KR101884326B1 - 신규 락토바실러스 브레비스 g1 균주 및 이를 포함하는 식품 알레르기 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

신규 락토바실러스 브레비스 g1 균주 및 이를 포함하는 식품 알레르기 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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백현동
임성일
이소영
이은정
이나경
전혜린
남영도
박소림
손성호
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건국대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 식품 알레르기 억제 활성을 가지는 락토바실러스 브레비스 G1(Lactobacillus brevis G1) 균주(KCCM11898P) 및 이를 유효성분으로 포함하는 식품 알레르기 예방, 치료 또는 개선용 조성물에 관한 것이다.

Description

신규 락토바실러스 브레비스 G1 균주 및 이를 포함하는 식품 알레르기 예방 또는 치료용 조성물{NOVEL STRAIN OF Lactobacillus brevis G1 AND COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING OF FOOD ALLERGY COMPRISING THE SAME}
본 발명은 신규 락토바실러스 브레비스 G1 균주 및 이를 포함하는 식품 알레르기 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
배추, 고추, 젓갈 등 다양한 재료로 만들어지는 한국의 전통적인 발효식품인 김치에는 항산화, 항염, 항균, 면역증진 등 다양한 효과를 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 이로운 효과는 김치가 발효 및 숙성하는데 중요한 역할을 하는 락토바실러스속(Lactobacillus), 류코노스톡속(Leuconostoc), 페디오코커스속(Pediococcus) 등의 다양한 유산균의 발효산물에 의해 발생한다고 알려져 있다.
프로바이오틱스란 섭취시 위 및 소장관내로 살아있는 상태로 생존하여 유익한 효과를 주는 미생물로 정의하고 있다. 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)는 미국 FDA에서 인정된 GRAS(Generally Recognized As Safe) 균주이며 유산균 발효식품 및 프로바이오틱스 제품형태로 오래전부터 다양하게 사용되어 왔다. 프로바이오틱스로 인정받기 위해서는 균주가 체내의 위산 및 담즙산에 대해 생존하여 소장까지 도달하여야 하며 장 상피세포에 부착하여 항균, 항염 등 유용한 효과를 나타내며 독성이 없고 비병원성이어야 한다. 이러한 프로바이오틱스의 기능성은 현재까지도 다양하게 연구되고 있다.
한편, 알레르기 관련 질환은 환경적인 요인의 악화로 인해 서서히 증가하고 있는 추세이다. 현재에는 전 세계 인구의 20% 정도가 알레르기 관련 질환으로 고통받고 있으며 심각한 사회문제를 일으키고 있기 때문에 대두되고 있는 실정이다.
본 발명은 식품 알레르기 억제 활성을 가지는 락토바실러스 브레비스 G1(Lactobacillus brevis G1) 균주(KCCM11898P) 등을 제공하고자 한다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 식품 알레르기 억제 활성을 가지는 락토바실러스 브레비스 G1(Lactobacillus brevis G1) 균주(KCCM11898P)을 제공한다.
상기 식품 알레르기 억제 활성은 Th1/Th2 균형 조절 또는 Th2 관련 사이토카인 억제를 통해 구현되는 것일 수 있다.
상기 식품 알레르기는 직장온도 감소, 설사 및 아나필락시스로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 증상을 나타낼 수 있다.
상기 균주는 하기 ⅰ) 내지 ⅲ)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 특징을 추가로 가질 수 있다:
ⅰ) 내산성, 내담즙성 또는 장부착능;
ⅱ) 생체 안전성; 및
ⅲ) 항생제 내성.
상기 ⅱ)에서 생체 안전성은 β-글루쿠로니다아제(β-Glucuronidase) 또는 N-아세틸-β-글루코사미니다아제(N-Acetyl-β-glucosaminidase) 생성 억제를 통해 구현되는 것일 수 있다.
상기 ⅲ)에서 항생제 내성은 카나마이신(Kanamycine), 스트렙토마이신(Streptomycin) 또는 시프로플록사신(Ciprofloxacin)에 대한 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로, 락토바실러스 브레비스 G1(Lactobacillus brevis G1) 균주(KCCM11898P)를 유효성분으로 포함하는 식품 알레르기 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 균주는 생균체, 사균체 또는 배양여액인 것일 수 있다.
상기 식품 알레르기는 직장온도 감소, 설사 및 아나필락시스로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 증상을 나타낼 수 있다.
상기 조성물은 직장 온도를 35℃ 이상으로 유지시키기 위한 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 락토바실러스 브레비스 G1(Lactobacillus brevis G1) 균주(KCCM11898P)를 유효성분으로 포함하는 식품 알레르기 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명은 식품 알레르기 억제 활성을 가지는 락토바실러스 브레비스 G1(Lactobacillus brevis G1) 균주(KCCM11898P) 및 이를 포함하는 식품 알레르기 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 상기 균주(KCCM11898P)는 면역 활성화를 통해 식품 알레르기 억제 활성을 가지는바, 직장온도 감소 완화, 설사 및 아낙필락시스 증상 완화 효과를 가진다. 뿐만 아니라, 상기 균주(KCCM11898P)는 내산성, 내담즙성 또는 장부착능; 생체 안정성; 및 항생제 내성이 우수한 이점을 가진다.
도 1은 Lactobacillus brevis G1 균주의 계통도를 보여주는 그림이다.
도 2(a)는 실시예 1에 따른 Lactobacillus brevis G1 균주 투여에 따른 비장에서의 Th2 관련 사이토카인 억제 활성을 보여주는 그래프이고, 도 2(b)는 실시예 1에 따른 Lactobacillus brevis G1 균주 및 비교예 2~3에 따른 Lactobacillus brevis 균주 투여에 따른 장간막림프절에서의 Th2 관련 사이토카인 억제 활성을 보여주는 그래프이다.
도 3(a)~(c)는 실시예 1에 따른 Lactobacillus brevis G1 균주와 비교예 2~3에 따른 Lactobacillus brevis 균주 투여에 따른 직장 온도의 변화, 설사 및 아나필락시스 증상 여부를 보여주는 그래프이다.
본 발명자들은 Lactobacillus brevis 균주 중에서도, 식품 알레르기 억제 활성을 가지는 Lactobacillus brevis G1 균주(KCCM11898P)를 분리 및 동정하고, 이의 면역 활성화를 통한 식품 알레르기 억제 활성을 확인하였고, 또한, 이의 내산성, 내담즙성 또는 장부착능; 생체 안정성; 및 항생제 내성을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 식품 알레르기 억제 활성을 가지는 락토바실러스 브레비스 G1(Lactobacillus brevis G1) 균주(KCCM11898P)을 제공한다.
상기 락토바실러스 브레비스 G1(Lactobacillus brevis G1) 균주(KCCM11898P)는 락토바실러스 브레비스의 아종으로 볼 수 있다. 락토바실러스 브레비스는 젖산과 초산, 에탄올, 탄산가스 등을 생성하는 헤테로 젖산균의 일종으로서, 김치 또는 치즈의 발효 후반에 많이 증식하며, 통상적으로 내산성 및 내답증성이 우수한 것으로 알려져 있다.
상기 락토바실러스 브레비스 G1(Lactobacillus brevis G1) 균주(KCCM11898P)의 계통도는 도 1에 도시한 바와 같으며, 배추김치, 열무김치, 깍두기 등 다양한 김치의 발효 후반에 증식할 수 있다.
먼저, 상기 락토바실러스 브레비스 G1(Lactobacillus brevis G1) 균주(KCCM11898P)는 Lactobacillus brevis 균주 중에서도 특히 우수한 식품 알레르기 억제 활성을 가지는 것을 특징으로 한다.
본 명세서 내 “식품 알레르기”라 함은 식품 섭취에 의해 발생하는 알레르기를 의미하는 것으로, 식품 섭취 후, 수십분 내에 증상이 나타나는 즉시형, 수시간~수일간 발병하는 지연형 외에, 잠재성 식품 알레르기라고 하는 감작상태가 변동하는 경우도 있다.
상기 식품 알레르기 억제 활성은 Th1/Th2 균형 조절(즉, Th1 관련 사이토카인 활성과 동시에, Th2 관련 사이토카인 억제) 또는 Th2 관련 사이토카인 억제, 즉, 면역 활성화를 통해 구현되는 것일 수 있다. 구체적으로, Th1 관련 사이토카인으로는 IFN-γ가 있고, Th2 관련 사이토카인으로는 IL-4 또는 IL-10이 있다.
상기 식품 알레르기는 소화기, 호흡기, 피부 등에서 증상이 나타낼 수 있고, 구체적으로, 직장온도 감소, 설사 및 아나필락시스로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 증상을 나타내는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 락토바실러스 브레비스 G1(Lactobacillus brevis G1) 균주(KCCM11898P)는 하기 ⅰ) 내지 ⅲ)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 특징을 추가로 가질 수 있다:
ⅰ) 내산성, 내담즙성 또는 장부착능;
ⅱ) 생체 안전성; 및
ⅲ) 항생제 내성.
상기 ⅰ)에서 내산성은 pH 2.5 조건에서 3시간 반응시, 균주의 생존율이 90% 이상일 수 있고, 내답즙성은 0.3% oxagall 조건에서 24시간 반응시, 균주의 생존율이 100% 이상일 수 있다.
상기 ⅱ)에서 생체 안전성은 효소 생산능 생성 및 세포독성 억제를 통해 구현될 수 있는 것으로, 구체적으로, β-글루쿠로니다아제(β-Glucuronidase) 또는 N-아세틸-β-글루코사미니다아제(N-Acetyl-β-glucosaminidase) 생성 억제를 통해 구현되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 이때, β-글루쿠로니다아제(β-Glucuronidase) 또는 N-아세틸-β-글루코사미니다아제(N-Acetyl-β-glucosaminidase)는 암 유발 효소로 분류되는바, 이의 생성을 억제함으로써, 생체 안전성을 확보할 수 있다.
상기 ⅲ)에서 항생제 내성은 카나마이신(Kanamycine), 스트렙토마이신(Streptomycin) 또는 시프로플록사신(Ciprofloxacin)에 대한 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 브레비스 G1(Lactobacillus brevis G1) 균주(KCCM11898P)를 유효성분으로 포함하는 식품 알레르기 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 락토바실러스 브레비스 G1(Lactobacillus brevis G1) 균주(KCCM11898P)에 대해서는 전술한 바와 같다. 또한, 상기 균주는 생균체, 사균체 또는 배양여액인 것일 수 있다.
상기 식품 알레르기는 소화기, 호흡기, 피부 등에서 증상이 나타낼 수 있고, 구체적으로, 직장온도 감소, 설사 및 아나필락시스로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 증상을 나타내는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 조성물은 직장 온도를 35℃ 이상으로 유지시키기 위한 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 균주(KCCM11898P)의 용량은 1㎍/㎖ 내지 100㎍/㎖인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 이때, 상기 균주(KCCM11898P)의 용량이 상기 범위 미만인 경우, 식품 알레르기 예방 또는 치료 효과를 발휘하기 어려운 문제점이 있고, 상기 균주(KCCM11898P)의 용량이 상기 범위를 초과하는 경우, 세포독성을 포함한 독성의 우려사항이 있을 수 있다.
본 발명에 따른 식품 알레르기 예방 또는 치료용 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구제 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화되어 사용할 수 있고, 제형화를 위하여 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.
상기 담체 또는, 부형제 또는 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리게이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조할 수 있다.
경구 투여를 위한 고형제제는 상기 균주(KCCM11898P)에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 제조할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다.
경구를 위한 액상 제제로는 현탁액, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용하는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등을 사용할 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤젤라틴 등을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 식품 알레르기 예방 또는 치료용 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서는 1일 0.0001 내지 2,000 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 2,000 mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수회 나누어서 투여할 수도 있다. 다만, 상기 투여량에 의해서 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명에 따른 식품 알레르기 예방 또는 치료용 약학 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유 동물에 다양한 경로로 투여할 수 있다. 투여의 모든 방식은 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해서 투여할 수 있다.
또한, 본 발명은 락토바실러스 브레비스 G1(Lactobacillus brevis G1) 균주(KCCM11898P)를 유효성분으로 포함하는 식품 알레르기 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
상기 락토바실러스 브레비스 G1(Lactobacillus brevis G1) 균주(KCCM11898P)에 대해서는 전술한 바와 같다. 또한, 상기 균주는 생균체, 사균체 또는 배양여액인 것일 수 있다.
상기 식품 알레르기는 소화기, 호흡기, 피부 등에서 증상이 나타낼 수 있고, 구체적으로, 직장온도 감소, 설사 및 아나필락시스로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 증상을 나타내는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 건강기능식품은 직장 온도를 35℃ 이상으로 유지시키기 위한 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 식품 알레르기 예방 또는 개선용 건강기능식품에 있어서, 상기 균주(KCCM11898P)를 건강기능식품의 첨가물로 사용하는 경우 이를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 예방, 건강 또는 치료 등의 각 사용 목적에 따라 적합하게 결정할 수 있다.
건강기능식품의 제형은 산제, 과립제, 환, 정제, 캡슐제의 형태뿐만 아니라 일반 식품 또는 음료의 형태 어느 것이나 가능하다.
상기 식품의 종류에는 특별히 제한은 없고, 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸콜렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함할 수 있다.
일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 상기 균주(KCCM11898P)는 원료 100 중량부에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가할 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있다.
본 발명에 따른 건강기능식품 중 음료는 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명에 따른 음료 100 mL당 약 0.01 ~ 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ~ 0.03 g일 수 있다.
상기 외에 본 발명에 따른 식품 알레르기 예방 또는 개선용 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제를 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명에 따른 식품 알레르기 예방 또는 개선용 건강기능식품은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 제한되지 않으나 본 발명에 따른 식품 알레르기 예방 또는 개선용 건강기능식품 100 중량부 대비 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
전술한 바와 같이, 본 발명은 식품 알레르기 억제 활성을 가지는 락토바실러스 브레비스 G1(Lactobacillus brevis G1) 균주(KCCM11898P) 및 이를 포함하는 식품 알레르기 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 상기 균주(KCCM11898P)는 면역 활성화를 통해 식품 알레르기 억제 활성을 가지는바, 직장온도 감소 완화, 설사 및 아낙필락시스 증상 완화 효과를 가진다. 뿐만 아니라, 상기 균주(KCCM11898P)는 내산성, 내담즙성 또는 장부착능; 생체 안정성; 및 항생제 내성이 우수한 이점을 가진다.
그밖에, 인비트로(in vitro) 상에서 락토바실러스 브레비스 G1(Lactobacillus brevis G1) 균주(KCCM11898P)를 유효성분으로 포함하여 Th1/Th2 균형 조절(즉, Th1 관련 사이토카인 활성과 동시에, Th2 관련 사이토카인 억제) 또는 Th2 관련 사이토카인을 억제하기 위한 조성물을 제공한다.
또한, 인간을 제외한 포유동물에 락토바실러스 브레비스 G1(Lactobacillus brevis G1) 균주(KCCM11898P)를 투여하여 Th1/Th2 균형 조절(즉, Th1 관련 사이토카인 활성과 동시에, Th2 관련 사이토카인 억제) 또는 Th2 관련 사이토카인을 억제하는 방법을 제공한다.
상기 락토바실러스 브레비스 G1(Lactobacillus brevis G1) 균주(KCCM11898P)에 대해서는 전술한 바와 같다. 또한, 상기 균주는 생균체, 사균체 또는 배양여액인 것일 수 있다.
상기 방법은 카월을 마우스, 래트, 가축 등의 포유동물에 다양한 방식으로 투여함으로써 이루어질 수 있고, 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 주입, 기관(trachea) 주입, 또는 기도(airway) 주입 등으로 투여할 수 있으며, 가장 바람직하게는 호흡기 등을 통하여 기도에 직접 투여할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 >
실시예 1: Lactobacillus brevis G1 균주(GK6) 분리 및 동정
신규 균주를 분리하기 위해, 집에서 담근 배추김치, 열무김치, 깍두기 등의 다양한 김치 국물을 샘플링하여 시료로 사용하였다. 김치 국물을 10배 희석법을 사용하여 MRS 한천 배지, LBS 한천 배지, PES 한천 배지에 도말하고 여러 차례 획선 도말하고 배양한 후 콜로니 형태를 관찰하여 신규 균주를 분리하였다. 분리된 신규 균주의 동정을 위해 Bionics(Seoul, Korea)에 16S rRNA 서열분석을 의뢰하였다. 구체적으로, 16S rRNA 서열분석을 수행하였고, 16S rRNA 유전자를 27F와 1492R 프라이머(primer)를 이용하여 PCR을 진행하였다. 염기서열을 분석하여 나온 결과를 토대로 BLAST 프로그램을 이용하여 Genbank의 데이터베이스에 등록된 다른 표준균주와 상동성을 비교하였다. 신규 균주는 Lactobacillus brevis G1 균주로 확인되었고, 유사성은 99%로 나타났다. 또한, Mega 7 program을 이용하여 상동성을 분석하고 계통도를 얻었다(도 1). 이때, Lactobacillus brevis G1 균주는 2016년 9월 22일자로 한국미생물보존센터에 기탁하여 수탁번호 KCCM 11898P를 부여받았다.
이후, Lactobacillus brevis G1 균주를 lactobacilli MRS broth에서 37℃, 18시간 동안 배양한 이후 원심분리(5,000×g, 10분)하여 침전물(균체)과 상층액(배양여액)으로 분리하였고. 침전물을 동결건조시킨 후 생균체를 제조하였고, 여기에 추가적인 열처리(121℃, 5 min)를 통하여 사균체를 제조하였다.
비교예 1: Lactobacillus brevis 균주( KCTC 3498) 준비
상업용 프로바이오틱스로 알려진 Lactobacillus brevis 균주(KCTC 3498, ATCC®14869™)를 준비하였다(Ronka et al., 2003). 배양 조건은 G1 균주와 동일하게 준비하였다.
비교예 2: Lactobacillus brevis B151 균주(GK1) 준비
전통발효식품으로부터 분리한 Lactobacillus brevis B151 균주를 준비하였다. 배양 조건은 G1 균주와 동일하게 준비하였다.
비교예 3: Lactobacillus brevis 균주( KCCM 200054)( GK8) 준비
전통발효식품으로부터 분리한 Lactobacillus brevis 균주(KCCM 200054)를 준비하였다. 배양 조건은 G1 균주와 동일하게 준비하였다.
균주명
실시예 1 Lactobacillus brevis G1 균주(KCCM11898P)
비교예 1 Lactobacillus brevis 균주(KCTC 3498)
비교예 2 Lactobacillus brevis B151 균주
비교예 3 Lactobacillus brevis 균주(KCCM 200054)
실험예 1: 균주의 내산성 , 내담즙성 및 장부착능 평가
실시예 1에 따른 Lactobacillus brevis G1 균주와 비교예 1에 따른 Lactobacillus brevis 균주 KCTC 3498의 내산성, 내담즙성 및 장부착능을 비교하였다.
구체적으로, 내산성 평가를 위해서 인공위액(pH 2.5, 0.3% pepsin)을 만들어 균주를 3시간 동안 반응시킨 후 살아있는 균수를 확인하였고, 내담즙성 평가를 위해서 배지에 0.3% oxgall을 첨가하여 균주를 24시간 동안 반응시킨 후 살아있는 균수를 측정하였다. 또한, 장부착능 평가를 위해서 1×105cells/well로 접종한 HT-29(human colon adenocarcinoma cell line) 세포주를 24시간 배양한 후 균주(1×107CFU/well)을 처리하고 2시간 추가로 배양하였다. Phosphate buffered saline으로 세 번 세척하여 부착되지 않은 균을 제거하였으며 1% Triton X-100 용액을 사용하여 세포주를 떼어낸 후 평판도말법을 이용하여 세포주에 부착된 균수를 측정하였으며, 그 결과는 하기 표 2에 나타내었다.
내산성 평가(%) 내담즙성 평가(%) 장부착능 평가(%)
실시예 1 99.30 106.85 2.62±0.22
비교예 1 83.70 88.77 0.72±0.11
상기 표 2에 나타난 바와 같이, 실시예 1에 따른 Lactobacillus brevis G1 균주는 산성 조건에서 3시간을 기준으로 약 99% 이상의 균수를 유지하는바, 우수한 내산성을 가지는 것으로 확인되고, 담즙성 조건에서 24시간을 기준으로 약 100% 이상의 균수를 유지하는바, 우수한 내담즙성을 가지는 것으로 확인된다. 다만, Lactobacillus brevis 균주라 할지라도, 비교예 1의 경우 실시예 1에 비해 내산성 및 내담즙성이 크게 저하되는 것으로 확인된다.
또한, 실시예 1에 따른 Lactobacillus brevis G1 균주는 HT-29 세포주에 약 2.62%가 부착되어 우수한 장부착능을 보여주는 반면, 비교예 1의 경우 실시예 1에 비해 장부착능이 크게 저하되는 것으로 확인된다.
실험예 2: 균주의 생체 안전성 평가
실시예 1에 따른 Lactobacillus brevis G1 균주와 비교예 1~3에 따른 Lactobacillus brevis 균주의 효소 생산능 및 세포독성을 비교하였다.
구체적으로, 효소 생산능 평가를 위해서 API ZYM kit를 이용하였다. 보다 구체적으로, 균주를 대수증식기까지 배양한 후 배양여액 제거를 위해 12,000rpm에 10분간 원심분리하였다. 세 번 세척하여 균체만 얻은 후 각 기질이 들어있는 큐플에 접종하여 4시간 동안 배양하였다. 그 후 용액 A, B를 각각 넣고 발색 정도에 따라 효소 생산능을 확인하였고, 그 결과는 표 3에 나타내었다.
효소 실시예 1 비교예 1 비교예 2 비교예 3
Control 0 0 0 0
Alkaline phosphatase 0 0 0 0
Esterase 0 0 0 0
Esterase lipase 0 0 0 0
Lipase 0 0 0 0
Leucine arylamidase 4 3 4 4
Valine arylamidase 3 2 3 2
Cystine arylamidase 0 0 0 0
Trypsin 0 0 0 0
α-Chymotrypsin 0 0 0 0
Acid phosphatase 2 1 1 1
Naphthol-AS-BI-phosphohydrolase 1 2 1 1
α-Galactosidase 0 0 1 0
β-Galactosidase 4 4 3 2
β-Glucuronidase 0 0 0 0
α-Glucosidase 4 1 1 1
β-Glucosidase 5 3 5 3
N-Acetyl-β-glucosaminidase 0 0 0 0
α-Mannosidase 0 0 0 0
α-Fucosidase 0 0 0 0
상기 표 3에서, 0, 1, 2, 3, 4 및 5는 효소 생성능을 의미하는 것으로, 0은 0 nmol; 1은 5 nmol; 2는 10 nmol; 3은 20 nmol; 4는 30 nmol; 및 5는 40 nmol 이상을 의미한다.
상기 표 3에 나타난 바와 같이, 실시예 1 및 비교예 1~3에 따른 균주 모두 암 유발 효소인 β-글루쿠로니다아제(β-Glucuronidase) 및 N-아세틸-β-글루코사미니다아제(N-Acetyl-β-glucosaminidase) 생성을 억제하는바, 생체 안전성이 확보된 것으로 확인된다.
또한, 정상세포에 대한 세포독성 평가를 위해서, MTT assay를 이용하여 정상세포에 대해 세포독성을 나타내는 농도를 확인하였다. 세포주의 농도를 2×105CFU/mL로 조절하여 100 μL씩 96 well plate에 접종하여 37℃, CO2incubator에서 24시간 동안 전 배양한 후, washing한 균을 적정 농도로 조절하여 100 μL씩 분주하고, 3시간 동안 추가 배양하였다. 배양이 끝나기 4시간 전에 MTT(0.5 mg/mL 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyltetrazolium bromide in PBS) 시약 50 μL씩 각각 첨가한 후 시간 추가 배양하여 formazan 형성을 유도시키고, 이것을 용해시키기 위하여 dimethyl sulfoxide (DMSO)를 각 well 당 100 μL씩 첨가한 후 plate shaker에서 20분 간 교반하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 저해율이 50% 이상인 경우에 세포독성이 있다고 판정하였다.
세포독성(Cytotoxicity)(%) = 1 - (처리된 세포의 흡광도)/(대조군 세포의 흡광도)× 100
그 결과는 표 4에 나타내었다.
세포독성(%)
실시예 1 0.44±0.76
비교예 1 59.48±8.38
비교예 2 9.38±6.63
비교예 3 17.42±1.12
상기 표 4에 나타난 바와 같이, 실시예 1에 따른 Lactobacillus brevis G1 균주는 정상세포에 대한 세포독성이 극히 낮으므로, 사람이 섭취한 경우에도 안전한 것으로 확인되나, 비교예 1~3의 경우 실시예 1에 비해 세포독성이 크게 증가하는 것으로 확인된다.
실험예 3: 균주의 항생제 내성 평가
CLSI(Clinical and Laboratory Standards Institute) 기준에 맞춰, 실시예 1에 따른 Lactobacillus brevis G1 균주와 비교예 1~3에 따른 Lactobacillus brevis 균주의 항생제 내성을 비교하였다.
구체적으로, 균주를 도말한 한천 배지 위에 다음과 같은 여덟 종류의 항생제로서 ampicillin(0.2mg/mL), gentamicin(0.2mg/mL), kanamycin(0.6mg/mL), streptomycin(0.2mg/mL), tetracycline(0.6mg/mL), ciprofloxacin(0.1mg/mL), chloramphenicol(0.6mg/mL), doxycycline(0.6mg/mL)를 분주한 페이퍼 디스크를 놓았다. 항생제 내성 강도는 inhibition zone의 직경(mm)을 통해 구분하였고, 그 결과는 하기 표 5에 나타내었다.
항생제 실시예 1 비교예 1 비교예 2 비교예 3
Ampicillin S S S S
Gentamicin S R R R
Kanamycin R R R R
Streptomycin R R R R
Tetracycline S S S S
Ciprofloxacin R R R R
Chloramphenicol S S S S
Doxycycline S S S S
상기 표 5에서, S는 민감성을, R은 내성을 의미한다.
상기 표 5에 나타난 바와 같이, 실시예 1 및 비교예 1~3에 따른 균주 모두 카나마이신(Kanamycine), 스트렙토마이신(Streptomycin) 또는 시프로플록사신(Ciprofloxacin)에 대한 항상제 내성을 보였으며, 이는 CLSI 기준에 적합한 것으로 확인된다.
실험예 4: 균주의 면역활성화( Th1 / Th2 균형 조절 또는 Th2 관련 사이토카인 억제) 평가
먼저, 실시예 1에 따른 Lactobacillus brevis G1 균주(생균체, 사균체 및 배양여액)의 Th1/Th2 균형 조절을 평가하였다.
구체적으로, 5주령의 암컷 BALB/C 생쥐에 1주 간격으로 2차례 알레르겐(OVA)을 복강면역하여 알레르기를 유발하였다. OVA (20μg)와 알럼(aluminum hydroxide gel, 2 mg)의 혼합액을 30분간 섞어준 다음 한 마리당 100 μL씩 복강 주사하였다. 면역 1주 후 생쥐 비장 및 장간막 림프절을 적출하여 단세포화세포를 96-well plate에 5×106cell/well로 분주하였다. 이때 항원(OVA, 100μg/mL) 및 실시예 1에 따른 Lactobacillus brevis G1 균주(생균체, 사균체 및 배양여액)를 1×107CFU/well농도로 첨가하고 37℃ CO2인큐베이터에서 72시간 배양 후 상등액을 회수하고 대표적인 Th2 관련 사이토카인인 IL-4와 대표적인 Th1 관련 사이토카인인 IFN-v 분비량을 측정하였다. 표 6에서는 실시예 1에 따른 Lactobacillus brevis G1 균주 처리에 따른 비장 세포 배양액의 사이토카인 패턴을, 표 7에서는 실시예 1에 따른 Lactobacillus brevis G1 균주 처리에 따른 비장 세포 배양액의 사이토카인 패턴을 나타내었다.
처리농도 IL-4 IFN-γ IFN-γ/
IL-4
PBS 100 μL 126.44±1.36 1450.27±71.58 11.47
실시예 1(생균체) 1×107CFU 33.17±0.91 1836.77±69.M 55.37
실시예 2(사균체) 1×107CFU 49.78±4.47 1937.50±41.44 38.92
실시예 3(배양여액) 100 μg/mL 56.52±6.52 1863.698±23.87 32.97
처리농도 IL-4 IFN-γ IFN-γ/
IL-4
PBS 100 μL 33.70±0.44 315.00±2.34 9.35
실시예 1(생균체) 1×107CFU 17.01±2.63 1214.54±59.38 71.39
실시예 2(사균체) 1×107CFU 33.56±2.01 1277.75±128.35 38.07
실시예 3(배양여액) 100 μg/mL 16.86±2.21 924.25±68.40 54.82
표 6 및 표 7에 나타난 바와 같이, 실시예 1에 따른 Lactobacillus brevis G1의 처리시 처리 형태(생균체, 사균체 및 배양여액)에 따른 차이가 있기는 하였으나, 비장세포 및 장간막림프절 모두에서 IL-4는 PBS 처리군 대비 감소하였으며, IFN-γ는 PBS 처리군 대비 증가하였는바 Th1/Th2 균형 조절(즉, Th1 관련 사이토카인 활성과 함께, Th2 관련 사이토카인 억제)이 있는 것으로 확인된다. 생균체, 사균체 및 배양여액 중에서는 생균체가 처리시 가장 뛰어난 Th1/Th2 균형 조절을 보이는 것으로 확인된다.
다음으로, 실시예 1에 따른 Lactobacillus brevis G1 균주(생균체)와 비교예 2~3에 따른 Lactobacillus brevis 균주(생균체)의 Th2 관련 사이토카인 억제 활성을 비교하였다.
구체적으로, 각 그룹의 마우스에서 비장(SPL) 및 장간막림프절(mLN)을 적출한 후, 단세포화한 세포(single cell suspension)를 1x107cells/well농도로 96-well plate에 seeding하고, 항원 특이적 반응을 확인하기 위해 세포에 OVA를 20μg 처리한 후, 72시간 동안 배양하였다. 72시간 배양 후, 상등액에 존재하는 사이토카인을 BD사의 사이토카인 정량 키트를 이용하여 ELISA 방법을 통해 확인하였다. 도 2(a)에서는 실시예 1에 따른 Lactobacillus brevis G1 균주 투여에 따른 비장에서의 Th2 관련 사이토카인 억제 활성을, 도 2(b)에서는 실시예 1에 따른 Lactobacillus brevis G1 균주 및 비교예 2~3에 따른 Lactobacillus brevis 균주 투여에 따른 장간막림프절에서의 Th2 관련 사이토카인 억제 활성을 보여주었다.
도 2(a) 및 (b)에 나타난 바와 같이, 실시예 1에 따른 Lactobacillus brevis G1 균주(GK6) 투여시 비장 배양상등액 및 장간막림프절 배양상등액에서 알레르기 증상 유도 및 지속과 관련이 있는 Th2 관련 사이토카인에 해당하는 IL-4, IL-10 및 IL-5의 생성이 억제됨을 확인할 수 있었다. 반면, 비교예 2~3에 따른 Lactobacillus brevis 균주(GK1, GK8) 투여시 장간막림프절 배양상등액에서 IL-4, IL-10 및 IL-5의 생성 억제 활성은 효과적이지 못한 것으로 확인된다.
실험예 5: 균주의 식품 알레르기 억제 활성 평가
실시예 1에 따른 Lactobacillus brevis G1 균주(생균체)와 비교예 2~3에 따른 Lactobacillus brevis 균주(생균체)의 식품 알레르기 억제 활성을 평가하였다.
구체적으로, 실험동물은 5주령의 자성 BALB/C 마우스를 (주)오리엔트바이오로부터 공급받아 실험동물실에서 일주일간 사육, 순화시킨 후 사용하였다. OVA (20μg) 및 알럼 (2mg) 혼합 용액을 마리당 100μL씩 복강 주사하여 1차 면역하고, 14일 뒤 동일한 방법으로 2차 면역을 실시하였다. 2차 면역 14일 후 균주(생균체)를 마리당 5×108CFU/일 농도로 매일 투여하였다. 이때 정상대조군(Naive)과 식품 알레르기 유도군(Sham)에는 균주 현탁액 대신 현탁 용매인 PBS를 동량 투여하였으며, 양성대조군[PC(daxa)]은 면역억제제인 덱사메타손을 투여하였다. 식품 알레르기 유도를 위해 2차 면역 14일 후부터 3일 간격으로 모든 group에 50 mg/마리/일 농도의 OVA를 경구 투여하여 식품 알레르기를 유발시켰다. OVA 경구투여 후 30분 간격으로 식품 알레르기 유발 지표인 직장 온도의 변화를 20분 간격으로 60분 동안 측정하였으며, 설사 및 아나필락시스 증상 여부를 확인하였다(도 3(a)~(c)).
도 3(a)~(c)에 나타난 바와 같이, 실시예 1에 따른 Lactobacillus brevis G1 균주(GK6) 투여시 직장 온도 감소가 크게 완화됨을 확인할 수 있었으며, 설사 및 아나필락시스 증상 역시 식품 알레르기 유도군(Sham) 대비 크게 감소하는바, 식품 알레르기 억제 활성을 가지는 것으로 확인된다. 반면, 비교예 2~3에 따른 Lactobacillus brevis 균주(GK1, GK8) 투여시에는 실시예 1에 비해 직장 온도 감소 정도가 크며, 설사 및 아나필락시스 증상이 식품 알레르기 유도군(Sham) 대비 감소하지 않는 것으로 확인된다.
하기에 본 발명의 Lactobacillus brevis G1 균주를 함유하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예 1: 산제의 제조
Lactobacillus brevis G1 균주 20 mg
유당수화물 100 mg
탈크 10 mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
제제예 2: 정제의 제조
Lactobacillus brevis G1 균주 10 mg
옥수수전분 100 mg
유당수화물 100mg
스테아르산마그네슘 2mg
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
제제예 3: 캅셀제의 제조
Lactobacillus brevis G1 균주 10 mg
미결정셀룰로오스 3 mg
유당수화물 14.8 mg
스테아르산마그네슘 0.2 mg
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캅셀제의 제조방법에 따라서 젤라틴캡슐에 충전하여 캅셀제를 제조하였다.
제제예 4: 주사제의 제조
Lactobacillus brevis G1 균주 10 mg
만니톨 180mg
주사용 멸균 증류수 2974 mg
인산일수소나트륨 26 mg
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 주사제의 제조방법에 따라 1앰플당(2mL) 상기의 성분 함량으로 제조하였다.
제제예 5: 액제의 제조
Lactobacillus brevis G1 균주 10 mg
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
레몬향 적량
상기의 성분을 통상의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 정제수를 가하여 전체 100mL로 조절한 후 멸균시켜 갈색병에 충진하여 액제를 제조한다.
제제예 6: 건강기능식품의 제조
Lactobacillus brevis G1 균주 10 mg
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이트 70 ㎍
비타민 E 1.0 ㎎
비타민 B1 0.13 ㎎
비타민 B2 0.15 ㎎
비타민 B6 0.5 ㎎
비타민 B12 0.2 ㎍
비타민 C 10 ㎎
비오틴 10 ㎍
니코틴산아미드 1.7 ㎎
엽산 50 ㎍
판토텐산 칼슘 0.5 ㎎
무기질 혼합물 적량
황산제1철 1.75 ㎎
산화아연 0.82 ㎎
탄산마그네슘 25.3 ㎎
제1인산칼륨 15 ㎎
제2인산칼슘 55 ㎎
구연산칼륨 90 ㎎
탄산칼슘 100 ㎎
염화마그네슘 24.8 ㎎
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강기능식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강기능식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강기능식품 제조에 사용할 수 있다.
제제예 7: 건강음료의 제조
Lactobacillus brevis G1 균주 10 mg
비타민 C 15 g
비타민 E(분말) 100 g
젖산철 19.75 g
산화아연 3.5 g
니코틴산아미드 3.5 g
비타민 A 0.2 g
비타민 B1 0.25 g
비타민 B2 0.3g
정제수 정량
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85 ℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.
상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM11898P 20160922

Claims (11)

  1. 오브알부민이 포함된 식품 알레르기 억제 활성을 가지며,
    직장 온도를 35℃ 이상으로 유지시키는 것을 특징으로 하는,
    내산성, 내담즙성 및 장부착능이 우수한 락토바실러스 브레비스 G1(Lactobacillus brevis G1) 균주(KCCM11898P).
  2. 제1항에 있어서,
    상기 식품 알레르기 억제 활성은 Th1/Th2 균형 조절 또는 Th2 관련 사이토카인 억제를 통해 구현되는 것인, 락토바실러스 브레비스 G1(Lactobacillus brevis G1) 균주(KCCM11898P).
  3. 제1항에 있어서,
    상기 식품 알레르기는 직장온도 감소, 설사 및 아나필락시스로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 증상을 나타내는, 락토바실러스 브레비스 G1(Lactobacillus brevis G1) 균주(KCCM11898P).
  4. 제1항에 있어서,
    상기 균주는 하기 ⅰ) 및 ⅱ)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 특징을 추가로 가지는, 락토바실러스 브레비스 G1(Lactobacillus brevis G1) 균주(KCCM11898P):
    ⅰ) 생체 안전성; 및
    ⅱ) 항생제 내성.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 생체 안전성은 β-글루쿠로니다아제(β-Glucuronidase) 또는 N-아세틸-β-글루코사미니다아제(N-Acetyl-β-glucosaminidase) 생성 억제를 통해 구현되는 것인, 락토바실러스 브레비스 G1(Lactobacillus brevis G1) 균주(KCCM11898P).
  6. 제4항에 있어서,
    상기 항생제 내성은 카나마이신(Kanamycine), 스트렙토마이신(Streptomycin) 또는 시프로플록사신(Ciprofloxacin)에 대한 것인, 락토바실러스 브레비스 G1(Lactobacillus brevis G1) 균주(KCCM11898P).
  7. 내산성, 내담즙성 및 장부착능이 우수한 락토바실러스 브레비스 G1(Lactobacillus brevis G1) 균주(KCCM11898P)를 유효성분으로 포함하는, 오브알부민이 포함된 식품 알레르기 예방 또는 치료용 약학 조성물로서,
    상기 조성물은 직장 온도를 35℃ 이상으로 유지시키기 위한 것인, 오브알부민이 포함된 식품 알레르기 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  8. 제7항에 있어서
    상기 균주는 생균체, 사균체 또는 배양여액인 것인, 식품 알레르기 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 식품 알레르기는 직장 온도 감소, 설사 및 아나필락시스로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 증상을 나타내는, 식품 알레르기 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  10. 삭제
  11. 내산성, 내담즙성 및 장부착능이 우수한 락토바실러스 브레비스 G1(Lactobacillus brevis G1) 균주(KCCM11898P)를 유효성분으로 포함하는, 오브알부민이 포함된 식품 알레르기 예방 또는 개선용 건강기능식품으로서,
    상기 균주는 직장 온도를 35℃ 이상으로 유지시키는 것을 특징으로 하는, 오브알부민이 포함된 식품 알레르기 예방 또는 개선용 건강기능식품.
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