascorbic acid, 양성대조군)
도 6은 본 발명에 따른 락토바실러스 퍼멘텀 Miev L1106 균주의 탄소원(수크로오스)의 농도별 콜라게네이즈 활성 억제능을 나타낸 그래프이다. (AA : ascorbic acid, 양성대조군)
도 7은 본 발명에 따른 락토바실러스 퍼멘텀 Miev L1106 균주의 질소원별 콜라게네이즈 활성 억제능을 나타낸 그래프이다. (AA : ascorbic acid, 양성대조군)
도 8은 본 발명에 따른 락토바실러스 퍼멘텀 Miev L1106 균주의 질소원(소고기추출물)의 농도별 콜라게네이즈 활성 억제능을 나타낸 그래프이다. (AA : ascorbic acid, 양성대조군)
도 9는 본 발명에 따른 락토바실러스 퍼멘텀 Miev L1106 균주의 미량원소별 콜라게네이즈 활성 억제능을 나타낸 그래프이다. (AA : ascorbic acid, 양성대조군)
도 10은 본 발명에 따른 락토바실러스 퍼멘텀 Miev L1106 균주의 미량원소(염화나트륨)의 농도별 콜라게네이즈 활성 억제능을 나타낸 그래프이다. (AA : ascorbic acid, 양성대조군)
도 11은 본 발명에 따른 락토바실러스 퍼멘텀 Miev L1106 균주를 최적조건에서 배양한 경우의 콜라게네이즈 활성 억제능을 나타낸 그래프이다. (AA : ascorbic acid, 양성대조군)

상기 상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 서열목록 제1서열의 염기서열을 포함하는 16S 라이보좀 DNA를 가지며, 콜라게네이즈 활성 억제 능력을 갖는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) Miev L1106(KCTC 12082BP) 균주임을 특징으로 한다. 이하 도면을 참조하여 본 발명을 구체적으로 설명한다.

상기 균주는 김치로부터 분리된 콜라게네이즈 활성 억제 물질을 생산하는 균주로서, 이를 순수 분리하여, 16S rDNA 염기서열 분석과 생화학적 특성 분석으로 동정한 결과, 바실러스 속(Bacillus sp.)에 속하는 것으로 동정되었으며, 이를 바실러스 퍼멘텀 Miev L1106으로 명명하고, 특허 절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약의 규정에 따라, 2011년 11월 22일자로 KCTC(Korean Collection for Type Culture, 한국생명공학원)에 수탁번호 제KTCT12081BP로 기탁하였다.

본 발명에 따른 락토바실러스 퍼멘텀 균주는 (ⅰ) 김치에서 분리됨, (ⅱ) 최적 배양 시간은 12시간 내지 48시간, (ⅲ) 최적 배양 온도는 25 내지 35℃, (ⅳ) 최적 초기 pH는 3.5 내지 4.5, (ⅴ) 배양 배지의 최적 탄소원으로서 수크로오스를 배지 총부피 대비 0.5 내지 3%(W/V) 포함, (ⅵ) 배양 배지의 최적 질소원으로서 소고기추출물을 배지 총부피 대비 3 내지 5%(W/V) 포함, 및 (ⅶ) 배양 배지의 최적 미량원소원으로서 염화나트륨을 배지 총부피 대비 0.15 내지 0.5%(W/V) 포함하는 특성 중에서 어느 하나 이상의 특성을 가질 수 있다.

본 발명에 따른 락토바실러스 퍼멘텀 균주는 락토바실러스 퍼멘텀 Miev L1106(KCTC 12082BP)일 수 있다.

본 발명에 따른 락토바실러스 퍼멘텀 균주는 (ⅰ) 락토바실러스 퍼멘텀 Miev L1106(KCTC 12082BP), (ⅱ) 최적 배양 시간은 24시간, (ⅲ) 최적 배양 온도는 30℃, (ⅳ) 최적 초기 pH는 4.5, (ⅴ) 배양 배지의 최적 탄소원으로서 수크로오스를 배지 총부피 대비 0.5%(W/V) 포함, (ⅵ) 배양 배지의 최적 질소원으로서 소고기추출물을 배지 총부피 대비 3%(W/V) 포함, (ⅶ) 배양 배지의 최적 미량원소원으로서 염화나트륨을 배지 총부피 대비 0.3%(W/V) 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 바람직하게는 상기 조건을 모두 만족하는 락토바실러스 퍼멘텀 균주의 배양액이 가장 우수한 콜라게네이즈 활성 억제 능력을 갖는다.

상기 배양 시간은 미생물의 생존을 고려한 것으로, 12시간 내지 72시간 정도 배양하는 것이 유산균의 증식으로 인한 균체 성장 저하를 최소화하면서 그 배양액의 콜라게네이즈 활성 억제 능력이 우수하고, 더욱 바람직하게는 24시간 내지 48시간이며, 가장 바람직하게는 24시간 배양하는 것이다.

상기 배양 온도는 20 내지 45℃의 범위 내에서 배양하는 것이 균체 성장 및 콜라게네이즈 활성 억제 능력면에서 바람직하고, 더욱 바람직하게는 25 내지 35℃, 가장 바람직하게는 30℃에서 배양하는 것이다.

상기 배양 초기 pH는 4.0 내지 8.0의 범위 내에서 배양하는 것이 균체 성장 및 콜라게네이즈 활성 억제 능력 면에서 바람직하고, 가장 바람직하게는 4.5에서 배양하는 것이다.

상기의 배양 배지는 락토바실러스 균주의 배양에 이용되는 어떠한 배지도 포함하나, 균체 성장 및 콜라게네이즈 활성 억제 능력 면에서 바람직하게는 MRS(deMan Rogosa Sharpe) 브로스 배지, APT (All Purpose with Tween) 배지 또는 BHI (Brain Heart Infusion) 배지이며, 그 중에서도 MRS 브로스 배지가 가장 바람직하다.

상기 배양 배지에 사용되는 탄소원으로는 다양한 탄수화물이 이용될 수 있으며, 균체 성장 및 콜라게네이즈 활성 억제 능력 면에서 바람직하게는 글루코오스(포도당, glucose), 프럭토오스(과당, fructose), 갈락토오스(galactose), 락토오스(유당, lactose), 말토오스(맥아당, maltose), 수크로오스(sucrose), 자일로오스(xylose), 아라비노오스(arabinose)이 이용될 수 있고, 가장 바람직하게는 수크로오스이다. 상기 탄소원이 배지에 포함되는 경우 균체 성장 및 콜라게네이즈 활성 억제 능력이 우수하다.

상기 탄소원이 포함되는 농도는 배지 총부피 대비 0.5%에서 10%(W/V)의 범위인 것이 균체 성장 및 콜라게네이즈 활성 억제 능력 면에서 바람직하며, 가장 바람직하게는 3%(W/V)로 포함되는 경우이다.

상기 배양 배지에 사용되는 질소원으로는 다양한 유기 질소원이 이용될 수 있으며, 바람직하게는 펩톤(peptone), 트립톤(tryptone), 소고기추출물(beef extract), 효모추출물(yeast extract), 말토추출물(malto extract), 요소(urea)이고, 가장 바람직하게는 소고기추출물이다. 상기 질소원이 배지에 포함되는 경우 균체 성장 및 콜라게네이즈 활성 억제 능력이 우수하다.

상기 질소원이 포함되는 농도는 바람직하게는 배지 총부피 대비 1.0%에서 10%의 범위인 것이 균체 성장 및 콜라게네이즈 활성 억제 능력 면에서 바람직하며, 가장 바람직하게는 3%(W/V)로 포함되는 경우이다.

상기 배양 배지에 사용되는 미량원소원으로는 다양한 미량원소원이 이용될 수 있으며, 바람직하게는 염화나트륨(NaCl), 염화칼슘(CaCl₂), 황산마그네슘(MgSO₄), 황산망간(MnO₄S), 인산이수소칼륨(KH₂P0₄), 인산수소이칼륨(K₂HPO₄), 황산아연(ZnSO₄)이고, 가장 바람직하게는 염화나트륨이다. 상기 미량원소원이 배지에 포함되는 경우 균체 성장 및 콜라게네이즈 활성 억제 능력이 우수하다.

상기 미량원소원이 포함되는 농도는 바람직하게는 배지 총부피 대비 0.01%에서 0.5%(W/V)의 범위인 것이 균체 성장 및 콜라게네이즈 활성 억제 능력 면에서 바람직하며, 가장 바람직하게는 0.3%(W/V)로 포함되는 경우이다.

본 발명은 상기 락토바실러스 퍼멘텀 균주를 배양하여 수득한 배양액을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

상기 배양액이란 특정 미생물을 배양 배지에서 배양하여 수득한 배양액, 농축 배양액, 배양액의 건조물, 배양 여과액, 농축 배양 여과액, 또는 배양 여과액의 건조물을 의미하는 것으로, 균주를 포함하는 것 또는 균주를 접종하여 배양한 후, 제균 즉 균주를 제거한 배양여액일 수 있다. 또한 상기 배양물은 그 제형이 한정되지 아니하고, 일 예로 액체, 에멀젼, 또는 고체일 수 있다.

상기와 같이 수득한 배양액은 본 발명의 화장료 조성물에 0.0001 내지 100 중량%로 포함되는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 전체 화장료 조성물에 대하여 0.0001-50.0 %(w/w)이고, 가장 바람직하게는 0.001-10%(w/w)이다. 배양액의 함량이 0.0001 %(w/w) 이상인 경우 본 발명이 목적하는 콜라게네이즈 활성 억제를 통한 피부 개선 효과를 기대할 수 있고, 배양액의 함량이 50.0% 이하인 경우에 함유량 증가에 따른 뚜렷한 효과의 증가 및 제형의 안정성을 효과적으로 도모할 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 표피 세라마이드 합성 촉진, 피부 콜라겐 합성 촉진, 콜라게네이즈 활성 저해, 피부 주름 개선, 피부 재생 촉진, 피부 탄력 향상 및 피부 보습 향상으로부터 선택되는 어느 하나의 피부 상태 개선 효과를 얻을 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 스프레이 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 제형을 가질 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화 될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 본 발명의 조성물이 화장료 조성물로 사용될 때에는 화장수, 에멀젼, 크림, 에센스, 젤, 팩 및 클렌징크림으로부터 선택되는 기초 화장료; 화운데이션 등의 메이크업 화장료로 구성되는 군으로부터 선택되는 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

또한 본 발명의 화장료 조성물은 각각의 제형에 상기 기재한 성분들 이외에 일반 피부화장료에 배합되는 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 또는 향료 등을 필요에 따라 적절히 배합하여 사용할 수 있다.

예컨대, 유연화장수는 본 발명에 따른 균주 배양액 이외에 다가알콜류(프로필렌글리콜, 글리세린 등) 1∼10 중량% 및 계면활성제(폴리에틸렌올레일에테르, 폴리옥시에틸렌 경화피마자유 등) 0.05∼2 중량%를 함유하도록 제조할 수 있다. 또한, 영양화장수 및 영양크림은 본 발명에 따른 균주 배양액 이외에 오일류(스쿠알란, 바셀린, 옥틸도데칸올 등) 5∼20 중량% 및 왁스성분(세탄올, 스테아릴알콜, 밀납 등) 3∼15 중량%를 함유하도록 제조할 수 있으며, 에센스는 본 발명에 따른 균주 배양액 이외에 글리세린, 프로필렌글리콜 등의 다가알콜류 5∼30 중량%를 함유하여 제조할 수 있다. 마사지 크림은 본 발명에 따른 균주 배양액 이외에 유동파라핀, 바셀린, 이소노닐이소노나노에이트 등의 오일 30∼70 중량%를 함유하여 제조되며, 팩은 본 발명에 따른 균주 배양액 이외에 폴리비닐알콜 5∼20 중량%를 함유하는 필 오프(peel off) 팩 또는 일반유화형 화장료에 본 발명에 따른 균주 배양액 이외에 카올린, 탈크, 산화아연, 이산화티탄 등의 안료가 5∼30 중량% 함유된 워시오프(wash off) 팩으로 제조할 수 있다.

본 발명은 상기 상술한 락토바실러스 퍼멘텀 균주를 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 화장료 조성물 제조방법을 제공한다. 본 발명에 따른 배양방법으로 균주를 배양하는 경우 균체의 성장이 활발하면서 콜라게네이즈 활성 억제능력도 우수한 배양액을 수득할 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물 제조방법에 사용되는 배지는 (ⅰ) 탄소원으로서 수크로오스를 배지 총부피 대비 0.5 내지 3%(W/V) 포함, (ⅱ) 질소원으로서 소고기추출물을 배지 총부피 대비 3 내지 5%(W/V) 포함, 및 (ⅲ) 미량원소원으로서 염화나트륨을 배지 총부피 대비 0.15 내지 0.5%(W/V) 포함하는 특성 중에서 어느 하나 이상의 특성을 가질 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물 제조방법의 배양하는 단계는 12시간 내지 48시간 동안, 25 내지 35℃에서, 초기 pH는 3.5 내지 4.5에서 수행될 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물 제조방법의 락토바실러스 퍼멘텀 균주는 락토바실러스 퍼멘텀 Miev L1106(KCTC 12082BP)이고, 배양 배지는 배지 총부피 대비 수크로오스를 0.5%(W/V) 포함하고, 소고기추출물을 3%(W/V) 포함하고, 염화나트륨을 0.3%(W/V) 포함하는 것을 사용하고, 배양하는 단계는 24시간 동안, 30℃에서, 초기 pH는 4.5의 조건에서 수행될 수 있다.

상기 화장료 조성물 제조방법에 사용되는 락토바실러스 퍼멘턴 균주 및 그 배양방법에 사용되는 배양 시간, 배양 온도, 배양 초기 pH, 탄소원, 질소원, 미량원소원에 대한 구체적인 내용은 상기 상술한 바와 같으며, 해당 방법을 사용하여 제조한 화장료 조성물은 가장 우수한 콜라게네이즈 활성 억제 능력을 나타낸다.

이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되어서는 안된다.

1. 유산균 분리 및 동정

시중에서 시판되는 김치를 구입한 후, 원심분리기를 이용하여 김치의 액상부분만을 분리하였다. 분리된 시료 2%를 취하여 20% 탈지분유(skim milk)에 접종 후 37℃ 배양기에서 curd가 생성되는 시점까지 배양하여 5~7일 배양 후 커드(curd)가 생성되는 시료를 선별하였다.

시료 1㎖를 취하여 십진 희석법으로 희석 후 100㎕를 MRS agar plate에 도말하여 37℃ 배양기에 48시간 배양하여 균을 관찰하였다. 균이 생성된 agar plate에서 단일 집락(colony) 1개를 선별하여 20% 탈지분유에 접종한 후, curd 형성 유무를 확인하였다. 커드가 잘 생성되는 배양액을 1가지 선정하여 계대 배양 횟수와 시간을 조절하여 균의 활성도를 높였다. 활성도가 높아진 균을 MRS배지에 배양하여 실험에 사용하였다.

실험을 위하여 먼저 세균의 genomic DNA를 추출한 후, 세균 동정에 사용되는 16S rRNA 유전자 영역을 증폭하기 위해 27f (5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3')와 1492r (5'-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3') primer set를 이용하여 유전자 영역을 PCR (MJ Research PTC 225, Ramsey, Minnesota, USA)로 증폭하였고 (annealing 온도는 60℃), 증폭된 PCR 생산물은 QIAquick PCR purification Kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 정제하였다.

정제한 PCR 산물의 염기서열 분석은 ABI Prism BigDye Terminator cycle sequencing ready reaction kit (Applied Biosystems, Foster City, California, USA)와 ABI 310 DNA sequencer (Applied Biosystems, Foster City, California, USA)를 이용하여 분석하였다.

분석된 각 균주의 염기서열은 NCBI Blast 검색을 통해 GenBank에 등록된 염기서열들과 비교하여 가장 높은 유사도를 나타내는 표준 균주를 기준으로 각 균주를 동정하였다. 또한 EzTaxon server 2.1^*시스템을 보충하여 사용하였다.

2. 실험 방법

1) 유산균 배양

실험에 사용한 균주는 300㎖ flask에 working volume 200㎖, 초기 접종 농도는 30g/L으로 배양하였다.

균주의 최적 시간을 확립하기 위해 0~72 시간까지 조건으로 배양하였으며, 배양 온도는 20℃ 25℃, 30℃, 35℃, 45℃ 등으로 온도 조건을 변화하여 배양하였다. 초기 pH는 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0 까지 1 N NaOH, 1 N HCl을 이용하여 조절하였고, pH meter (720P, Istek Inc., Korea)를 사용하였으며, 매 측정시 보정 후 사용하였다.

탄소(C)원의 종류와 농도에 따른 영향을 알아보기 위하여 탄소원은 글루코오스(포도당, glucose), 프럭토오스(과당, fructose), 갈락토오스(galactose), 락토오스(유당, lactose), 말토오스(맥아당, maltose), 수크로오스(sucrose), 자일로오스(xylose), 아라비노오스(arabinose)를 배지 총 부피 대비 각각 0.5%부터 10%(W/V)까지의 농도로 조절하여 실험하였다.

질소(N)원의 종류와 농도에 따른 영향을 알아보기 위하여 질소원은 펩톤(peptone), 트립톤(tryptone), 소고기추출물(beef extract), 효모추출물(yeast extract), 말토추출물(malto extract), 요소(urea)를 배지 총 부피 대비 각 0.5%부터 10%(W/V)까지의 농도로 조절하여 실험하였다.

미량원소원의 종류와 농도에 따른 영향을 알아보기 위하여 미량원소원으로 염화나트륨(NaCl), 염화칼슘(CaCl₂), 황산마그네슘(MgSO₄), 황산망간(MnO₄S), 인산이수소칼륨(KH₂P0₄), 인산수소이칼륨(K₂HPO₄), 황산아연(ZnSO₄)를 배지 총 부피 대비 각 0.01%부터 0.5%(W/V)까지의 농도로 조절하여 실험하였다.

2) 콜라게네이즈 효소 억제 평가

콜라겐 효소의 기질인 Azocoll(Azo dye-impregnatedcollagen, A4341, Sigma) 1mg에 완충용액인 0.1 M Tris-HCl(pH 7.0)을 900㎕ 첨가하여 균질화한 후 200 units/㎖의 농도로 제조한 콜라게네이즈 type I 효소(C0130, Sigma) 용액 100㎕를 첨가하여 총 반응액이 1㎖이 되도록 하였다. 43℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 반응이 완료되면 3000rpm에서 10분 동안 원심분리시켜 분해되지 않은 콜라겐은 침전시키고 분해된 콜라겐을 함유하는 상등액을 취하여 550nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로서 효소액 대신 반응완충액을 효소와 동량 첨가하여 흡광도를 측정하였으며 시료 자체의 값도 측정하여 효소 활성 계산시 보정하였다.

3. 실험 결과

1) 미생물 동정 결과

상기에서 수득한 미생물의 염기서열을 GenBank DB 및 EzTaxon DB에 수록된 염기서열들과 비교한 결과, Lactobacillus속 균주들과 90-99.86% 수준의 염기서열 유사도를 나타내어, Lactobacillus속 균주임을 알 수 있었다. 또한 Lactobacillus속의 표준균주 중 Lactobacillus fermentum NBRC 3956^T 균주의염기서열과 비교시 유사도가 99.86%를 나타내는 것으로 분석되어 Lactobacillus fermentum 종과 염기서열 유사도가 가장 높게 나타났으며, 그외 Lactobacillus ingluviei KR3^T 균주와96.203%, Lactobacillus gastricus Kx156A7^T 균주와95.921%, Lactobacillus equigenerosi NRIC 0697^T균주와95.710% 및 Lactobacillus mucosae S32^T 균주와95.292%의 유사도를 나타내었다.

16S rRNA 유전자 서열에 근거해 종(species)을 가르는 기준으로 일반적으로 받아들여지고 있는 논문(Stackebrandt & Goebel, 1994; Stackebrandt & Ebers, 2006)에 근거하여 의뢰된 본 실험균주는 97% 이상의 염기서열 유사도를 나타낸 Lactobacillus fermentum 종에 속하는 Lactobacillus fermentum Miev L1106 균주로 동정할 수 있었고, 상기 미생물은 기탁(기탁번호 KCTC 12082BP)하였다.

2) 배양 시간에 따른 영향

본 발명에 따른 균주에 대하여 배양시간이 균체 성장 및 콜라게네이즈 활성 억제능에 미치는 영향을 확인하였다.

이를 위해 일반적인 기본 배지 조성인 탄소원으로 글루코오스(포도당, glucose) 2%(W/V), 질소원으로 효모추출물(yeast extract) 1%(W/V), 미량원소로 염화나트륨(NaCl) 0.1%(W/V)을 첨가한 배지에, 전배양한 종균을 3%(v/v)되게 접종한 후 37℃ 에서 각각 3h, 12h, 24h, 48h, 72시간별로 배양하여 균체 성장 및 콜라게네이즈 활성 억제능을 조사하였다. 대조군으로는 0.5% 아스코르브산(ascorbic acid, 대조군 1), 비배양(대조군 2)를 사용하였다.

배양 시간별 균체 성장 결과는 도 1에 나타냈다. 실험 결과, 배양 12시간 후부터 균체 성장이 급격하게 증가하여 48시간부터는 균체 성장이 일정 수준으로 유지되는 것으로 나타났다.

배양 시간별 콜라게네이즈 활성 억제 실험 결과는 도 2 및 표 1에 나타냈다. 실험 결과, 24시간 배양한 배양액에서 92%이상의 콜라게네이즈 활성 억제능을 보여서 가장 높은 것으로 나타났다.

	배양시간 (h)	콜라게네이즈 억제 활성(%)
대조군 1 (0.5% AA)	0	67.05
대조군 2 (비배양)	0	20.52
실시예 H1	3	49.63
실시예 H2	12	84.84
실시예 H3	24	92.63
실시예 H4	48	77.46
실시예 H5	72	85.36

이를 통해 배양 시간의 효율 및 경제성을 고려하여 24시간을 최적 배양 시간으로 결정하였다.

3) 배양 온도의 영향

본 발명에 따른 균주에 대하여 온도가 균체 성장 및 콜라게네이즈 활성 억제능에 미치는 영향을 확인하였다.

이를 위해 기본배지 조성인 탄소원으로 포도당(glucose) 2%(W/V), 질소원으로 효모추출물(yeast extract) 1%(W/V), 미량원소로 염화나트륨(NaCl) 0.1%(W/V)을 첨가한 배지에, 전배양한 종균을 3%(v/v)되게 접종한 후, 각각 20℃, 25℃, 30℃, 35℃, 45℃ 에서 24시간 동안 배양하였다. 대조군으로는 0.5% 아스코르브산(ascorbic acid, 대조군)을 사용하였다.

배양 온도별 균체 성장은 실험 결과 비슷하게 유지되다 35℃에서 가장 높은 성장을 하였고, 20℃보다 45℃에서 높은 균체 성장을 보였다.

배양 온도별 콜라게네이즈 활성 억제능에 대한 결과는 도 3 및 표 2에 나타냈다.

	배양온도(℃)	콜라게네이즈 억제 활성(%)
대조군(0.5% AA)	상온	84.88
실시예 T1	20	90.99
실시예 T2	25	95.56
실시예 T3	30	96.34
실시예 T4	35	94.93
실시예 T5	40	94.77

실험 결과 수행된 모든 범위의 온도에서 각각 90%이상의 콜라게네이즈 활성 억제능을 보여서 효과가 우수한 것으로 나타났고, 그 중 30℃에서 배양하는 경우 96%의 콜라게네이즈 활성 억제능을 보여 가장 높은 것으로 나타났다.

이를 통해 배양 온도의 효율 및 경제성을 고려하여 30℃를 최적 배양 온도로 결정하였다.

4) 초기 pH 의 영향

본 발명에 따른 균주에 대하여 배양액 초기 pH가 균체 성장과 콜라게네이즈 활성 억제능에 미치는 영향을 확인하였다.

이를 위해 배양시간 24시간, 배양온도 30℃로, 탄소원 글루코오스(포도당, glucose) 2%(W/V), 질소원 효모추출물(yeast extract) 1%(W/V), 미량원소 염화나트륨(NaCl) 0.1%(W/V)으로 고정하고, 초기 pH를 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0으로 달리하여 성장 양상과 콜라게네이즈 활성 억제능을 확인하였다. 대조군으로는 0.5% 아스코르브산(ascorbic acid, 대조군)을 사용하였다.

배양액의 초기 pH별 균체 성장은 실험 결과 산 쪽인 pH 3.0 부근에서부터 균의 성장이 거의 일어나지 않았으며, 중성 pH 범위인 7과 8에서 균체 성장이 최대로 나타났다.

배양 온도별 콜라게네이즈 활성 억제능에 대한 결과는 도 4 및 표 3에 나타냈다.

	초기 pH	콜라게네이즈 억제 활성(%)
대조군(0.5% AA)	2.86	75.21
실시예 P1	3.0	39.42
실시예 P2	3.5	27.41
실시예 P3	4.0	95.90
실시예 P4	4.5	96.85
실시예 P5	5.0	96.59
실시예 P6	6.0	95.40
실시예 P7	7.0	95.28
실시예 P8	8.0	95.42

실험 결과, 모든 pH에서 90% 이상의 콜라게네이즈 활성 억제능이 나타났다. 이는 균체의 성장이 초기 pH 8.0에서 최대로 나타나지만 시간이 지나면서 배양액에 젖산과 같은 산 물질이 증가하면서 초기 pH와 상관없이 최종 pH 가 3.5 내지 4.5 정도로 형성되는 것을 감안하여(도 1 및 표 1 참조), 최적 초기 pH는 4.5로 결정하였다(도 4).

5) 탄소원의 영향

본 발명에 따른 균주에 대하여 탄소원이 균체 성장과 콜라게네이즈 활성 억제능에 미치는 영향을 확인하였다.

이를 위해 질소원 효모 추출물 1%(W/V)와 미량원소원 염화나트륨 0.1%(W/V)가 첨가된 배지에, 탄소원으로 글루코오스(포도당, glucose), 프럭토오스(과당, fructose), 갈락토오스(galactose), 락토오스(유당, lactose), 말토오스(맥아당, maltose), 수크로오스(sucrose), 자일로오스(xylose), 아라비노오스(arabinose)를 각각 2%(W/V)씩 첨가하여, 24시간, 30℃, 초기 pH 4.5에서 배양 한 후 균체 성장과 균주 배양액의 콜라게네이즈 활성 억제능을 확인하였다.

탄소원별 균체 성장 결과는 표 4에 나타냈다. 실험 결과, 수크로오스 배양액에서 균체 성장이 1.170로 가장 높았으며, 그에 따른 최종 pH도 3.55로 가장 낮았다.

	탄소원	균체 성장 (A 660)	최종 pH(-)
실시예 C1	글루코오스 (glucose)	1.029	3.70
실시예 C2	프럭토오스 (fructose)	0.961	3.68
실시예 C3	갈락토오스 (galactose)	0.667	3.83
실시예 C4	락토오스 (lactose)	0.577	3.65
실시예 C5	말토오스 (maltose)	1.116	3.64
실시예 C6	수크로오스 (sucrose)	1.170	3.55
실시예 C7	자일로오스 (xylose)	0.470	3.93
실시예 C8	아라비노오스 (arabinose)	0.207	4.44

탄소원별 콜라게네이즈 활성 억제능을 평가한 결과는 도 5에 나타냈다. 실험 결과, 수크로오스를 첨가한 경우의 콜라게네이즈 활성 억제 정도가 97.34%로 가장 높았다.

이에 따라 최적 탄소원을 수크로오스로 결정하고, 이를 0.5%, 1%, 2%, 3%, 5%, 7%, 10%(W/V) 함유하도록 각각의 배지에 넣어 탄소원의 농도별 콜라게네이즈 활성 억제능 실험을 진행하였다.

탄소원의 농도별 콜라게네이즈 활성 억제능을 평가한 결과는 도 6에 도시하였다. 실험 결과, 수크로오스를 3% 포함하는 경우 가장 높은 콜라게네이즈 활성 억제능을 보였으며, 다만 전체적으로 0.5%에서 10%까지 범위에서 콜라게네이즈 활성 억제 정도가 비슷하였다.

이를 통해 탄소원의 첨가량 대비 효율 및 경제성을 고려하여 수크로오스(sucrose) 3.0%를 최적 탄소원으로 결정하였다.

6) 질소원의 영향

본 발명에 따른 균주에 대하여 질소원이 균체 성장과 콜라게네이즈 활성 억제능에 미치는 영향을 확인하였다.

이를 위해 탄소원 수크로오스(sucrose) 0.5%(W/V) 와 미량원소원 염화나트륨(NaCl) 0.1%(W/V) 을 첨가한 배지에, 전배양한 종균을 3%(v/v)되게 접종한 후, 기본배지에 각 질소원별로 펩톤(peptone), 트립톤(tryptone), 소고기추출물(beef extract), 효모추출물(yeast extract), 말토추출물(malto extract), 요소(urea)를 각각 1%(W/V) 씩 첨가하여, 30℃에서 24시간 동안 배양하였다.

질소원별 균체 성장 결과는 표 5에 나타냈다. 실험 결과, 효모추출물을 첨가한 배양액의 균체 성장이 2.201로 가장 높았으며, 요소를 첨가한 배양액에서는 균체가 거의 성장하지 않는 것으로 나타났다.

	질소원	균체 성장 (A 660)	최종 pH (-)
실시예 N1	펩톤(peptone)	1.785	3.89
실시예 N2	트립톤(tryptone)	2.135	3.65
실시예 N3	소고기추출물(Beef extract)	2.111	3.57
실시예 N4	효모추출물(yeast extract)	2.201	3.70
실시예 N5	말토추출물(Malto extract)	1.061	3.43
실시예 N6	요소(urea)	0.400	4.11

질소원별 콜라게네이즈 활성 억제능을 평가한 결과는 도 7에 나타냈다. 실험 결과, 트립톤(tryptone), 소고기추출물(beef extract), 효모추출물(yeast extract)의 콜라게네이즈 활성 억제능이 우수하였으며, 그 중에서도 소고기추출물(beef extract)을 첨가한 배양액의 콜라게네이즈 활성 억제능이 97%로 가장 높았다.

이에 따라 최적 질소원을 소고기추출물(beef extract)로 결정하고, 이를 0.5%, 1%, 2%, 3%, 5%, 7%, 10%(W/V) 함유하도록 각각의 배지에 넣어 질소원의 농도별 콜라게네이즈 활성 억제능 실험을 진행하였다.

질소원의 농도별 콜라게네이즈 활성 억제능을 평가한 결과는 도 8에 나타냈다. 실험 결과, 0.5%를 제외한 1% 내지 10%의 소고기추출물을 포함하는 배양액에서 95% 이상의 콜라게네이즈 활성 억제능을 보였으며, 그 중에서 소고기추출물(beef extract)을 3% 포함하는 경우 가장 높은 콜라게네이즈 활성 억제능을 보였다.

이를 통해 질소원의 첨가량 대비 효율 및 경제성을 고려하여 소고기추출물(beef extract) 3.0%를 최적 질소원으로 결정하였다.

7) 미량원소의 영향

본 발명에 따른 균주에 대하여 미량원소원이 균체 성장과 콜라게네이즈 활성 억제능에 미치는 영향을 확인하였다.

이를 위해 탄소원 수크로오스(sucrose) 0.5%(W/V)와 질소원인 소고기추출물(beef extract) 3%(W/V)를 첨가한 배지에, 전배양한 종균을 3%(v/v)되게 접종한 후 기본배지에 각 미량원소인 염화나트륨(NaCl), 염화칼슘(CaCl₂), 황산마그네슘(MgSO₄), 황산망간(MnO₄S), 인산이수소칼륨(KH₂P0₄), 인산수소이칼륨(K₂HPO₄), 황산아연(ZnSO₄)를 0.1%(W/V) 포함하도록 각각 적용한 후, 30℃에서 24시간 동안 배양하였다.

미량원소별 균체 성장결과는 표 6에 나타냈다. 실험결과, 염화나트륨(NaCl)을 첨가한 배양액의 균체 성장이 1.786으로 가장 높은 반면, 황산아연(ZnSO₄)을 첨가한 배양액의 균체 성장은 0.541로 가장 낮았다.

	미량원소원	균체 성장 (A 660)	최종 pH
실시예 M1	염화나트륨(NaCl)	1.786	3.87
실시예 M2	염화칼슘(CaCl₂)	1.731	3.84
실시예 M3	황산마그네슘(MgSO₄)	1.741	3.90
실시예 M4	황산망간(MnO₄S)	1.712	3.85
실시예 M5	인산이수소칼륨(KH₂P0₄)	0.729	3.95
실시예 M6	인산수소이칼륨(K₂HPO₄)	1.729	3.95
실시예 M7	황산아연(ZnSO₄)	0.541	4.50

미량원소별 콜라게네이즈 활성 억제능을 평가한 결과는 도 9에 나타냈다. 실험 결과, ZnSO₄를 첨가한 배양액은 콜라게네이즈 활성 억제능이 80%로 가장 낮은 반면, 염화나트륨(NaCl) 또는 황산마그네슘(MgSO₄)을 첨가한 배양액은 98%이상의 콜라게네이즈 활성 억제능을 나타냈다.

이에 따라 최적 미량원소원을 염화나트륨(NaCl)으로 결정하고, 이를 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.15%, 0.3%, 0.5%(W/V) 함유하도록 각각의 배지에 넣어 미량원소원의 농도별 콜라게네이즈 활성 억제능 실험을 진행하였다.

미량원소원의 농도별 콜라게네이즈 활성 억제능을 평가한 결과는 도 10에 나타냈다. 실험 결과, 염화나트륨(NaCl)을 0.3% 포함하는 배양액이 98% 이상의 콜라게네이즈 활성 억제능을 보여서 가장 높은 것으로 나타났다.

이를 통해 미량원소원의 첨가량 대비 효율 및 경제성을 고려하여 염화나트륨(NaCl)을 0.3%를 최적 미량원소원으로 결정하였다.

8) 최적 배양 조건의 조합 및 배양실험

상기 실험 결과로부터 얻어진 각각의 최적 배양 조건을 조합하여 배양하였다. 즉 락토바실러스 퍼멘텀(lactobacillus fermentum) Miev L1106 균주를 0.5%(W/V) 수크로오스, 3%(W/V) 소고기추출물, 0.3%(W/V) 염화나트륨을 포함하고 초기 pH 4.5로 적정된 배지에서, 24시간 동안 30℃에서 배양한 후, 균체 성장 및 콜라게네이즈 활성 억제능을 평가하였다(실시예 B1).

최적 배양 조건의 조합에 따라 배양한 배양액의 균체 성장 실험 결과, 균체 성장은 A660에서 1.643의 값이 나왔고, 최종 pH는 3.87로 특정되어 상기 조건하에서 배양시 젖산 및 유기산이 생성되는 적정한 성장을 보였다.

최적 배양 조건의 조합에 따라 배양한 배양액의 콜라게네이즈 활성 억제능을 평가한 결과는 도 11에 나타냈다. 실험 결과, 최적 배양 조건의 조합에 따라 배양한 배양액은 91.94%의 콜라게네이즈 활성 억제능을 보여서, 균체를 배양하지 않은 유산균의 기본 합성배지보다 2배 이상의 억제 능력을 나타냈다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항 들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

한국생명공학연구원

KCTC12082BP

20111122

<110> Miev Co.Ltd <120> Novel Strain of Lactobacillus fermentum spp., Cosmetic composition using the same and Preparation method thereof <130> DP120207 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1426 <212> DNA <213> lactobaillus fermentum <220> <221> rRNA <222> (1)..(1426) <223> DNA sequnece complemenetary to 16s rRNA <400> 1 tgcagtcgaa cgcgttggcc caattgattg atggtgcttg cacctgattg attttggtcg 60 ccaacgagtg gcggacgggt gagtaacacg taggtaacct gcccagaagc gggggacaac 120 atttggaaac agatgctaat accgcataac aacgttgttc gcatgaacaa cgcttaaaag 180 atggcttctc gctatcactt ctggatggac ctgcggtgca ttagcttgtt ggtggggtaa 240 yggcctacca aggcgatgat gcatagccga gttgagagac tgatcggcca caatgggact 300 gagacacggc ccatactcct acgggaggca gcagtaggga atcttccaca atgggcgcaa 360 gcctgatgga gcaacaccgc gtgagtgaag aagggtttcg gctcgtaaag ctctgttgtt 420 aaagaagaac acgtatgaga gtaactgttc atacgttgac ggtatttaac cagaaagtca 480 cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgtta tccggattta 540 ttgggcgtaa agagagtgca ggcggttttc taagtctgat gtgaaagcct tcggcttaac 600 cggagaagtg catcggaaac tggataactt gagtgcagaa gagggtagtg gaactccatg 660 tgtagcggtg gaatgcgtag atatatggaa gaacaccagt ggcgaaggcg gctacctggt 720 ctgcaactga cgctgagact cgaaagcatg ggtagcgaac aggattagat accctggtag 780 tccatgccgt aaacgatgag tgctaggtgt tggagggttt ccgcccttca gtgccggagc 840 taacgcatta agcactccgc ctggggagta cgaccgcaag gttgaaactc aaaggaattg 900 acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gaagctacgc gaagaacctt 960 accaggtctt gacatcttgc gccaacccta gagatagggc gtttccttcg ggaacgcaat 1020 gacaggtggt gcatggtcgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa 1080 cgagcgcaac ccttgttact agttgccagc attaagttgg gcactctagt gagactgccg 1140 gtgacaaacc ggaggaaggt ggggacgacg tcagatcatc atgcccctta tgacctgggc 1200 tacacacgtg ctacaatgga cggtacaacg agtcgcgaac tcgcgagggc aagcaaatct 1260 cttaaaaccg ttctcagttc ggactgcagg ctgcaactcg cctgcacgaa gtcggaatcg 1320 ctagtaatcg cggatcagca tgccgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc 1380 cgtcacacca tgagartttg taacacccaa agtcggtggg gtaacc 1426

Claims

서열목록 제1서열의 염기서열을 포함하는 16S 라이보좀 DNA를 가지며, 콜라게네이즈 활성 억제 능력을 갖는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) Miev L1106 (KCTC 12082BP) 균주.
제1항에 있어서,
상기 락토바실러스 퍼멘텀 Miev L1106 균주는 하기 (ⅰ) 내지 (ⅶ)에서 선택된 어느 하나 이상의 특성을 갖는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 퍼멘텀 Miev L1106 (KCTC 12082BP) 균주:
(ⅰ) 김치에서 분리됨;
(ⅱ) 최적 배양 시간은 12시간 내지 48시간;
(ⅲ) 최적 배양 온도는 25 내지 35℃;
(ⅳ) 최적 초기 pH는 3.5 내지 4.5;
(ⅴ) 배양 배지의 최적 탄소원으로서 수크로오스를 배지 총부피 대비 0.5 내지 3%(W/V) 포함;
(ⅵ) 배양 배지의 최적 질소원으로서 소고기추출물을 배지 총부피 대비 3 내지 5%(W/V) 포함;
(ⅶ) 배양 배지의 최적 미량원소원으로서 염화나트륨을 배지 총부피 대비 0.15 내지 0.5%(W/V) 포함
삭제
제1항에 있어서,
상기 락토바실러스 퍼멘텀 Miev L1106 (KCTC 12082BP) 균주는 하기 (ⅰ) 내지 (ⅶ)의 특성을 갖는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 퍼멘텀 Miev L1106 (KCTC 12082BP) 균주:
(ⅰ) 락토바실러스 퍼멘텀 Miev L1106(KCTC 12082BP);
(ⅱ) 최적 배양 시간은 24시간;
(ⅲ) 최적 배양 온도는 30℃;
(ⅳ) 최적 초기 pH는 4.5;
(ⅴ) 배양 배지의 최적 탄소원으로서 수크로오스를 배지 총부피 대비 0.5%(W/V) 포함;
(ⅵ) 배양 배지의 최적 질소원으로서 소고기추출물을 배지 총부피 대비 3%(W/V) 포함;
(ⅶ) 배양 배지의 최적 미량원소원으로서 염화나트륨을 배지 총부피 대비 0.3%(W/V) 포함.
제1항, 제2항, 제4항 중 어느 한 항의 락토바실러스 퍼멘텀 Miev L1106 (KCTC 12082BP) 균주를 배양하여 수득한 배양액을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물.
제5항에 있어서,
상기 화장료 조성물은 피부 콜라겐 합성 촉진, 콜라게네이즈 활성 저해, 피부 주름 개선, 피부 재생 촉진, 피부 탄력 향상 및 피부 보습 향상으로부터 선택되는 어느 하나의 피부 상태 개선 효과를 얻는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제5항에 있어서,
상기 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 스프레이 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항, 제2항 또는 제4항 중 어느 한 항의 락토바실러스 퍼멘텀 Miev L1106 (KCTC 12082BP) 균주를 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 화장료 조성물 제조방법으로서,
상기 배지는 하기 (ⅰ) 내지 (ⅲ) 중 어느 하나 이상의 특성을 가지며,
상기 배양하는 단계는 12시간 내지 48시간 동안, 25 내지 35℃에서, 초기 pH 3.5 내지 4.5에서 수행되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물 제조방법:
(ⅰ) 탄소원으로서 수크로오스를 배지 총부피 대비 0.5 내지 3%(W/V) 포함;
(ⅱ) 질소원으로서 소고기추출물을 배지 총부피 대비 3 내지 5%(W/V) 포함;
(ⅲ) 미량원소원으로서 염화나트륨을 배지 총부피 대비 0.15 내지 0.5%(W/V) 포함.
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