KR20210046195A

KR20210046195A - 클레마티스 꽃 추출물을 함유하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR20210046195A
Application number: KR1020190129668A
Authority: KR
Inventors: 백미정; 박현우; 이광식; 이건국
Original assignee: 주식회사 코리아나화장품
Priority date: 2019-10-18
Filing date: 2019-10-18
Publication date: 2021-04-28

Abstract

본 발명은 클레마티스(Clematis hybrida grandiflora Hort.) 꽃 추출물 또는 클레마티스 꽃 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부주름 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 화장료 조성물에 포함된 유효성분인 클레마티스 꽃 추출물은 콜라겐 생합성, MMP-1생성 억제 효과가 우수하여 피부 주름 개선 및 노화 방지의 효과가 우수하다.

Description

클레마티스 꽃 추출물을 함유하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물{COSMETIC COMPOSITION FOR IMPROVING SKIN WRINKLE COMPRISING EXTRACT OF CLEMATIC FLORIDA FLOWER}

본 발명은 클레마티스(Clematis hybrida grandiflora Hort.) 꽃 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부주름 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

최근 여성들의 화장품 기능에 대한 욕구가 높아짐에 따라 화장품의 기본기능인 청결 및 미적 기능뿐만 아니라 서양 여성들과 같은 하얀 피부를 나타내는 미백효과, 피부의 주름 개선 및 억제 효과 등을 갖는 고기능성 제품이 등장하게 되면서 관심이 많아지고 있다. 또한, 사회적으로 어려보이는 "동안"이라는 단어가 등장, 젊음을 유지하고 싶어 하는 많은 여성들이 주름 개선에 관심이 높아지고 있다.

주름은 연령이 높아짐에 따라 피부의 노화로 생기며, 노화된 피부란 노화의 과정과 연관된 자연적 변화의 총체이다. 피부 노화는 크게 두 가지로 구분된다. 나이와 관련된 피부 기능, 구조 모양의 변화로 나타내는 생리적 노화와 자외선에 의한 광노화로 구분된다.

외부의 유해한 환경으로 인해 섬유아세포의 대사과정이 원활하지 않아도 노화가 발생하기도 한다. 섬유아세포는 피부의 진피층에 존재하며 세포외 간질에 콜라겐을 생성한다. 콜라겐은 생체 단백질 총 중량의 30%를 차지하는 중요한 단백질로 견고한 3중 나선 구조를 가지고 있다. 주된 기능은 피부의 기계적 견고성, 결합조직의 저항력과 세포접착의 지탱 등이 알려져 있다. 이러한 콜라겐은 고령화 및 자외선 조사에 의한 광노화에 의하여 섬유아세포의 기능이 저하되어 그 생성량이 감소되며, 콜라겐을 분해하는 콜라게나제 효소 활성으로 콜라겐 감소를 촉진시킨다. 일반적으로 80세에서는 20세에 비해 65%정도가 감소하여 피부의 두께가 얇아지고 이러한 현상으로 피부의 주름 형성에 밀접한 연관이 있다고 알려져 있다.

태양광 중 자외선에 의해 생성되는 자유라디칼은 반응성이 높은 활성 산소종으로 세포 구성물질인, 당, 단백질, DNA, 세포막 지질 등의 생체 주요 성분을 산화시키거나 변형시켜 세포 손상 및 사멸을 일으킨다. 특히, 피부에서 세포노화를 일으키는 가장 큰 요인으로 밝혀지고 있다. 자유라디칼은 생체가 호흡과정 중 산소의 환원이나 자회선 조자, 식균작용 등으로 발생하는 하나 이상의 짝을 이루지 못한 전자를 가지고 있는 원소 또는 분자로 수명이 수천분의 일 정도로 매우 짧고, 불안정하여 매우 공격적인 성질을 나타내어 세포손상을 일으킨다.

현재, 주름 개선 화장료로는 레티노이드, 아데노신, 동물 태반 유래 단백질, 베툴린산, 클로렐라 추출물 등이 알려져 있다. 잘 알려져 있는 레티놀은 콜라겐을 합성 촉진하며 엘라스타제 효소를 저해하는 물질이지만 불안정하여 피부 적용시 자극, 발적 등의 안전성 문제로 사용량의 제한이 있으며 클로렐라 추출물 등은 효과가 미미하여 실질적으로 피부의 콜라겐 합성을 촉진하여 피부 주름 개선효과를 기대하기 어렵다. 따라서 생체에 안전하고 효과가 높은 새로운 콜라겐 합성 촉진제의 개발이 필요하다.

뿐만 아니라, 노화에는 자유 라디칼 뿐만 아니라 콜라겐 분해효소인 기질 금속 단백질 분해 효소(Matrix etalloproteinase; MMP)라는 효소도 관여한다. 즉, 생체 내에서 콜라겐과 같은 세포외기질의 합성과 분해는 적절하게 조절되나, 노화가 진행되면서 콜라겐 합성이 감소하고, 콜라겐을 분해하는 효소인 기질 금속 단백질 분해 효소(MMP)의 발현이 촉진되어 피부의 탄력이 저하되고 주름이 형성된다. 또한, 자외선 조사에 의해 이러한 분해 효소가 활성화되기도 한다. 그러므로 세포 내에서 활성화가 유도되는 MMP 발현을 조절하거나 그 활성을 억제할 수 있는 물질의 개발이 요구되고 있다.

식물 추출물을 포함하여 피부 주름 개선 효과를 갖는 화장료 조성물에 대한 특허들이 다수 공개되어 있다. 한국등록특허 제10-1574248호에서는 왕호장(Reynoutria sachalinensis) 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 주름개선용 화장료 조성물을 개시한다. 또한, 한국 등록특허 제10-1693931호에서는 고리매 (Scytosiphon lomentaria) 추출물을 유효성분으로 포함하는 주름개선용 화장료 조성물을 개시한다.

본 발명자는 노화를 개선하기 위해 천연 식물 성분들에 대한 다양한 피부 생리활성을 검색한 결과, 천연 식물추출물 중에서 클레마티스(Clematis hybrida grandiflora Hort.) 꽃 추출물이 우수한 항산화, 엘라스타제(Elastase) 저해 활성, 콜라겐 합성 촉진 효과, MMP-1 생성 억제 효과를 보이는 것을 확인했으며, 클레마티스(Clematis hybrida grandiflora Hort.) 꽃 발효 추출물이 클레마티스 꽃 용매 추출물보다 효과적으로 피부 주름을 개선할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기한 과제는, 클레마티스(Clematis hybrida grandiflora Hort.) 꽃 추출물 또는 클레마티스 꽃 발효 추출물을 함유하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물에 의해 달성된다.

바람직하게는 상기 클레마티스 꽃 추출물 또는 클레마티스 꽃 발효 추출물은 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0. 001 ~ 30.0 중량% 함유될 수 있다.

또한 바람직하게는, 상기 클레마티스 꽃 발효 추출물은 28 내지 42℃의 온도 조건 하에서 pH 5 내지 8을 유지하면서, 5 내지 10일간 발효시켜 얻은 것일 수 있다.

또한 바람직하게는, 상기 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 젤, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형을 가질 수 있다.

본 발명은 클레마티스 꽃 추출물 또는 클레마티스 꽃 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 화장료 조성물에 포함된 유효성분인 클레마티스 꽃 추출물은 콜라겐 생합성, MMP-1생성 억제 효과가 우수하여 피부 주름 개선 및 노화 방지의 효과가 우수하다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 하기의 정의를 가지며 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미에 부합된다. 또한, 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다.

용어 "약"이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.

본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, "포함하다" 및 "포함하는"이란 말은 제시된 단계 또는 구성요소, 또는 단계 또는 구성요소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 구성요소, 또는 단계 또는 구성요소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.

본 발명은 클레마티스(Clematis hybrida grandiflora Hort.) 꽃 또는 클레마티스 꽃 발효 추출물을 유효 성분으로 포함하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 사용된 클레마티스(Clematis hybrida grandiflora Hort.)는 쌍떡잎식물 미나리아재비목 미나리아재비과에 속하는 식물로서 으아리속이라고도 한다. 대부분 덩굴성이지만 줄기가 곧게 서는 것도 있다. 높이 2∼3m이다. 잎은 마주달리고 3장의 작은잎이 나온 잎이거나 깃꼴겹잎이지만 간혹 단순한 것도 있다. 잎자루가 길고 작은잎은 밋밋하거나 톱니가 있다. 꽃은 잎겨드랑이와 가지 끝에 1개씩 달려서 전체가 원추꽃차례를 이룬다. 꽃은 흰색·자주색 등이고 지름 10∼15cm이며 양성화이거나 단성화이다. 꽃받침조각은 4∼8장으로서 꽃잎처럼 생기며 꽃잎은 없다. 수술과 암술은 많으며 암술대는 꽃이 진 다음 길게 자란다. 열매는 수과이다. 배수가 잘 되고 햇빛이 많이 쬐는 곳에서 잘 자란다. 번식은 종자나 꺾꽂이로 하는데, 꺾꽂이는 5∼8월에 자란 새순을 꽂아서 뿌리를 낸다.

본 발명에 있어서, 클레마티스 꽃 추출물은 클레마티스의 꽃으로부터 얻은 추출물이고, 가장 바람직하게는 개화한 꽃으로부터 얻은 것을 의미한다.

클레마티스 꽃 추출물은 통상적인 온도와 압력의 조건 하에서, 통상적인 용매를 사용하여 제조될 수 있으나, 바람직하게는 (a) 물, 탄소수 1 ~ 4의 무수 또는 함수 저급 알코올(예를 들면, 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올), 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 글리세린, 아세톤, 디에틸에테르, 에틸 아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, 클로로포름, 헥산 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 용매를 이용한 용매 추출법, (b) 이산화탄소에 의한 감압 및 고온에 의한 초임계 추출법, 또는 (c) 초음파 추출법을 이용하여 추출한다.

본 발명에 있어서, 클레마티스 꽃 발효 추출물은 클레마티스 꽃 추출물을 발효하여 얻은 것을 의미한다.

본 발명의 클레마티스 꽃 발효 추출물은 통상의 미생물 배양 배지에 상기 클레마티스 추출물을 첨가한 것을 배양배지로 하고, 여기에 미생물을 접종하여 발효시켜 사용한다. 구체적으로는, 배양 배지에 전체 배양 배지 중량에 대해 클레마티스 추출물 1 ~ 30 중량%을 첨가하고, 여기에 효모균, 유산균, 바실러스속 균 및 이의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 미생물을 10,000 ~ 100,000 CFU/L의 양으로 첨가한다. 배양 온도는 28 ~ 42℃의 통상적인 미생물 배양 조건으로 배양할 수 있으며, 바람직하게는 30 ~ 37℃에서 배양할 수 있다. PH는 5 내지 8로 호기적 또는 통상 혐기적인 조건으로 약 5일 내지 10일간 배양하며 이후 숙성 및 여과를 통해 얻을 수 있다. 발효에 사용되는 배양배지에서 클레마티스 추출물의 양은 전체 배양 배지 중량에 대해 1 ~ 30 중량%를 첨가하여 사용할 수 있다. 클레마티스 추출물이 1 중량% 미만이면 미생물에 의한 발효액의 양이 적어 효과가 나타나기 어렵고, 30 중량%를 초과하면 클레마티스 추출물이 배지에 잘 녹지 않아 발효 효율이 떨어진다.

발효 공정에 사용되는 발효균주로서는 효모균, 유산균, 바실러스속 균 및 이의 혼합물에서 선택될 수 있고, 바람직하게는 아스퍼질러스(Aspergillus sp.) 균주, 바실러스(Bacillus sp.) 균주, 락토바실러스(Lcatobacillus sp.) 균주 중에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다.

상기 락토바실러스 균주의 일예로 락토바실러스 아키도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 부크네리(Lactobacillus buchneri), 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus (Lactobacillus heterohiochii), 락토바실러스 힐가르디이(Lactobacillus hilgardii), 락토바실러스 호모히오키이(Lactobacillus homohiochii), 락토바실러스 옌세니이(Lactobacillus jensenii), 락토바실러스 락티스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 카세이(아종) 아락토수스(Lactobacillus caselactis), 락토바실러스 레이크만니이(Lactobacillus leichmannii), 락토바실러스 카세이(아종) 카세이(Lactobacillus caseisubsp. casei), 락토바실러스 카세이 (아종) 프세우도플란타룸(Lactobacillus casei subsp.pseudoplantarum), 락토바실러스 카세이 람노수스(Lactobacillus casei subsp. rhamnosus), 락토바실러스 카세이 톨레란스(Lactobacillus casei subsp. tolerans), 락토바실러스 카네나포르미스(Lactobacilluscatenaformis), 락토바실러스 켈로비오수스(Lactobacillus cellobiosus), 락토바실러스 콜리노이데스(Lactobacillus collinoides), 락토바실러스 콘푸수스(Lactobacillus confusus), 락토바실러스 코리니포르미스(Lactobacillus coryniformis), 락토바실러스 코리니포르미스 (아종) 코리니포르미스(Lactobacillus coryniformis subsp. coryniformis), 락토바실러스 코리니포르미스 (아종) 토르쿠엔스(Lactobacillus coryniformis subsp. torquens), 락토바실러스 리케니포르미스(Lactobacillus licheniformis), 락토바실러스크리스파투스(Lactobacillus crispatus), 락토바실러스 쿠르바투스(Lactobacillus curvatus), 락토바실러스 델브루엑끼이(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 페르멘툼(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 프룩티보란스(Lactobacillus fructivorans), 락토바실러스 프룩토수스(Lactobacillus fructosus), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus) 중에서 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus)가 바람직하다.

상기 아스퍼질러스 균주의 일예로 아스퍼질러스 오리제(Aspergillus oryzae), 아스퍼질러스 나이거(Aspergillusniger), 아스퍼질러스 우사미(Aspergillus 중에서 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있으며 보다 바람직하게는 아스퍼질러스 오리제(Aspergillus oryzae)가 바람직하다.

상기 바실러스 균주의 일예로 바실러스 아키도칼다리우스(Bacillus acidocaldarius), 바실러스 알칼로필루스(Bacillus alcalophilus), 바실러스 알베이(Bacillus alvei), 바실러스 안트라키스(Bacillus anthracis), 바실러스 바디우스(Bacillus badius), 바실러스 브레비스(Bacillus brevis), 바실러스 케레우스(Bacillus cereus), 바실러스 키르쿨란스(Bacillus circulans), 바실러스 코아굴란스(Bacillus coagulans), 바실러스 파스티디오수스(Bacillus fastidiosus), 바실러스 렌티모르부스 (Bacillus lentimorbus), 바실러스 렌투스 lentus),

바실러 스릭케니포르미스 (Bacillus licheniformis), 바실러스 마케란스(Bacillus macerans), 바실러스 막쿠아리엔시스(Bacillus macquariensis), 바실러스 메가테리움 megaterium), 바실러스 미코이데스(Bacillusmycoides), 바실러스 판토텐티쿠스 (Bacillus pantothenticus), 바실러스 파스테우리이 pasteurii),바실러스 플리믹크사 polymyxa) , 바실러스 포필리아이(Bacillus popilliae), 바실러스 푸밀루스(Bacillus pumilus), 바실러스 스파이리쿠스(Bacillus sphaericus), 바실러스 스테아로테르모필루스(Bacillus stearothermophilus), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 바실러스 투린기엔시스(Bacillus thuringiensis) 중에서 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있으며 바람직하게는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)가 바람직하다.

상기 클레마티스 꽃 추출물 또는 클레마티스 꽃 발효 추출물은 화장료 조성물의 전체 중량에 대해서 0.001 내지 30.0 중량%, 바람직하게는 0.01 내지 10.0 중량% 함유되는 것을 특징으로 한다. 상기 추출물의 함량이 0.001 중량% 미만인 경우에는 피부개선 효과가 나타나지 않으며, 30.0 중량%를 초과하는 경우에는 함유량 증가에 대한 피부개선 효과 증대 정도가 미미하며, 제형상의 안전 및 안정성에 문제가 있으며 경제적이지도 못하다. 따라서 이러한 다양한 기능을 가진 클레마티스 꽃 추출물 또는 클레마티스 꽃 발효 추출물을 포함하는 본 발명의 화장료 조성물은 우수한 항산화 효과, 엘라스타제 저해활성, 콜라겐 생합성 효과, MMP-1 생성억제 효과를 갖는 것을 특징으로 한다.

발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서 상기 유효 성분 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 팩, 마사지크림 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로 서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 계면활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물이 비누, 계면활성제 함유 클렌징 제형 또는 계면활성제 비함유 클렌징 제형일 경우, 피부에 도포한 후 닦아내거나 떼거나 물로 씻어낼 수도 있다. 구체적인 예로서, 상기 비누는 액상비누, 가루비누, 고형비누 및 오일비누이며, 상기 계면활성제 함유 클렌징 제형은 클렌징 폼, 클렌징 워터, 클렌징 수건 및 클렌징 팩이며, 상기 계면활성제 비함유 클렌징 제형은 클렌징크림, 클렌징 로션, 클렌징 워터 및 클렌징 겔이며, 이에 한정되는 것은 아니다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다.

제조예 1 - 클레마티스 꽃 용매 추출물 제조

클레마티스 꽃을 깨끗한 물로 씻어 건조시킨 다음 일정한 크기로 절단하여 70%(V/V) 에탄올 수용액으로 5시간씩 3회 환류 추출하고 냉침한 후, 와트만(Whatman) #4 여과지로 여과하였다. 여과된 추출물을 50℃ 이하에서 감압 농축 및 동결 건조하였다.

제조예 2 - 클레마티스 꽃 발효 추출물 제조

클레마티스 꽃을 깨끗한 물로 씻어 건조시킨 다음 일정한 크기로 절단하여70%(V/V) 에탄올 수용액으로 5시간씩 3회 환류 추출하고 냉침한 후, 와트만(Whatman) #4 여과지로 여과하였다. 여과된 추출물(2L 70% EtOH)을 50℃ 이하에서 감압 농축하여 발효 미생물이 잘 배양되도록 하기 위하여 수분 함량을 물을 첨가함으로써 70%로 조절하여 발효 원료를 수득하였다. 이어 수득한 발효 원료를 121℃에서 15분간 멸균하였다. 발효 균주의 배양은 LB 배지(Difco, USA)를 사용하였고, 상기 배지에 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)를 중량 대비 3% 접종시킨 후 37도에서 pH 7.5로 호기적 조건에서 10일간 배양시켰다. 그런 다음 배양액을 0.25μM의 여과지를 이용하여 여과한 후 이 여액을 4℃에서 10일간 저온 숙성시킨 후 0.25μM 여과지를 사용하여 최종 여과하였다.

실험예 1 - DPPH 라디칼 소거능 측정

상기의 제조예 1 및 제조예 2에 대하여 항산화 효과를 측정하기 위해 실험실 조건에서 L-Ascorbic acid를 비교샘플로 하여 DPPH법을 이용하여 항산화 활성을 측정하였다.

DPPH법은 DPPH(2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl) 프리라디칼이라는 유리기를 사용하여 환원력에 의한 항산화 활성을 측정하는 것이다. 피검물질에 의해 DPPH가 환원되어 흡광도가 감소하는 정도를 공시험액의 흡광도와 비교하여 파장 560nm에서 자유라디칼 소거율을 측정한다. 사용한 시약으로서는 2,2-Di(4-tertoctylphenyl)-1-picrylhydrazyl 프리라디칼(Aldrich Chem. Co., MW=618.76)0.2mM 용액으로서 메탄올에 용해하여 100ml로 맞춰 사용한다. 측정방법으로서, 96-웰 플레이트에 0.2mM DPPH 용액 0.15ml과 시료용액 0.15ml를 가하여 빨리 교반하고 25℃에서 10분간의 배양을 개시한다. 그 후 560nm에서의 흡광도 St를 측정한다. 공시험은 시료용액 대신에 증류수를 사용한 것을 상기와 똑같이 조작해 흡광도 Bt를 측정한다. 시료용액의 블랭크(Blank)는 0.2mM DPPH 용액 대신에 메탄올을 사용해 똑같이 조작하여 흡광도 Bo를 측정한다.

결과는 수학식 1에 의하여 산출하였으며, 결과는 표 1에 나타내었다. 비교군으로써 L-ascorbic acid를 사용하였다

St : 시료용액의 자유라디칼 소거 후의 560nm에서의 흡광도

Bt : 공시험용액의 자유라디칼 소거 후의 560nm에서의 흡광도

So : 시료용액의 자유라디칼 무첨가시 반응 전의 560nm에서의 흡광도

Bo : 공시험용액의 자유라디칼 무첨가시 반응 전의 560nm에서의 흡광도

시료명	농도(ppm)	자유라디칼소거율(%)
제조예 1	1000	65.12 ± 2.23
제조예 2	1000	83.90 ± 3.03
제조예 1	500	41.31 ± 3.73
제조예 2	500	55.77 ± 1.60
제조예 1	100	16.65 ± 2.93
제조예 2	100	33.31 ± 3.01

표 1에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 클레마티스 꽃 추출물(제조예 1) 및 클레마티스 꽃 발효 추출물(제조예 2)의 자유라디칼 소거 효과가 있는 것을 알 수 있으며, 특히 클레마티스 꽃 추출물 보다 클레마티스 꽃 발효 추출물(제조예 2)의 자유라디칼 소거 효과가 더 우수한 것을 알 수 있다.

실험예 2 - 엘라스타제 ( Elastase ) 저해활성 측정

엘라스타제(Elastase)는 진피 내 피부탄력을 유지시키는 데 중요한 기질인 엘라스틴을 분해하는 효소이다. 또한, 엘라스타제는 다른 중요한 기질 단백질인 콜라겐을 분해할 수 있는 비특이적 가수분해 효소이다. 따라서 엘라스타제 저해제는 피부주름을 개선하는 작용을 나타내며, 우리솔산(ursolic acid) 등이 엘라스타제 저해제로서 이용되고 있다. 엘라스타제는 동물 결합조직의 불용성 탄성 섬유 단백질인 엘라스틴을 분해시켜 피부의 진피조직의 그물망 구조 결합을 끊음으로써 주름을 생성시키는 주원인이 되는 효소로 알려져 있다. 피부의 진피 조직 속에는 콜라겐과 피부의 탄력성에 관련된 엘라스틴이 그물망 구조를 형성하고 있는데, 이러한 그물망 구조가 깨지면서, 즉 엘라스틴이 엘라스타제에 의해 분해되어 피부가 처지고 주름이 생기므로 내인성 피부노화가 발생한다. 그러므로 피부노화의 주원인 중의 하나인 엘라스틴 분해효소인 엘라스타제의 활성을 저하시킴으로써 피부노화를 억제할 수 있다.

기질로서 N-succinyl-(L-Ala)3-p-nitroanilide, S4760, Sigma)를 사용하여 37℃에서 20분간 기질로부터 생성되는 p-nitroanilide의 생성량을 445nm에서 측정하였다. 즉, 각 시험용액을 일정 농도가 되도록 조제하여 500μL 씩 시험관에 취하고, 2mM tris-HCl 버퍼(pH 8.6)에 녹인 porcine pancreas elastase(E1250, Sigma) 2.5U/mL)용액 500μL을 가한 후 기질로 50mM tris-HCl 버퍼(pH 8.6)에 녹인 N-succinyl-(L-Ala)3- p-nitroanilide(500μg/mL)을 첨가하여 20분간 반응시켜 측정하였다. Elastase 저해활성은 시료용액의 첨가군와 무첨가군의 흡광도 감소율로 하기 수학식 2에 따라 계산하여 나타내었다.

시료명	농도(ppm)	엘라스타제 저해율(%)
제조예 1	100	15.129
제조예 2	100	29.219
제조예 1	500	27.311
제조예 2	500	56.315
제조예 1	1000	43.281
제조예 2	1000	78.152

표 2에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 클레마티스 꽃 추출물(제조예 1) 및 클레마티스 꽃 발효 추출물(제조예 2)의 엘라스타제 저해 활성효과가 있는 것을 알 수 있으며, 특히 클레마티스 꽃 추출물 보다 클레마티스 꽃 발효 추출물(제조예 2)의 엘라스타제 저해 활성이 더 우수한 것을 알 수 있다.

실험예 3 - ELISA 키트를 이용한 콜라겐(collagen) 생합성 측정 결과

인간 섬유아세포(Human Skin Fibroblast)를 37℃, 5% CO2 배양기에서 일정한 습도를 유지하는 세포 배양기 내에서 10% FBS, Penicillin(50U/ml), Streptomycin(50/ml)를 함유하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Gibco, USA)으로 배양하여, 1× 10 5개/ml로 24 well plate에 500㎕씩 분주한 다음 24시간 배양하였다.

섬유아세포에서 콜라겐 타입 I(collagen type I)의 정량은 'Procollagen Type I c-peptide EIAkit(TaKaRa,japan)'를 이용하여 효소면역분석법(immunosorbent assay, ELISA)으로 실시하였는데, 분석을 위해 48시간 동안 배양한 상기의 세포 배양 상등액을 조심스럽게 수집하였다. 먼저 'Procollagen Type I c-peptide와 결합하는 항체 (antibody)가 코팅된 스트립(strip)에 48시간 배양된 배양 상등액을 각각 100 ul씩 첨가하고 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 워싱버퍼(washing buffer)를 이용하여 3회 세척하여 미반응 물질을 제거한 다음, 여기에 블라킹 버퍼(Blocking buffer) 100 ul씩 넣고, 다시 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 워싱버퍼(washing buffer)를 이용하여 3회 세척하여 미반응 물질을 제거하고, 'Procollagen Type I c-peptide'와 결합하는 또 다른 항체에 POD가 콘쥬게이트(conjugate)된 용액(Antiobody-POD conjugate solution) 100 ul씩 넣고 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 워싱 버퍼(washing buffer)를 이용하여 3회 세척하여 미반응 물질을 제거하고, 동량의 기질 (substrate) 용액 넣고, 30분간 반응시킨 다음 정지용액(stop solution, 1N H2SO4)을 넣고 실험을 종료하였다. 실험이 종료된 스트립(strip)을 450 nm에서 흡광도를 측정하여 콜라겐 표준품과 비교하여 새로 합성된 콜라겐 양을 PICP 양으로 측정하였으며 콜라겐의 합성효과를 표 3에 나타내었다.

시료명	농도(ppm)	콜라겐 합성량 (ng/2x10⁴)
제조예 1	200	136 ± 4.71
제조예 2	200	215 ± 6.15
제조예 1	100	80 ± 3.17
제조예 2	100	131 ± 7.81

표 3에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 클레마티스 꽃 추출물(제조예 1) 및 클레마티스 꽃 발효 추출물(제조예 2)의 콜라겐 합성이 있는 것을 알 수 있으며, 특히 클레마티스 꽃 추출물 보다 클레마티스 꽃 발효 추출물(제조예 2)의 콜라겐 합성량이 우수하여 주름 개선 효과가 더 우수한 것을 알 수 있다.

실험예 4 - MMP -1 생성 억제 효과

상기 제조예 1 또는 제조예 2에서 수득한 클레마티스 꽃 추출물 및 클레마티스 꽃 발효 추출물이 콜라겐 분해효소인 MMP-1 생성을 억제하는 효과가 있는지를 측정하기 위하여, MMP-1의 생성을 억제하는 효과가 있는 것으로 알려진 물질인 TGF-β(10ng/ml, Roche, 미합중국)를 비교군으로 하여 MMP-1의 생성을 억제하는 효과를 측정하였다. 인간 정상 피부 세포인 섬유아세포(한국 세포주 은행, 대한민국)를 48-웰 마이크로 플레이트(Nunc, 덴마크)에각 웰당 1× 10 6 세포가 되도록 접종하고, DMEM 배지(Sigma, 미합중국) 및 37℃의 조건에서 24시간 동안 배양한 후 상기 제조예 1 또는 제조예 2에서 수득한 클레마티스 꽃 추출물 및 클레마티스 꽃 발효 추출물의 최종 농도 100 ㎍/㎖로 첨가한 무혈청 DMEM 배지 및 대조군으로 클레마티스 꽃 발효 추출물이 포함되지 않은 무혈청 DMEM 배지에서 48시간 동안 추가로 배양하였다. 배양 후, 각 웰의 상층액을 모아 MMP-1 분석 킷트(Amersham,미합중국)를 이용하여 새로 합성된 MM P-1의 양(ng/㎖)을 측정하고, 하기 수학식 3에 따라 MMP-1 생성 억제율(%)을 계산하였으며, 그 결과를 표 4에 나타내었다.

시료명	농도(ppm)	MMP-1 생성 저해율(%)
제조예 1	200	45.07 ± 3.35
제조예 2	200	57.52 ± 3.12
제조예 1	100	23.37 ± 3.01
제조예 2	100	42.26 ± 4.01

상기 표 4에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 클레마티스 꽃 발효 추출물(제조예 1)의 MMP-1 생성 저해율이 용매 추출물(비교제조예 1)보다 우수한 것을 알 수 있다.

제형예 1 - 크림

클레마티스 꽃 추출물 또는 클레마티스 꽃 발효 추출물을 함유한 화장료 중 크림의 처방예는 다음 표 5와 같다.

구분(중량%)	처방예 1	처방예 2
클레마티스 꽃 추출물 (제조예 1) 클레마티스 꽃 발효 추출물 (제조예 2) 친유형 모노스테아린산글리세린 세테아릴알콜 스테아린산 밀납 폴리솔베이트 60 솔비탄스테아레이트 경화식물유 스쿠알란 광물유 트리옥타노인 디메치콘 소듐마그네슘실리케이트 글리세린 베타인 트리에타올아민 소듐히아루로네이트 방부제, 향, 색소 증류수	3.0 - 2.0 2.2 1.5 1.0 1.5 0.6 1.0 3.0 5.0 5.0 1.0 0.1 5.0 3.0 1.0 4.0 미량 잔량	- 3.0 2.0 2.2 1.5 1.0 1.5 0.6 1.0 3.0 5.0 5.0 1.0 0.1 5.0 3.0 1.0 4.0 미량 잔량
합계	100	100

제형예 2 - 화장수

클레마티스 꽃 추출물 또는 클레마티스 꽃 발효 추출물을 함유한 화장료 중 화장수의 처방예는 다음 표 6과 같다.

구분(중량%)	처방예 3	처방예 4
클레마티스 꽃 추출물(제조예 1) 클레마티스 꽃 발효 추출물 (제조예 2) 글리세린 1.3-부틸렌글리콜 피이지1500 알란토인 DL-판테놀 EDTA-2Na 벤조페논-9 소듐 히아루로네이트 에탄올 옥틱도데세스-16 폴리솔베이트 20 방부제, 향, 색소 증류수	3.0 - 5.0 3.0 1.0 0.1 0.3 0.02 0.04 5.0 10.0 0.2 0.2 미량 잔량	- 3.0 5.0 3.0 1.0 0.1 0.3 0.02 0.04 5.0 10.0 0.2 0.2 미량 잔량
합계	100	100

제형예 3 - 에센스

클레마티스 꽃 추출물 또는 클레마티스 꽃 발효 추출물을 함유한 화장료 중 에센스의 처방예는 다음 표 7과 같다.

구분(중량%)	처방예 5	처방예 6
클레마티스 꽃 추출물(제조예 1) 클레마티스 꽃 발효 추출물 (제조예 2) 글리세린 베타인 피이지 1500 알란토인 DL-판테놀 이.디.티.에이-2Na 벤조페논 - 9 히드록시에칠 셀룰로오스 소듐히아루로네이트 카르복시비닐폴리머 트리에탄올아민 옥틸도데칸올 옥틸도데세스 -16 에탄올 방부제, 향, 색소 증류수	3.0 - 10.0 5.0 2.0 0.1 0.3 0.02 0.04 0.1 8.0 0.2 0.18 0.3 0.4 6.0 미량 잔량	- 3.0 10.0 5.0 2.0 0.1 0.3 0.02 0.04 0.1 8.0 0.2 0.18 0.3 0.4 6.0 미량 잔량
합계	100	100

비교제형예 1 - 크림

클레마티스 꽃 추출물 또는 클레마티스 꽃 발효 추출물을 함유하지 않은 크림의 처방예는 다음 표 8과 같다.

구분(중량%)	처방예 7
친유형 모노스테아린산글리세린 세테아릴알콜 스테아린산 밀납 폴리솔베이트 60 솔비탄스테아레이트 경화식물유 스쿠알란 광물유 트리옥타노인 디메치콘 소듐마그네슘실리케이트 글리세린 베타인 트리에타올아민 소듐히아루로네이트 방부제, 향, 색소 증류수	2.0 2.2 1.5 1.0 1.5 0.6 1.0 3.0 5.0 5.0 1.0 0.1 5.0 3.0 1.0 4.0 미량 잔량
합계	100

실험예 5 - 화장료의 주름 개선 효과 평가

본 발명에 따른 클레마티스 꽃 추출물 또는 클레마티스 꽃 발효 추출물을 함유하는 화장료의 주름 개선 효과를 실제 사용 테스트를 통하여 평가하였다. 클레마티스 꽃 추출물을 3%(v/v)를 함유하고 있는 처방예 1 크림 및 클레마티스 꽃 발효 추출물을 3%(v/v)를 함유하고 있는 처방예 2 크림과, 크림에서 추출물을 정제수로 대체한 비효제형예 1의 제형예 7 크림을 사용해 평가하였다. 30명의 30-40세 여성을 무작위로 2개군으로 나누어 각 크림을 매일 아침, 저녁 2회씩 세안 후 크림 적당량을 눈가를 중심으로 2개월간 연속적으로 바르게 하였다. 각 피검자의 주름 개선 효과를 육안 관찰을 통하여 평가하였다. 실험 결과는 하기의 표 9에 나타낸 바와 같다.

구분	주름개선효과 우수	주름개선효과 약간	주름개선 효과 없음
처방예 1	15	12	3
처방예 2	20	8	2
처방예 7	4	7	19

표 9에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 클레마티스 꽃 추출물(처방예 1) 또는 클레마티스 꽃 발효 추출물(처방예 2)을 함유한 화장료(제형예 1)는 함유하지 않은 화장료(비교제형예 1)에 비하여 주름개선 효과가 뛰어나고, 클레마티스 꽃 추출물(처방예 1) 보다 클레마티스 꽃 발효 추출물(처방예 2)을 함유한 화장료가 더 높음 주름개선 효과를 있음을 알 수 있으며, 본 발명의 화장료를 피부에 도포한 부분의 피검자들에서 피부 자극을 관찰할 수 없었다.

Claims

클레마티스(Clematis hybrida grandiflora Hort.) 꽃 추출물 또는 클레마티스 꽃 발효 추출물을 함유하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 클레마티스 꽃 추출물 또는 클레마티스 꽃 발효 추출물은 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0. 001 ~ 30.0 중량% 함유되는, 피부 주름 개선용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 클레마티스 꽃 발효 추출물은 28 내지 42℃의 온도 조건 하에서 pH 5 내지 8을 유지하면서, 5 내지 10일간 발효시켜 얻은 것인, 피부 주름 개선용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 젤, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형을 갖는, 피부 주름 개선용 화장료 조성물.