KR20240001770A - β-갈락토시다제 분비능 및 담즙산염 분해 활성을 가지며, 프로바이오틱스 특성을 보유한 락토바실러스 브레비스 SRCM 101610 균주 및 이의 용도 - Google Patents
β-갈락토시다제 분비능 및 담즙산염 분해 활성을 가지며, 프로바이오틱스 특성을 보유한 락토바실러스 브레비스 SRCM 101610 균주 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 항산화 활성, 유해 미생물에 대한 항균 활성, 장 부착능, 항생제 내성, 담즙산염 분해 활성, 내산성, 내담즙성, 내열성, β-갈락토시다제(β-galactosidase) 분비능 및 β-글루코시다제(β-glucosidase) 분비능이 우수하고, 탈지유 발효시 커드를 형성하지 않는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SRCM 101610 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 β-갈락토시다제 분비능 및 담즙산염 분해 활성을 가지며, 프로바이오틱스 특성을 보유한 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SRCM 101610 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.
프로바이오틱스(probiotics)란 체내에 들어가서 건강에 좋은 효과를 주는 살아있는 균을 말하는 것으로, 주로 스트렙토코커스 속(Streptococcus sp.), 페디오코커스 속(Pediococcus sp.), 류코노스톡 속(Leuconostoc sp.), 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.), 스포로락토바실러스 속(Sporolactobacillus sp.), 비피도박테리움 속(Bifidobacterium sp.) 유산균이 이에 속한다. 프로바이오틱스로 인정받기 위해서는 위산 및 담즙산에 의해 죽지 않고 소장까지 도달하여 장에서 증식하고 정착하여야 하며 장관 내에서 유익한 효과를 나타내어야 하고 독성이 없으며 병원성이 없어야 한다. 최근 과민성 대장 증후군이나 항생제로 인한 설사, 염증성 장질환, 변비 등과 같은 대장 질환의 영역에서 프로바이오틱스의 사용을 시도해보는 추세이다. 따라서, 프로바이오틱스로서 필요한 특성은 안전성, 기능성(생존능, 정착능, 서식능, 항미생물제 생성능, 면역 촉진능, 항유전독성 활성, 병원성 세균의 억제능), 기술성(관능적 특성, 박테리오파지 저항성, 제조과정 중의 생존성) 및 GRAS(Generally Recognized As Safe) 승인 등이 있다. 프로바이오틱스는 항생제와는 반대되는 특성을 가지고 있는데, 항생제가 미생물이 생산하는 대사 산물로서 소량으로 다른 미생물의 발육을 억제하거나 사멸시키는 물질인 반면, 프로바이오틱스는 균들의 공생, 상생의 능력을 이용하여 면역 기능을 증진시키고 유해 미생물의 성장을 저해하는 등의 효과를 나타내므로 오남용으로 사회적 문제가 되고 있는 항생제의 대체 물질로서 이용 가능하다.
특히, 락토바실러스 속 유산균은 대표적인 프로바이오틱스로, 동형 또는 이형 발효를 하는 젖산 간균이며, 사람을 포함한 동물의 장관 및 유제품이나 채소의 발효과정에서 흔히 볼 수 있다. 또한, 락토바실러스 속 유산균은 장내 pH를 산성으로 유지시켜 유해균의 번식을 억제하고 설사와 변비를 개선할 뿐만 아니라 비타민 합성, 항암 작용, 혈청 콜레스테롤 저하 등의 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
한편, 한국등록특허 제2034371호에는 '병원성 미생물에 대한 항균 활성을 갖는 신균주 락토바실러스 브레비스 BNT 11 및 이의 용도'가 개시되어 있고, 한국공개특허 제2021-0092173호에는 'GABA를 생산하는 락토바실러스 브레비스 HBT 균주 및 이를 포함하는 조성물'이 개시되어 있으나, 본 발명의 'β-갈락토시다제 분비능 및 담즙산염 분해 활성을 가지며, 프로바이오틱스 특성을 보유한 락토바실러스 브레비스 SRCM 101610 균주 및 이의 용도'에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 김치로부터 분리한 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SRCM 101610 균주(기탁번호: KCCM12732P)가 항산화 활성, 유해 미생물에 대한 항균 활성, 장 부착능, 항생제 내성, 담즙산염 분해 활성, 내산성, 내담즙성, 내열성, β-갈락토시다제(β-galactosidase) 분비능 및 β-글루코시다제(β-glucosidase) 분비능이 우수하고, 탈지유 발효시 커드를 형성하지 않는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 기탁번호가 KCCM12732P인 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SRCM 101610 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하며, 항산화 활성, 유해 미생물에 대한 항균 활성, 장 부착능, 항생제 내성, 담즙산염 분해 활성, 내산성, 내담즙성, 내열성, β-갈락토시다제(β-galactosidase) 분비능 및 β-글루코시다제(β-glucosidase) 분비능을 가지며, 탈지유 발효시 커드를 형성하지 않는 것을 특징으로 하는 프로바이오틱스 제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 기탁번호가 KCCM12732P인 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SRCM 101610 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하며, 항산화 활성, 유해 미생물에 대한 항균 활성, 장 부착능, 항생제 내성, 담즙산염 분해 활성, 내산성, 내담즙성, 내열성, β-갈락토시다제(β-galactosidase) 분비능 및 β-글루코시다제(β-glucosidase) 분비능을 가지며, 탈지유 발효시 커드를 형성하지 않는 것을 특징으로 하는, 발효식품 제조용 스타터(starter) 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 기탁번호가 KCCM12732P인 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SRCM 101610 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes), 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) 및 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa)에 대한 항균용 조성물을 제공한다.
본 발명의 락토바실러스 브레비스 SRCM 101610 균주는 항산화 활성, 유해 미생물에 대한 항균 활성, 장 부착능, 항생제 내성, 담즙산염 분해 활성, 내산성, 내담즙성, 내열성, β-갈락토시다제(β-galactosidase) 분비능 및 β-글루코시다제(β-glucosidase) 분비능이 우수하고, 탈지유 발효시 커드를 형성하지 않으므로, 프로바이오틱스 제제, 발효식품 제조를 위한 스타터 균주 및 항균용 조성물 등의 관련 산업 분야에 매우 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 락토바실러스 브레비스 SRCM 101610 균주의 계통도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 락토바실러스 브레비스 SRCM 101610 균주의 내산성(A), 내담즙성(B) 및 내열성(C)을 확인한 결과이다.
도 2는 본 발명의 락토바실러스 브레비스 SRCM 101610 균주의 내산성(A), 내담즙성(B) 및 내열성(C)을 확인한 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 기탁번호가 KCCM12732P인 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SRCM 101610 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하며, 항산화 활성, 유해 미생물에 대한 항균 활성, 장 부착능, 항생제 내성, 담즙산염 분해 활성, 내산성, 내담즙성, 내열성, β-갈락토시다제(β-galactosidase) 분비능 및 β-글루코시다제(β-glucosidase) 분비능을 가지며, 탈지유 발효시 커드를 형성하지 않는 것을 특징으로 하는 프로바이오틱스 제제를 제공한다.
본 발명의 프로바이오틱스 제제에 있어서, 상기 균주는 항산화 활성, 유해 미생물에 대한 항균 활성, 장 부착능, 항생제 내성, 담즙산염 분해 활성, 내산성, 내담즙성, 내열성, β-갈락토시다제(β-galactosidase) 분비능 및 β-글루코시다제(β-glucosidase) 분비능을 가지며, 탈지유 발효시 커드를 형성하지 않는, 기탁번호가 KCCM12732P인 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SRCM 101610 균주일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서는 김치로부터 유산균을 분리하였고, 그 중 항산화 활성, 유해 미생물에 대한 항균 활성, 장 부착능, 항생제 내성, 담즙산염 분해 활성, 내산성, 내담즙성, 내열성, β-갈락토시다제 분비능 및 β-글루코시다제 분비능이 우수하고, 탈지유 발효시 커드를 형성하지 않는, 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 균주를 선발하여 동정하였으며, 이를 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SRCM 101610 균주로 명명하여 한국미생물보존센터(KCCM)에 2020년 5월 26일자로 기탁하였다(기탁번호: KCCM12732P).
본 발명의 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SRCM 101610 균주에 있어서, 상기 유해 미생물은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes), 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) 및 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa)이고, 상기 항생제는 린코마이신(lincomycin), 오플록사신(ofloxacin), 스트렙토마이신(streptomycin) 및 반코마이신(vancomycin)이다.
또한, 상기 내산성은 pH 3~5에서의 내산성일 수 있고, 상기 내담즙성은 0.1~0.5% 담즙에서의 내담즙성일 수 있으며, 상기 내열성은 40~60℃에서의 내열성일 수 있다.
본 발명의 상기 프로바이오틱스 제제는 당업계에 공지된 방법에 따라 다양한 제형과 방법으로 제조 및 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SRCM 101610 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물은 약제학적 분야에서 통상적으로 사용되는 담체와 혼합하여 산제(powder), 액제(liquids and solutions), 정제(tablet), 캡슐(capsule), 시럽(syrup), 현탁제(suspension) 또는 과립제(granule) 등의 형태로 제조되어 투여될 수 있다. 상기 담체로는 예를 들어, 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 및 향료 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 투여 용량은 체내에서의 활성성분의 흡수도, 불활성률, 배설속도, 피투여자의 연령, 성별, 축종, 상태 및 질병의 중증 정도 등에 따라 적절히 선택할 수 있다.
본 발명의 상기 프로바이오틱스 제제를 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 프로바이오틱스를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 프로바이오틱스 제제는 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 혼합양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 혼합양은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 프로바이오틱스 제제를 첨가할 수 있는 식품의 예로는 빵, 캔디류, 스낵류, 과자류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.
본 발명은 또한, 기탁번호가 KCCM12732P인 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SRCM 101610 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하며, 항산화 활성, 유해 미생물에 대한 항균 활성, 장 부착능, 항생제 내성, 담즙산염 분해 활성, 내산성, 내담즙성, 내열성, β-갈락토시다제(β-galactosidase) 분비능 및 β-글루코시다제(β-glucosidase) 분비능을 가지며, 탈지유 발효시 커드를 형성하지 않는 것을 특징으로 하는, 발효식품 제조용 스타터(starter) 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 발효식품 제조용 스타터란 발효식품 제조를 위해 발효에 관여하는 미생물을 포함하는 제제 또는 조성물을 의미한다. 발효식품 제조시에 첨가함으로써 발효된 식품에서 생장할 수 있는 미생물 또는 우점종으로 생장할 수 있는 미생물을 제공하기 위하여 사용된다. 상기 발효식품 제조용 스타터를 사용하여 식품을 제조하는 경우, 상기 발효식품 제조용 스타터에 포함된 미생물에 의하여 식품의 품질을 일정하게 조절하거나, 특정한 목적, 일 예로 식품에서 이취를 발생시키지 않거나, 감소시키는 목적을 달성할 수 있다. 본 발명에서는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SRCM 101610 균주 또는 이의 배양액을 스타터 균주로 이용함으로써, 항산화 활성, 유해 미생물에 대한 항균 활성, 장 부착능, 항생제 내성, 담즙산염 분해 활성, 내산성, 내담즙성, 내열성이 우수하고, β-갈락토시다제(β-galactosidase) 함량 및 β-글루코시다제(β-glucosidase) 함량이 높으며, 탈지유 발효시 커드를 형성하지 않는 발효식품을 제조할 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 발효식품 제조용 스타터 조성물에서, 상기 발효식품은 김치, 장류 또는 발효유 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 균주를 배양하는 방법은 당업계에 통상적으로 이용되는 방법에 따라 배양할 수 있으며, 특별한 방법에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 균주를 배양하는 단계에서 얻어지는 상기 균주 또는 상기 균주의 배양물 또는 상기 균주의 배양액의 농축액을 첨가제로 사용할 경우, 상기 균주 또는 상기 균주의 배양물 또는 상기 균주의 배양액의 농축액을 그대로 첨가하거나 다른 첨가제를 함께 사용할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
본 발명은 또한, 기탁번호가 KCCM12732P인 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SRCM 101610 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes), 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) 및 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa)에 대한 항균용 조성물을 제공한다.
용어 "항균(antimicrobial)"은 세균(bacteria)의 성장 또는 생존을 감소, 방지, 억제, 또는 제거하는 능력을 의미한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 항균용 조성물에서, 상기 조성물은 식품, 식품 첨가제, 사료 또는 사료첨가제 형태일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 항균용 조성물은 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SRCM 101610 균주(KCCM12732P), 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물 외에 당질, 단백질, 지질, 비타민류 및 미네랄류를 포함할 수 있다. 상기 당질, 단백질, 지질, 비타민류 또는 미네랄류는 그 사용 목적 및 용도에 따라 적의 선택될 수 있으며, 일 예로 상기 당질은 벌꿀, 덱스트린, 수크로오스, 팔라티노스, 포도당, 과당, 물엿, 당알콜(sugar alcohol), 소르비톨, 크실리톨, 말티톨일 수 있고 상기 단백질은 카제인(casein), 유청 단백질(whey protein) 등의 우유 유래 단백질, 대두 단백질, 이들 단백질의 트립신, 펩신 등의 동물 유래 효소 및 뉴트라아제(neutrase), 알칼라아제(alkilase)에 의한 가수분해물일 수 있으며, 상기 지질은 제1가 포화지방산, 다가 불포화지방산을 포함하는 해바라기유, 채종유(rapeseed oil), 올리브유, 홍화유(safflower oil), 옥수수유, 대두유, 팜유(palm oil), 야자유 등의 각종 식물 유래 유지, 중쇄 지방산(middle-chain fatty acid), EPA, DHA, 대두 유래 인지질, 우유 유래 인지질일 수 있고, 상기 미네랄류는 인산칼륨, 탄산칼륨, 염화칼륨, 염화나트륨, 유산칼슘, 글루콘산칼슘, 판토텐산칼슘, 카제인칼슘, 염화마그네슘, 황산제1철, 탄산수소나트륨일 수 있으나, 각각의 예에 의해 특별히 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 균주 분리 및 배양 조건
전국에서 수집한 김치 약 50종을 유산균 분리를 위한 균원 시료로 사용하였다. 각각의 시료 1 g을 멸균 생리식염수 9 ㎖에 단계 희석하고 MRS 아가 배지에 100 ㎕씩 도말한 후, 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 이후, 배양된 균주 중에서 집락 형태가 상이한 균주를 선별하여 순수 분리하였고, 10% 스킴 밀크(skim milk)에 재부유하여 -80℃에 보관하며 이후 실험에 사용하였다.
2. 선별 균주의 동정
선별 균주의 동정을 위해 한천 평판배지로부터 균체를 회수하였으며, ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrep kit(Zymo Research. Cat. No: D6005)를 사용하여 DNA를 추출한 후, 27F 정방향(5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3', 서열번호 2) 및 1492R 역방향(5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3', 서열번호 3) 프라이머를 사용하여 16S rRNA 유전자 증폭을 위한 PCR을 수행하였다. PCR은 변성 95℃에서 1분, 결합 60℃에서 1분, 신장 72℃에서 1분 또는 2분의 과정을 총35회 반복하는 조건으로 수행하였으며, 반응이 끝난 PCR 산물은 1% 아가로즈겔(5 ㎕, X-gal 30 mg/㎖)에서 전기영동한 후 밴드를 확인하였고, 증폭이 확인된 PCR 산물은 (주)마크로젠에 의뢰하여 서열을 분석하였다.
3. β-갈락토시다제(β-galactosidase) 활성 분석
MRS 액체배지에 5 g 락토스, 50 mg/㎖ X-gal(chromogenic substrate), 1 mM IPTG(isopropyl β-D-1-thioga-lactopyrinoside)를 첨가하여 제조한 MRS-갈락토시다제 배지에 균주를 접종하고 37℃에서 48시간 동안 배양한 후, 콜로니 주변의 색의 변화로 β-갈락토시다제 활성을 확인하였다.
4. 담즙산염 분해효소(bile salt hydrolase, BSH) 활성 분석
담즙산의 일종인 TDCA(tauro-deoxycholic acid) 및 GDCA(glyco-deoxycholic acid)를 첨가한 배지를 이용하여 담즙산염 분해효소 활성을 확인하였다. MRS 아가 배지에 0.5% TDCA 또는 GDCA를 첨가하여 제조한 MRS-담즙산염 아가 배지에 균주를 접종하고 37℃에서 2~4일간 혐기적 상태로 배양한 후, 균주 주위의 불투명한 침전 형성 여부로 담즙산염 분해효소 활성을 확인하였다.
5. β-글루코시다제(β-glucosidase) 활성 분석
MRS 액체배지에 에스쿨린 철 아가(esculin iron agar)를 혼합하여 제조한 MRS-EI 아가 배지에 균주를 접종하고 37℃에서 48시간 동안 배양한 후, 콜로니 주변의 색의 변화로 β-글루코시다제 활성을 확인하였다.
6. 항산화 활성 분석
DPPH(2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl)를 이용한 자유 라디칼(free radical) 소거능을 통해 균주의 항산화 활성을 분석하였다. 100 μM DPPH 용액 1 ㎖에 균주의 배양 상등액 200 ㎕를 혼합한 후 실온에서 30분간 반응시킨 후, UV/VIS 스펙트로포토미터(SPECOR 200, Analytik jena)로 528 nm에서 흡광도를 측정한 후 아래 식에 대입하여 DPPH 자유 라디칼 소거 활성(%)을 산출하였으며, 대조군으로는 MRS 액체배지를 사용하였다.
DPPH 자유 라디칼 소거 활성(%)=[1-(A/B)x100]
A : 528 nm에서 시료 첨가된 DPPH 용액의 흡광도
B : 528 nm에서 시료 무첨가 DPPH 용액의 흡광도
7. 탈지유 발효 활성 분석
균주의 탈지유 발효 활성을 확인하기 위하여 10% 스킴 밀크를 이용하여 커드(curd) 형성 여부를 확인하였다. 멸균된 10% 스킴 밀크에 균주를 접종하고 37℃에서 5일간 배양하며 커드 형성 유무를 확인하여 탈지유 발효 활성을 확인하였다.
8. 식중독 관련 유해 병원성 미생물에 대한 항균 활성 확인
식품을 부패 또는 오염시켜 식중독을 유발하는 유해 병원성 미생물에 대한 균주의 항균 활성을 측정하였다. 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) KCCM 40935, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) KCCM 11234, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) KCCM 11335, 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes) KCCM 43155, 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) KCTC 1056, 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa) KCCM 11803를 지시균주로 사용하였고, 영양 배지(nutrient broth)에서 37℃, 24시간 동안 각각 배양한 후, OD660=0.4의 지시균주 배양액을 0.8% 아가를 함유한 NB 소프트 아가 배지에 첨가하여 평판배지를 제조하였다. 선별된 균주는 MRS 배지에서 37℃, 24시간 진탕 배양하고 15,000 rpm으로 10분간 원심분리 후 상등액 취하여 0.45 μm 시린지 필터로 필터링한 뒤 상기 제조한 평판배지 위에 올린 6 mm 웰에 각각 분주하였다. 이후, 30℃에서 24시간 배양하여 각의 웰 주변에 생기는 억제환의 크기를 측정하여 항균 활성을 확인하였다.
9. 장상피세포 부착능 분석
정상 대장 상피세포(CCD-18Co)를 24웰 플레이트에 2×105 셀/웰로 분주하고 24시간 동안 배양한 후 균주를 MOI(multiplicity of infection)=10으로 45분간 감염시켰다. 세포에 침투하지 못한 균주는 PBS로 3회 세척하여 제거하였고, 1% Triton X-100으로 세포를 파괴한 후, 세포에 침투했던 균주를 연속적으로 희석해 MRS 배지에 도말하였다. 이후, 생균수를 확인하여 아래의 식에 대입하여 균주의 장내 상피세포 부착율(%)을 산출하였다.
부착율(adhesion, %)=[부착 균 수/초기 처리 균 수]×100
10. 내산성, 내담즙성 및 내열성 분석
균주의 낮은 pH에 대한 내성 효과를 알아보기 위하여, MRS 액체배지에서 37℃, 24시간 동안 배양하여 균주 배양액을 준비하였다. 이후, pH 2, 3, 4 또는 5로 조절한 각 MRS 액체배지에 상기 균주 배양액을 5%로 접종하고 37℃에서 30분 동안 진탕배양한 후, 생균수를 측정하여 내산성 정도를 확인하였으며, pH 조절하지 않은 MRS 액체배지에서의 생균수를 대조구로 사용하였다.
균주의 담즙산염에 대한 내성 효과를 알아보기 위하여, 균주를 MRS 액체배지에서 37℃, 24시간 동안 배양하여 균주 배양액을 준비하였다. 이후, 옥스갈(oxgall)을 0.1, 0.3, 0.5 또는 1%로 첨가한 MRS 액체배지에 상기 균주 배양액을 5%로 접종하고 37℃에서 6시간 동안 진탕배양한 후, 생균수를 측정하여 내담즙성을 확인하였으며, 옥스갈을 첨가하지 않은 배지에서의 생균수를 대조구로 사용하였다.
균주의 열에 대한 내성 효과를 알아보기 위하여, MRS 액체배지 37℃에서 24시간 배양하여 균주 배양액을 준비하였다. 이후, 상기 균주 배양액을 MRS 액체배지에 5%로 접종하고 40, 50, 60 또는 80℃에서 각각 10분간 반응시켰다. 이후, 생균수를 측정하여 내열성 정도를 확인하였으며, 37℃에서 반응시켰을 때의 생균수를 대조구로 사용하였다.
11. 항생제 내성 분석
균주의 항생제 내성 여부를 판단하기 위하여 NCCLS(National Committee for clinical Laboratory Standards)의 디스크 확산법을 실시하였다. 사용한 항생제 디스크(BBL)는 아미카신(amikacin, 30 ㎍, AK), 아목시실린/클라뷰란산(amoxicillin/clavulanic acid, 2 ㎍/1 ㎍, AUG), 암피실린(ampicillin, 10 ㎍, AMP), 세파로신(cephalothin, 30 ㎍, CL), 시프로플록사신(ciprofloxacin, 5 ㎍, CIP), 에리트로마이신(erythromycin, 15 ㎍, E), 젠타마이신(gentamicin, 30 ㎍, CN), 이미페넴(imipenem, 10 ㎍, IMI), 카나마이신(kanamycin, 30 ㎍, K), 린코마이신(lincomycin, 15 ㎍, MY), 메티실린(methicllin, 5 ㎍, MET), 네오마이신(neomycin, 30 ㎍, N), 니트로퓨레이션(nitrofuration, 300 ㎍, F), 오플록사신(ofloxacin, 5 ㎍, OFX), 옥사실린(oxacillin, 5 ㎍, OX), 페니실린 G(penicillin G, 1/2/10 IU, P), 리팜피신(rifampicin, 5 ㎍, RD), 스트렙토마이신(streptomycin, 10 ㎍, S), 테트라사이클린(tetracyline, 30 ㎍, TE), 트리메소프림/설파메톡사졸(trimethoprim/sulfamethoxazole, 1.25 ㎍/23.75 ㎍, SXT), 반코마이신(vancomycin, 30 ㎍, VA)이다. 균주를 뮬러 힌튼(Mueller hinton) 액체배지에 접종하고 37℃에서 5시간 동안 배양한 후 0.5 MacFarland unit(BioMerieux)으로 맞춰 뮬러 힌튼 아가 배지에 도말하고 30분간 건조하여 상기 항생제 디스크를 올린 후 37℃에서 24시간 방치 후 각 항생제에 대한 억제환의 크기를 측정하고 CLSI(Clinical and Laboratory Standards Institute) 가이드라인에 따라 감수성과 내성을 판정하였다.
실시예 1. 선별 균주의 동정
김치에서 분리된 균주 중에서 최종 선별된 균주를 동정하기 위하여, 16S rRNA 유전자 염기서열을 이용한 BLAST 분석 및 메가 프로그램(Mega program)을 이용한 표준 균주와의 상동성 분석을 통해 계통수를 작성한 결과, 최종 선별된 균주는 락토바실러스 브레비스 ATCC 14869와 유사성이 높은 것으로 확인되었고(도 1), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SRCM 101610으로 명명하였으며, 한국미생물보존센터(KCCM, Korean Culture Center of Microorganisms)에 2020년 5월 26일자로 기탁하였다(기탁번호: KCCM12732P).
실시예 2. β-갈락토시다제(β-galactosidase) 활성 분석
포유류의 젖 성분에 많이 존재하는 유당(lactose)은 갈락토스(galactose)와 글루코스(glucose)가 β-1,4-글리코시드 결합(β-1,4-glycoside bond)으로 형성된 이당류이다. 이러한 유당을 가수분해하는 효소가 락타아제(lactase)이고, 세균에서는 β-갈락토시다제로 불리며, 한국인의 80%가 겪는 유당불내증의 저하에 도움을 주는 효소로 알려져 있다. 락타아제의 활성이 결핍된 사람의 경우 우유를 섭취하였을 때 우유 성분 중 유당이 섭취되지 않고 소장의 내강에 축적되어 삼투압 상승을 유발한다. 이로 인해 수분 과잉 상태가 되며, 맹장 내의 미생물에 의해 발효됨으로서 탄산가스를 발생시키고 대장 내 pH 저하 및 장을 자극하여 불쾌감을 줄 뿐만 아니라 일시적인 설사나 대장의 만성 염증을 유발하여 만성 설사를 일으킨다. 이에, 유당불내증 완화 효과가 있는 균주를 선별하고자 균주의 β-갈락토시다제 활성을 측정하였다.
그 결과, 김치에서 분리된 균주 중에서 SRCM 101610, SRCM 101603 및 SRCM 101649 균주의 β-갈락토시다제 활성이 높은 것을 확인하였다(표 1).
| 균주명 | 동정 | β-갈락토시다제 활성 |
| SRCM 101610 | Lactobacillus brevis | +++ |
| SRCM 101603 | Lactobacillus brevis | ++ |
| SRCM 101649 | Lactobacillus brevis | ++ |
(++++:>2.0 cm, +++:1.5~1.9 cm, ++:1.0~1.4 cm, ND:<1.0)
실시예 3. 담즙산염 분해효소(bile salt hydrolase, BSH) 활성 분석
콜레스테롤은 간세포에서 1차 담즙산인 콜산(cholic aicd)과 케노디옥시콜산(chenodeoxycholic acid)으로 전환되며, 글리신(glycine)이나 타우린(taurine)과 결합된 후 GDCA(glyco-deoxycholic acid) 또는 TDCA(tauro-deoxycholic acid)가 되며 주로 염(sodium) 형태의 담즙산으로 존재한다. 담즙산염 분해효소는 담즙산의 글리신이나 타우린이 결합하는 부위에 작용하여 자유 콜산으로 분해시켜 담즙산의 체내 흡수율을 감소시키며, 이렇게 담즙산의 체내 농도가 감소하게 되면 콜레스테롤을 분해하여 담즙산의 생성이 촉진되고 결론적으로 체내 콜레스테롤이 낮아지게 된다. 이에, 체내 콜레스테롤을 낮춰주는 효과가 있는 균주를 선별하고자 TDCA와 GDCA가 첨가된 배지를 이용하여 균주의 정성적 담즙산염 분해효소 활성을 측정하였다.
그 결과, 김치에서 분리된 균주 중에서 SRCM 101610, SRCM 101603 및 SRCM 101649 균주가 TDCA는 분해하지 못하였지만 GDCA는 분해하여 일부 담즙산염 분해효소 활성을 가지는 것을 확인하였다(표 2).
| 균주명 | 동정 | TDCA | GDCA |
| SRCM 101610 | Lactobacillus brevis | - | + |
| SRCM 101603 | Lactobacillus brevis | - | + |
| SRCM 101649 | Lactobacillus brevis | - | + |
(+: 분해 활성 있음, -: 분해 활성 없음)
실시예 4. β-글루코시다제(β-glucosidase) 활성 분석
대두를 이용한 다양한 식품에는 당 성분이 혼합되어 있는 아글리콘(aglycone) 형태의 배당체가 존재하며 이의 대표적인 물질이 이소플라본(isoflavone)이다. 이소플라본은 피토에스트로겐(phytoestrogen)이라 불리며, 체내 활성물질로 일컫는 것이 다이드제인(daidzein)과 제니스테인(genistein)이다. 배당체 형태로 존재하고 있는 이소플라본은 위산과 장내 미생물이 생산하는 효소인 β-글루코시다제에 의하여 유리된 형태, 즉 비배당화 형태의 다이드제인과 제니스테인 등으로 전환되어 장에서 흡수가 된다. 최근 보고에 따르면 제니스테인은 강한 항암 작용을 하는 것으로 확인되었으며, 특히 이러한 효소를 생산하는 미생물을 이용한 발효식품은 더욱더 기능성 식품으로 각광받을 것으로 예측되고 있다. 이에, 기능성 프로바이오틱스 균주로 활용 가능한 균주를 선별하고자 균주의 β-글루코시다제 활성을 측정하였다.
그 결과, 김치에서 분리된 균주 중에서 SRCM 101610 및 SRCM 101649 균주가 β-글루코시다제 활성을 가지는 것을 확인하였다(표 3).
| 균주명 | 동정 | β-글루코시다제 활성 |
| SRCM 101610 | Lactobacillus brevis | + |
| SRCM 101603 | Lactobacillus brevis | - |
| SRCM 101649 | Lactobacillus brevis | + |
(+: 활성 있음, -: 활성 없음)
실시예 5. 항산화 활성 분석
DPPH는 페놀성 물질에 대한 항산화 작용의 지표물질 중 하나이며, 항산화 물질은 자유 라디칼(free radical)에 전자를 공여하여 지방질 산화를 억제하고, 활성산소에 의한 노화를 억제하는 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 이에, 항산화 활성을 가져 노화 예방에 도움이 되는 균주를 선별하고자 균주의 DPPH 자유 라디칼 소거능을 측정하였다.
그 결과, 김치에서 분리된 균주 중에서 SRCM 101610 균주의 DPPH 자유 라디칼 소거능이 가장 우수한 것을 확인하였다(표 4).
| 균주명 | 동정 | DPPH 자유 라디칼 소거능(%) |
| SRCM 101610 | Lactobacillus brevis | 34.33 |
| SRCM 101603 | Lactobacillus brevis | 31.85 |
| SRCM 101649 | Lactobacillus brevis | 33.09 |
실시예 6. 탈지유에서의 커드 형성 유무 확인
커드(curd)는 우유의 주요 단백질인 카세인이 응고된 것으로, 프로바이오틱스 제형 개발에 있어서 커드 형성은 여러 가지 문제를 야기하므로 부형제로 사용하는 탈지유에서의 커드 형성 유무는 프로바이오틱스 제형 개발 및 산업화에 중요한 기초 자료가 된다. 이에, 산업화에 유용한 균주를 선별하고자 탈지유에서의 커드 형성 유무를 확인하였다. 시판 프로바이오틱스 유산균인 락토바실러스 람노서스 GG(Lactobacillus rhamnosus GG) 균주를 양성대조군으로 이용하였다.
그 결과, 김치에서 분리된 균주 중에서 SRCM 101610, SRCM 101603 및 SRCM 101649 균주는 탈지유 발효 시, 커드를 형성하지 않는 것을 확인하였다(표 5).
| 균주명 | 동정 | 커드 형성 유무 |
| SRCM 101610 | Lactobacillus brevis | - |
| SRCM 101603 | Lactobacillus brevis | - |
| SRCM 101649 | Lactobacillus brevis | - |
| Lactobacillus rhamnosus GG | - | |
(-: 커드 형성하지 않음)
실시예 7. 식중독 관련 유해 병원성 미생물에 대한 항균 활성 확인
식중독 관련 유해 병원성 미생물에 대한 항균 활성을 확인하고자 웰 확산 방법을 통해 균주의 항균 활성을 확인하였다.
그 결과, 김치에서 분리된 균주 중에서 SRCM 101610 균주는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes), 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) 및 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa)에 대한 항균 활성이 우수한 것을 확인하였다(표 6).
| 균주명 | 동정 | 항균 활성 (억제환 크기, cm) | |||||
| B.cereus | L.monocytogenes | M.luteus | E.coli | S.aureus | P.aeruginosa | ||
| SRCM 101610 |
Lactobacillus
brevis |
1.15 | 1.27 | 1.11 | 1.56 | 1.07 | 1.67 |
| SRCM 101603 |
Lactobacillus
brevis |
1.08 | 1.39 | 1.07 | 2.03 | 1.05 | 1.53 |
| SRCM 101649 |
Lactobacillus
brevis |
0.99 | 1.20 | - | 1.51 | 0.60 | 1.28 |
실시예 8. 장상피세포 부착능 분석
프로바이오틱스 균주는 장상피세포에 부착 효과를 가진다고 알려져 있어 균주의 대장 상피세포(CCD-18Co) 부착능을 측정하였다.
그 결과, 김치에서 분리된 균주 중에서 SRCM 101610의 장상피세포 부착능이 가장 우수한 것을 확인하였다(표 7).
| 균주명 | 동정 | 장상피세포 부착능(%) |
| SRCM 101610 | Lactobacillus brevis | 89.41 |
| SRCM 101603 | Lactobacillus brevis | 72.01 |
| SRCM 101649 | Lactobacillus brevis | 64.16 |
실시예 9. 내산성, 내담즙성 및 내열성 분석
사람이 섭취한 프로바이오틱스가 소화기관을 안정적으로 통과하여 많은 생균이 장내로 도달하기 위해서는 위액의 낮은 pH에 대한 내성을 가지고 있어야 하고, 미생물의 세포막에 영향을 주어 사멸하게 하는 담즙산에 내성을 가지고 있어야 하며, 제품 제조 시 고온의 가공 처리 조건에도 견딜 수 있어야 한다. 이에, 프로바이오틱스로서의 특성이 우수한 균주를 선별하고자 균주의 내산성, 내담즙성 및 내열성을 분석하였다.
그 결과, 김치에서 분리된 균주 중에서 SRCM 101610 균주는 내산성, 내담즙성 및 내열성이 우수한 것을 확인하였다(도 2).
실시예 10. 항생제 내성 분석
항생제는 식품과 의약품 등 다양한 산업 분야에 사용되고 있는 물질로, 사람의 경우 음식물의 섭취를 통해 체내로 쉽게 유입되기 때문에 프로바이오틱스 제품이 항생제에 대한 내성이 없을 경우, 치료 목적으로 사용된 항생제에 의해 제품의 기능성 저해 및 유용 미생물의 사멸로 인해 제 역할을 수행하기 어렵게 된다. 이에, 프로바이오틱스 식품 제조를 위한 종균으로 사용될 수 있는 균주를 선별하고자 균주의 항생제 내성을 측정하였다.
그 결과, 김치에서 분리된 균주 중에서 SRCM 101610 균주는 린코마이신(lincomycin), 오플록사신(ofloxacin), 스트렙토마이신(streptomycin) 및 반코마이신(vancomycin)에 대한 항생제 내성이 있음을 확인하였다(표 8).
상기 결과를 바탕으로, 락토바실러스 브레비스 SRCM 101610 균주는 β-갈락토시다제 활성, 담즙산염 분해효소 활성, β-글루코시다제 활성, 항산화 활성, 유해 미생물에 대한 항균 활성, 장상피세포 부착능, 내산성, 내담즙성, 내열성 및 항생제에 대한 내성이 우수하고 탈지유 발효시 커드를 형성하지 않는 것을 확인함으로써, 우수한 프로바이오틱스 특성을 가지는 균주임을 알 수 있었다.
<110> Microbial Institute for Fermentation Industry
<120> Lactobacillus brevis SRCM 101610 strain having b-galactosidase
secretion activity, bile salt hydrolytic activity and probiotics
property and uses thereof
<130> PN22204
<160> 3
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 1502
<212> DNA
<213> Lactobacillus brevis
<400> 1
tcgtcagacg aacgctggcg gcatgcctaa tacatgcaag tcgaacgagc ttccgttgaa 60
tgacgtgctt gcactgattt caacaatgaa gcgagtggcg aactggtgag taacacgtgg 120
ggaatctgcc cagaagcagg ggataacact tggaaacagg tgctaatacc gtataacaac 180
aaaatccgca tggattttgt ttgaaaggtg gcttcggcta tcacttctgg atgatcccgc 240
ggcgtattag ttagttggtg aggtaaaggc ccaccaagac gatgatacgt agccgacctg 300
agagggtaat cggccacatt gggactgaga cacggcccaa actcctacgg gaggcagcag 360
tagggaatct tccacaatgg acgaaagtct gatggagcaa tgccgcgtga gtgaagaagg 420
gtttcggctc gtaaaactct gttgttaaag aagaacacct ttgagagtaa ctgttcaagg 480
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taggtggcaa gcgttgtccg gatttattgg gcgtaaagcg agcgcaggcg gttttttaag 600
tctgatgtga aagccttcgg cttaaccgga gaagtgcatc ggaaactggg agacttgagt 660
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accagtggcg aaggcggctg tctagtctgt aactgacgct gaggctcgaa agcatgggta 780
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ggtgagataa ccttcgggag tcagccgtct aaggtgggac agatgattag ggtgaagtct 1500
ac 1502
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 2
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<210> 3
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<212> DNA
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<220>
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tacggytacc ttgttacgac tt 22
Claims (4)
- 기탁번호가 KCCM12732P인 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SRCM 101610 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하며, 항산화 활성, 유해 미생물에 대한 항균 활성, 장 부착능, 항생제 내성, 담즙산염 분해 활성, 내산성, 내담즙성, 내열성, β-갈락토시다제(β-galactosidase) 분비능 및 β-글루코시다제(β-glucosidase) 분비능을 가지며, 탈지유 발효시 커드를 형성하지 않는 것을 특징으로 하는 프로바이오틱스 제제.
- 제1항에 있어서, 상기 유해 미생물은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes), 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) 및 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa)이며, 상기 항생제는 린코마이신(lincomycin), 오플록사신(ofloxacin), 스트렙토마이신(streptomycin) 및 반코마이신(vancomycin)인 것을 특징으로 하는 프로바이오틱스 제제.
- 기탁번호가 KCCM12732P인 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SRCM 101610 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하며, 항산화 활성, 유해 미생물에 대한 항균 활성, 장 부착능, 항생제 내성, 담즙산염 분해 활성, 내산성, 내담즙성, 내열성, β-갈락토시다제(β-galactosidase) 분비능 및 β-글루코시다제(β-glucosidase) 분비능을 가지며, 탈지유 발효시 커드를 형성하지 않는 것을 특징으로 하는, 발효식품 제조용 스타터(starter) 조성물.
- 기탁번호가 KCCM12732P인 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SRCM 101610 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes), 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) 및 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa)에 대한 항균용 조성물.
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|---|---|---|---|
| KR1020220078197A KR20240001770A (ko) | 2022-06-27 | 2022-06-27 | β-갈락토시다제 분비능 및 담즙산염 분해 활성을 가지며, 프로바이오틱스 특성을 보유한 락토바실러스 브레비스 SRCM 101610 균주 및 이의 용도 |
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|---|---|---|---|
| KR1020220078197A KR20240001770A (ko) | 2022-06-27 | 2022-06-27 | β-갈락토시다제 분비능 및 담즙산염 분해 활성을 가지며, 프로바이오틱스 특성을 보유한 락토바실러스 브레비스 SRCM 101610 균주 및 이의 용도 |
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2022
- 2022-06-27 KR KR1020220078197A patent/KR20240001770A/ko unknown
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