KR101608502B1

KR101608502B1 - 마늘 발효물을 포함하는 심혈관계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물

Info

Publication number: KR101608502B1
Application number: KR1020140174629A
Authority: KR
Inventors: 김해성
Original assignee: 김해성
Priority date: 2014-12-08
Filing date: 2014-12-08
Publication date: 2016-04-01

Abstract

본 발명은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis BBS815, KCTC 12696BP) 또는 (BB825, KCTC 12697BP) 또는 이 둘의 혼합균주로 발효시킨 마늘 발효물을 유효성분으로 포함하는 심혈관계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 예방용 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것으로써, 상기 조성물은 산화스트레스를 저해하고 혈관이완 및 수축을 조절함으로써 심혈관계 질환을 예방 또는 치료용 약품, 또는 개선용 건강기능식품으로 용이하게 사용 할 수 있다.

Description

마늘 발효물을 포함하는 심혈관계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 {Composition for prevention or treatment of cardiovascular diseases comprising fermentation product of garlic}

본 발명은 유산균을 이용한 마늘 발효물을 유효성분으로 포함하는 심혈관계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 예방용 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 산화스트레스를 저해하고 혈관이완 및 수축을 조절함으로써 심혈관계 질환을 예방 또는 치료 효과를 지닌, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis BBS815, KCTC 12696BP) 또는 (BB825, KCTC 12697BP) 또는 이 둘의 혼합균주로 발효시킨 마늘 발효뮬을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 한다.

심혈관계 질환은 심장 및 혈관계의 이상이 온 것으로서, 심장질환, 대동맥과 같은 중심혈관 및 하부 기관, 조직의 말초혈관의 질환을 포함한다. 세계보건기구(WHO)의 통계에 의하면 전 세계적으로 매년 심혈관계 질환으로 인한 사망자가 가파른 증가 추세에 있으며, 특히 일본, 한국 등 아시아의 증가율이 높다고 보고하고 있다. 이는 고령화 사회로의 접근, 식사 습관 등의 변화로 인한 관상동맥 질환 위험 인자등의 증가로 인한 것으로 추정된다.

심혈관계 질환은 초기 내피세포 기능장애를 시작으로 종래에는 심장 및 혈관계의 이상이 온 것으로서, 동맥경화, 고혈압, 고지혈, 관상동맥질환 (심장마비), 뇌혈관계 질환 (뇌졸중, 치매), 말초혈관질환, 부정맥, 심부전, 울혈성 심장질환, 심근질환 등을 포함하는 심장, 혈관의 이상의 그룹에 대한 명칭이나, 이에 제한되는 것은 아니다.

심혈관계 질환 발현의 주요 인자로서는 유전적 요인, 생활습관, 당뇨의 합병증 등 매우 다양하게 알려져 있으나 현대의학의 관점에서 NADPH 옥시다제의 활성 증가에 따른 활성산소종 (Reactive Oxygen Species, ROS)과 혈관내 산화성 스트레스의 증가 및 내피 세포형 산화질소 합성효소 (endothelial type Nitric Oxide Synthase, eNOS)의 활성감소로 인한 산화질소의 감소에 의한다고 알려져 있다. 내피 세포형 산화질소 합성효소에 의해 생성되는 산화질소는 강력한 혈관이완 인자인 동시에 혈소판 응집, 혈관근육세포 증식, 단핵구 세포의 혈관침착, 동맥경화 관련 단백질 발현을 저해하여 전체적인 심혈관계의 항상성 조절에 매우 중요한 역할을 한다.

한편, 마늘을 많이 먹는 사람들은 대장암, 방광암, 위암에 걸릴 위험이 낮은 것으로 밝혀져 마늘의 암예방 효과가 인정을 받고 있다. 또한 마늘은 동맥경화를 일으키는 콜레스테롤 수치를 떨어뜨리고 혈소판 응집을 억제해 혈액순환을 원활하게 함으로써 심장병이나 중풍 예방에도 도움이 된다고 알려져 있다. 독일에서는 마늘을 주성분으로 한 건강기능식품이 콜레스테롤 저하제로 허가받아 판매되고 있다. 마늘성분의 보충제는 하루 600 내지 1000mg 복용이 권장되지만 우리나라 사람들은 음식으로 마늘을 충분히 섭취하고 있으므로 굳이 보충제를 복용하지 않아도 된다. 마늘을 많이 먹으면 속쓰림 같은 위장 증상을 보이긴 해도 심각한 부작용은 없는 것으로 알려져 있다.

마늘가루 효과를 분석한 연구에서는 900mg의 마늘가루가 총콜레스테롤을 25% 감소시키고, 특히 혈관에 좋은 역할을 하는 고밀도 콜레스테롤(HDL)을 50% 상승시키는 것으로 나타났다. 이는 마늘의 알리신(Allicin) 성분이 피를 엉기게 하지 않는 항혈전 작용과 피속의 지질을 감소시키는 효과가 있기 때문으로 분석된다. 게다가 마늘이 혈당을 11.6%정도 감소시킨다는 보고가 있으며, 항산화 작용으로 동맥경화를 예방하는 것으로 알려져 있다. 마늘 속의 유황 화합물은 체내의 활성 산소를 제거하는 강력한 항산화작용이 있다. 피속의 활성 산소는 혈관을 손상시키거나 일부 암을 일으키는 원인이 될 수 있다. 그래서 마늘은 미국 국립 암연구소가 추천한 첫번째 항암식품이기도 하다.

이 외에도 마늘에는 많은 종류의 유기 및 무기화합물이 들어 있다. 그중에서 알린(alliin)이라는 황을 포함한 화합물은 그 자체만으로는 특별한 냄새가 별로 없다. 그러나 사람들이 마늘에 상처를 입히거나 균 또는 벌레의 침입을 받으면, 마늘에 포함된 효소인 알리나제(allinase)가 알린을 알리신(allicin)으로 바꾼다. 알리신은 피톤치드(phytoncide)의 일종이며, 항균, 항진균성 특성이 있다. 마늘은 다른 종류의 백합과 식물보다 alliin을 다량 함유하고 있는데, 파쇄 과정에서 마늘에 존재하는 alliin은 allinase의 작용을 받게 되어 alliin이 allicin, pyruvate 및 암모니아 상태로 분해되며, 이렇게 생성된 allicin 역시 매우 불안정한 화합물로서 여러 형태의 함 황화합물로 쉽게 전환된다. 그 중 diallyl disulfide, diallyl sulfide, allyl propyl disulfide, methyl trisulfide가 주요 화합물로서 allicin과 더불어 이들 함 황화합물이 마늘의 매운 맛을 나타내는 주된 화합물로서 알려져 있다.

양파(onion)에도 알린을 비롯한 황을 포함하는 화합물이 들어 있다. 마늘이나 양파를 요리하다 보면, 독한 냄새나 강한 맛이 없어진다는 사실을 알 수 있다. 이는 굽거나 찌는 과정에서 마늘이나 양파에 열이 가해지고, 이때 알리신이 생성되지 않기 때문이다. 마늘이나 양파에 포함된 효소 알리나제는 열에 약해, 조리 과정에서 손상을 입어 제대로 기능을 발휘하지 못하여 알리신이 만들어지지 않아 마늘과 양파의 향과 맛이 약해진다. 양파를 썰 때 눈물이 나게 하는 물질은 조리 과정에서 증발되기도 하며, 화학반응이 진행되어 새로운 화합물(bispropenyl disulfide)을 생성하기도 한다. 마늘에 포함된 알리신은 보관 상태에 따라서 여러 개가 결합하여 아조엔(ajoene)이라는 불포화 이황화 화합물을 형성하기도 한다. 아조엔의 아조는 스페인어에서 마늘을 뜻하는 아조와 이중결합을 의미하는 접미사 -ene가 결합하여 만들어진 이름이다.

마늘에는 비타민 C를 비롯하여 다양한 종류의 비타민 B가 들어 있으며, 칼슘, 칼륨을 비롯하여 철, 마그네슘, 셀레늄(selenium) 등과 같은 다양한 무기물도 포함되어 있다. 마늘은 혈액 속의 지방 함유량을 낮추어 주고, 혈소판의 엉김을 감소시키는 효과가 있다는 연구 보고도 있다. 또한 치료약으로써 마늘 추출물을 장기 복용하면 호모시스틴(homocysteine)의 혈액 농도를 낮출 수 있다는 의학 연구결과도 있다. 호모시스틴은 혈관의 생성과 연결에 필요한 단백질(콜라겐, 엘라스틴 등) 형성을 억제하기도 하고 혈관을 퇴화시켜서 심장질환 유발 가능성이 큰 물질로 알려졌다. 호모시스틴은 필수아미노산인 메싸이오닌(methionine)으로부터 생체 내에서 합성되지만, 비타민 B의 도움으로 시스틴(cysteine)으로 변할 수 있다.

마늘에 포함된 무기물질 가운데 흥미로운 원소는 항산화작용을 한다고 알려진 셀레늄이다. 셀레늄의 하루 권장 섭취량은 약 50g이며, 최대 400g 이상 넘지 말 것을 권유한다. 마늘을 재배하는 밭에 셀레늄이 들어 있으면, 풍부한 셀레늄이 포함된 마늘을 수확할 수 있다. 아마도 마늘에는 셀레늄을 잘 흡수하는 성질이 있는 것 같다. 우리 몸 속에 필요한 셀레늄이 부족하면 심장병이 발병할 가능성이 비교적 높은 것으로 알려졌다.

마늘의 약리효능으로는 면역증진효과(등록특허 제1028155호), 항산화효과(공개특허 제2013-105106호), 항균효과(등록특허 제1038516호), 항암작용(공개특허 ㅈ제2014-78389호, 등록특허 제412424호), 항염증 효과(공개특허 제2013-31008호) 등이 보고 되었다.

한편, 바실러스 속 미생물은 산업적으로 중요한 종으로서, 오랜 세월동안 식품 및 각종 발효산업에서 숙주 세포로서 널리 사용되고 있고, protease, amylase, glucanases 또는 cellulase 등의 중요한 효소 및 넓은 항균 spectrum과 다양한 구조를 지니는 peptide antibiotics를 생산하는 특징을 지니고 있다. 구체적으로, B. subtilis, B. megaterium, B. stearothermophilus, B. lichemiformis, B. thuringiensis 또는 B. cereus 등 다양한 바실러스 속 미생물에서 박테리오신 또는 bacteriocin-like substances(BLS)들이 발견되어 보고되었다. 프로바이오틱 생균제는 유산균을 주로 사용하여 제조되어 왔으나, 제한적 범위에서만 항균활성이 인정된다는 문제점이 제기되어 왔으여, 최근 바실러스 서브틸리스나 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 등과 같은 바실러스 속에 해당하는 미생물을 이용한 프로바이오틱 생균제에 대한 관심이 증대되고 있다. 상기 바실러스 서브틸리스나 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 등은 유산균과 같이 유용한 미생물이며, 우리나라의 청국장이나 일본의 낫또(natto)를 비롯하여 극동 아시아나 아프리카 지역의 전통음료나 알칼리-발효식품에서 매우 중요한 발효미생물로 작용한다.

본 발명자는 청국장에서 분리된 바실러스 속 균주로서, 본 발명에서 최초로 개시된 신균주인 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis BBS815, KCTC 12696BP) 또는 (BB825, KCTC 12697BP) 또는 이 둘의 혼합균주를 마늘 발효에 이용하는 경우 마늘의 본래 지니고 있는 다양한 효과 중에 특히 심혈관계 질환에 대하여 우수한 효과있다는 사실을 최초로 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

이에 본 발명자는 다수의 물질을 대상으로 혈관이완 효과를 검색하던 중 신규의 특이균주에 의해 발효된 마늘 발효물이 혈관내 산화스트레스를 감소시키고 혈관이완 효과를 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 신균주인 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis BBS815, KCTC 12696BP) 또는 (BB825, KCTC 12697BP) 또는 이 둘의 혼합균주를 접종하여 발효시킨 생성물인 마늘 발효물을 유효성분으로 포함하는 심혈관계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 다른 목적은, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis BBS815, KCTC 12696BP) 또는 (BB825, KCTC 12697BP) 또는 이 둘의 혼합균주를 접종하여 발효시킨 마늘 발효물을 유효성분으로 포함하는 심혈관계 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 심혈관계 질환의 예방 및 치료용 조성물은 상술한 바와 같은 목적으로 달성하기 위해 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis BBS815, KCTC 12696BP) 또는 (BB825, KCTC 12697BP) 또는 이 둘의 혼합균주에 의해 발효된 마늘 발효물을 유효성분으로 하는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 마늘 발효물은 혈관이완 효과를 지니는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 건강기능식품 조성물은 상기 마늘 발효물 이외에 기능성 식품 제조시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제 등을 포함할 수 있다. 상술한 탄수화물은 포도당 및 과당 당의 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스 및 올리고당 등의 디사카라이드, 덱스트린 및 사이클로덱스트린 등의 폴리사카라이드, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상기 향미제는 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.

상기 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 본 발명의 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능성식품류 등이 있다. 상기 마늘 발효물을 첨가할 수 있는 식품의 구체적인 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강기능식품이 음료일 경우 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기의 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.

상기 건강기능식품은 상술한 성분 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강식품은 천연 과일쥬스, 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

상기 마늘 발효물의 유효성분은 전체 조성물을 기준으로 하여 0.00001 내지 15중량%, 바람직하게는 0.0001 내지 10중량%, 보다 바람직하게는 0.0001 내지 5중량%이다. 상기 마늘 발효물의 중량이 0.00001중량% 미만일 경우 혈관이완 효능이 미약하고, 15중량%를 초과하는 경우에는 함량의 증가에 따른 효과의 증가가 매우 미약하다는 문제점이 있다.

한편, 본 발명의 마늘 발효물에 대한 세포독성 시험 결과, 독성이 거의 없으므로 장기간 사용 시에도 안심하고 사용할 수 있으며, 특히 상기한 바와 같이 약학 조성물 및 식품 조성물에 적용할 수 있다.

상기 마늘 발효물을 포함하는 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 마늘 발효물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이 외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 심혈관계 질환 약학적 조성물은 상기 마늘 발효물에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1 종 이상 함유할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 단독으로 투여되거나 다른 창상 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 병용하여 투여할 경우 다른 치료제와 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 상기 단독 투여 또는 병용 투여 시 본 발명의 약학 조성물의 투여량은 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 바람직하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 심혈관계 질환의 치료방법을 제공한다. 그리고, 본 발명의 약학적 조성물은 심혈관계 질환을 수반하는 질환의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명은 유산균을 이용한 마늘 발효물을 유효성분으로 포함하는 심혈관계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 예방용 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것으로써, 상기 조성물은 산화스트레스를 저해하고 혈관이완 및 수축을 조절함으로써 심혈관계 질환을 예방 또는 치료용 약품, 또는 개선용 건강기능식품으로 용이하게 사용 가능하다.

도 1은 마늘 발효물의 혈관이완효과를 측정한 결과를 나타낸다.
도 2는 마늘 발효물의 내피세포형 산화질소 합성효소의 활성 증강에 대한 효과를 측정한 결과를 나타낸다.
도 3은 마늘 발효물의 혈관평활근세포 증식억제 효과를 나타낸다.

이하, 본 발명의 바람직한 구현예에 대하여 상세히 설명한다. 또한, 하기의 설명에서는 구체적인 구성요소 등과 같은 많은 특정 사항들이 도시되어 있는데, 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것일 뿐 이러한 특정 사항들 없이도 본 발명이 실시될 수 있음은 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명하다 할 것이다. 그리고, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 혹은 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

본 발명은 분쇄된 마늘에 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis BBS815, KCTC 12696BP) 또는 (BB825, KCTC 12697BP) 또는 이 둘의 혼합균주를 접종하여 배양 및 숙성시킨 마늘 발효물을 유효성분으로 하는 심혈관계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

상기 심혈관계 질환은 고혈압, 동맥경화증, 허혈성 심장질환, 관상동맥질환, 협심증, 현기증, 만성피로, 뇌졸중, 심근경색증 또는 뇌혈관질환 등으로 부터 선택된 질환이다.

본 발명의 바실러스 균주는 청국장으로 부터 분리되었다. 청국장에서 선별된 바실러스 균주 4종을 20% 마늘 분쇄액에 접종한 후 37℃에서 3일간 진탕배양하여 1.0x10¹⁰CFU/ml 이상의 생균력을 보이는 특이 균주를 분리한 결과, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis BBS815, KCTC 12696BP), (BB825, KCTC 12697BP)로 확인되었다.

상기 균주를 마늘 분쇄물에 다시 접종하고 배양하여 본 발명의 마늘 발효물을 제조할 수 있다. 구체적으로 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis BBS815, KCTC 12696BP) 또는 (BB825, KCTC 12697BP) 또는 이 둘의 혼합균주를 마늘 분쇄물에 접종하고 배양하여 제조할 수 있다. 이와 같이 제조된 마늘 발효물은 생리활성물질들의 함량이 증가되고, 그에 따라 항암, 항염, 항산화 등의 효과도 증진되었다.

본 발명에서 마늘 발효물은 상기와 같은 조건에서 얻어진 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis BBS815, KCTC 12696BP) 또는 (BB825, KCTC 12697BP) 또는 이 둘의 혼합균주를 이용하는데, 먼저 껍질을 깐 마늘을 분쇄하고 이에 물을 혼합하여 혼합물을 만든다. 이때 마늘 분쇄물의 양은 물의 중량대비 1 내지 85%로 하고 바람직하게는 5 내지 20 %를 첨가하는 것이 적절하다. 상기의 혼합물에 균주를 접종시키고 이때 균주 접종비는 혼합물 중량 대비 0.01 내지 5%가 바람직하다. 이를 25 내지 40℃에서 진탕배양이나 기포주입을 하여 호기성 발효를 하고, 기포 주입시에는 필터링 방법을 하여 기타 다른 균주의 침투를 방지한다.

상기 배양은 10일 내지 90일 동안 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며 마늘 발효물에 가장 적합한 기간을 반복실시하여 얻어낸 것이다.

또한 본 발명은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis BBS815, KCTC 12696BP) 또는 (BB825, KCTC 12697BP) 또는 이 둘의 혼합균주를 마늘에 접종하고 수득한 마늘 발효물을 유효성분으로 포함하는 심혈관계 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

아래의 실시예 및 실험예들은 본 발명의 내용을 설명하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 균주의 분리 및 동정

청국장으로부터 바실러스 속 균주를 분리하기 위해 시험관에서 청국장을 멸균수에 현탁하고 80℃에서 15분간 물중탕을 하였다. 이를 LB 고체 배지에 도말하여 콜로니 모양이 다른 균주들을 분리한 후, 그람 염색과 포자 염색을 하여 그람양성의 간균으로 포자를 형성하는 4종의 균주를 분리하였다. 마늘발효를 위한 균주를 선별하기 위하여 20% 마늘분쇄액이 첨가된 액체 LB 배지에 균주를 접종하였으며, 37℃에서 72시간 동안 배양을 진행하였다. 그 결과 1.0x1010 CFU/ml 이상의 생균력을 보이는 특이 균주를 선별하였다. 선별된 균주는 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 기탁하여, 2014년 10월 23일자로 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) BBS815를 균주번호 KCTC 12696BP 및 BB825를 KCTC 12697BP로 기탁하였다.

실시예 2 : 마늘 발효물 제조

껍질을 깐 생마늘 1 Kg을 분쇄하고 이에 정제수 2 L를 넣고 혼합한다. 이때 정제수와 마늘 분쇄물의 비율은 정제수 대비 10 %를 넣는다. 상기의 혼합물에 실시예 1에서 균주를 배양한 액을 혼합물의 중량대비 0.05 %로 넣어 접종한 후 발효조(37℃, 100 rpm, 0 bar)에서 기포주입을 하여 호기성 발효를 10일간 시켰다.

시험예 1 : 혈관이완 효과 측정

마늘 발효물의 관상동맥이완 및 수축능을 검정하기 위하여 관상동맥을 이용하여 등척성장력을 힘-변위변환기가 장착된 생리기록계를 이용하여 측정하였다. 돼지의 관상동맥을 적출하여 크렙스 완충용액에 넣고 주변 조직과 지방을 제거한 후 약 3mm 길이로 자른 coronary artery ring을 준비하였다. 준비된 관상동맥 중 내피세포의존성 혈관이완 효과검정을 위해 일부의 ring 은 내피세포를 제거하여 준비하였다. 준비된 coronary artery ring을 Organ bath 내의 95 % O₂ 및 5 % CO₂ 기체로포화시킨 37℃의 크렙스용액에서 고정시킨 후, 등척성장력을 힘-변위변환기가 장착된 생리기록계를 이용하여 측정하였다. Ring을 5 grm으로 안정화시킨 후 KCl을 넣어 최대장력을 측정하고, 다시 안정화시킨 coronary artery ring을 혈관최대장력의 80%로 수축시킨 후 일정한 grm을 유지시키고 acetylcholine을 처리하여 내피세포의존성 혈관이완효과를 측정한 다음, 크렙스용액으로 3회 세척하였다. 시료의 혈관기능에 대한 영향평가는 먼저 안정화된 혈관을 수축시킨 후, 이어서 대상물질에 의한 이완-수축반응을 농도의존적으로 수회 처리하여 relaxation percent를 확인하였고 혈관기능에 대한 영향은 phenylephrine의 수축에 대한 이완율로 계산하여 대조군과 비교하였다.

그 결과 마늘 발효물을 이용하여 혈관 이완효능을 평가한 결과 0.5 mg/ml에서 50%에 가까운 이완효능을 확인 하였고 1 mg/ml 농도에서 90%의 이완 효능이 관찰 되었다. 그 결과는 도 1에 나타낸 바와 같다.

시험예 2 : 혈관평활근세포 증식억제 효과 측정

마늘 발효물의 혈관평활근세포 증식억제 효과를 검정 하기 위해 wound healing법을 이용 하였다. 96 well plate 상에 균일한 너비의 유주 구역을 생성하여 다양한 농도 (0, 0.3, 1 mg/ml)의 마늘발효물과 혈소판유래성장인자(PDGF-BB) (20 ng/ml)을 동시에 처리하고 2시간 간격으로 사진을 촬영하여 혈관 평활근 세포의 유주를 관찰 하였다. 48 시간 후 PDGF-BB만 처리한 대조군에서는 활발한 혈관 평활근 세포의 유주가 확인 되었고 수치적으로는 정상군과 비교하여 약 5배의 세포 유주를 관찰 하였다. 그러나 다양한 농도의 마늘발효물은 혈관 평활근 세포의 유주를 농도 의존적으로 억제하여 1 mg/ml 에서는 정상군과 같은 수준의 혈관 평활근 세포 유주 억제 효과를 나타내었다( 도 3 참고).

시험예 3 : 항산화 효과 측정

상기 실시예 1 및 실시예 2에 의해 제조된 마늘 발효물의 내피세포형 산화질소 합성효소의 활성 증강에 대한 효과를 송아지 혈관내피세포 (Bovine aortic endothelial cells)의 내피세포형 산화질소 합성효소 (eNOS)의 1177 번 세린 잔기 (serine residue) 인산화 정도를 확인하였고, 그 결과는 도 2에 나타낸 바와 같다.

먼저 혈관내피세포를 DMEM (Dubleco's minimum essential medium) 및 10 % FBS (Fetal bovine serum) 용액과 혼합하여 배양 후 FBS가 제외된 배양액으로 다시 24 시간 동안 배양하였다. 세포가 안정화된 후에 시료를 각 농도별로 처리한 후 30 분 동안 반응시켰다. 이후 단백질을 추출하고 원심분리하여 상등액을 취해 세포의 파편들을 제거하였다. 추출한 단백질은 SDS-폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamide gel)에 전기영동시킨 후 니트로셀룰로오스 막 (nitrocellulose membrane)으로 겔의 단백질을 블롯시켰다. 3 % BSA로 1 시간 동안 차단(blocking)한 후에 1:1,000의 비율로 phospho-eNOS를 하루 밤 동안 4 ℃에서 배양하였다. 다음으로, 1:2000의 비율로 희석한 2 차 항체를 처리하여 1 시간 상온에서 배양한 후 화학발광법(chemiluminescence)로 현상하였다.

제제예 1 : 약제

제조예 1-1 : 산제

마늘 발효물 0.01 내지 10 mg 에 유당 1 g을 혼합하고, 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

제조예 1-2 : 정제

마늘 발효물 50 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 ng

스테아린산 마그네슘 2 mg을 혼합한 후 통상의 정제 제조방법에 따라 타정하여 정제를 제조하였다.

제조예 1-3 : 캡슐제

마늘 발효물르 10 내지 100 mg,

옥수수전분 100 mg,

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg을 혼합한 후 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

제제예 2 : 건강기능식품

제조예 2-1 : 밀가루 식품

본 발명의 마늘 발효물을 밀가루에 0.1 중량%로 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다. 마늘 발효물을 밀가루에 0.1 중량%로 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.

제조예 2-2 : 유제품

유제품(dairy products)의 제조

마늘 발효물을 우유에 0.1 중량%로 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

제조예 2-3 : 과일쥬스

마늘 발효물 100 mgdmf 사과쥬스, 오렌지 쥬스 또는 포도쥬스 1 L에 혼합하여 건강 증진용 과일주스를 제조하였다.

이상에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 대해서 설명하였으나, 본 발명은 상술한 특정의 실시예에 한정되지 아니하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본원 발명의 요지를 벗어남이 없이 다양한 변형 실시가 가능함은 물론이다. 따라서, 본 발명의 범위는 위의 실시예에 국한해서 해석되어서는 안되며, 후술하는 특허청구범위 뿐만 아니라 이 특허청구범위와 균등한 것들에 의해 정해져야 할 것이다.

KCTC

KCTC12696BP/KCTC12697BP

20141023

Claims

바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis BBS815, KCTC 12696BP) 또는 (BB825, KCTC 12697BP), 또는 이 둘의 혼합균주로 발효시킨 마늘 발효물을 유효성분으로 하는 고혈압, 동맥경화증, 허혈성 심장질환, 관상동맥질환, 뇌졸중, 심근경색증 또는 뇌혈관질환 중의 어느 하나 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
삭제
제 1항에 있어서, 상기 마늘 발효물은 상기 균주 접종 후 10일 내지 90일 동안 발효한 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis BBS815, KCTC 12696BP) 또는 (BB825, KCTC 12697BP), 또는 이 둘의 혼합균주로 발효시킨 마늘 발효물을 유효성분으로 하는 고혈압, 동맥경화증, 허혈성 심장질환, 관상동맥질환, 뇌졸증, 심근경색증 또는 뇌혈관질환 중의 어느 하나 질환의 예방 또는 개선용 기능성 식품 조성물.
삭제