KR101883307B1

KR101883307B1 - 황근 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR101883307B1
Application number: KR1020170062947A
Authority: KR
Inventors: 주환빈; 이지영; 김태양; 이춘몽; 이건국
Original assignee: 주식회사 코리아나화장품
Priority date: 2017-05-22
Filing date: 2017-05-22
Publication date: 2018-07-31

Abstract

본 발명은 황근 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 화장료 조성물은 황근 잎 추출물을 포함하여, 콜라겐 생합성, MMP-1 생성 억제효과가 우수하여, 주름개선 효과 및 노화 방지 효과가 우수하다.

Description

황근 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물{COSMETIC COMPOSITION FOR IMPROVING SKIN WRINKLE COMPRISING EXTRACTS OF HIBISCUS HAMABO LEAF AS ACTIVE INGREDIENT}

본 발명은 황근 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부는 체내의 근육들과 기관을 보호하는 다수의 상피조직으로 이루어진 조직으로, 외부 환경으로부터 신체 내부를 보호하여 체내의 항상성을 유지시키는데 중요한 역할을 한다. 그 결과 피부는 외부에서 주어지는 물리적, 화학적 자극, 스트레스, 영양 결핍 등에 의해 피부의 정상기능이 저하되고 탄력 저하, 주름 생성 등의 피부 노화 현상이 촉진된다. 피부의 노화는 내인적 노화(innate age)와 외인적 노화(extrinsic age)로 구분할 수 있다. 상기 내인적 노화는 연령이 증가함에 따라 발생하는 노화로, 신체의 생리적인 기능이 저하되어 나타나는 노화이다. 또한, 상기 외인적 노화는 외부 자외선, 활성산소, 스트레스 등에 의해 발생하는 노화 현상을 말한다. 이러한 내인적 및 외인적 노화 요인에 의해 피부의 노화가 진행되고, 그 결과 피부 표면에 주름이 생성되어 피부결이 거칠어지고 탄력이 감소한다. 주름이 생성되는 기작에 따르면, 진피 내의 콜라겐(collagen), 엘라스틴(elastin) 등은 분해 및 생성이 계속해서 이루어지는데, 이때 분해작용 후 생성작용으로 인한 보충이 원활하지 않으면 피부가 탄력을 잃고 주름이 생성된다. 지금까지 연구보고된 대표적인 주름완화 및 피부 노화 예방 물질로는 레티노익산(retinoic acid), 레티놀(retinol), 아스코르브산(ascorbic acid), α-히드록시산(α-hydroxy acid) 등이 있으며 이에 관한 연구가 활발히 이루어져 왔다.

노화에는 자유 라디칼 뿐만 아니라 콜라겐 분해효소인 기질 금속 단백질 분해 효소(Matrix Metalloproteinase; MMP)라는 효소도 관여한다. 즉, 생체 내에서 콜라겐과 같은 세포외기질의 합성과 분해는 적절하게 조절되나, 노화가 진행되면서 콜라겐 합성이 감소하고, 콜라겐을 분해하는 효소인 기질 금속 단백질 분해 효소(MMP)의 발현이 촉진되어 피부의 탄력이 저하되고 주름이 형성된다. 또한, 자외선 조사에 의해 이러한 분해 효소가 활성화되기도 한다. 그러므로 세포 내에서 활성화가 유도되는 MMP 발현을 조절하거나 그 활성을 억제할 수 있는 물질의 개발이 요구되고 있다.

산소는 물과 더불어 우리가 살아가는데 없어서는 안 되는 물질이나, 그 산소가 일단 우리의 체내에 들어가면 여러 원인들에 의해 굉장히 활성이 강한 산소로 변하여 혈관 세포를 산화시킨다. 오늘날 질병의 원인의 약 90% 정도가 이 활성산소에 의한 것으로 규명되어지고 있다. 사람의 몸은 약 60조의 세포로 구성되어 있으며, 세포막은 임피질로 형성되어 있어 활성산소가 연결되기 쉽다. 산화반응이 발생하면 불포화 지방산은 과산화지질로 변화한다. 이 과산화지질이 유전자 DNA, RNA, 단백질, 세포막 및 세포 구조 등에 손상을 주어 암이 되거나 여러 성인병의 원인이 되며, 궁극적으로 노화의 원인이 된다. 바로 이러한 활성산소를 없애거나 중화시켜 세포가 산화하는 것을 막는 역할을 하는 물질을 항산화 물질이라고 한다. 일반적으로 피부세포의 구성성분인 지질의 활성산소로 인해 과산화가 일어나면 세포막의 구조가 변형되어 세포 투과성, 유동성, 막 효소와 운반 단백질의 불활성화, 단백질 사슬의 절단, DNA, RNA 손상 등이 발생하여 피부세포가 노화가 일어난다고 알려져 있다. 이러한 이유 때문에 활성산소를 제거하려고 하는 노력이 지속되었으며, 이러한 결과로 인해 많은 황산화 물질이 개발되었다.

지금까지 항산화 작용을 갖는 것으로 알려진 물질로는, 아스코르브산(ascorbic acid), 베타카로틴(β-carotene), 디부틸히드록실톨루엔(BHT), 디엘-알파 토코페롤(DL-α-tocopherol) 등이 있다. 그러나, 이러한 물질들은 합성물질로 사용되기 때문에, 장기 사용시 또는 다량 사용하여 피부에 사용 시 피부 안전성의 문제를 일으키거나, 화장품에 제형에 함유시 안정성에 문제가 있어 그 사용에 있어 제한을 받고 있는 실정이다. 이에 많은 연구자들이 이러한 문제점들을 해결하고자 많은 노력을 하고 있다.

한국공개특허 제2009-0041071호에서는 호랑버들, 오미자, 황근, 부들 등의 꽃 추출물을 포함하는 조성물을 개시하고 있다. 상기 특허에서는 상기 꽃 추출물들이 SNARE 복합체 형성을 저해하여 신경전달물질 배출을 조절함으로써, 피부 주름 개선 효과를 제공할 수 있다고 개시하고 있다.

본 발명자는 노화의 주요 원인 중 하나인 주름을 개선하기 위해 천연 식물 성분들에 대한 다양한 피부 생리활성을 검색한 결과, 천연 식물 추출물 중에서 황근의 잎 추출물이 엘라스타제(Elastase) 저해 활성, 콜라겐 합성 촉진 효과, MMP-1 생성 억제 효과를 보임으로써 효과적으로 피부를 개선할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 상기 과제는, 황근(Hibiscus hamabo) 잎 추출물을 유효성분을 포함하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물에 의해 달성된다.

바람직하게는, 상기 화장료 조성물은 황근 잎 추출물을 화장료 조성물의 총 중량에 대하여 0.0001 ~ 30.0 중량%로 함유할 수 있다.

또한 바람직하게는, 상기 황근 잎 추출물은 물, 탄소수 1-4개의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 에틸 아세테이트 및 부틸 아세테이트로 구성된 군으로부터 선택되는 추출용매로 추출될 수 있다.

또한 바람직하게는, 상기 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 젤, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형을 가질 수 있다.

본 발명은 황근 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 화장료 조성물에 포함된 유효성분인 황근의 잎의 추출물은 콜라겐 생합성, MMP-1 생성 억제효과가 우수하여, 주름개선 효과 및 노화 방지 효과가 우수하다.

본 발명은 황근(Hibiscus hamabo )잎 추출물을 유효 성분으로 포함하는 화장료 조성물로써, 본 발명에 사용된 황근(Hibiscus hamabo )은 아욱과(Malvaceae)에 속한다. 형태학적 특징으로는 높이 1m 내외이고 수피는 옅은 회갈색이고 어린 잔가지에 털이 밀생하고 있다. 잎은 어긋나고 거꾸로 세운 달걀모양이고 길이 3~6cm, 너비 3~7cm로 앞면에 털이 있고 뒷면에는 회백색 털이 있으며 끝이 뾰족하고 가장자리에 잔 거치가 있다. 꽃은 7∼8월에 피고 가지 끝의 잎겨드랑이에 지름 5cm의 노란색 꽃이 피는데 가운데는 짙은 자주색이다. 5개의 꽃받침조각과 5개의 꽃잎을 가지고 수술은 많고 암술대는 5개이며 암술머리는 짙은 자주색이다. 열매는 삭과로 8∼9월에 익으며 길이 2cm의 달걀 모양으로 뾰족하고 노란빛을 띤 갈색 잔털이 있으며 5개로 갈라진다. 주로 우리나라 제주도 바닷가에서 자란다.

본 발명의 황근(Hibiscus hamabo) 잎 추출물은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라, 즉, 통상적인 온도와 압력의 조건하에서, 통상적인 용매를 사용하여 제조될 수 있으나, 바람직하게는 (a) 물, 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올(예를 들면, 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올), 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 글리세린, 아세톤, 디에틸에테르, 에틸 아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, 클로로포름, 헥산 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 용매를 이용한 용매 추출법 (b) 이산화탄소에 의한 감압 및 고온에 의한 초임계 추출법 또는 (c) 초음파 추출법을 이용하여 추출할 수 있다. 본 발명에서는 바람직하게는 추출용매를 이용한 용매 추출법을 이용하였다. 보다 바람직하게는 상기 추출물은 에탄올, 70%(v/v) 에탄올 또는 물을 사용하여 얻어진 것이고, 가장 바람직하게는 70%(v/v) 에탄올을 사용하여 얻어진 것이다. 또한, 본 발명의 황근 잎 추출물은 상술한 추출 용매에 의한 추출물뿐만 아니라, 통상적인 정제 및 발효 과정을 거친 추출물도 포함한다. 예컨대, 이산화탄소에 의한 감압, 고온에 의한 초임계추출법에 의한 추출, 초음파를 이용한 추출법에 의한 추출, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의해 분리하거나 자연 상태나 각종 미생물을 이용한 발효산물에 의한 추출물 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 및 추출방법을 통해 얻어진 활성 분획도 본 발명의 추출물에 포함된다.

본 발명에 따른 황근 잎 추출물은 발효과정을 거친 추출물도 포함하는 데, 황근 잎 발효추출물은 다음과 같이 제조할 수 있다. 황근의 잎을 건조시킨 후 100~500메쉬 정도로 미세하게 파쇄한 다음 통상적인 미생물 배양액을 1~50g/L를 첨가하고 효모 균주 또는 유산균등의 미생물을 10,000~100,000 cfu/L의 양으로 첨가한다. 배양온도는 30~37℃의 통상적인 미생물 배양조건으로 배양한다. pH는 5~7로 호기적 또는 통상 혐기(anaerobic)적인 조건으로 약 5 내지 10일간 배양한다. 이후 숙성 및 여과를 통해 얻을 수 있다. 본 발명에 따르면, 상기 황근 잎 추출물은 화장료 조성물의 전체 중량에 대해서 0.0001 ~ 30.0 중량% 함유되며, 더욱 바람직하게는, 상기 황근 잎 추출물은 화장료 조성물의 전체 중량에 대해서 0.01 ~ 10 중량% 함유되는 것을 특징으로 한다. 상기 추출물의 함량이 0.0001 중량% 미만인 경우에는 피부개선 효과가 나타나지 않으며, 30.0 중량%를 초과하는 경우에는 함유량 증가에 대한 피부 개선 효과 증대 정도가 미미하며, 제형상의 안전 및 안정성에 문제가 있으며 경제적이지도 못하다.

따라서 이러한 다양한 기능을 가진 황근 잎 추출물을 포함하는 본 발명의 화장료 조성물은 우수한 엘라스타제 저해활성, 콜라겐 생합성 효과, MMP-1 생성억제 효과를 갖는 것을 특징으로 한다.

발명의 화장료 조성물에는 상기 유효 성분 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있다. 예컨대, 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다. 본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 팩, 마사지크림 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 계면활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물이 비누, 계면활성제 함유 클렌징 제형 또는 계면활성제 비함유 클렌징 제형일 경우, 피부에 도포한 후 닦아내거나 떼거나 물로 씻어낼 수도 있다. 구체적인 예로서, 상기 비누는 액상비누, 가루비누, 고형비누 및 오일비누이며, 상기 계면활성제 함유 클렌징 제형은 클렌징 폼, 클렌징 워터, 클렌징 수건 및 클렌징 팩이며, 상기 계면활성제 비함유 클렌징 제형은 클렌징크림, 클렌징 로션, 클렌징 워터 및 클렌징 겔이며, 이에 한정되는 것은 아니다.

한편, 본 발명의 화장 방법은 본 발명의 화장료 조성물을 이용하는 모든 화장 방법을 일컫는다. 즉, 화장료 조성물을 이용하는 당업계에 공지된 모든 방법이 본 발명의 화장 방법에 속한다. 본 발명의 화장료 조성물은 단독 또는 중복하여 사용하거나, 본 발명 이외의 다른 화장료 조성물과 중복하여 사용할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 통상적인 사용방법에 따라 사용될 수 있으며, 사용자의 피부 상태 또는 취향에 따라 그 사용횟수를 달리할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다. 하기의 제조예는 상기에서 언급한 (a) 물, 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올(예를 들면, 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올), 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 글리세린, 아세톤, 디에틸에테르, 에틸 아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, 클로로포름, 헥산 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 용매를 이용한 용매 추출법 (b) 이산화탄소에 의한 감압 및 고온에 의한 초임계 추출법 또는 (c) 초음파 추출법, (d)발효공정을 이용하여도 실질적으로 동일한 효과를 나타내는 추출물을 얻어질 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 사실이며, 하기에 언급한 제조예에 한정되는 것은 아니다.

제조예 1 - 황근 잎 추출물 제조

음건한 황근 잎 600g을 70%(v/v) 에탄올 수용액으로 24시간씩 3회 침지 추출을 한 후, 와트만(Whatman) 여과지로 여과하였다. 여과된 추출물을 60℃ 이하에서 감압농축 및 동결 건조하여 42.87g의 황근 잎 추출물을 수득하였으며, 획득한 황근 잎 추출물은 30%(v/v) 에탄올 수용액에 1%(w/v)로 용해하여 하기 실험예에 사용하였다.

제조예 2 - 황근( Hibiscus hamabo ) 줄기-수피 추출물 제조

음건한 황근 수피 300g을 70%(v/v) 에탄올 수용액으로 24시간씩 3회 침지 추출을 한 후, 와트만(Whatman) 여과지로 여과하였다. 여과된 추출물을 60℃ 이하에서 감압농축 및 동결 건조하여 17.25g의 황근 수피 추출물을 수득하였으며, 획득한 황근 줄기-수피 추출물은 30%(v/v) 에탄올 수용액에 1%(w/v)로 용해하여 하기 실험예에 사용하였다.

제조예 3 - 황근( Hibiscus hamabo ) 꽃 추출물 제조

음건한 황근 꽃 400g을 70%(v/v) 에탄올 수용액으로 24시간씩 3회 침지 추출을 한 후, 와트만(Whatman) 여과지로 여과하였다. 여과된 추출물을 60℃ 이하에서 감압농축 및 동결 건조하여 19.11g의 황근 꽃 추출물을 수득하였으며, 획득한 황근 꽃 추출물은 30%(v/v) 에탄올 수용액에 1%(w/v)로 용해하여 실험예에 사용하였다.

실험예 1 - 총 폴리페놀 함량 및 총 플라보노이드 함량 측정

총 폴리페놀 함량은 Gutfinger의 방법을 변형하여 측정하였다. 추출물을 100-1000 ppm 농도로 희석하여 준비한 후 실험에 사용하였고 시료 0.2 mL와 Folin-ciocalteu reagent 0.2 mL를 혼합한 후 상온에서 3분간 반응하였다. 반응 후 2M Na2CO20.4 mL와 증류수 0.2 mL를 혼합한 다음 상온에서 30분간 반응 후 각각의 시료를 96 well plate에 0.2 mL씩 분주하여 725nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 탄닌산(tannic acid)을 이용하였으며 표준물질의 표준곡선으로부터 총 폴리페놀 함량(mg/g)을 계산하였다. 황근 잎 추출물, 줄기 추출물, 꽃 추출물에 존재하는 총 폴리페놀과 플라보노이드 함량을 비교하여 측정한 결과는 표 1에 나타내었다. 황근 잎 추출물의 총 폴리페놀과 총 플라보노이드의 함량은 각각 305.19, 102.11 mg/g으로 나타난 것을 확인하였다. 총 폴리페놀의 경우, 모든 추출물이 200 mg/g 이상의 높은 함량을 함유하지만 황근 잎 추출물이 가장 많은 폴리페놀 및 플라보노이드를 함유한다.

시료명	총 폴리페놀(mg/g)	총 플라보노이드(mg/g)
제조예 1	305.19 ± 18.24	102.11 ± 10.77
제조예 2	251.27 ± 12.19	68.24 ± 4.65
제조예 3	237.66 ± 14.29	55.54 ± 5.12

실험예 2 - DPPH 라디칼 소거능 측정

상기 제조예 1 내지 3의 황근 잎, 줄기, 꽃 추출물에 대하여 항산화 효과를 측정하기 위해 실험실 조건에서 L-Ascorbic acid를 비교샘플로 하여 DPPH법을 이용하여 항산화 활성을 측정하였다. DPPH법은 DPPH(2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl) 프리라디칼이라는 유리기를 사용하여 환원력에 의한 항산화 활성을 측정한다. 피검물질에 의해 DPPH가 환원되어 흡광도가 감소하는 정도를 공시험액의 흡광도와 비교하여 파장 560nm에서 자유라디칼 소거율을 측정한다. 사용한 시약은 2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl 프리라디칼(Aldrich Chem. Co., MW=618.76) 0.2mM 용액으로서 메탄올에 용해하여 100mL로 한다, 측정방법으로서, 96-웰 플레이트에 0.2mM DPPH 용액 0.15mL과 시료용액 0.15mL를 가하여 빨리 교반하고 25℃에서 10분간의 배양을 개시한다. 그 후 560nm에서의 흡광도 St를 측정한다. 공시험은 시료용액 대신에 증류수를 사용한 것을 상기와 똑같이 조작해 흡광도 Bt를 측정한다. 시료용액의 블랭크(Blank)는 0.2mM DPPH 용액 대신에 메탄올을 사용해 똑같이 조작하여 흡광도 Bo를 측정한다.

결과는 수학식 1에 의하여 산출하였으며, 라디칼 소거율이 50%가 되는 추출물의 농도(ppm)를 표 2에 기재하였다. 비교군으로써 L-아스코르브산(L-ascorbic acid)를 사용하였다.

St : 시료용액의 자유라디칼 소거 후의 560nm에서의 흡광도

Bt : 공시험용액의 자유라디칼 소거 후의 560nm에서의 흡광도

So : 시료용액의 자유라디칼 무첨가시 반응 전의 560nm에서의 흡광도

Bo : 공시험용액의 자유라디칼 무첨가시 반응 전의 560nm에서의 흡광도

시료명	SC ₅₀ (ppm)
L-아스코르브산	5.22 ± 1.14
제조예 1	62.16 ± 9.87
제조예 2	71.17 ± 10.65
제조예 3	66.28 ± 8.46

상기 표 2를 보면, 제조예 1의 황근 잎 추출물이 가장 효능이 좋은 것을 확인할 수 있다.

실험예 3 - 콜라게나제 ( Collagenase ) 저해활성 측정

콜라게나제 저해활성 측정은 Wunsch 등의 방법에 따라 측정하였다. 즉 반응구는 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 7.5)에 4 mM CaCl₂를 첨가하여, 4-phenylazobenzyloxycarbonyl-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg(300ppm)를 녹인 기질액 0.25 mL 및 시료용액 0.1 mL의 혼합액에 콜라게나제(200ppm) 0.15 mL를 첨가하여 실온에서 20분간 방치한 후 6% 시트르산(citric acid) 0.5 mL을 넣어 반응을 정지시킨 후, 에틸 아세테이트(ethyl acetate) 1.5 mL을 첨가하여 320nm에서 흡광도를 측정하였다. 콜라게나제 저해활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다. 결과를 표 3에 나타내었다. 비교군으로써 뷰틸레이티드 하이드록시애니졸(butylated hydroxyanisol)을 사용하였다.

시료명	처리농도(ppm)	콜라게나제 억제율( % )
뷰틸레이티드 하이드록시애니졸	500	83.11 ± 5.15
제조예 1	100	21.41 ± 4.62
	500	62.79 ± 6.25
	1000	85.29 ± 7.51
제조예 2	100	15.11 ± 2.21
	500	55.88 ± 4.19
	1000	77.47 ± 5.89
제조예 3	100	11.27 ± 3.99
	500	42.31 ± 4.16
	1000	66.13 ± 5.88

실험예 4 - 엘라스타제 ( Elastase ) 저해활성 측정

엘라스타제(Elastase)는 진피 내 피부탄력을 유지시키는 데 중요한 기질인 엘라스틴을 분해하는 효소이다. 또한, 엘라스타제는 다른 중요한 기질단백질인 콜라겐(collagen)을 분해할 수 있는 비특이적 가수분해 효소이다. 따라서 엘라스타제 저해제는 피부 주름을 개선하는 작용을 나타내며, 우소르산(ursolic acid) 등이 엘라스타제 저해제로서 이용되고 있다. 엘라스타제는 동물 결합조직의 불용성 탄성 섬유 단백질인 엘라스틴(elastin)을 분해시켜 피부의 진피조기의 그물망 구조 결합을 끊어줌으로서 주름생성의 주원인인 효소로 알려져 있다. 피부의 진피 조직 속에는 콜라겐과 피부의 탄력성에 관련된 엘라스틴이 그물망 구조를 형성하고 있는데, 이러한 그물망 구조가 깨어지면서 즉 엘라스틴이 엘라스타제에 의해 분해되어 피부가 처지고 주름이 생기므로 내인성 피부노화가 발생한다. 그러므로 피부노화의 주원인 중의 하나인 엘라스틴 분해효소인 엘라스타제의 활성을 저하시킴으로서 피부노화를 억제할 수 있다. 기질로서 N-succinyl-(L-Ala)3-p-nitroanilide, S4760, Sigma)를 사용하여 37℃에서 20분간 기질로부터 생성되는 p-nitroanilide의 생성량을 445nm에서 측정하였다. 즉, 각 시험용액을 일정 농도가 되도록 조제하여 500μL씩 시험관에 취하고, 2mM tris-HCl 버퍼(pH8.6)에 녹인 porcine pancreas elastase(E1250, Sigma)2.5U/mL)용액 500μL을 가한 후 기질로 50mM tris-HCl 버퍼pH8.6)에 녹인 N-succinyl-(L-Ala)3- p-nitroanilide(500μg/mL)을 첨가하여 20분간 반응시켜 측정하였다. 엘라스타제 저해활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 하기 수학식 2에 따라 계산하여 나타내었다.

시료명	처리농도(ppm)	엘라스타제 저해율( % )
아데노신	500	71.21
제조예 1	100	24.11
	500	57.74
	1000	68.54
제조예 2	100	16.28
	500	48.21
	1000	55.33
제조예 3	100	10.08
	500	24.17
	1000	41.54

표 4를 보면, 제조예 1의 황근 잎 추출물이 우수한 엘라스타제 저해활성을 나타내었으며 이를 통하여 황근 잎은 주름 개선 소재로써의 이용가능성을 확인 할 수 있었다.

실험예 5 - ELISA kit를 이용한 콜라겐(collagen) 생합성 측정 결과

인간 섬유아세포(Normal Human dermal Fibroblast)를 37℃, 5% CO₂배양기에서 일정한 습도를 유지하는 세포 배양기 내에서 10% FBS, Penicillin(50U/ml), Streptomycin(50/ml)를 함유하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Gibco, USA)으로 배양하여, 1× 10⁵개/ml로 24 well plate에 500 μl씩 분주한 다음 24시간 배양하였다. 섬유아세포에서 콜라겔 타입 I(collagen type I)의 정량은 'Procollagen Type I c-peptide EIAkit(TaKaRa, japan)'를 이용하여 효소면역분석법 (immunosorbent assay, ELISA)으로 실시하였는데, 분석을 위해 48시간 동안 배양한 상기의 세포 배양 상등액을 조심스럽게 수집하였다. 먼저 'Procollagen Type I cpeptide와 결합하는 항체 (antibody)가 코팅된 스트립(strip)에 48시간 배양된 배양 상등액을 각각 100 μl씩 첨가하고 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 워싱 버퍼(washing buffer)를 이용하여 3회 세척하여 미반응 물질을 제거한 다음, 여기에 블라킹 버퍼(Blocking buffer) 100 μl씩 넣고, 다시 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 워싱 버퍼(washing buffer)를 이용하여 3회 세척하여 미반응 물질을 제거하고, 'Procollagen Type I c-peptide'와 결합하는 또 다른 항체에 POD가 콘쥬게이트(conjugate)된 용액(Antiobody-POD conjugate solution) 100 ul씩 넣고 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 워싱 버퍼(washing buffer)를 이용하여 3회 세척하여 미반응 물질을 제거하고, 동량의 기질 (substrate) 용액 넣고, 30분간 반응시킨 다음 정지용액(stop solution, 1N H2SO4)을 넣고 실험을 종료하였다. 실험이 종료된 스트립(strip)을 450 nm에서 흡광도를 측정하여 콜라겐 표준품과 비교하여 새로 합성된 콜라겐 양을 PICP 양으로 측정하였으며 PICP양은 ng/2x10⁴세포로 환산하여 콜라겐의 합성효과를 표 5에 나타내었다.

시료명	처리농도	콜라겐 합성량 (ng/ 2x10 ⁴ cell )
TGF-β	200nM	159
제조예 1	10ppm	121
	50ppm	144
	100ppm	168
제조예 2	10ppm	117
	50ppm	126
	100ppm	142
제조예 3	10ppm	108
	50ppm	121
	100ppm	136

실험예 6 - MMP -1 생성 억제 효과

본 실험예 6은 상기 제조예 1 내지 3에서 수득한 황근 잎, 줄기, 꽃 추출물을 이용하여 콜라겐 분해효소인 MMP-1 생성을 억제하는 효과가 있는지 여부를 측정하기 위해, MMP-1의 생성을 억제하는 효과가 있는 것으로 알려진 물질인 TGF-β(10ng/ml, Roche, 미합중국)를 비교군으로 하여 MMP-1의 생성을 억제하는 효과를 측정하였다. 인간 정상 피부 세포인 섬유아세포 (한국 세포주 은행, 대한민국)를 48-웰 마이크로 플레이트(Nunc, 덴마크)에 각 웰당 1× 10⁶세포가 되도록 접종하고, DMEM 배지(Sigma, 미합중국) 및 37℃의 조건에서 24시간 동안 배양한 후 상기 제조예 1 내지 3의 황근 잎, 줄기, 꽃 추출물의 농도를 각각 100 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖로 첨가한 무혈청 DMEM 배지 및 대조군으로 추출물이 포함되지 않은 무혈청 DMEM 배지에서 48시간 동안 추가로 배양하였다. 배양 후, 각 웰의 상층액을 모아 MMP-1 분석 킷트(Amersham,미합중국)를 이용하여 새로 합성된 MMP-1의 양(ng/㎖)을 측정하고, 하기 수학식 3에 따라 MMP-1 생성 저해율(%)을 계산하였으며, 그 결과를 표 6에 나타내었다.

시료명	처리농도	MMP -1 생성 저해율( % )
TGF-β	200nM	66.31
제조예 1	100 ppm	33.52
제조예 1	200 ppm	48.15
제조예 2	100 ppm	21.71
제조예 2	200 ppm	42.14
제조예 3	100 ppm	14.59
제조예 3	200 ppm	35.97

상기 실험예를 통해 본 발명의 황근 잎 추출물이 엘라스타제(Elastase) 저해활성, 콜라겐 합성 증진 효과 및 MMP-1 생성억제 효과가 뛰어남을 확인하였다. 이에, 본 발명의 황근의 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료를 제조하여 처방예를 제시하나 본 발명의 화장료 조성물이 이 처방예에 한정되는 것은 아니다.

제형예 1 - 화장수

황근 잎 추출물을 함유한 화장료중 화장수의 제형예는 아래와 같다.

성분	함량(단위:중량%)
제형예1	함량(단위:중량%)
황근 잎 추출물(제조예 1) 글리세린 1.3-부틸렌글리콜 피이지1500 알란토인 DL-판테놀 EDTA-2Na 벤조페논-9 소듐 히아루로네이트 에탄올 옥틱도데세스-16 폴리솔베이트 20 방부제, 향, 색소 증류수	2.0 5.0 3.0 1.0 0.1 0.3 0.02 0.04 5.0 10.0 0.2 0.2 미량 잔량
합계	100

제형예 2 - 크림

황근 잎 추출물을 함유한 화장료 중 크림의 제형예는 아래와 같다.

성분	함량 (단위:중량%)
제형예2	함량 (단위:중량%)
황근 잎 추출물(제조예 1) 친유형 모노스테아린산글리세린 세테아릴알콜 스테아린산 밀납 폴리솔베이트 60 솔비탄스테아레이트 경화식물유 스쿠알란 광물유 트리옥타노인 디메치콘 소듐마그네슘실리케이트 글리세린 베타인 트리에타올아민 소듐히아루로네이트 방부제, 향, 색소 증류수	2.0 2.0 2.2 1.5 1.0 1.5 0.6 1.0 3.0 5.0 5.0 1.0 0.1 5.0 3.0 1.0 4.0 미량 잔량
합계	100

제형예 3 - 에센스

황근 잎 추출물을 함유한 화장료중 에센스의 제형예는 아래와 같다.

성분	함량 (단위:중량%)
제형예3	함량 (단위:중량%)
황근 잎 추출물(제조예 1) 글리세린 베타인 피이지 1500 알란토인 DL-판테놀 이.디.티.에이-2Na 벤조페논 - 9 히드록시에칠 셀룰로오스 소듐히아루로네이트 카르복시비닐폴리머 트리에탄올아민 옥틸도데칸올 옥틸도데세스 -16 에탄올 방부제, 향, 색소 증류수	2.0 10.0 5.0 2.0 0.1 0.3 0.02 0.04 0.1 8.0 0.2 0.18 0.3 0.4 6.0 미량 잔량
합계	100

실시예 1: 황근 잎 추출물을 함유하는 화장료의 주름 개선 효과 평가

본 발명의 황근 잎 추출물을 함유하는 화장료의 주름 개선 효과를 실제 사용 테스트를 통하여 평가하였다. 황근 잎 추출물을 2%(v/v)를 함유하고 있는 제형예 2의 크림과, 제형예 2의 크림에서 추출물을 정제수로 대체한 비교예의 크림을 사용해 평가하였다. 30명의 30-40세 여성을 무작위로 2개군으로 나누어 제형예 2와 비교예의 크림을 매일 아침 저녁 2회씩 세안 후 크림 적당량을 눈가를 중심으로 2개월간 연속적으로 바르게 하였다. 각 피검자의 주름 개선 효과를 육안 관찰을 통하여 평가하였다. 실험 결과는 하기의 표 10에 나타낸 바와 같다.

구분	주름개선효과 우수	주름개선효과 약간	주름개선 효과 없음
제형예 2	15	10	5
비교예의 크림	4	5	21

표 10을 보면, 본 발명의 황근 잎 추출물을 함유한 화장료는 황근 잎 추출물을 함유하지 않은 비교예에 비하여 높은 주름개선 효과를 나타내었으며, 본 발명의 화장료를 피부에 도포한 부분의 피검자들에서 피부 자극을 관찰할 수 없었다.

실시예 2: 황근 잎 추출물을 함유하는 화장료의 피부 탄력 개선 효과 평가

본 발명의 화장료의 피부 탄력 효과를 실제 사용 테스트를 통하여 평가하였다. 황근 잎 추출물을 각각 2%(v/v) 함유하고 있는 제형예 2의 영양 크림과 제형예 2에서 황근 잎 추출물을 정제수로 대체한 비교예의 크림을 사용해 평가하였다. 30명의 30-40세 여성을 무작위로 2개군으로 나누어 제형예 2와 비교예의 크림을 매일 아침 저녁 2회씩 세안 후 크림 적당량을 양볼을 중심으로 2개월간 연속적으로 바르게 하였다. 각 피검자의 피부 탄력 개선 효과를 Cutometer(C+K,독일)를 이용하여 탄력 증진 유무를 평가하였다. 실험 결과는 하기의 표 11에 나타낸 바와 같다.

	탄력개선효과 우수	탄력개선효과 약간	탄력개선 효과 없음
제형예 2	16	9	5
비교예의 크림	2	7	21

표 11을 보면, 본 발명의 황근 잎 추출물을 함유한 제형예 2의 크림은 황근 잎 추출물을 함유하지 않은 비교예의 크림에 비하여 높은 피부 탄력 증진 효과를 보여주었으며, 본 발명의 화장료를 피부에 도포한 부분의 피검자들에게서 피부 자극을 관찰할 수 없었다.

Claims

황근(Hibiscus hamabo) 잎 추출물을 유효성분을 포함하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 황근 잎 추출물을 화장료 조성물의 총 중량에 대하여 0.0001 ~ 30.0 중량%로 함유하는, 피부 주름 개선용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 황근 잎 추출물은 물, 탄소수 1-4개의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 에틸 아세테이트 및 부틸 아세테이트로 구성된 군으로부터 선택되는 추출용매로 추출된 것인, 피부 주름 개선용 화장료 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 젤, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형을 갖는, 피부 주름 개선용 화장료 조성물.