KR101982759B1

KR101982759B1 - 신규 바실러스 서브틸리스 균주 및 이를 포함하는 식중독 원인균 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101982759B1
Application number: KR1020170117039A
Authority: KR
Inventors: 백현동; 손성호; 양서진; 이나경; 전혜린
Original assignee: 주식회사 메가랩
Priority date: 2017-09-13
Filing date: 2017-09-13
Publication date: 2019-05-27
Also published as: KR20190029938A

Abstract

본 발명은 식중독 원인균의 장내 부착 저해능을 가지는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주(KCCM12104P) 및 이를 유효성분으로 포함하는 식중독 원인균 예방, 치료 또는 개선용 조성물에 관한 것이다.

Description

신규 바실러스 서브틸리스 균주 및 이를 포함하는 식중독 원인균 예방 또는 치료용 조성물{NOVEL STRAIN OF Bacillus subtilis AND COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING OF PHATHOGEN BACTERIUM COMPRISING THE SAME}

본 발명은 신규 바실러스 서브틸리스 균주 및 이를 포함하는 식중독 원인균 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

프로바이오틱스(Probiotics)는 적정량 섭취하였을 때 장내 정착하여 유해균의 장내 정착을 막는 등의 이로운 역할을 하는 살아있는 균으로 장건강 및 면역반응을 증진시키고 콜레스테롤 수치를 감소시켜준다고 알려져 있다. 그러나, 프로바이오틱스로서 작용을 하기 위해서는 장에서의 생존을 위해 산과 담즙에 대해 내성이 있어야 하고 장에 정착하는 능력을 가지고 있어야 한다. 또한, 안전성 측면에서 항생제 감수성, 용혈성 등이 확인되어야 한다.

바실러스 균은 주로 청국장, 된장, 그리고 낫토와 같은 콩 발효식품에 많이 존재하며, 그 중에서 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균은 프로바이오틱스로 알려진 바실러스 균이며 안전하다고 여겨지는 균이다. 바실러스 균은 극한의 환경이 되면 포자세포를 생산하고 이는 열이나 낮은 pH에 저항성을 가진다. 이러한 바실러스 균의 특징은 포자를 생성하지 않는 다른 프로바이오틱스 균들보다 생존기간이 길다는 장점을 가진다. 최근에는 발효식품으로부터 바실러스 균을 분리하고 그것의 프로바이오틱 특성을 검증하는 연구가 진행되고 있으며, 실제로 해외에서는 바실러스 균주의 포자세포를 함유하는 프로바이오틱스 제품이 판매되고 있다.

본 발명은 식중독 원인균의 장내 부착 저해능을 가지는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주(KCCM12104P) 등을 제공하고자 한다.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 식중독 원인균의 장내 부착 저해능을 가지는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주(KCCM12104P)를 제공한다.

상기 식중독 원인균은 황색포도상구균, 살모넬라균, 리스테리아균 및 대장균으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

상기 균주는 자가응집력 및 식중독 원인균과의 공동응집력을 가질 수 있다.

상기 균주는 서열번호 1의 16S rRNA 염기서열을 포함할 수 있다.

상기 균주는 하기 ⅰ) 내지 ⅲ)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 특징을 추가로 가질 수 있다:

ⅰ) 내산성, 내담즙성 또는 장부착능;

ⅱ) 효소 생산능; 및

ⅲ) 항생제 감수성.

삭제

상기 ⅱ)에서 효소 생산능은 β-글루쿠로니다아제(β-Glucuronidase) 활성 억제; 및 아밀라아제(Amylase) 또는 프로테아제(Protease) 활성 증가를 통해 구현되는 것일 수 있다.

상기 ⅲ)에서 항생제 감수성은 암피실린(Ampicillin), 젠타마이신(Gentamicin), 카나마이신(Kanamycine), 테트라사이클린(Tetracycline), 시프로플록사신(Ciprofloxacin), 클로람페니콜(Chloramphenicol) 또는 독시사이클린(Doxycycline)에 대한 것일 수 있다.

본 발명의 일 구현예로, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주(KCCM12104P)를 유효성분으로 포함하는 식중독 원인균 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 균주는 생균체, 사균체 또는 배양여액인 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주(KCCM12104P)를 유효성분으로 포함하는 식중독 원인균 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명은 식중독 원인균의 장내 부착 저해능을 가지는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주(KCCM12104P) 및 이를 포함하는 식중독 원인균 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 상기 균주(KCCM12104P)는 높은 자가응집력 및 낮은 식중독 원인균과의 공동응집력을 가지면서, 내산성, 내담즙성 또는 장부착능; 효소 생산능; 및 항생제 감수성이 우수한 이점을 가지는바, 프로바이오틱스로서 활용가능할 뿐만 아니라, 식중독 원인균 예방 또는 치료에 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 Bacillus subtilis 균주(KCCM12104P)("P223")의 계통도를 보여주는 그림이다.
도 2는 실시예 1에 따른 Bacillus subtilis 균주(KCCM12104P)와 비교예 1에 따른 Bacillus clausii 균주(ATCC 700160)의 식중독 원인균의 장내 부착 저해능을 비교한 결과를 보여주는 그래프이다: (A) S. enteritidis; (B) L. monocytogenes; (C) E. coli(a, 식중독 원인균의 균수; b, 식중독 원인균 및 비교예 1에 따른 Bacillus clausii 균주(ATCC 700160)의 혼합균의 균수; c, 식중독 원인균 및 실시예 1에 따른 Bacillus subtilis 균주(KCCM12104P)의 혼합균의 균수; 이때, 각 막대 상에 상이한 문자는 값 사이의 유의적인 차이를 나타낸다(p<0.05)).
도 4는 실시예 1에 따른 Bacillus subtilis 균주(KCCM12104P)의 용혈성을 평가한 결과를 보여주는 사진이다.

본 발명자들은 바실러스 균 중에서, 우리나라 전통 발효식품인 김치로부터 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주(KCCM12104P)를 분리 및 동정한 후, 이의 식중독 원인균의 장내 부착 저해능과 함께 프로바이오틱 특성을 검증함으써, 본 발명을 완성하였다.

본 명세서 내 "식중독 원인균"이라 함은 원인에 따라 세균성 식중독 원인균, 바이러스 식중독 원인균, 자연독 식중독 원인균, 화학성 식중독 원인균으로 나눌 수 있다. 이때, 세균성 식중독은 발현 기전에 따라 감염형, 독소형, 기타군으로 나뉘며, 자연독 식중독은 원인 식품에 따라 식물성과 동물성 식중독으로 다시 분류할 수 있다. 구체적으로, 상기 식중독 원인균은 황색포도상구균, 살모넬라균, 리스테리아균 및 대장균으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있고, 살모넬라균, 리스테리아균 및 대장균으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주(KCCM12104P)는 바실러스 서브틸리스의 아종으로 볼 수 있다.

통상적인 바실러스 균은 청국장, 된장, 그리고 낫토와 같은 콩 발효식품에 많이 존재하며, 그중에서도 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균은 프로바이오틱스로 알려진 바실러스 균이며 안전하다고 여겨지는 균이다.

본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주(KCCM12104P)("P223")의 계통도는 도 1에 도시한 바와 같으며, 배추김치, 열무김치, 깍두기 등 다양한 김치로부터 분리된 것이다. 상기 분리된 균주를 동정하기 위해 16S rRNA 서열을 분석한 결과, 상기 균주(KCCM12104P)는 서열번호 1의 16S rRNA 염기서열을 가지는 것으로 확인되며, 2017년 9월 6일자로 한국미생물보존센터에 기탁하여 수탁번호 KCCM12104P를 부여받았다.

상기 균주(KCCM12104P)는 바실러스 균 중에서도 특히 식중독 원인균의 장내 부착 저해능이 우수한 것을 특징으로 한다. 이를 구현하기 위해, 상기 균주(KCCM12104P)는 높은 값의 자가응집력 및 식중독 원인균과의 공동응집력을 가질 수 있다. 구체적으로, 상기 균주(KCCM12104P)는 37℃에서 4시간 및 24시간 동안 배양시 자가응집력이 모두 80% 이상이고, 동일한 조건에서 식중독 원인균과 혼합 배양시 공동응집력이 각각 40% 이상, 60% 이상일 수 있다.

또한, 상기 균주(KCCM12104P)는 하기 ⅰ) 내지 ⅲ)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 특징을 추가로 가짐으로써, 프로바이오틱 특성을 구현할 수 있다:

ⅰ) 내산성, 내담즙성 또는 장부착능;

ⅱ) 효소 생산능; 및

ⅲ) 항생제 감수성.

삭제

상기 ⅰ)에서 내산성은 pH 2.5 조건에서 3시간 반응시, 상기 균주(KCCM12104P)의 생존율이 60% 이상일 수 있고, 내답즙성은 0.3%(w/v) oxgall 조건에서 24시간 반응시, 상기 균주(KCCM12104P)의 생존율이 100% 이상일 수 있다.

상기 ⅱ)에서 효소 생산능은 β-글루쿠로니다아제(β-Glucuronidase) 활성 억제; 및 아밀라아제(Amylase) 또는 프로테아제(Protease) 활성 증가를 통해 구현될 수 있다. 이때, β-글루쿠로니다아제(β-Glucuronidase)는 암 유발 효소로 분류되는바, 이의 생성을 억제함으로써, 생체 안전성을 확보할 수 있다. 한편, 아밀라아제(Amylase) 또는 프로테아제(Protease)는 소화 기능 개선 또는 단백질 분해능 개선에 영향을 미칠 수 있다.

상기 ⅲ)에서 항생제 감수성은 암피실린(Ampicillin), 젠타마이신(Gentamicin), 카나마이신(Kanamycine), 테트라사이클린(Tetracycline), 시프로플록사신(Ciprofloxacin), 클로람페니콜(Chloramphenicol) 또는 독시사이클린(Doxycycline)에 대한 것일 수 있다. 이때, 항생제 내성은 항생제 내성 유전자의 전이라는 측면에서 문제점을 발생시킬 수 있는데, 상기 균주(KCCM12104P)는 스트렙토마이신(Streptomycin)을 제외하고는, 다른 항생제에 대해서는 내성을 가지지 않으므로, 항생제 내성 유전자의 전이에 따른 우려는 발생하지 않을 수 있다.

삭제

또한, 본 발명은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주(KCCM12104P)를 유효성분으로 포함하는 식중독 원인균 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주(KCCM12104P)에 대해서는 전술한 바와 같다. 또한, 상기 균주(KCCM12104P)는 생균체, 사균체 또는 배양여액인 것일 수 있다.

상기 식중독 원인균은 황색포도상구균, 살모넬라균, 리스테리아균 및 대장균으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있고, 살모넬라균, 리스테리아균 및 대장균으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 균주(KCCM12104P)의 용량은 1 μg/mL 내지 100 μg/mL인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 이때, 상기 균주(KCCM12104P)의 용량이 상기 범위 미만인 경우, 식중독 원인균 예방 또는 치료 효과를 발휘하기 어려운 문제점이 있고, 상기 균주(KCCM12104P)의 용량이 상기 범위를 초과하는 경우, 독성의 우려사항이 있을 수 있다.

본 발명에 따른 식중독 원인균 예방 또는 치료용 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구제 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화되어 사용할 수 있고, 제형화를 위하여 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.

상기 담체 또는, 부형제 또는 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리게이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조할 수 있다.

경구 투여를 위한 고형제제는 상기 균주(KCCM12104P)에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 제조할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다.

경구를 위한 액상 제제로는 현탁액, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용하는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등을 사용할 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤젤라틴 등을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 식중독 원인균 예방 또는 치료용 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서는 1일 0.0001 내지 2,000 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 2,000 mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수회 나누어서 투여할 수도 있다. 다만, 상기 투여량에 의해서 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명에 따른 식중독 원인균 예방 또는 치료용 약학 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유 동물에 다양한 경로로 투여할 수 있다. 투여의 모든 방식은 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해서 투여할 수 있다.

또한, 본 발명은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주(KCCM12104P)를 유효성분으로 포함하는 식중독 원인균 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명에 따른 식중독 원인균 예방 또는 개선용 건강기능식품에 있어서, 상기 균주(KCCM12104P)를 건강기능식품의 첨가물로 사용하는 경우 이를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 예방, 건강 또는 치료 등의 각 사용 목적에 따라 적합하게 결정할 수 있다.

건강기능식품의 제형은 산제, 과립제, 환, 정제, 캡슐제의 형태뿐만 아니라 일반 식품 또는 음료의 형태 어느 것이나 가능하다.

상기 식품의 종류에는 특별히 제한은 없고, 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸콜렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함할 수 있다.

일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 상기 균주(KCCM12104P)는 원료 100 중량부에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가할 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있다.

본 발명에 따른 건강기능식품 중 음료는 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명에 따른 음료 100 mL당 약 0.01 ~ 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ~ 0.03 g일 수 있다.

상기 외에 본 발명에 따른 식중독 원인균 예방 또는 개선용 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제를 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명에 따른 식중독 원인균 예방 또는 개선용 건강기능식품은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 제한되지 않으나 본 발명에 따른 식중독 원인균 예방 또는 개선용 건강기능식품 100 중량부 대비 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

그밖에, 본 발명은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주(KCCM12104P)를 포함하는 발효용 스타터, 종균 조성물 또는 발효 식품을 제공할 수 있다.

전술한 바와 같이, 본 발명은 식중독 원인균의 장내 부착 저해능을 가지는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주(KCCM12104P) 및 이를 포함하는 식중독 원인균 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 상기 균주(KCCM12104P)는 높은 자가응집력 및 낮은 식중독 원인균과의 공동응집력을 가지면서, 내산성, 내담즙성 또는 장부착능; 효소 생산능; 및 항생제 감수성이 우수한 이점을 가지는바, 프로바이오틱스로서 활용가능할 뿐만 아니라, 식중독 원인균 예방 또는 치료에 유용하게 활용될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 >

실시예 1: Bacillus subtilis 균주( KCCM12104P ) 분리 및 동정

신규 균주를 분리하기 위해, 집에서 담근 배추김치, 열무김치, 깍두기 등의 다양한 김치 국물을 샘플링하여 시료로 사용하였다. 김치 국물을 열처리(80℃, 30 분)하고, 10배 희석법을 사용하여 TSA 한천 배지에 도말하고 여러 차례 획선 도말하고 배양한 후 콜로니 형태를 관찰하여 신규 균주를 분리하였다. 분리된 신규 균주의 동정을 위해 Bionics(Seoul, Korea)에 16S rRNA 서열분석을 의뢰하였다. 구체적으로, 16S rRNA 서열분석을 수행하였고, 16S rRNA 유전자를 27F와 1492R 프라이머(primer)를 이용하여 PCR을 진행하였다. 염기서열을 분석하여 나온 결과를 토대로 BLAST 프로그램을 이용하여 Genbank의 데이터베이스에 등록된 다른 표준균주와 상동성을 비교하였다. 신규 균주는 Bacillus subtilis 균주로 확인되었고, 유사성은 99%로 나타났다. 또한, Mega 7 program을 이용하여 상동성을 분석하고 계통도를 얻었다(도 1). 이때, Bacillus subtilis 균주는 2017년 9월 6일자로 한국미생물보존센터에 기탁하여 수탁번호 KCCM12104P를 부여받았다.

이후, Bacillus subtilis 균주를 TS broth에서 37℃, 18시간 동안 배양한 이후 원심분리(5,000×g, 10분)하여 침전물(균체)과 상층액(배양여액)으로 분리하였고. 침전물을 동결건조시킨 후 생균체를 제조하였고, 여기에 추가적인 열처리(80℃, 30 분)를 통하여 사균체를 제조하였다.

비교예 1: Bacillus clausii 균주( ATCC 700160) 준비

상업용 프로바이오틱스로 알려진 Bacillus clausii 균주(ATCC 700160)를 한국미생물보존센터에서 제공받아 준비하였다. 배양 조건은 실시예 1에 따른 균주와 동일하게 준비하였다.

실험예 1: 균주의 내산성 및 내담즙성 평가

실시예 1에 따른 Bacillus subtilis 균주(KCCM12104P)와 비교예 1에 따른 Bacillus clausii 균주(ATCC 700160)의 내산성 및 내담즙성을 비교하였다.

구체적으로, 내산성 평가를 위해서 인공위액(pH 2.5, 0.3(w/v)% pepsin)을 만들어 균주를 3시간 동안 반응시킨 후 살아있는 균수를 확인하였고, 내담즙성 평가를 위해서 배지에 0.3%(w/v) oxgall을 첨가하여 균주를 24시간 동안 반응시킨 후 살아있는 균수를 측정하였다.

처리	균수(Log CFU/mL)
처리	실시예 1	비교예 1
영양세포
초기 균수	6.88 ± 0.18^b	6.82 ± 0.35^a
0.3%(w/v) pepsin, pH 2.5, 3시간	4.15 ± 0.22^a	ND
0.3%(w/v) oxgall, 24시간	7.14 ± 0.32^b	7.50 ± 0.49^a
아포세포
초기 균수	5.04 ± 0.57^a	5.69 ± 0.21^b
0.3%(w/v) pepsin, pH 2.5, 3시간	5.38 ± 0.59^a	5.31 ± 0.16^a
0.3%(w/v) oxgall, 24시간	7.07 ± 0.36^b	7.86 ± 0.10^c

* 동일한 행에 있는 상이한 위첨자는 각 특성의 통계적 차이를 나타낸다(p<0.05). 값은 평균±SD(n = 3)로 표현된다.

표 1에 나타난 바와 같이, 실시예 1에 따른 Bacillus subtilis 균주(KCCM12104P)의 내산성 평가결과, 영양세포에서는 초기 균수 대비 균수가 2.73 log CFU/mL 정도 감소한 반면 아포세포에서는 초기 균수와 유의적 차이가 없었다. 또한, 내담즙성 평가결과, 영양세포와 아포세포에서 모두 초기 균수 대비 균수가 증가하여 내담즙성이 우수한 것으로 확인된다.

또한, 비교예 1에 따른 Bacillus clausii 균주(ATCC 700160)의 내산성 평가결과, 영양세포에서는 균수가 검출되지 않았으나, 아포세포에서는 초기 균수 대비 균수가 0.38 log CFU/mL 정도 감소하였다. 또한, 내담즙성 평가 결과, 영양세포와 아포세포에서 모두 초기 균수 대비 균수가 증가하여 내담즙성이 우수한 것으로 확인된다.

실험예 2: 균주의 장부착능 평가

실시예 1에 따른 Bacillus subtilis 균주(KCCM12104P)의 장부착능을 평가하였다.

구체적으로, 장부착능 평가를 위해서 1×10⁵ cells/well로 접종한 HT-29(human colon adenocarcinoma cell line) 세포주를 24시간 배양한 후 균주(1×10⁷ CFU/well)을 처리하고 37℃에서 2시간 추가로 배양하였다. Phosphate buffered saline으로 세 번 세척하여 부착되지 않은 균을 제거하였으며 1% Triton X-100 용액을 사용하여 세포주를 떼어낸 후 평판도말법을 이용하여 세포주에 부착된 균수를 측정하였다.

처리	균수 (Log CFU/mL)
처리	실시예 1
영양세포
초기 균수	6.96 ± 0.09^a
부착 균수	4.52 ± 0.09^b
장부착능	64.9%
아포세포
초기 균수	4.63 ± 0.05^a
부착 균수	3.36 ± 0.10^b
장부착능	72.6%

* 장부착능= 부착균수/초기균수 × 100%로 표기하였다.

상기 표 2에 나타난 바와 같이, 실시예 1에 따른 Bacillus subtilis 균주(KCCM12104P)의 장부착능 평가결과, 영양세포를 6.96 log CFU/mL로 접종하였을 때 4.52 log CFU/mL의 균수가 부착된 반면, 아포세포를 4.63 log CFU/mL로 접종하였을 때 3.36 log CFU/mL의 균수가 부착되는바, 아포세포는 영양세포 대비 장부착능이 더 우수하였다.

상업용 프로바이오틱스로 알려진 Bacillus polyfermenticus SCD 아포세포의 경우, 장부착능이 64.0% 이하로 알려져 있는바, 실시예 1에 따른 Bacillus subtilis 균주(KCCM12104P)의 장부착능 평가결과는 매우 우수한 것으로 확인된다.

실험예 3: 균주의 자가응집력 및 식중독 원인균과의 공동응집력 평가

자가응집력은 장정착능에 기여할 수 있는 정도를 나타낸다. 실시예 1에 따른 Bacillus subtilis 균주(KCCM12104P)와 비교예 1에 따른 Bacillus clausii 균주(ATCC 700160)의 자가응집력 및 식중독 원인균과의 공동응집력을 비교하였다.

구체적으로, 자가응집력 평가를 위해서 균주를 배양한 뒤 균체를 PBS로 두 번 washing하고 600 nm에서의 흡광도를 0.30.05로 맞춘다. 자가응집은 흡광도를 맞춘 균주를 37℃에서 4시간, 24시간 배양하여 자가응집력을 측정하였다:

자가응집력 (%) =

A1, 배양전 균주의 흡광도; A2, 배양후 균주의 흡광도.

또한, 식중독 원인균과의 공동응집력 평가를 위해서 흡광도를 맞춘 균주와 각각의 식중독 원인균을 2 mL씩 섞어 37℃에서 4시간 배양하여 식중독 원인균과의 공동응집력을 측정하였다:

식중독 원인균과의 공동응집력 (%) = [

A1, 배양전 식중독 원인균의 흡광도; A2, 배양전 균주의 흡광도; A3, 배양후 혼합균주의 흡광도.

	4 시간
자가응집력( % )
균주
실시예 1	88.13 ± 3.55^e
비교예 1	85.10 ± 1.56^d
식중독 원인균
S. aureus ATCC 6538	29.42 ± 2.14^c
S. enteritidis ATCC 13076	8.88 ± 0.94^a
L. monocytogenes ATCC 15313	12.26 ± 1.59^b
E. coli ATCC 25922	13.26 ± 3.38^b
식중독 원인균과의 공동응집력( % )
실시예 1
S. aureus ATCC 6538	57.09 ± 3.48^d
S. enteritidis ATCC 13076	46.86 ± 4.43^a
L. monocytogenes ATCC 15313	54.07 ± 2.49^cd
E. coli ATCC 25922	49.74 ± 2.45^ab
비교예 1
S. aureus ATCC 6538	62.37 ± 4.83^e1 ⁾
S. enteritidis ATCC 13076	50.32 ± 3.66^ab
L. monocytogenes ATCC 15313	51.73 ± 3.32^bc
E. coli ATCC 25922	51.81 ± 3.11^bc

상기 표 3에 나타난 바와 같이, 실시예 1에 따른 Bacillus subtilis 균주(KCCM12104P)는 비교예 1에 따른 Bacillus clausii 균주(ATCC 700160)에 비해, 자가응집력은 높으면서, S. aureus ATCC 6538, S. enteritidis ATCC 13076, E. coli ATCC 25922와 같은 식중독 원인균과의 공동응집력은 낮은 값을 보이는 것으로 확인된다.

실험예 4: 균주의 식중독 원인균의 장내 부착 저해능 평가

실시예 1에 따른 Bacillus subtilis 균주(KCCM12104P)와 비교예 1에 따른 Bacillus clausii 균주(ATCC 700160)의 식중독 원인균의 장내 부착 저해능을 비교하였다.

구체적으로, 식중독 원인균의 장내 부착 저해능 평가를 위해서 1×10⁵cells/well로 접종한 HT-29(human colon adenocarcinoma cell line) 세포주를 24시간 배양한 후 혼합균(식중독 원인균 및 균주의 혼합균)(10⁶cells/well)을 처리하고 37℃에서 2시간 추가로 배양하였다. Phosphate buffered saline으로 세 번 세척하여 부착되지 않은 균을 제거하였으며 1% Triton X-100 용액을 사용하여 세포주를 떼어낸 후 평판도말법을 이용하여 세포주에 부착된 균수를 측정하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타난 바와 같이, 실시예 1에 따른 Bacillus subtilis 균주(KCCM12104P)는 식중독 원인균의 장내 부착을 효과적으로 저해하는 것으로 확인된다. 특히, 실시예 1에 따른 Bacillus subtilis 균주(KCCM12104P)는 비교예 1에 따른 Bacillus clausii 균주(ATCC 700160) 대비, S. enteritidis ATCC 13076, L. monocytogenes ATCC 15313, E. coli ATCC 25922와 같은 식중독 원인균의 장내 부착을 효과적으로 저해할 수 있는 것으로 확인된다.

특히, 실시예 1에 따른 Bacillus subtilis 균주(KCCM12104P)는 비교예 1에 따른 Bacillus clausii 균주(ATCC 700160) 대비, L. monocytogenes ATCC 15313의 식중독 원인균의 장내 부착을 효과적으로 저해할 수 있는 것으로 확인되는데, 이는 표 3에 나타난 L. monocytogenes ATCC 15313의 식중독 원인균과의 공동응집력 이외에, 실시예 1에 따른 Bacillus subtilis 균주(KCCM12104P)가 생산하는 유기산과 같은 항균성 물질의 작용이 영향을 미친 결과로 볼 수 있다.

즉, 식중독 원인균의 장내 부착 저해능은 식중독 원인균과의 공동응집력뿐만 아니라 균주가 생산하는 항균성 물질 등 대사산물의 작용에 따라 좌우된다고 볼 수 있다.

실험예 5: 균주의 효소 생산능 평가

실시예 1에 따른 Bacillus subtilis 균주(KCCM12104P)의 효소 생산능을 평가하였다.

구체적으로, 효소 생산능 평가를 위해서 API ZYM kit를 이용하였다. 보다 구체적으로, 균주를 대수증식기까지 배양한 후 배양여액 제거를 위해 12,000 rpm에 10분간 원심분리하였다. 세 번 세척하여 균체만 얻은 후 각 기질이 들어있는 큐플에 접종하여 4시간 동안 배양하였다. 그 후 용액 A, B를 각각 넣고 발색 정도에 따라 효소 생산능을 확인하였다.

효소	실시예 1
Control	0
Alkaline phosphatase	0
Esterase	2
Esterase lipase	1
Lipase	0
Leucine arylamidase	0
Valine arylamidase	0
Cystine arylamidase	0
Trypsin	0
α-Chymotrypsin	0
Acid phosphatase	0
Naphthol-AS-BI-phosphohydrolase	1
α-Galactosidase	0
β-Galactosidase	0
β-Glucuronidase	0
α-Glucosidase	0
β-Glucosidase	0
N-Acetyl-β-glucosaminidase	0
α-Mannosidase	0
α-Fucosidase	0

* 0, 1, 2, 3, 4 및 5는 효소 생성능을 의미하는 것으로, 0은 0 nmol; 1은 5 nmol; 2는 10 nmol; 3은 20 nmol; 4는 30 nmol; 및 5는 40 nmol 이상을 의미한다.

상기 표 4에 나타난 바와 같이, 실시예 1에 따른 Bacillus subtilis 균주(KCCM12104P)는 암 유발 효소인 β-글루쿠로니다아제(β-Glucuronidase) 활성을 억제하는바, 생체 안전성이 확보된 것으로 확인된다.

그밖에, 아밀라아제(Amylase) 활성을 측정하기 위해서 균주 상등액 1 mL과 1%의 전분 용액 1 mL을 3분간 반응시킨뒤 DNS시약을 넣고 15분간 끓여주었다. 충분히 식힌 뒤 9 mL의 증류수를 넣고 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 또한, 프로테아제(Protease) 활성을 측정하기 위해서 37℃에서 균주 상등액 1 mL과 0.6% casein 용액을 10분간 반응시킨 뒤 TCA 용액 2 mL을 넣고 10분간 방치하여 반응을 정지시켰다. 반응 정지 후 용액을 여과하고 5 mL의 0.4 M sodium carbonate와 1 mL의 3×Folin & Ciocalteu’s 시약을 넣고 20분간 상온에서 방치한 뒤 660 nm 에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 정량 분석을 통해 아밀라아제(Amylase) 및 프로테아제(Protease) 활성은 각각 0.73 ± 0.10 Unit/mL과 448.08 ± 12.42 Unit/mL로 확인되었다. 아밀라아제(Amylase) 및 프로테아제(Protease) 활성 증가는 소화 기능 개선에 영향을 미칠 수 있다. 특히, 프로테아제(Protease) 활성 증가를 통해 단백질 분해능을 개선시킬 수 있다.

실험예 6: 균주의 항생제 감수성 평가

CLSI(Clinical and Laboratory Standards Institute) 기준에 맞춰, 실시예 1에 따른 Bacillus subtilis 균주(KCCM12104P)의 항생제 감수성을 평가하였다.

구체적으로, 항생제 감수성을 평가하기 위해 균주를 도말한 한천 배지 위에 다음과 같은 여덟 종류의 항생제로서 ampicillin(0.2 mg/mL), gentamicin(0.2 mg/mL), kanamycin(0.6 mg/mL), streptomycin(0.2 mg/mL), tetracycline(0.6 mg/mL), ciprofloxacin(0.1 mg/mL), chloramphenicol(0.6 mg/mL), doxycycline(0.6 mg/mL)를 분주한 페이퍼 디스크를 놓았다. 항생제 내성 강도는 inhibition zone의 직경(mm)을 통해 구분하였고, 그 결과는 하기 표 5에 나타내었다.

항생제	실시예 1
Ampicillin	I
Gentamicin	S
Kanamycin	S
Streptomycin	R
Tetracycline	S
Ciprofloxacin	S
Chloramphenicol	S
Doxycycline	S

* S: 감수성; I: 중간; R: 내성을 의미한다.

상기 표 5에 나타난 바와 같이, 실시예 1에 따른 Bacillus subtilis 균주(KCCM12104P)는 스트렙토마이신(Streptomycin)을 제외하고는, 암피실린(Ampicillin), 젠타마이신(Gentamicin), 카나마이신(Kanamycine), 테트라사이클린(Tetracycline), 시프로플록사신(Ciprofloxacin), 클로람페니콜(Chloramphenicol) 및 독시사이클린(Doxycycline)에 대해 모두 항생제 내성을 가지지 않는바, 항생제 내성 유전자의 전이에 따른 우려는 발생하지 않을 것으로 확인된다.

실험예 7: 균주의 독소 생산능 및 용혈성 평가

실시예 1에 따른 Bacillus subtilis 균주(KCCM12104P)의 독소 생산능 및 용혈성을 평가하였다.

구체적으로, 독소 생산능을 평가하기 위해서 균주를 배양한 뒤 DNA extraction kit를 이용하여 DNA를 추출하였고 PCR을 이용하여 균주에 장내 독소 관련 유전자(hblA, hblC, hblD, nheA, nheB, nheC )의 발현을 검사하였다.

또한, 용혈성을 평가하고자, Sheep blood를 5% 함유한 Columbia agar 배지에 바실러스 균을 스트레이킹하였다. 콜로니 주위에 clear zone이 생기면 α-용혈, green-hued zone이 생기면 β-용혈, 아무런 변화가 없으면 γ-용혈로 나타내었고, 그 결과는 도 4에 나타내었다.

삭제

도 4에 나타난 바와 같이, 실시예 1에 따른 Bacillus subtilis 균주(KCCM12104P)는 투명환을 형성시키지 않으므로, 용혈성을 갖지 않는 것으로 확인된다. 따라서, 이는 안전한 균주인 것으로 확인된다.

하기에 본 발명의 균주를 함유하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1: 산제의 제조

Bacillus subtilis 균주 20 mg

유당수화물 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

제제예 2: 정제의 제조

Bacillus subtilis 균주 10 mg

옥수수전분 100 mg

유당수화물 100mg

스테아르산마그네슘 2mg

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

제제예 3: 캅셀제의 제조

Bacillus subtilis 균주 10 mg

미결정셀룰로오스 3 mg

유당수화물 14.8 mg

스테아르산마그네슘 0.2 mg

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캅셀제의 제조방법에 따라서 젤라틴캡슐에 충전하여 캅셀제를 제조하였다.

제제예 4: 주사제의 제조

Bacillus subtilis 균주 10 mg

만니톨 180mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

인산일수소나트륨 26 mg

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 주사제의 제조방법에 따라 1앰플당(2 mL) 상기의 성분 함량으로 제조하였다.

제제예 5: 액제의 제조

Bacillus subtilis 균주 10 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

레몬향 적량

상기의 성분을 통상의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 정제수를 가하여 전체 100 mL로 조절한 후 멸균시켜 갈색병에 충진하여 액제를 제조한다.

제제예 6: 건강기능식품의 제조

Bacillus subtilis 균주 10 mg

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 ㎎

비타민 B1 0.13 ㎎

비타민 B2 0.15 ㎎

비타민 B6 0.5 ㎎

비타민 B12 0.2 ㎍

비타민 C 10 ㎎

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 ㎎

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 ㎎

산화아연 0.82 ㎎

탄산마그네슘 25.3 ㎎

제1인산칼륨 15 ㎎

제2인산칼슘 55 ㎎

구연산칼륨 90 ㎎

탄산칼슘 100 ㎎

염화마그네슘 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강기능식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강기능식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강기능식품 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7: 건강음료의 제조

Bacillus subtilis 균주 10 mg

비타민 C 15 g

비타민 E(분말) 100 g

젖산철 19.75 g

산화아연 3.5 g

니코틴산아미드 3.5 g

비타민 A 0.2 g

비타민 B1 0.25 g

비타민 B2 0.3g

정제수 정량

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM12104P

20170906

<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp <120> NOVEL STRAIN OF Bacillus subtilis AND COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING OF PHATHOGEN BACTERIUM COMPRISING THE SAME <130> 1063015 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1367 <212> RNA <213> Bacillus subtilis <400> 1 ttgctccctg atgttagcgg cggacgggtg agtaacacgt gggtaacctg cctgtaagac 60 tgggataact ccgggaaacc ggggctaata ccggatggtt gtttgaaccg catggttcag 120 acataaaagg tggcttcggc taccacttac agatggaccc gcggcgcatt agctagttgg 180 tgaggtaacg gctcaccaag gcgacgatgc gtagccgacc tgagagggtg atcggccaca 240 ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtagggaat cttccgcaat 300 ggacgaaagt ctgacggagc aacgccgcgt gagtgatgaa ggttttcgga tcgtaaagct 360 ctgttgttag ggaagaacaa gtgccgttca aatagggcgg caccttgacg gtacctaacc 420 agaaagccac ggctaactac ttgccagcag ccgcggtaat acccccgtgg caagcgttgt 480 ccggaattat tgggcgtaaa gggctcgcag gcggtttctt aagtctgatg tgaaagcccc 540 cggctcaacc cggggagggt cattggaaac tggggaactt gagtgcagaa gaggagagtg 600 gaattccacg tgtagcggtg aaatgcgtag agatgtggag gaacaccagt ggcgaaggcg 660 actctctggt ctgtaactga cgctgaggag cgaaagcgtg gggagcgaac aggattagat 720 accctggtag tccacgccgt aaacgatgag tgctaagtgt tagggggttt ccgcccctta 780 gtgctgcagc taacgcatta agcactccgc ctggggagta cggtcgcaag actgaaactc 840 aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc 900 gaagagcctt accaggtctt gacatcctat gacaatccta gagataggac gtccccttcg 960 ggggcagagt gacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta 1020 agtcccgcaa cgagcgcaac ccttgatctt agttgccagc attcagttgg gcactctaag 1080 gtgactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctta 1140 tgacctgggc tacacacgtg ctacaatgga cagaacaaag ggcagcgaaa ccgcgaggtt 1200 aagccaatcc cacaaatctg ttctcagttc ggatcgcagt ctgcaactcg actgcgtgaa 1260 gctggaatcg ctagtaatcg cggatcagca tgccgcggtg aatacgttcc cgggccttgt 1320 acacaccgcc cgtcacacca cgagagtttg taacacccga agtcggt 1367

Claims

식중독 원인균의 장내 부착 저해능을 가지고,
상기 식중독 원인균은 살모넬라균, 리스테리아균 및 대장균으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주(KCCM12104P).
삭제
제1항에 있어서,
상기 균주는 자가응집력 및 상기 식중독 원인균과의 공동응집력을 가지는, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주(KCCM12104P).
제1항에 있어서,
상기 균주는 서열번호 1의 16S rRNA 염기서열을 포함하는, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주(KCCM12104P).
제1항에 있어서,
상기 균주는 하기 ⅰ) 내지 ⅲ)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 특징을 추가로 가지는, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주(KCCM12104P):
ⅰ) 내산성, 내담즙성 또는 장부착능;
ⅱ) 아밀라아제(Amylase) 또는 프로테아제(Protease) 활성 증가; 및
ⅲ) 젠타마이신(Gentamicin), 카나마이신(Kanamycine), 테트라사이클린(Tetracycline), 시프로플록사신(Ciprofloxacin), 클로람페니콜(Chloramphenicol) 또는 독시사이클린(Doxycycline)에 대한 항생제 감수성.
삭제
삭제
바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주(KCCM12104P)를 유효성분으로 포함하고,
상기 균주는 식중독 원인균의 장내 부착 저해능을 가지고,
상기 식중독 원인균은 살모넬라균, 리스테리아균 및 대장균으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인, 프로바이오틱스.
제8항에 있어서
상기 균주는 생균체, 사균체 또는 배양여액인 것인, 프로바이오틱스.
삭제