KR102523743B1

KR102523743B1 - 락토코커스 락티스 kc24 균주를 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR102523743B1
Application number: KR1020200089740A
Authority: KR
Inventors: 백현동; 이나경; 임성민
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2020-07-20
Filing date: 2020-07-20
Publication date: 2023-04-19
Also published as: KR20220010955A

Abstract

본 발명은 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) 균주(KCCM 11159P)를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 예방, 치료 또는 개선용 조성물에 관한 것이다.

Description

락토코커스 락티스 KC24 균주를 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 조성물{Compositions for preventing or treating of neurodegenarative disease comprising lactococcus lactis KC24 strain}

본 발명은 락토코커스 락티스 KC24 균주를 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

프로바이오틱스는 적절한 양을 섭취시, 숙주의 건강에 도움을 주는 것으로 정의되고 있는데, 이들 균주들은 항산화능, 항염증능, 콜레스테롤 저하능, 항당뇨 효능들이 알려져 있으며, 이러한 기능성은 균주마다 차이가 있는 것으로 보고된다.

장 환경은 뇌에 영향을 끼치는 것으로 보고되고 있으며, 이들은 양방향 시그널을 나타내는 것으로 보고되고 있다. 신경, 호르몬, 면역 조절 등에 의해, 초조함, 우울증, 치매와 같은 뇌 건강 등에 영향을 끼치는 것으로 알려져 있다.

종래 연구에 따르면, 락토코커스 락티스 KC24 균주가 항균성 단백질인 락티신 KC24를 생산하여, 메치실린 내성 황색포도상구균에 대한 항균 효과를 가짐을 보고한바 있으나, 이의 신경 세포 사멸에 대한 보호 효과를 직접적으로 확인한 예는 보고된바 없다.

국내 등록특허공보 제10-1327552호 (2013.11.04)

본 발명은 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) 균주(KCCM 11159P)를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 등을 제공하고자 한다.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) 균주(KCCM 11159P)를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

상기 균주는 30℃ 내지 40℃에서 10시간 내지 50시간 동안 배양한 후, 100℃ 내지 130℃ 에서 10분 내지 1시간 동안 열처리하여 사균체로 제조될 수 있다.

상기 균주는 신경 세포 사멸에 대한 보호 효과를 가질 수 있다.

상기 신경 세포 사멸은 산화적 스트레스에 의해 유도될 수 있다.

상기 신경 세포 사멸에 대한 보호 효과는 상기 균주 및 장세포 간 반응을 통해 생산된 대사산물의 작용으로 인한 것일 수 있다.

상기 퇴행성 신경질환은 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 루게릭 질환, 헌팅턴 질환, 근위축성 측석 경화증, 다발성 경화증, 면역계이상 뇌기능 부전, 진행성 신경퇴행질환, 대사성 뇌질환, 니만-픽병, 뇌 허혈 및 뇌출혈로 인한 치매로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 일 구현예로, 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) 균주(KCCM 11159P)를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명에 따른 락토코커스 락티스 KC24 균주는 신경 세포 사멸(특히, 산화적 스트레스에 의해 유도된 신경 세포 사멸)에 대한 보호 효과를 가지는바, 퇴행성 신경질환(특히, 알츠하이머 질환) 예방 또는 치료용 조성물로 유용하게 활용될 수 있다. 더욱이, 상기 균주는 프로바이오틱 특성이 우수하고, 메치실린 내성 황색포도상구균 및 리스테리아균에 대한 항균 효과를 가지면서, 항산화 및 항암 효과가 우수한 이점을 가진다.

도 1은 실시예 1 및 비교예 1~3에서 분리된 균주 유래 CM의 H₂O₂처리된 인간 유래 신경 세포의 보호 효과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 실시예 1 및 비교예 1~3에서 분리된 균주 사균체의 인간 유래 대장암 세포의 BDNF 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 3은 실시예 1 및 비교예 1~3에서 분리된 균주 유래 CM의 H₂O₂처리된 인간 유래 신경 세포의 BDNF 발현량(a) 및 Bax/Bcl-2 발현량 비율(b)을 나타낸 그래프이다.

본 발명자들은 프로바이오틱 특성을 가지는 Lactococcus lactis 균주 중에서도, 특히, 항균, 항산화 및 항암 효과가 우수한 Lactococcus lactis K24 균주를 분리 및 동정하고, 이를 최적 열처리를 통해 사균체로 제조하여, 신경 세포 사멸에 대한 보호 효과를 평가함으로써, 본 발명을 완성하였다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

상기 균주(KCCM 11159P)는 2010년 12월 29일자로 한국미생물보존센터(국외)에 기탁하여 수탁번호 KCCM 11159P를 부여받았다. 상기 균주(KCCM 11159P)는 락토코커스 락티스의 아종으로, 김치로부터 분리되어 프로바이오틱 특성(내산성, 내답즙성, 장부착능 및 발암성 효소인 β-glucuronidase를 생산하지 아니함)을 가지며, 메치실린 내성 황색포도상구균 및 리스테리아균에 대한 항균 효과를 가지면서, 항산화 및 항암 효과가 우수한 이점을 가진다. 구체적으로, 상기 균주(KCCM 11159P)는 L-Arabinose, Ribose, D-Xylose, Galactose, D-Glucose, D-Fructose, D-Mannose, Mannitol, N-Acetyl Glucosamine, Amygdaline, Arbutine, Esculine, Salicine, Cellobiose, Maltose, Lactose, Saccharose, Trehalose, Amidon, β-Gentiobiose, D-Lyxose 및 Gluconate를 탄소원으로 이용할 수 있고, 그람 음성균에 대한 항균 활성 없이, Staphylococcus aureus 및 Listeria monocytogenes에 대한 항균 활성을 가질 수 있다. 이러한 항균 활성은 pH 3~9 및 약 100℃에서 열안정성을 가지는 약 3.5 kDa의 항균활성물질 박테리오신 lacticin KC24의 생산에 따른 결과로 볼 수 있다.

상기 균주(KCCM 11159P)는 상기 균주(KCCM 11159P)는 생균체, 사균체 또는 배양여액으로 제조될 수 있지만, 30℃ 내지 40℃에서 10시간 내지 50시간 동안 배양한 후, 100℃ 내지 130℃에서 10분 내지 1시간 동안 최적 열처리하여 사균체로 제조되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 균주(KCCM 11159P)는 신경 세포 사멸에 대한 보호 효과를 가지는 것을 특징으로 한다.

구체적으로, 상기 신경세포 사멸에 대한 보호 효과는 상기 균주(KCCM 11159P)의 작용으로 인한 것일 수도 있다. 이러한 효과는 상기 균주(KCCM 11159P)를 장세포에 처리했을 때, BDNF 발현양이 증가하는 것을 통해 확인될 수 있다.

그밖에, 상기 신경세포 사멸에 대한 보호 효과는 상기 균주(KCCM 11159P) 및 장세포 간 반응을 통해 생산된 대사산물의 작용으로 인한 것일 수 있다. 상기 균주(KCCM 11159P)는 장세포와 반응을 하여 대사산물을 생산하는데, 이와 같이 생산된 대사산물은 신경 세포에 대해 세포 독성을 유발하지 않으면서, 산화적 스트레스(H₂O₂ 처리)에 대한 세포 보호 효과를 가질 수 있다. 이러한 효과는 이와 같이 생산된 대사산물을 신경 세포에 처리했을 때, 신경 세포에 대해 세포 독성을 유발하지 않으면서, 산화적 스트레스(H₂O₂ 처리)에 의해 감소된 BDNF 발현양을 증가시키고, 산화적 스트레스(H₂O₂ 처리)에 의해 증가된 Bax/Bcl-2 발현양 비율을 크게 감소시키는 것을 통해 확인될 수 있다. 이때, BDNF의 낮은 분비는 인간의 기억과 해마의 기능에 영향을 미칠 수 있으며, 세포 사멸이 BDNF 분비에 영향을 미칠 수 있다. 또한, 세포사멸과 관련된 Bax/Bcl-2 발현양 비율은 신경세포의 사멸을 제어하는 인자로 알려져 있다.

상기 균주(KCCM 11159P)의 용량은 1×10⁶ CFU/mL 내지 1×10¹⁰ CFU/mL인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 이때, 상기 균주(KCCM 11159P)의 용량이 상기 범위 미만인 경우, 신경 세포 사멸에 대한 보호 효과를 발휘하기 어려운 문제점이 있고, 상기 균주(KCCM 11159P)의 용량이 상기 범위를 초과하는 경우, 세포독성을 포함한 독성의 우려사항이 있을 수 있다.

본 명세서 내 "퇴행성 신경질환"이라 함은 신경 세포가 퇴행하는 병태 전부를 포함하는 의미로, 산화적 스트레스에 의해 유도된 것일 수 있다. 구체적으로, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 루게릭 질환, 헌팅턴 질환, 근위축성 측석 경화증, 다발성 경화증, 면역계이상 뇌기능 부전, 진행성 신경퇴행질환, 대사성 뇌질환, 니만-픽병, 뇌 허혈 및 뇌출혈로 인한 치매로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있고, 알츠하이머 질환을 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명은 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) 균주(KCCM 11159P)를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

상기 균주(KCCM 11159P)에 대해서는 전술한 바와 같으며, 상기 균주(KCCM 11159P)는 생균체, 사균체 또는 배양여액으로 제조될 수 있지만, 30℃ 내지 40℃에서 10시간 내지 50시간 동안 배양한 후, 100℃ 내지 130℃에서 10분 내지 1시간 동안 최적 열처리하여 사균체로 제조되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

한편, 상기 균주(KCCM 11159P)를 포함하는 발효용 스타터 또는 발효식품용 종균 조성물을 첨가하여 발효식품으로 제조하여, 이를 퇴행성 신경질환 예방 또는 개선용 건강기능식품으로 제공할 수도 있다. 상기 발효식품은 요거트, 김치, 치즈 등 다양할 수 있는데, 상기 발효식품 역시 신경 세포 사멸(특히, 산화적 스트레스에 의해 유도된 신경 세포 사멸)에 대한 보호 효과를 가질 수 있고, 따라서, 퇴행성 신경질환(특히, 알츠하이머 질환) 예방, 개선 또는 치료에 효과적이다.

구체적으로, 상기 신경세포 사멸에 대한 보호 효과는, 상기 발효식품을 장세포에 처리했을 때, BDNF 발현양이 증가하는 것을 통해 확인될 수 있다.

그밖에, 상기 신경세포 사멸에 대한 보호 효과는 상기 발효식품 및 장세포 간 반응을 통해 생산된 대사산물의 작용으로 인한 것일 수 있다. 상기 발효식품은 장세포와 반응을 하여 대사산물을 생산하는데, 이와 같이 생산된 대사산물은 신경 세포에 대해 세포 독성을 유발하지 않으면서, 산화적 스트레스(H₂O₂처리)에 대한 세포 보호 효과를 가질 수 있다. 이러한 효과는 이와 같이 생산된 대사산물을 신경 세포에 처리했을 때, 신경 세포에 대해 세포 독성을 유발하지 않으면서, 산화적 스트레스(H₂O₂ 처리)에 의해 감소된 BDNF 발현양을 증가시키고, 산화적 스트레스(H₂O₂ 처리)에 의해 증가된 Bax/Bcl-2 발현양 비율을 크게 감소시키는 것을 통해 확인될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구제 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화되어 사용할 수 있고, 제형화를 위하여 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.

상기 담체 또는, 부형제 또는 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리게이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조할 수 있다.

경구 투여를 위한 고형제제는 상기 균주(KCCM 11159P)에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 제조할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다.

경구를 위한 액상 제제로는 현탁액, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용하는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등을 사용할 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(Tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤젤라틴 등을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서는 1일 0.0001 내지 2,000 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 2,000 mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수회 나누어서 투여할 수도 있다. 다만, 상기 투여량에 의해서 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유 동물에 다양한 경로로 투여할 수 있다. 투여의 모든 방식은 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해서 투여할 수 있다.

본 발명에 따른 건강기능식품 조성물에 있어서, 상기 균주(KCCM 11159P)를 건강기능식품의 첨가물로 사용하는 경우 이를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 예방, 건강 또는 치료 등의 각 사용 목적에 따라 적합하게 결정할 수 있다.

건강기능식품의 제형은 산제, 과립제, 환, 정제, 캡슐제의 형태뿐만 아니라 일반 식품 또는 음료의 형태 어느 것이나 가능하다.

상기 식품의 종류에는 특별히 제한은 없고, 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸콜렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함할 수 있다.

일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 상기 균주(KCCM 11159P)는 원료 100 중량부에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가할 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있다.

본 발명에 따른 건강기능식품 중 음료는 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명에 따른 음료 100 mL당 약 0.01 ~ 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ~ 0.03 g일 수 있다.

상기 외에 본 발명에 따른 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제를 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명에 따른 건강기능식품 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 제한되지 않으나 본 발명에 따른 건강기능식품 조성물 100 중량부 대비 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 락토코커스 락티스 KC24 균주는 신경 세포 사멸(특히, 산화적 스트레스에 의해 유도된 신경 세포 사멸)에 대한 보호 효과를 가지는바, 퇴행성 신경질환(특히, 알츠하이머 질환) 예방 또는 치료용 조성물로 유용하게 활용될 수 있다. 더욱이, 상기 균주는 프로바이오틱 특성이 우수하고, 메치실린 내성 황색포도상구균 및 리스테리아균에 대한 항균 효과를 가지면서, 항산화 및 항암 효과가 우수한 이점을 가진다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

<실시예>

실시예 1: Lactococcus lactis K24 균주 사균체 제조

김치 유래 Lactococcus lactis K24 균주(KCCM 11159P)는 20% 글리세롤 스탁하여 - 80℃에서 보존하고, 본 발명에 사용하기 위해 2회 계대배양하였다. 이후, Lactococcus lactis K24 균주를 lactobacilli MRS broth(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA)에서 37℃, 24시간 동안 배양하여 초기 균수를 1.0×10⁹ CFU/mL로 조절하였다. 이후, 원심분리(12,000×g, 4℃, 10분) 및 PBS로 2번 세척하였다. 그 다음, 추가적인 열처리(121℃, 15 분)를 통하여 균주 사균체를 제조하였고, - 80℃에서 보관하여 실험에 사용하였다.

비교예 1: Lactobacillus rhamnosus LGG 균주 사균체 제조

상업용 프로바이오틱스로 알려진 Lactobacillus rhamnosus LGG 균주를 준비하였다. 배양 및 추가적인 열처리 조건은 Lactococcus lactis K24 균주와 동일하게 하였다.

비교예 2: Lactobacillus delbrueckii KU200170 균주 사균체 제조

상업용 프로바이오틱스로 알려진 Lactobacillus delbrueckii KU200170 균주를 준비하였다. 배양 및 추가적인 열처리 조건은 Lactococcus lactis K24 균주와 동일하게 하였다.

비교예 3: Lactobacillus plantarum KU200661 균주 사균체 제조

상업용 프로바이오틱스로 알려진 Lactobacillus plantarum KU200661 균주를 준비하였다. 배양 및 추가적인 열처리 조건은 Lactococcus lactis K24 균주와 동일하게 하였다.

실험예 1: 균주 유래 대사산물의 신경 세포 사멸 보호 평가

먼저, 인간 유래 대장암 세포인 HT-29 세포주를 6-well plate에 접종하여 (5×10⁵ cells/mL) 단일층을 형성할 때까지 배양한 후 균주 사균체를 1.0×10⁶~ 1.0×10⁸CFU/mL 접종하여 24시간 동안 배양하였다. 이후 상등액을 수거하여 13,000×g, 4℃에서 5분 동안 원심분리 후 0.45 μM 필터를 사용해 필터링하여 균주 유래 대사산물(conditioned medium; CM)을 제조하였다.

균주 유래 CM의 인간 유래 신경 세포인 SH-SY5Y 세포주에 대한 세포 독성 유발 여부와 산화적 스트레스인 H₂O₂에 대한 세포 보호 효과를 측정하기 위해 MTT(methylthizol-2-yl-2,5-diphenyl tetrazoliumbromide) 어세이를 실시하였다. 96 well-plate에 DMEM에 현탁한 SH-SY5Y 세포주를 0.1 mL 넣어 24시간 동안 배양하였다. 균주 유래 CM의 세포독성 여부를 측정하기 위해서는 80 μL의 균주 유래 CM을 24시간 동안 처리하였고, H₂O₂에 대한 세포 보호 효과를 측정하기 위해서는 80 μL의 균주 유래 CM을 4시간 동안 미리 처리한 다음 20 μL의 H₂O₂(50 μM)을 처리하여 20시간 배양하였다. 이후 배지를 제거한 후 well에 MTT(5 mg/mL)을 20 μL 첨가하여 1시간 동안 배양하면서 환원반응을 유도한 후 배양액을 제거하고 0.1 mL의 DMSO(Dimethyl sulfoxide) 용액을 첨가하여 15분간 반응시켜 생성된 결정을 녹여 주었다. 이후 흡광도를 540 ㎚ 측정하였으며 세포 생존률에 관한 식은 다음과 같고, 그 결과는 도 1에 나타내었다:

.

도 1에 나타난 바와 같이, 대조군의 세포 생존률을 100%로 설정했을 때 H₂O₂를 처리한 세포의 세포 생존률은 약 45.46%로 나타났으며, 순서대로 비교예 1~3 및 실시예 1에서 분리된 균주 유래 CM을 1.0×10⁸CFU/mL 처리하고 세포 독성을 유발했을 때 세포 생존률은 각각 약 55.93%, 약 63.28%, 약 65.00% 및 약 67.23%인 것으로 확인된다(p<0.05). 따라서, 실시예 1에서 분리된 균주는 다른 상업용 프로바이오틱스에 비해, 신경 세포 사멸에 대한 보호 효과가 우수하다고 볼 수 있다.

실험예 2: 균주 사균체의 인간 유래 대장암 세포에 대한 유전자 발현 조사

균주 사균체를 인간 유래 대장암 세포에 처리했을 때 신경 성장 촉진인자인 BDNF(brain derived neurotrophic factor) 증감 여부를 real time PCR으로 측정하였다. 인간 유래 대장암 세포인 HT-29 세포주(1×10⁶cells/well)를 6-well plate에 접종하여 단층이 형성될 때까지 배양하였다. 이후, 균주 사균체 1.0×10⁸CFU/mL를 4시간 동안 처리하였다. 유전자 발현을 RNA 프라이머(표 1) 및 real-time PCR을 이용하여 확인하였고, 그 결과는 도 2에 각각 나타내었다.

RNA 순도는 Multiscan GO (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 이용하였고, cDNA로 Revertaid first strand cDNA synthesis kit(Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 전환하였다. Semi-quantitative real-time PCR은 SYBR Green PCR Master Mix를 이용하였고, PCR 조건은 총 20 μL 볼륨으로, 95℃ for 2 min as initial denaturation; 95℃ for 5 s as denaturation (40 cycle); 60℃ for 15 s as annealing and extension으로 하였다.

유전자	정방향 (5’→3’)	역방향(3’→5’)
Brain derived neurotrophic factor (BDNF)	CAAACATCCGAGGACAAGGTGG	TCTACGACGTTTGTACAGGTACTC
Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase (GAPDH) normalizing internal standard	GAGTCAACGGATTTGGTCGT	GACTCTTGCCCTTCGAACAG

도 2에 나타난 바와 같이, 인간 유래 대장암 세포의 BDNF 발현량을 살펴본 결과, HT-29 세포주에 실시예 1에서 분리된 균주 사균체를 처리했을 경우 대조군에 비해 약 1.84배 증가한 BDNF 발현량을 보였는바, 실시예 1에서 분리된 균주 사균체는 장세포와 반응하여 뛰어난 뇌 유래 신경영양인자인 BDNF 생성능을 보이는 것으로 확인된다. 반면, HT-29 세포주에 비교예 2 및 3에서 분리된 균주 사균체를 처리한 경우 대조군에 비해 각각 약 1.21배 및 약 1.07배 증가한 BDNF 발현량을 보인 것에 불과하였다.

실험예 3: 균주 유래 대사산물의 인간 유래 신경 세포에 대한 유전자 발현 조사

균주 유래 대사산물을 인간 유래 신경 세포에 처리했을 때 신경 성장 촉진인자인 BDNF(brain derived neurotrophic factor) 증감 여부와, 세포사멸에 관련된 인자인 Bax(Bcl-2 associated protein X) 및 Bcl-2(B-cell lymphoma 2) 증감 여부를 real time PCR으로 측정하였다. 인간 유래 신경 세포인 SH-SY5Y 세포주(1Х10⁶cells/well)를 6-well plate에 접종하여 단층이 형성될 때까지 배양하였다. 이후, 800 μL의 균주 유래 CM(균주 사균체 1.0×10⁸CFU/mL 처리)을 4시간 동안 처리한 후, 산화적 스트레스를 유도하기 위해 200 μL의 H₂O₂ (50 μM)을 20 시간 동안 처리하였다. 유전자 발현을 RNA 프라이머(표 2) 및 real-time PCR을 이용하여 확인하였고, 그 결과는 도 3에 나타내었다.

유전자	정방향 (5’→3’)	역방향(3’→5’)
Brain derived neurotrophic factor (BDNF)	CAAACATCCGAGGACAAGGTGG	TCTACGACGTTTGTACAGGTACTC
Bcl-2 associated protein X (Bax)	GTGGTTGCCCTCTTCTACTTTGC	GTAGAAACACCGACCTCAGGAG
B-cell lymphoma 2 (Bcl-2)	CGGCTGAAGTCTCCATTAGC	TGTGTGGTCTTGAAGGGACC
Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase (GAPDH) normalizing internal standard	GAGTCAACGGATTTGGTCGT	GACTCTTGCCCTTCGAACAG

도 3에 나타난 바와 같이, 산화적 스트레스가 유도된 인간 유래 신경 세포의 BDNF 발현량 및 Bax/Bcl-2 발현량 비율을 살펴본 결과, BDNF 발현량이 음성대조군에 비해 약 1.06배 증가한 것으로 확인되고, Bax/Bcl-2 발현량 비율이 음성대조군과 유사한 수준을 보이는 것으로 확인되는바, 즉, 실시예 1에서 분리된 균주 유래 CM은 BDNF 발현량을 음성대조군 수준 이상으로 증가시키면서, Bax/Bcl-2 발현량 비율이 음성대조군과 유사한 수준으로 낮추었는바, 실시예 1에서 분리된 균주 유래 CM은 H₂O₂의 세포 사멸 유도 작용을 완화하는 것으로 확인된다. 반면, SH-SY5Y 세포주에 H₂O₂및 비교예 1~3에서 분리된 균주 유래 CM을 처리했을 경우에는 음성대조군에 비해 크게 증가한 Bax/Bcl-2 발현량 비율을 보였다.

하기에 본 발명의 균주를 유효성분으로 포함하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1: 산제의 제조

Lactococcus lactis K24 균주 20 mg

유당수화물 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

제제예 2: 정제의 제조

Lactococcus lactis K24 균주 10 mg

옥수수전분 100 mg

유당수화물 100 mg

스테아르산마그네슘 2 mg

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

제제예 3: 캅셀제의 제조

Lactococcus lactis K24 균주 10 mg

미결정셀룰로오스 3 mg

유당수화물 14.8 mg

스테아르산마그네슘 0.2 mg

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캅셀제의 제조방법에 따라서 젤라틴캡슐에 충전하여 캅셀제를 제조하였다.

제제예 4: 주사제의 제조

Lactococcus lactis K24 균주 10 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

인산일수소나트륨 26 mg

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 주사제의 제조방법에 따라 1앰플당(2 mL) 상기의 성분 함량으로 제조하였다.

제제예 5: 액제의 제조

Lactococcus lactis K24 균주 10 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

레몬향 적량

상기의 성분을 통상의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 정제수를 가하여 전체 100 mL로 조절한 후 멸균시켜 갈색병에 충진하여 액제를 제조한다.

제제예 6: 건강기능식품의 제조

Lactococcus lactis K24 균주 10 mg

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 ㎎

비타민 B1 0.13 ㎎

비타민 B2 0.15 ㎎

비타민 B6 0.5 ㎎

비타민 B12 0.2 ㎍

비타민 C 10 ㎎

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 ㎎

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 ㎎

산화아연 0.82 ㎎

탄산마그네슘 25.3 ㎎

제1인산칼륨 15 ㎎

제2인산칼슘 55 ㎎

구연산칼륨 90 ㎎

탄산칼슘 100 ㎎

염화마그네슘 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강기능식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강기능식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강기능식품 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7: 건강음료의 제조

Lactococcus lactis K24 균주 10 mg

비타민 C 15 g

비타민 E(분말) 100 g

젖산철 19.75 g

산화아연 3.5 g

니코틴산아미드 3.5 g

비타민 A 0.2 g

비타민 B1 0.25 g

비타민 B2 0.3g

정제수 정량

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85

에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11159P

20101229

Claims

락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) 균주(KCCM 11159P)를 유효성분으로 포함하는, 신경세포 사멸로 인해 유발되는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 약학 조성물로서,
상기 조성물은 상기 균주 및 장세포 간 반응을 통해 생산된 대사산물의 작용으로 신경세포 사멸에 대한 보호 효과를 제공하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서,
상기 균주는 30℃ 내지 40℃에서 10시간 내지 50시간 동안 배양한 후, 100℃내지 130℃에서 10분 내지 1시간 동안 열처리하여 사균체로 제조된, 신경세포 사멸로 인해 유발되는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
삭제
제1항에 있어서,
상기 신경 세포 사멸은 산화적 스트레스에 의해 유도된 것인, 신경세포 사멸로 인해 유발되는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
삭제
제1항에 있어서,
상기 퇴행성 신경질환은 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 루게릭 질환, 헌팅턴 질환, 근위축성 측석 경화증, 다발성 경화증, 면역계이상 뇌기능 부전, 진행성 신경퇴행질환, 대사성 뇌질환, 니만-픽병, 뇌 허혈 및 뇌출혈로 인한 치매로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인, 신경세포 사멸로 인해 유발되는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) 균주(KCCM 11159P)를 유효성분으로 포함하는, 신경세포 사멸로 인해 유발되는 퇴행성 신경질환 예방 또는 개선용 건강기능식품로서,
상기 건강기능식품은 상기 균주 및 장세포 간 반응을 통해 생산된 대사산물의 작용으로 신경세포 사멸에 대한 보호 효과를 제공하는 것을 특징으로 하는 건강기능식품.