KR20100008831A - 락토바실러스 카제이 배양물을 유효성분으로 함유하는항암용 조성물 - Google Patents

락토바실러스 카제이 배양물을 유효성분으로 함유하는항암용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei spp.) 배양물을 유효성분으로 함유하는 항암용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 탄소원, 질소원, 인원 등을 함유한 배양배지에서 락토바실러스 카제이를 배양한 다음 상기 균주를 제거한 배양물을 유효성분으로 함유하는 항암용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei)의 배양물은 항암활성이 우수하여 항암용 조성물의 유효한 성분으로 효과적으로 이용될 수 있다. 특히 효용가치가 없어 버려지는 유산균 배양물이 상기와 같은 활성이 있음을 규명함으로써 본 발명은 산업적으로 활용 가치가 매우 크다.
락토바실러스 카제이, 항암, 조성물, 배양물

Description

락토바실러스 카제이 배양물을 유효성분으로 함유하는 항암용 조성물{Anti-cancer composition comprising a culture fluid of lactobacillus casei as an effective component}
본 발명은 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei spp.) 배양물을 유효성분으로 함유하는 항암용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 탄소원, 질소원, 인원 등을 함유한 배양배지에서 락토바실러스 카제이를 배양한 다음 상기 균주를 제거한 배양물을 유효성분으로 함유하는 항암용 조성물에 관한 것이다.
유산균(lactic acid bacteria)은 탄수화물을 분해를 하고, 이를 이용하여 유산을 만드는 세균으로서, 산소가 적은 곳에서 잘 증식하는 통성 혐기성균 또는 편성 혐기성균이다. 유산균은 5개 속으로 구분할 수 있는데, 스트렙토코커스(Streptococcus), 락토바실러스(Lactobacillus), 루코노스탁(Leuconostoc), 비피도박테리아(Bifidobacteria), 그리고 페디오코커스(Pediococcus)로 나뉜다. 연쇄상 구균인 스트렙토코커스 속 미생물은 동형발효균으로, 우유를 발효시켜 유산을 생성함으로써 부패균이나 병원균을 억제하는 것으로 알려져 있다. 락토바실러스 속 미 생물은 동형 또는 이형발효를 하는 유산간균으로, 유제품이나 채소의 발효과정에서 흔히 볼 수 있는 균이며, 쌍구균인 루코노스탁 속 미생물은 이형 발효를 하며 채소류의 발효에 주로 관여한다. 또한, 비피도박테리아 속 미생물은 산소가 있는 곳에서는 생육하지 못하는 편성 혐기성균으로, 당을 발효하여 유아에게 유용하게 대사될 수 있는 L(+)형의 유산을 생성한다. 마지막으로, 페디오코커스 속 미생물은 사련균의 형태를 가지는 동형 발효균으로, 김치나 절임 식품에 존재하며 소시지 등의 육류 발효에 관여한다.
유산균은 장내 pH를 산성으로 유지시켜 대장균이나 크로스트리디움(Clostridium sp.)과 같은 유해균의 번식을 억제하고 설사와 변비를 개선할 뿐 아니라, 비타민 합성, 항암작용, 혈청 콜레스테롤 저하 등의 역할을 한다. 특히, 유산균은 장의 점막과 상피세포에 강하게 결합할 수 있는 특정 단백질을 가지고 있어 유해 세균의 성장을 막는 정장 작용에 많은 도움을 준다. 또한, 유산균은 대식세포의 증식을 촉진하여 대식세포의 장내 유해 세균에 대한 인지능력, 살균능력 등을 강화시키고, 면역 관련 물질의 분비를 촉진하여 면역증강 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다(Gabriela perdigon et al., J. of food Protection 53:404-410, 1990; Katsumasa sato et al., Microbiol. Immunol., 32(7):689-698, 1988). 그 중에서도 락토바실러스 속 미생물은 애시도필린(acidophillin)을 생산하여 이질균, 살모넬라균, 포도상구균 등의 유해균의 성장을 저해하고, 설사 원인균의 증식을 억제하여 장내균총을 정상화함으로써 설사를 멈추게 하는 작용을 하는 것으로 알려져 있다.
특히 최근에는 유산균의 항암활성에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 이러한 연구 성과를 예를 들어 살펴보면, 락토바실러스 불가리커스(Lactobacillus bulgaricus ), 락토바실러스 애시도 필러스(Lactobacillus acidophilus) 및 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus)가 쥐에서 DMH에 의해 유발되는 종양의 빈도를 감소시켰다(Shakelford et al., Nutr. Cancer 5:159-1647, 1983). 락토바실러스 불가리커스에 의해 발효된 유제품은 쥐에서 DMH에 의해 유발되는 암화과정과 햄스터(hamster)에서 DEN(diethylnitrosamine)에 의해 유발되는 상부 호흡 기관의 암화과정을 억제하였다(Balansky et al., Cancer Lett., 147:125-137, 1999). 비피도박테리움 인판티스 균주(Bifidobacterium infantis ATCC 15697)로부터 분리된 펩티도글라이칸(peptidoglycan)을 단회 피하 주사함으로써 종양(syngeneic fibrosarcoma, Meth A in Balb/c mice)이 억제되었다(Sekine et al., Cancer Res., 45:1300-1307, 1985). 락토바실러스 헬베티쿠스 배양액으로부터 유래한 다당류 분획은 종양(sarcoma 180) 억제 효과가 있었으며, 당단백질은 자궁 경부암 세포주에서 세포 독성 효과를 보였다(Oda et al., Agri. Biol. Chem., 47:1623-1625, 1983; Manjunath et al., Indian Journal Exp.Biol., 27:141-145, 1989). 또한, BCG(Bacillus Calmette-Guerin)로부터 유래한 대식 세포구 활성화 물질에 의해 대식 세포 종양 세포주가 억제되었다(Ralph et al., Nature, 249:49-51, 1974; Ralph et al., Cancer Res., 37:546-550, 1977).
그러나 상기 연구 성과들은 항암활성이 있는 주된 화합물이 세포벽의 펩티도글라이칸이라 보고하고 있다(Fichera, G. A., and Giese, G., Cancer Lett ., 85:93-103, 1994). 이외에도 엔테로코커스 파에칼리스(Enterococcus faecalis )의 세포벽 성분이 종양세포 증식억제 효과가 있다고 보고된 바 있다(Nomoto, K., Biotherapy, 1:169-177, 1989; Park, S.J. et al., Kor. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 27:8-14, 1999).
그러나 유산균의 배양물이 상기와 같은 우수한 항암활성이 있는 것에 대해서는 알려진 바가 전혀 없다. 특히 상기와 같이 유산균에 대하여 연구/개발/이용이 활발하게 이뤄지고 있는 반면에 많이 생산되고 버려지는 것이 바로 유산균 배양물이다. 따라서 유산균의 배양물이 상기와 같은 활성이 있다면 산업적으로 활용 가치가 매우 크다고 할 것이다.
이에 본 발명자들은 락토바실러스 카제이 균주가 우수한 항암활성이 있음을 규명하였으며, 특히 상기 균주 자체가 아닌 그의 배양물을 다양한 암세포에 적용한 결과 암세포의 증식을 현저하게 억제하여 상기 배양물이 우수한 항암활성이 있음을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 락토바실러스 카제이의 배양물을 유효성분으로 함유하는 항암용 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 락토바실러스 카제이의 배양물을 유효성분으로 함유하는 항암용 조성물을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 항암용 조성물은 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei spp.)의 배양물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 락토바실러스 카세이는 당업계에서 일반적으로 사용되는 유산균주 일 수 있으며, 바람직하게는 락토바실러스 카세이 ATCC 334, ATCC 393, ATCC 11578, KCTC 3109, KCTC 3189, DSM 20011, DSM L26 10633일 수 있다.
상기 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) 균주의 배양물은 종래 유산균의 배양 방법에 의한 것이라면 어떠한 방법에 의해서도 상기 균주를 배양한 다음 균주를 제거하여 수득될 수 있다.
상기 유산균의 배양은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 이러한 다양한 배양 방법은 다양한 문헌(예를 들면, James et al., Biochemical Engineering, Prentice-Hall International Editions)에 개시되어 있다. 세포의 성장방식에 따라 현탁배양과 부착배양을 배양방법에 따라 회분식과 유가식 및 연속배양식의 방법으로 구분된다.
배양에 사용되는 배지는 특정한 균주의 요구조건을 적절하게 만족시켜야 하다. 상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 사용될 수 있는 탄소원의 예에는, 포도당, 자당, 유당, 과당(fructose), 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유와 같은 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리셀롤 및 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 탄소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원의 예에는, 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아추출물, 옥수수 침지액(CSL), 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄과 같은 무기 질소원이 포함된다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서, 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 또한, 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 그 외에, 아미노산, 비타민, 및 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 적절한 방식으로 첨가하여, pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 호기상태를 유지하기 위하여, 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입할 수도 있다. 배양시의 온도는 보통 20 ℃ 내지 45 ℃, 바람직하게는 25 ℃ 내지 40 ℃이며, 10시간 내지 40시간 동안 배양할 수 있다.
배양 종료 후에 배양물과 균체를 분리하기 위해 원심분리(centrifugation) 또는 여과(filtration)과정을 거칠 수 있으며 이러한 단계는 당업자가 필요에 따라 수행할 수 있다. 이 때, 균체의 제거는 통상적인 균체의 제거를 위한 방법을 통해 락토바실러스 카제이가 실질적으로 제거된 것을 나타낸다.
보다 구체적으로 본 발명의 배양물은
(a) 락토바실러스 카세이를 포도당, 자당, 유당, 과당(fructose), 말토즈, 전분, 셀룰로즈, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산, 글리세롤, 에탄올 및 아세트산으로 이루어진 군에서 선택된 탄소원; 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아추출물, 옥수수 침지액(CSL), 대두밀, 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄으로 이루어진 군에서 선택된 질소원; 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 인산이수소나트륨 및 인산수소이나트륨으로 이루어진 군에서 선택된 인원을 포함하는 배지에서 20 ℃ 내지 45 ℃로 10시간 내지 40시간 동안 배양하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계에서 배양된 배지에서 락토바실러스 카세이를 제거하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다.
아울러, 상기 (a) 단계에서의 배지는 금속염, 아미노산 또는 비타민을 추가로 포함할 수도 있다.
바람직하게는 배양을 위한 배지는 포도당(Glucose), 콩-펩톤 A3(Soy-peptone A3), 효모 추출물(yeast extract), K2HPO4, 아세트산 나트륨(sodium acetate), 시트르산 이암모늄(diammonium citrate), MgSO4, MnSO4를 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) 균주 를 회분 배양 방법으로 배양함으로써 제조하였다(<실시예 1> 참조).
본 발명자들은 상기와 같은 방법으로 수득한 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) 균주의 배양물에서 항암 활성이 있는 성분을 구체적으로 규명하기 위해, 상기 배양물을 이온교환수지를 이용하여 전처리하고 항산암모늄을 투여하여 단백질 성분을 침전시키고 버퍼를 이용하여 용해시켜 단백질을 분리하였다(<실시예 2-1> 참조).
상기 분리된 단백질을 분획분자량이 3, 10, 30, 100 kDa인 한외 여과막(ultrafiltration membrane)을 이용하여 농축하여 3~100kDa, 10~30kDa 크기의 단백질을 각각 농축하였다(<실시예 2-2> 참조).
상기 농축된 농축물에서 항암활성을 가지는 단백질을 정제하기 위해서, FPLC를 수행하여 3~100kDa, 10~30kDa의 분획에서 항암활성을 가지는 단백질 성분을 수득하였다(<실시예 2-3> 참조).
상기 수득된 3~100kDa의 분획에서 항암활성을 가지는 단백질 성분을 위암세포(AGS), 폐암세포(A549), 유방암 세포(MCF-7), 난소암 세포(SK-OV-3) 및 대장암 세포(LoVo)에 투여한 결과, 정상세포에 대한 세포독성은 나타내지 않았지만, 모든 암세포주에 대해 50%이상의 우수한 항암 활성을 나타내었다(<실험예> 참조). 또한 10~30kDa의 분획에서 항암활성을 가지는 단백질 성분을 동일하게 실험한 결과, 정상세포에 대한 세포독성 효과는 없으면서 60%이상 높은 항암 활성을 나타내었다.
따라서 상기 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) 또는 상기 균주의 배양물은 항암용 조성물의 유효성분으로 효과적으로 이용될 수 있다. 상기 암은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 위암, 폐암, 유방암, 난소암 및 대장암으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 암인 것을 특징으로 한다.
상기 항암용 조성물은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 약학적 조성물 또는 식품 조성물을 말한다.
상기 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양의 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei)의 배양물을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.
상기에서 “약학적으로 유효한 양”이란 암을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 말한다. 본 발명에 따른 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) 또는 상기 균주의 배양물의 약학적으로 유효한 양은 0.1 ~ 100mg/day/체중kg, 바람직하게는 1 ~ 10 mg/day/체중kg이다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 암의 종류 및 이의 중증정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.
상기에서 “약학적으로 허용되는”이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 약학적 조성물에는 담체, 부형제 및 희석제를 추가적으로 포함할 수 있으며 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록 시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
상기 약학적 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 암을 예방 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 락토바실러스 카제이의 배양물은 암의 예방 또는 치료 목적으로 식품 조성물의 유효성분으로 이용될 수 있다.
본 발명에서 사용한 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) 균주는 식품 등급으로 사용할 수 있어 독성을 제거하기 위한 별도의 정제 과정 없이도 안전하게 섭취할 수 있는 이점이 있으므로, 암 세포주 억제 활성을 갖는 락토바실러스 카제이의 배양물을 식품에 첨가하여 섭취하게 되면 항암효과를 얻을 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다. 예를 들면, 건강식품으로는 본 발명의 락토바실러스 카제이의 배양물을 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 기능성 식품으로는 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지 콘비이 프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치이즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명에 따른 락토바실러스 카제이의 배양물을 첨가하여 제조할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 락토바실러스 카제이의 배양물이 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다. 본 발명의 식품 조성물 중 락토바실러스 카제이의 배양물의 바람직한 함유량으로는 식품 100g당 약 0.01~90g이다.
본 발명에 따른 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei)의 배양물은 항암활성이 우수하여 항암용 조성물의 유효한 성분으로 효과적으로 이용될 수 있다. 특히 효용가치가 없어 버려지는 유산균 배양물이 상기와 같은 활성이 있음을 규명함으로써 본 발명은 산업적으로 활용 가치가 매우 크다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1>
락토바실러스 카제이( Lactobacillus casei 배양물의 제조
락토바실러스 카세이 균주(DSM L26 10633)를 배양하기 위하여 배지(Glucose 4.0%, Soy-peptone A3 1.5%, yeast extract 1.0%, K2HPO4 0.1%, sodium acetate 0.1%, diammonium citrate 0.1%, MgSO4 0.01%, MnSO4 0.005%)를 제조하고 여기에 락토바실러스 카세이 균주를 접종(초기 접종농도 0.5%)하여 37℃에서 약 13~14시간동안 배양하였다. 배양시의 pH는 5.5~6.5로 조절하였다.
상기와 같이 배양한 다음 락토바실러스 카제이 균주를 제거하고 배양물만을 수득하기 위해, 원심분리기를 이용하여 8000× g로 20분간 원심 분리하고 0.45μm크기의 공극막(pore membrane, Millipore, Bedford, Mass.)을 통과시켜 균체가 포함되지 않은 배양물만을 수득하였다.
< 실시예 2>
락토바실러스 카제이의 배양물에서 항암활성이 있는 단백질의 분리 및 정제
<2-1> 락토바실러스 카제이의 배양물에서 항암활성이 있는 단백질의 분리
상기 <실시예 1>에서 제조된 락토바실러스 카제이 균주의 배양물을 양이온 교환수지(SK-104, 강산, Na+형), 음이온교환수지(PA-412, 강염기, Cl-형) 및 합성이온교환수지(HP-20)를 이용하여 전처리하고, 상기 전처리된 배양물에 황산암모늄(ammonium sulfate)을 최종농도 70%가 되도록 4℃에서 4시간동안 투여하여 교반하였다. 상기 교반 후, 4℃에서 8,000× g로 20분간 원심 분리하여 단백질을 침전시키고, 침전된 단백질을 50mM Tris-HCl 버퍼(pH 7.0)로 용해시켜 단백질을 분리하였다.
<2-2> 락토바실러스 카제이의 배양물에서 항암활성이 있는 단백질의 농축
상기 <실시예 2-1>에서 분리된 단백질을 농축하기 위하여, 분획분자량이 3, 30, 100 kDa인 한외 여과막(ultrafiltration membrane)을 사용하였으며 250ml Ultrafiltration kit(Milipore)이용하여 농축하였다. 농축순서는 100kDa 한외 여과막을 사용하여 통과하는(flow-through) 용액을 받았다. 상기 용액을 다시 3kDa, 10kDa, 30kDa 한외 여과막을 사용하여 상등액을 획득하였다.
<2-3> 락토바실러스 카제이의 배양물에서 항암활성이 있는 단백질의 정제
상기 <실시예 2-2>에서 농축된 농축물에서 항암활성을 가지는 단백질을 정제하기 위해서, FPLC(fast protein liquid chromatography, sephadex 75)을 수행하였다. 구체적으로 버퍼로 0.05M의 인산염 및 0.15M 염화나트륨이 혼합된 pH 7.2의 용액을 사용하고, 유속을 0.5㎖/분으로 유지하였으며 시료양은 1㎖(2~4㎎/㎖)로 하고 칼럼은 Superdex 75(분리능 Mr= 3,000~70,000)를 사용하여 수행하여 3~100kDa, 10~30kDa의 분획에서 항암활성을 가지는 단백질 성분을 수득할 수 있었다.
< 실험예 >
락토바실러스 카제이의 배양물에서 정제된 단백질의 항암활성
신장정상세포(293)를 대조군으로 하고 위암세포(AGS), 폐암세포(A549), 유방암 세포(MCF-7), 난소암 세포(SK-OV-3) 및 대장암 세포(LoVo)를 24웰-플레이트에 900㎕씩 첨가하고 24시간 동안 배양(37℃, 5% CO2)하였다. 상기 배양 후 상기 <실시예 2>에서 분리 정제된 단백질 100㎕씩 첨가하고 24시간 동안 추가 배양(37℃, 5% CO2)하였다. 상기 배양 후, MTT(0.5㎎/㎖)용액을 100㎕씩 추가 첨가하여 4시간 동안 다시 배양(37℃, 5% CO2)하였다. 상기 배양 후, 흡입기(aspirator)를 이용하여 상등액을 제거하고 300㎕의 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 첨가하여 생성된 포르마잔(formazan)을 용해시킨 다음, ELISA reader를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다.
상기 흡광도 측정 결과를 바탕으로 암세포 생육 억제활성을 하기 식을 이용하여 계산하고 그 결과를 하기 표 1 및 표 2에 기재하였다. 각각의 분획은 FPLC (Sephadex 75) 0.5ml/min, 3ml/fraction으로 회수하였다..
억제 활성(Inhibition ratio(%)) = (1-T/C)ⅹ100
(T : 시료첨가구의 흡광도, C : 무첨가구의 흡광도)
3~100kDa 분획에서 분리된 단백질의 항암활성(저해율%)
Fraction number 3번 4번 5번 6번 7번 8번 9번
신장정상세포 53± 2 0 0 0 0 40± 1 47± 2
위암세포 0 0 3± 1 4 55± 4 6± 2 0
폐암세포 0 0 0 0 63± 1 9± 2 0
유방암세포 2 0 6 8± 3 64± 2 0 0
난소암세포 0 0 4 10± 5 63± 1 5 5
대장암세포 0 0 0 0 64± 2 5 7
10~30kDa 분획에서 분리된 단백질의 항암활성(저해율%)
Fraction number 3번 4번 5번 6번 7번 8번 9번
신장정상세포 54± 2 17± 5 42± 4 0 0 53± 3 52± 5
위암세포 18± 4 16± 4 6± 3 14± 2 65± 5 0 0
폐암세포 0 6± 2 0 0 72± 1 0 0
유방암세포 15± 3 15± 5 0 16± 3 70± 2 3± 1 0
난소암세포 14± 2 10± 4 0 0 73± 1 7± 2 0
대장암세포 0 0 0 5± 1 67± 1 0 0
상기 표 1에 기재된 바와 같이, 3~100kDa 분획에서 분리된 단백질의 항암활성을 조사한 결과, 7번 분획에서 정상세포에 대한 세포독성은 나타내지 않았지만, 모든 암세포주에 대해 50%이상의 항암 활성을 나타내었다. 또한 상기 표 2에 기재된 바와 같이, 10~30kDa 분획에서 분리된 단백질의 항암활성을 조사한 결과, 7번 분획에서 정상세포에 대한 세포독성 효과는 없으면서 60%이상 높은 항암 활성을 나타내었다. 따라서 10~30kDa의 단백질 농축액 중 7번 분획(5-20kDa)이 항암 활성을 지니고 있는 물질임을 확인하였다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei)의 배양물은 항암활성이 우수하여 항암용 조성물의 유효한 성분으로 효과적으로 이용될 수 있다. 특히 효용가치가 없어 버려지는 유산균 배양물이 상기와 같은 활성이 있음을 규명함으로써 본 발명은 산업적으로 활용 가치가 매우 크다.
도 1은 본 발명의 배양물의 FPLC 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 배양물 중 3 내지 100kDa 부분의 FPLC 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 배양물 중 10 내지 30kDa 부분의 FPLC 결과를 나타낸 것이다.(청색선 : 단백질(280nm에서의 흡광도로 측정); 갈색선 : conductivity; 붉은 타원 : 항암활성을 가지는 분획)

Claims (5)

  1. 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei spp.)의 배양물을 유효성분으로 함유하는 항암용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 암은 위암, 폐암, 유방암, 난소암 및 대장암으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 암인 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 배양물은
    (a) 락토바실러스 카세이를 포도당, 자당, 유당, 과당(fructose), 말토즈, 전분, 셀룰로즈, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산, 글리세롤, 에탄올 및 아세트산으로 이루어진 군에서 선택된 탄소원; 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아추출물, 옥수수 침지액(CSL), 대두밀, 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄으로 이루어진 군에서 선택된 질소원; 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 인산이수소나트륨 및 인산수소이나트륨으로 이루어진 군에서 선택된 인원을 포함하는 배지에서 20 ℃ 내지 45 ℃로 10시간 내지 40시간 동안 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 (a) 단계에서 배양된 배지에서 락토바실러스 카세이를 제거하는 단 계를 포함하는 방법에 의해 제조된 것임을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 배지는 금속염, 아미노산, 비타민으로 이루어진 군에서 선택된 화합물을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 배양물은
    (a) 포도당(Glucose), 콩-펩톤 A3(Soy-peptone A3), 효모 추출물(yeast extract), K2HPO4, 아세트산 나트륨(sodium acetate), 시트르산 이암모늄(diammonium citrate), MgSO4, MnSO4를 포함하는 배지에서 20 ℃ 내지 45 ℃로 10시간 내지 40시간 동안 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 (a) 단계에서 배양된 배지에서 락토바실러스 카세이를 제거하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된 것임을 특징으로 하는 조성물.
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