KR100387279B1

KR100387279B1 - 산마늘 추출물을 포함하는 동맥경화증 및고콜레스테롤혈증의 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR100387279B1
Application number: KR10-2000-0079495A
Authority: KR
Inventors: 김태균; 한형미; 김승희; 강석연; 정기경; 최돈하; 박용복; 류종훈
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2000-12-21
Filing date: 2000-12-21
Publication date: 2003-06-12
Also published as: KR20020050362A

Abstract

본 발명은 산마늘 추출물을 유효성분으로 하는 동맥경화증 및 고콜레스테롤혈증의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 상기 산마늘 (Allium victorialis) 추출물은 혈중 콜레스테롤, 지질 및 과산화지질의 농도를 감소시켜 동맥 내피에 지질이 침착되는 것을 억제할 뿐만 아니라, HDL-콜레스테롤을 LDL-콜레스테롤로 전환시키는 동맥경화 유발 인자 CETP (cholesteryl ester transfer protein) 활성을 억제하므로, 동맥경화증 및 고콜레스테롤혈증의 예방 및 치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

산마늘 추출물을 포함하는 동맥경화증 및 고콜레스테롤혈증의 예방 및 치료용 조성물 {Prophylactic and therapeutic compositions for atherosclerosis and hypercholesterolemia containing the extract of Allium victorialis}

본 발명은 산마늘 추출물을 유효 성분으로 하는 동맥경화증 및 고콜레스테롤혈증의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

순환기계 질환은 미국, 유럽뿐만 아니라 우리나라에서도 주요 사망 원인으로대두되고 있으며, 특히 동맥경화성 질환인 허혈성 심질환 (협심증, 심근경색증)과 뇌혈관 질환에 의한 사망률이 큰 폭으로 증가되고 있다 (송영득, 고콜레스테롤 환자의 임상적 접근,한국지질학회지6(2):163-170, 1996). 현재 가장 많은 지지를 받고 있는 동맥 경화증 발생 이론은 손상 반응설 (response-to-injury hypothesis)로서, 동맥경화증은 동맥 내피 세포의 손상 및 증식, 혈중 단핵구 (monocyte)의 혈관벽내 이동과 대식세포 (macrophage)로의 변형, 지질과 죽은 세포의 침착, 평활근 세포의 증식 및 섬유화 과정. 혈소판 침착 및 응집 반응으로 인한 혈관 수축과 협착을 거쳐 일어나며, 이에 따라 혈관이 비후되어 좁아지고 동맥벽이 경화되는 것으로 설명되고 있다 (Ross R.,Nature362:801-809, 1993).

구미에서 수십만 명을 대상으로 한 연구를 통해, 고콜레스테롤혈증과 혈중 저밀도 지단백질(low-density lipoprotein, LDL)의 농도 증가가 중요한 동맥경화증의 발병 요인이며, 그 외에도 흡연, 고혈압, 비만, 당뇨, 스트레스, 나이 등이 위험 인자 (risk factor)로 작용함이 밝혀졌다 (Natio H.K.,Clin. Chem.41(1) :131-133, 1995; Wong N.D.et al., Am. J. Epidemiol.130:469-480, 1989). 현대인의 식생활 환경의 향상에 따른 과다한 영양섭취로 인해 과다섭취된 콜레스테롤은 신체 내의 세포 요구를 충족시키고 남게 된다. 이러한 콜레스테롤은 저밀도 지단백질을 통해 떠돌다가 변형된 형태로 바뀌어 혈관 내막에 흡착되고, 거품 세포 (foam cell), 지방반 (fatty streak), 아테롬 (atherom)으로 전환되기도 하며, 이들은 혈관의 수축, 팽창 능력을 떨어뜨려 관상동맥 질환, 뇌졸중, 말초혈관 협착, 고혈압 등을 일으키는 원인이 되고 있다 (Wilztum J.L.et al., J. Clin. Invest.88:1785-1792, 1991). 불과 20년 전만 하더라도 동맥경화증은 나이가 들면서 자연히 생기는 퇴행성 (degenerative) 과정이라고 생각했으나 수십 년에 걸친 역학조사 과정에서 여러 위험 인자들이 복합적으로 작용하여 동맥경화 병변을 만들며, 많은 종류의 세포들과 이들이 분비하는 각종 성장 인자와 사이토카인 (cytokine)들이 복잡한 과정으로 병변에 관여한다는 사실이 밝혀졌다. 부검을 통한 연구 결과에서 보면, 동맥 경화는 소아기 시절부터 이미 생기기 시작하고 (Newman W.P. Ⅲet al., Annu. N. Y. Acad. Sci.623:16-25, 1991), 사춘기에 급속히 증가하여 이후 계속 진행하면서 여러 위험 인자에 의해 동맥 경화증의 발생이 가속화된다 (Strong J.P.,Clin. Chem.41(1):134-138, 1995). 동맥경화증에 대한 연구는 고콜레스테롤혈증과 여러 위험 인자들의 복잡한 반응에 의한 동맥경화로의 진행을 차단함으로써 이를 예방하는 것이 주목적인데 현재의 의학 수준에서는 이들 인자를 모두 제거하지는 못하는 실정이다.

구체적으로, 동맥경화증은 죽상경화 (atherosclerosis), 중막 경화 (medial calcification) 및 세동맥경화 (arteriosclerosis)의 3가지 질환으로 나눌 수 있으며, 흔히 동맥경화증이라고 부르는 질환은 죽상동맥경화증을 지칭하는 것으로 쓰인다 (김치정의약정보12월호:24-28,1994). 동맥경화증의 가장 중요한 병인은 고콜레스테롤혈증이며 그 중에서도 LDL-콜레스테롤 농도가 높을수록 동맥경화증이 쉽게 유발된다.

혈중 콜레스테롤의 양을 줄이는 방법으로는 간 속의 ACAT (acyl CoA : cholesterol-o-acyltransferase)의 활성을 저해하거나, 또는 지단백질간에 콜레스테롤 전이를 매개하는 콜레스테릴 에스테르 전이 단백질 (cholesteryl ester transfer protein, CETP)의 작용을 억제하거나, 또는 간에서 콜레스테롤 생합성에 관여하는 3-하이드록시-3-메틸 글루타릴 조효소 A (HMG-CoA) 환원 효소의 작용을 억제하는 방법이 이용된다.

혈액에서 콜레스테롤 혹은 다른 지질들을 운반하는 지단백질 대사 경로의 복잡한 과정들은 크게 세포의 콜레스테롤 수요를 충족시키는 경로와 세포에서 사용하고 남은 콜레스테롤을 수거하여 제거하는 경로로 나눌 수 있다 (Tall A.R.,Eur. Heart J.19(Supply A):A31-A35, 1998). 상기에서 후자를 콜레스테롤 역수송 (reverse cholesterol transport) 경로라고 부르며, 이 과정에서 CETP 효소는 고밀도 지단백질 (high density lipoprotein; HDL)의 콜레스테롤을 저밀도 지단백질 (low density lipoprotein; LDL)로 옮기는 작용을 한다. 이러한 작용의 결과로 HDL을 통해 간으로 전달되어 체외로 배출되어야 할 콜레스테롤이 LDL로 전달되어 혈중에서 효과적으로 제거되지 못하고 동맥경화증의 병인으로서 작용하므로 CETP는 동맥경화 유발인자 (atherogenic factor)라고 불리운다.

CETP는 HDL로부터 LDL로 콜레스테롤을 이동시키는데 관여하는 효소로, 최근 혈중 콜레스테롤 조절에 있어서 중요한 효소로 주목받고 있다. 혈중 CETP 활성이 거의 없는 것으로 알려진 돼지나 흰쥐를 이용한 연구와 일본에서 수행된 혈중 CETP 결핍 가계에 관한 연구 (Koijumi J.et al., Atherosclerosis58:175-186, 1985)에서는 공통적으로 혈중 LDL 농도는 현저히 낮아지고, HDL의 농도는 현저히 높아지는결과를 보이며 혈중 총 콜레스테롤 농도는 정상인에 비해 2~3배 가량 높으나 동맥경화는 발병하지 않는 것으로 보고되었다. 이러한 점에 주목하여 CETP 효소의 저해를 통한 새로운 개념의 동맥경화 치료제 개발이 이루어지고 있다.

유전적으로 CETP가 결핍된 사람에게 있어서 LDL 내의 콜레스테릴 에스테르의 양이 감소하고 상대적으로 HDL 내의 콜레스테릴 에스테르의 양이 증가하는 현상과, 사람의 CETP로 발현된 형질전환 마우스의 LDL내 콜레스테릴 에스테르의 양이 감소됨을 보고한 연구 결과들은 혈장 HDL과 LDL내의 콜레스테릴 에스테르의 양이 혈장 단백질인 CETP 활성에 의해 크게 영향을 받음을 보여준다. 혈장 CETP 활성이 감소되면 항죽종성 (anti-atherogenic) HDL이 증가되며, 죽종 형성성 VLDL (초저밀도 지단백질)과 LDL의 감소로 인해 관상동맥질환의 발병률이 줄어든다. 또한 VLDL과 LDL은 동맥경화의 진전과 관련이 있고, HDL은 항죽종성과 연계되어 있기 때문에 CETP를 죽종 형성성 단백질이라고도 하며, CETP 발현은 동맥경화의 진전속도를 가속화시킨다. CETP가 발현되도록 형질전한된 쥐 (transgenic mice)는 정상 쥐보다 악성의 동맥경화 현상을 나타냈으며, 동맥경화에 대한 심화의 정도는 주로 CETP로부터 유도된 지단백질 양상 (profile)과 관계가 있다. CETP 결핍은 HDL의 콜레스테롤 에스테르가 LDL로 운반되는 기작을 중지시키므로써, LDL 내에 콜레스테롤의 양이 적게 분포되는 결과를 초래한다. 이와 같은 배경을 바탕으로 새로운 개념의 동맥경화 치료제를 개발하기 위해 CETP 효소 활성 억제제 개발에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.

상기와 같은 동맥경화증을 예방하기 위하여 여러 가지 민간요법 혹은 식이요법들이 권장되고 있고, 특히 생약재나 천연물 혹은 그 추출물들은 우리나라를 비롯한 동양권에서 과거로부터 현재까지 민간적으로 널리 사용되고 있으며 부작용이 적은 반면, 기초적, 과학적 연구가 많이 되지 않고 있는 실정이다.

이에 본 발명자들은 혈중 지질 및 콜레스테롤 농도 감소 효과 및 CETP 억제 효과가 뛰어난 천연물을 찾고자 연구를 거듭한 결과, 백합과 다년초 식물의 일종으로 예로부터 강장 및 생리장애 완화 효과 및 해독 작용을 갖는 것으로 알려진 산마늘 (Allium vitorialisMakino) 추출물이 고콜레스테롤혈증이 유도된 토끼와 CETP 형질 전환 마우스에서 지질과 과산화지질의 농도를 저하시키며 대동맥 내벽에 동맥경화증의 지표인 플라크 (plaque) 형성을 억제시킬 뿐만 아니라, CETP 효소 활성 저해 효과가 큰 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 동맥경화증 예방 및 치료 활성을 갖는 식물 추출물 및 이를 유효성분으로 하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 동맥경화증 유발 인자인 CETP의 효소 활성에 대한 억제효과가 클 뿐만 아니라, 식용이 가능하고, 특히 기능성 식품으로써 상품화가 가능한 동맥경화증 예방 및 치료 활성을 갖는 식물 추출물을 제공하는 것이다.

구체적으로 본 발명의 목적은 산마늘 추출물을 포함하는 동맥경화증 예방 및 치료용 약학 조성물과 산마늘 추출물을 포함하는 동맥경화증 예방 및 치료용 기능성 건강식품을 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명의 산마늘 추출물이 대동맥의 지질침착 정도에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 정상 토끼 (A), 고콜레스테롤혈증을 유발시킨 토끼 (B), 고콜레스테롤혈증 유발 후 각각 산마늘 추출물 (C)과 콜레스테롤 저하제인 로바스타틴 (lovastatin) (D)을 투여한 토끼 대동맥을 적출하고, 오일 레드 O 염색 (oil red O staining)으로 지질 침착 정도를 관찰한 광학현미경 사진이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명에서는 산마늘 추출물을 유효 성분으로 하는 동맥경화증 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 산마늘 추출물을 포함하는 혈중 지질 및 콜레스테롤 감소를 위한 기능성 식품을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 산마늘 추출물은 뿌리뿐만 아니라 지상부 전체를 포함하는 전초를 열수 또는 알콜 등의 유기용매로 추출한 것으로서, 95∼99 %의 에탄올을 이용하여 추출하는 것이 바람직하다.

보다 바람직하게는, 본 발명의 산나물 추출물은 지상부를 포함하는 산마늘의 건조된 전초를 20∼100 메쉬 (mesh)로 분쇄하고 15∼25℃에서 시료 부피의 2~5 배 용량의 에탄올에 24∼96시간 침적하여 추출함으로써 얻을 수 있다.

산마늘은 동북아시아 지역에 분포하고 있으며, 우리 나라에서는 주로 울릉도 및 강원도 북부 산간의 고산대에서 많이 자라고 있다. 산마늘의 일반 성분은 수분 77.3%이며 건조 상태에서 조단백 11.6%, 조지방 10.2%, 무기질 46.3%, 섬유소 22.18%를 포함한다. 또한, 잎과 줄기 부위에는 건조물 중량으로 과당이 7.86%, 포도당이 8.89%, 자당이 1.69% 함유되어 감미가 높으며, 비타민 함량도 B₂가 0.017%. 나이신 함량은 0.8%이고, 무기물 함량은 칼륨이 3.2%로 가장 많은 함량을 보이고 있다.

본 발명의 산마늘 추출물은 동물에게 투여시 동맥 내피에 지질이 침착되는 것을 억제할 뿐만 아니라, 혈중 지질 농도를 감소시키므로, 동맥경화증 및 고콜레스테롤혈증에 대한 예방 및 치료용 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.

상기와 같은 산마늘 추출물의 동맥경화증 및 고지혈증의 예방 및 치료 효과는 본 발명의 동물 실험을 통해 확인되었다. 이를 위해 본 발명의 바람직한 일 실시예에서는 고콜레스테롤혈증이 유발된 토끼와 CETP 효소 유전자로 형질전환된 마우스를 모델로 산마늘 추출물의 약리 효과를 조사하였다. 동맥경화증 연구에는 일반적으로 토끼가 실험 모델로 쓰이는데 이는 단기간에 고콜레스테롤혈증과 동맥경화성 병변의 형성이 유도되며 (Tall A.R.,J. Lipid Res.34:1255-1274, 1993), 동맥경화 유발인자 (atherogenic factor)인 CETP의 효소 활성도가 사람에 비해 2.8배나 높기 때문이다 (Ha, Y.C. and Barter, P.J.,Comp. Biochem. Phsiol.71B:265-269, 1982).

상기 실험 동물들에 동맥경화증을 유발하기 위해, 사료에 1%의 콜레스테롤과 0.3%의 소듐 콜레이트 (sodium cholate)를 혼합한 고콜레스테롤 식이를 30일간 섭취시킨 후, 12시간 절식시키고 귀정맥 또는 꼬리 정맥에서 채혈하여 고콜레스테롤혈증이 유발된 동물을 선별하였으며, 이를 다시 산마늘 투여군, 양성대조군 및 음성대조군의 3개군으로 나누어 각각 0.5% (v/w) 산마늘 추출물을 30일간 (마우스는 40일간) 사료에 섞어 투여하거나, 공지의 콜레스테롤 저하제인 로바스타틴을 사료 kg당 0.05g씩 섞어 투여하였다. 로바스타틴은 간에서 콜레스테롤 생합성에 관여하는 3-하이드록시-3-메틸 글루타릴 조효소 A 환원 효소 (HMG-CoA reductase)의 작용을 억제하여 HMG-CoA가 메발론산 (mevalonate)으로 전환되는 것을 억제하는 공지의 콜레스테롤 저해제이다.

상기와 같이 처리한 실험 동물에서 트리글리세라이드, 총 콜레스테롤, HDL-콜레스테롤, LDL-콜레스테롤 및 ALP 효소 활성 등 혈장 지질에 대한 분석을 수행한 결과, 산마늘 추출물 투여군은 대조군에 비해 혈중 총 콜레스테롤, LDL 콜레스테롤, TG의 농도와 ALP의 활성, 그리고 과산화지질의 농도가 감소하는 것으로 관찰되었다. 알카라인 포스파타제 (alkaline phosphatase; ALP) 효소는 간이나 신장 등의 기능에 이상이 있을 때 그 혈중 농도가 증가하는 효소로, 본 발명에서는 고콜레스테롤혈증 유발과 산마늘 추출물의 투여가 실험 동물의 간 등의 기능에 미치는 영향을 알아보기 위한 지표로 이 효소의 활성을 측정하였다. 고콜레스테롤혈증이 유발된 토끼의 혈중 ALP 활성은 지속적으로 증가하였으나, 산마늘 추출물을 투여한 토끼의 ALP의 활성은 산마늘 추출물 처리 전후에 변화가 없는 것으로 나타났다.

한편, 본 발명의 또다른 실시예에서 처리 종료 후 실험 동물의 간과 심장 조직의 지질함량을 살펴본 결과, 산마늘 추출물 투여군에서 콜레스테롤의 농도가 감소된 것으로 나타났다. 아울러, 대동맥을 적출하여 지질을 염색한 결과, 산마늘추출물을 투여한 토끼의 대동맥 내벽에 지질 침착이 감소된 것으로 확인되었다.

이상과 같은 산마늘 추출물의 항동맥경화 효과가 LDL-콜레스테롤을 생성하는 CETP 효소의 활성 억제와 관련있는지 확인하기 위하여 본 발명의 또다른 실시예에서는, CETP 유전자로 형질전환된 마우스 동물 모델을 이용하여 산마늘 추출물의 항동맥경화성 효능을 관찰하였다. CETP는 HDL-콜레스테롤을 LDL-콜레스테롤로 전환시킴으로써 HDL을 통해 간으로 전달되어 체외로 배출되어야 할 콜레스테롤을 LDL로 전달하여 혈중에서 효과적으로 제거되지 못하게 함으로써 동맥경화증의 병인으로 작용케 하는 효소이다. CETP 형질전환 마우스를 이용한 실험 결과, 본 발명의 산마늘 추출물은 혈중 콜레스테롤과 TG의 농도 및 조직의 지질 함량을 감소시키는 것으로 나타났다. 이러한 혈중 지질과 과산화지질 농도의 감소 효과를 양성 대조군인 로바스타틴 투여군과 비교하였을 때, 본 실험에 사용된 산마늘이 1차 추출물임을 감안하면 혈중 지질의 농도 저하가 상당히 높은 약리 활성물질이 함유되어 있을 것으로 기대된다.

한편, 산마늘은 독특한 맛을 지니고 있어 봄철에 미각을 돋우는데 적합하고, 예로부터 강장 및 생리장애 완화 효과 및 해독작용을 나타내는 것으로 전해 왔으므로, 산마늘 추출물은 본 발명의 약리 효과와 더불어 혈중 지질 및 콜레스테롤 감소를 위한 기능성 식품으로 제조될 수도 있다. 기능성 식품 개발을 위하여 산마늘 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어 각종 식품류, 육류, 음료수, 초코렛, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류, 알콜 음료류,비타민 복합제, 건강보조식품류 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 기능성 식품 분야에서 통상적으로 이용되는 방법에 따라 제조될 수 있다.

본 발명의 동맥경화증 및 고지혈증 예방 및 치료를 위한 약학적 조성물은 유효성분으로서 산마늘 추출물을 포함하며, 이외에도 비독성, 불활성, 제약상 적합한 부형제를 포함할 수 있다. 본 발명의 산마늘 추출물은 임상투여시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.

실제 임상투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 바람직하게는 경구용으로 이용하는 것이 좋으며, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비독성이고 불활성인 제약상 적합한 부형제는 고상, 준고상 또는 액상 희석제, 충전제 및 모든 유형의 제형 보조물이다.

바람직한 제형으로는 정제, 피복 정제, 캡슐제, 환제, 과립제, 좌약, 액제, 현탁액제 및 에멀전제, 페이스트제 (pastes), 연고제, 겔제, 크림제, 로션제, 산제 및 분무제 등이 포함된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

상기 제약 제형에 있어서 유효성분인 산마늘 추출물은 전체 혼합물의 약 0.1 내지 99.5 중량%, 바람직하기로는 0.5 내지 95 중량%의 양으로 함유되어야 한다.

개별 투약 형태는 본 발명에 의한 산나물 추출물을 약 1 내지 약 80 ㎎/㎏ (체중), 특히 3 내지 30 ㎎/㎏ (체중)으로 투여하는 것이 적합하다. 그러나, 상기 투약량은 변화시킬 필요가 있으며, 특히 치료할 객체의 체질 특이성 및 체중, 질병의 종류 및 심도, 제형의 성질, 의약품 투여의 성질, 및 투여기간 또는 간격을 고려해서 변화시킬 수 있다.

본 발명의 산마늘 추출물은 생체 내에 공급하였을 경우 독성을 나타내지 않으므로 고지혈증 예방 및 치료 목적의 약학적 조성물의 유효 성분 또는 기능성 식품의 유효성분으로 안전하게 포함될 수 있다. 산마늘 추출물의 독성 여부를 확인하기 위하여 본 발명의 실시예에서는 랫드에 대한 경구투여 급성 독성 시험을 수행하였으며 혈액학적 검사와 혈액생화학적 검사 결과 독성 변화는 나타나지 않았고 5ｇ/㎏ 이하의 범위에서 독성변화를 나타내지 않음을 확인할 수 있었다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 산마늘 추출물의 제조

본 발명에서 사용한 산마늘은 뿌리뿐만 아니라 지상부 전체를 포함하는 전초를 사용하였다. 울릉도에서 채집한 산마늘 전초를 실내에서 건조시키고 추출을 위해 윌리 분쇄기 (Wiley mill)를 사용하여 40~60 mesh로 분쇄하였다. 분쇄된 전초를 실온에서 시료 부피의 3배 용량의 에탄올에 72시간 침적한 후 연속하여 3회 추출하고 추출액은 회전 증발 건조기 (rotary evaporator)에서 추출액 부피의 5%까지 농축시킨 후 4℃에 보관하여 사용하였다.

<실시예 2> 실험동물에서 고콜레스테롤혈증의 유발과 산마늘 추출물 투여

2-1) 실험동물에서 고콜레스테롤혈증의 유발

2.2∼2.6kg의 웅성 토끼 (New Zealand White; 삼육실험동물농장, 오산)를 온도 23 ±1℃, 상대습도 55 ±5%, 명암교대 12시간의 조건으로 물과 사료를 자유롭게 섭취할 수 있도록 충분히 공급하며 사육하였다. 상기 토끼를 2주간의 순화기간 동안 펠렛 사료 (육성용, 신촌사료)를 분쇄한 분말사료에 적응하게 하였고, 동맥경화증 유발을 위해서 분말 사료에 1%의 콜레스테롤과 0.3%의 소듐 콜레이트 (sodium cholate)를 혼합한 고콜레스테롤 식이 (high cholesterol diet, HCD; Teklad사, 미국)를 30일간 섭취시켰다 (Vesselinovitch D.,Arch. Pathol. Lab. Med.112:1011-1017, 1988; Manning P.J.et al., The Biology of the Laboratory Rbbits, 2nd ed., 367-372, 1994). 이후 토끼를 12시간 절식시키고 귀정맥에서 채혈하여 혈중 콜레스테롤 농도가 1,000㎎/㎗ 이상으로 고콜레스테롤혈증이 유발된 토끼를 선별하여 시험에 사용하였다. CETP 형질전환 마우스 (C57BL/6 UCTP-20, 대전 생명공학연구소 유전자 자원 센터)는 정상 식이용 분말 사료 (퓨리나 1호)에 1%의 콜레스테롤, 0.3%의 소듐 콜레이트 (sodium cholate)와 5% 라드 (lard)를 섞은 후 펠렛 형태로 제조하여 30일간 섭취시켰다. 이후 마우스의 꼬리 정맥에서 혈액을 채취하여 고콜레스테롤혈증 유발을 확인한 후 시험에 사용하였다.

2-2) 고콜레스테롤 혈증이 유발된 실험동물에 산마늘 추출물 투여

토끼에 고콜레스테롤 식이를 30일 동안 섭취시켰을 때, 혈중 콜레스테롤 농도는 섭취 전 60 ㎎/㎗에서 급속히 증가하여 1284㎎/㎗로 높아졌으며, TG의 농도도 87㎎/㎗에서 135㎎/㎗로 높아져 고콜레스테롤혈증이 유발되었다. 상기와 같이 고콜레스테롤혈증이 유발된 토끼를 산마늘 추출물 투여군, 양성 대조군 및 대조군의 3개 군으로 나누었다. 산마늘 추출물 투여군은 이후 30일 동안 0.5%(v/w) 산마늘 추출물을 고콜레스테롤 분말 식이에 섞어 투여하였으며, 매 10일마다 토끼의 귀정맥에서 채혈하여 혈장을 분석하였다. 양성 대조군에는 콜레스테롤 저하제로 잘 알려져 있는 로바스타틴 (lovastatin, 중외제약)을 사료 ㎏당 0.05g씩 섞어 투여하였다.

CETP 형질전환 마우스는 고콜레스테롤 식이를 30일간 섭취시킨 후 0.5% (v/w) 산마늘 추출물을 첨가한 고콜레스테롤 펠렛 사료를 이후 40일 동안 섭취시키면서 매 10일마다 마우스의 꼬리정맥에서 혈액을 채취하여 분석하였다.

<실시예 3> 산마늘 추출물이 토끼의 혈장 지질 및 과산화지질의 농도와 ALP 활성도에 미치는 영향

3-1) 실험 토끼의 혈장 지질 분석

트리글리세라이드 (triglyceride, TG)는 글리세롤 산화효소 (glycerol oxidase)법을 이용하여 TG 측정 키트 (Sigma, 미국)로, 총 콜레스테롤은 콜레스테롤 산화효소 (cholesterol oxidase)법을 이용하여 총 콜레스테롤 측정 키트 (Sigma, 미국)로, HDL-콜레스테롤은 인산화텅스텐산-염화 마그네슘(phosphotunstic acid-MgCl₂) 침전법 (Assmann G.et al., Clin. Chem.28:2026-2030, 1983)을 이용한 키트 (Sigma, 미국)를 이용하여 정량하였으며, 토끼의 LDL-콜레스테롤은 프리드발트 식 (Friedwald W.T.et al., Clin. Chem.18(6):499-502, 1972)을 이용하여 계산하였다. ALP (alkaline phosphatase) 활성은 동역학적 방법 (Bowers G.N.Jr and McComb R.B.,Clin.Chem.12:70-89, 1966)을 이용하여 측정하였다.

3-2) 실험 토끼의 혈장 지질과산화 상태 측정

한편, 혈장 과산화물의 측정에 있어서는 구테리지의 방법 (Gutteridge J.M.C. and Trickner T.R.,Anal. Biochem.91:250-257, 1978)을 적용하여 TBA (thiobarbituric acid) 반응으로 형성되는 MDA (malondialdehyde)를 정량하였다. 먼저, 혈장 50㎕에 5% TCA (trichloroacetic acid) 용액 300㎕와 60mM TBA 100㎕를 넣어 잘 혼합한 후, 80℃ 수조에서 90분간 가열하였다. 이 반응액을 실온으로 식혀 500 ×g에서 15분간 원심분리한 다음 상등액을 취하여 535nm에서 흡광도를 측정하였다 (SPECTRAmax 190, Molecular Devices사, 미국). MDA 표준용액은 TMP (tetramethoxypropane)를 가수분해하여 조제하였으며 이를 혈장과 동일한 조건에서 반응시켜 TBA-MDA 발색 표준 곡선을 얻고, 이 곡선으로부터 TBA 반응물질의 양을 생성된 MDA의 양 (nmoles/ml)으로 산출하였다.

3-3) 실험 토끼의 혈장 지질 분석 결과

고콜레스테롤혈증이 유발된 토끼에서의 상기 실험 결과는 하기 표 1에 나타내었는데, 산마늘 추출물 투여군에서 혈중 콜레스테롤 농도는 투여 30일째에 대조군에 비해 유의하게 20.8% 감소하였고 (대조군: 1373 ±38㎎/㎗, 투여군: 1087 ±48㎎/㎗, P<0.01), LDL-콜레스테롤 농도는 유의하게 21.8% 감소하였다 (대조군: 1293 ±36㎎/㎗, 투여군: 1010 ±49㎎/㎗, P<0.01). 또한, HDL-콜레스테롤의 농도는 변화가 없었으며, TG 농도는 유의하게 22.1% 감소하는 것으로 나타났다 (대조군: 172 ±24 ㎎/㎗, 투여군: 134 ±12㎎/㎗, P<0.05). 한편, ALP의 활성은 감소하는 경향을 나타내었으나 통계적인 유의성은 없었고, 혈장 지질의 과산화 정도를 MDA의 농도로 측정하였을 때 유의하게 51.7% 감소되었다 (대조군:5.6 ±1.3nmol/㎖, 투여군: 2.7 ±0.4nmol/㎖, P<0.05). 한편, 양성대조군인 로바스타틴 투여군에서는 강력한 혈중 지질 강하효과가 관찰되었다.

산마늘 추출물의 투여가 고콜레스테롤혈증이 유발된 토끼의 혈중 지질 농도와 효소 농도에 미치는 영향

처리	처리일^a	총콜레스테롤(㎎/㎗)	LDL-콜레스테롤(㎎/㎗)	HDL-콜레스테롤(㎎/㎗)	트리글리세라이드(㎎/㎗)	ALP(Ｕ/Ｌ)	MDA(nmol/㎖)
고콜레스테롤식이(n=11)	0	1233 ±69	1162 ±66	47 ±5	119 ±18	73 ±9	3.2 ±0.3
	10	1342 ±47	1241 ±40	50 ±5	255 ±54	108 ±16	3.4 ±0.5
	20	1313 ±65	1226 ±62	48 ±2	196 ±23	77 ±9	5.3 ±0.8
	30	1373 ±38	1293 ±36	45 ±1	172 ±24	96 ±13	5.6 ±1.3
고콜레스테롤식이+ 산마늘추출물(n=7)	0	1321 ±55	1257 ±54	34 ±4	151 ±23	57 ±7	3.1 ±0.2
	10	1298 ±29	1220 ±27	46 ±3	157 ±17	57 ±19	3.9 ±0.1
	20	1108 ±57*	1034 ±58*	49 ±2	128 ±18	75 ±22	3.9 ±0.3
	30	1087 ±48**	1010 ±49**	50 ±2	134 ±12	58 ±11	2.7 ±0.4
고콜레스테롤식이 + 로바스타틴(n=6)	0	1297 ±80	1223 ±75	48 ±4	135 ±22	66 ±8	2.9 ±0.2
	10	1253 ±64	1170 ±63	54 ±6	141 ±11	114 ±24	3.2 ±0.4
	20	985 ±27**	912 ±24**	54 ±5	92 ±6	71 ±12	4.1 ±0.7
	30	972 ±54**	903 ±53**	52 ±2	85 ±5	97 ±31	3.9 ±0.7
정상식이	30	54 ±8	26 ±7	17 ±5	55 ±7	39 ±7	2.1 ±0.2
수치는 평균±S.E(표준편차)를 나타낸다.^a:30일 동안 고콜레스테롤 식이를 급여한 후 샘플을 처리한 날짜:P<0.05에서 해당하는 처리일의 대조군과 현격한 차이가 있는 것*:p<0.01에서 해당하는 처리일의 대조군과 현격한 차이가 있는 것

<실시예 4> 산마늘 추출물의 투여가 토끼의 조직지질에 미치는 영향

고콜레스테롤 혈증이 유발된 토끼의 간과 심장 조직에서의 지질 함량에 산마늘 추출물의 투여가 미치는 영향을 조사하기 위해 실험 종료 12시간 전에 모든 군의 토끼를 절식시킨 후 300 ㎎/kg 케타민 하이드로클로라이드 (ketamine hydrochloride, 유한양행)를 복강 내 주사하여 마취시키고 간과 심장 조직을 적출하였다. 조직을 생리식염수로 씻어 혈액을 제거한 후 1g을 달아 10㎖의 완충액(0.1 M Tris-HCl, pH 7.4, 1mM EDTA, 0.01% sodium azide)에 넣어 폴리트론 균질 파쇄기 (polytron homogenizer; Janke Kunkel, 독일)를 사용하여 분쇄하였다. 분쇄된 조직균질액은 10 배 용량의 클로로포름/메탄올 용액 (2:1, v/v)에 넣어 조직내 전체 지질을 추출하였다. 2차 추출은 Folch 방법 (Folch J.et al., J. Biol. Chem.226:497-509, 1952)을 사용하였으며, 추출된 지질은 질소 가스로 말린 다음 이소프로필 알콜에 다시 녹인 후 총콜레스테롤 농도와 트리글리세라이드 농도를 실시예 3의 방법으로 측정하였다.

고콜레스테롤 혈증이 유발된 토끼에서의 상기 실험 결과는 하기 표 2에 나타나 있는데, 산마늘 추출물 투여군에 있어서는 간 조직의 총콜레스테롤 (대조군: 53.4 ±6.6 ㎎/g, 투여군: 29.3 ±1.8㎎/g, P<0.05) 및 트리글리세라이드 함량 (대조군: 20.6 ±3.4 ㎎/g, 투여군: 12.5 ±1.1㎎/g, P<0.05)의 유의성 있는 감소가 관찰되었다. 심장조직에서 총콜레스테롤 함량은 유의성 있게 감소되었으나 (대조군: 16.4 ±1.9 ㎎/g, 투여군: 5.5 ±1.0㎎/g, P<0.01), 트리글리세라이드 함량은 변화되지 않았다. 한편 양성대조군인 로바스타틴 투여군에서는 간과 심장조직 모두에서 총콜레스테롤 및 트리글리세라이드 함량의 유의성 있는 감소가 관찰되었다.

산마늘 추출물의 투여가 고콜레스테롤혈증 토끼의 조직 지질 함량에 미치는 영향

처리	동물수	간(㎎/g)	심장(㎎/g)
처리	동물수	총콜레스테롤	트리글리세라이드	총콜레스테롤	트리글리세라이드
고콜레스테롤식이	11	53.4 ±6.6	20.6 ±3.4	16.4 ±1.9	12.6 ±2.6
고콜레스테롤식이+산마늘추출물	7	29.3 ±1.8	12.5 ±1.1	5.5 ±1.0	14.0 ±3.8
고콜레스테롤식이+로바스타틴	6	26.4 ±1.8	10.4 ±2.4	8.9 ±2.0	6.7 ±2.0
정상식이	3	23.5 ±3.3	8.2 ±3.1	8.7 ±1.8	6.1 ±2.5
수치는 평균±S.E(표준편차)를 나타낸다.:P<0.05에서 대조군과 현격한 차이가 있는 것*:p<0.01에서 대조군과 현격한 차이가 있는 것

<실시예 5> 산마늘추출물의 토끼 동맥경화증 예방 효과

실험예 2와 같이 처리한 후 토끼의 대동맥을 적출하여 지질을 염색하고 각 군별 지질 침착 상태를 보여주는 죽상 경화반 (ahteromatous plaque)의 침식이 있는지를 관찰하여 산마늘 추출물이 토끼 동맥경화증에 예방 효과가 있는지를 조사하였다. 부검한 토끼의 대동맥 (aorta)을 적출하여 생리식염수로 씻어 동맥 주위의 지방질을 제거한 후 고정액 (4% paraformaldehyde, 50mM phosphate buffered saline(PBS), pH 7.4)에 24시간 동안 고정시켰다. 고정된 동맥은 20% 수크로스 (sucrose) 용액에 침적시킨 후 보관액 (30% glycerin, 30% ethylene glycol in 20mM phosphate buffer, pH 7.4)에 다시 침적시켰다. 침적된 동맥을 PBS로 씻은 후 동결절편기를 사용하여 16㎛의 두께로 박절하고 젤라틴으로 표면 처리된 슬라이드에 부착시켰다. 상기 슬라이드에 PBS용액을 가한 다음 무수 프로필렌 글리콜 (propylene glycol) 용액에 2분간 헹구고 0.5% 오일 레드 O (oil red O) 용액에 1 시간 동안 염색하였다. 이후 85% 프로필렌 글리콜 용액에 1분간 감별시키고 증류수로 두 번 세척한 후 플로이마운트 (ploymount)로 봉입하여 광학 현미경으로 관찰하였다 (Luna L.G.,Manual of histological staining methods of the AFIP,140-141, Kimen, 1968).

그 결과는 도 1에 나타나 있는데, 정상적인 식이를 공급한 토끼 (A)의 대동맥 내벽에는 지질 플라크 (plaque)의 침착이 전혀 관찰되지 않았으나, 고콜레스테롤 식이 투여군 (B)에서는 동맥 내벽에 지질 플라크가 동맥의 혈관벽 두께 이상으로 침착되었다. 반면 산마늘 추출물 투여군 (C)에서는 침착된 죽상경화반이 현저히 줄어들었으며, 양성 대조군인 로바스타틴 투여군 (D)에서도 지질침착 감소가 관찰되었다. 따라서 기존에 항동맥경화증 효능이 알려진 노바스타틴과 마찬가지로 본 발명의 산마늘 추출물의 동맥경화증 예방 효과가 우수함을 알 수 있다.

<실시예 6> 산마늘 추출물이 CETP 형질전환 마우스의 혈장 지질 및 과산화지질의 농도와 ALP 활성도에 미치는 영향

상기 실시예 3과 동일한 방법으로 CETP 유전자로 형질전환된 마우스에 대해 산마늘 추출물이 혈장 지질 및 과산화지질 농도와 ALP 농도에 미치는 영향을 조사하였다. 그 결과를 하기 표 3에서 보여주고 있는데, 산마늘 추출물 투여군에서 혈중 콜레스테롤 농도는 투여 40일째에 대조군에 비해 9.4% 감소하였으며 (대조군: 235.9±31.3 ㎎/㎗, 투여군: 213.8 ±20.9 ㎎/㎗, P<0.05), HDL-콜레스테롤이나 TG의 농도에 있어서는 변화가 관찰되지 않았다. 한편, ALP의 활성은 유의하게 48.2% 감소되었다 (대조군: 96.0 ±20.8 U/L, 투여군:49.7 ±2.8 U/L, P<0.01).

산마늘 추출물의 투여가 고지혈증 CETP 형질전환 마우스의 혈중 지질 농도와 효소 농도에 미치는 영향

	동물수	처리일	총콜레스테롤(㎎/㎗)	HDL-콜레스테롤(㎎/㎗)	트리글리세라이드(㎎/㎗)	ALP(Ｕ/Ｌ)
고콜레스테롤식이	7	0	152.0 ±5.2	41.7 ±3.7	67.7 ±7.4	152.0 ±5.2
고콜레스테롤식이	7	40	235.9 ±31.3	64.5 ±5.4	81.1 ±1.8	96.0 ±20.8
고콜레스테롤식이+ 산마늘추출물	7	0	152.0 ±10.4	42.0 ±1.5	55.4 ±2.5	152.0 ±10.4
고콜레스테롤식이+ 산마늘추출물	7	40	213.8 ±20.9	65.0 ±8.2	71.6 ±5.2	49.7 ±2.8
고콜레스테롤식이 + 로바스타틴	5	0	145.2 ±14.9	40.1 ±2.3	46.5 ±8.4	145.2 ±14.9
고콜레스테롤식이 + 로바스타틴	5	30	209.8 ±4.9	63.7 ±8.5	67.5 ±7.3	67.7 ±11.7
수치는 평균±S.E(표준편차)를 나타낸다.:P<0.05에서 대조군과 현격한 차이가 있는 것*:p<0.01에서 대조군과 현격한 차이가 있는 것

<실시예 7> 산마늘 추출물의 투여가 CETP 형질전환 마우스의 조직 지질에 미치는 영향

상기 실시예 4와 동일한 방법으로 CETP 유전자로 형질전환된 마우스간과 심장 조직에서의 지질함량에 산마늘 추출물의 투여가 미치는 영향을 조사하였다.

표 4에 나타난 바와 같이, 실험 종료 후 CETP 형질 전환 마우스의 간 조직을 분석한 결과 총 콜레스테롤과 TG 함량은 감소하는 경향을 나타내었으나 유의성이 없었고, 심장 조직의 TG 함량은 유의성 있게 63.7% 감소하였다 (대조군: 39.1 ±9.8 ㎎/g, 투여군: 14.2 ±0.9㎎/g, P<0.05).

산마늘 추출물의 투여가 CETP 형질전환 마우스의 조직 지질 함량에 미치는 영향

	동물수	간 (㎎/g)	심장 (㎎/g)
	동물수	총콜레스테롤	TG	총콜레스테롤	TG
고콜레스테롤식이	7	44.6 ±5.8	42.0 ±8.1	7.9 ±0.9	39.1 ±9.8
고콜레스테롤식이+ 산마늘추출물	7	38.8 ±2.4	35.3 ±4.0	10.5 ±1.3	14.2 ±0.9
고콜레스테롤식이 + 로바스타틴	5	32.5 ±3.5	46.9±15.4	13.8 ±4.7	11.0 ±2.1
수치는 평균±S.E(표준편차)를 나타낸다.:P<0.05에서 대조군과 현격한 차이가 있는 것*:P<0.01에서 대조군과 현격한 차이가 있는 것

<실시예 8> 랫드에 대한 경구투여 급성 독성 시험

6주령의 특정병원부재 (SPF) SD계 랫드를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 군당 암수 3 마리씩의 동물에 산마늘 추출물을 생리식염수로 부피를 맞춘 다음 5g/kg/10ml의 용량으로 단회 경구투여하였다. 시험물질 투여후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉각장기의 이상여부를 관찰하였다. 시험결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과 시험된 화합물은 모두 랫드에서 5g/kg까지 독성변화를 나타내지 않으며 경구투여 최소치사량 (LD₅₀)은 5g/kg 이상인 안전한 물질로 판단되었다.

본 발명의 산마늘 추출물은 동물에게 투여시 동맥 내피에 지질이 침착되는 것을 억제할 뿐만 아니라, 동물 체내의 혈중 콜레스테롤 및 과산화지질의 양을 현저히 감소시키고, HDL 콜레스테롤을 동맥경화증 유발성 LDL 콜레스테롤로 전환시키는 CETP 효소에 대해 억제 활성을 가지므로, 동맥경화증 및 고지혈증 예방 및 치료를 위한 약학적 조성물 또는 기능성 식품의 유효성분으로 효과적으로 이용할 수 있다.

Claims

산마늘 (Allium victorialis) 추출물을 유효 성분으로 하는 동맥경화증의 예방 및 치료용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 산마늘 추출물은 산마늘의 열수 추출물 또는 알콜을 포함하는 유기용매 추출물인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 2항에 있어서, 상기 산마늘의 유기용매 추출물은 15~50℃에서 에탄올에 24~96시간 침적하여 추출하는 방법에 의해 수득되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 3항에 있어서, 상기 산마늘 추출물은 건조된 전초를 20∼100 메쉬 (mesh)로 분쇄하여 15∼50℃에서 시료 부피의 2~5 배 용량의 에탄올에 24∼96시간 침적하여 추출하는 방법에 의해 수득되는 것을 특징으로 하는 조성물.
에탄올에 의해 추출되는 것으로서 혈중 지질 및 콜레스테롤 감소, CETP(cholesteryl ester transfer protein)에 대한 억제 활성을 가져 동맥경화증에 대해 예방 및 치료 효과를 나타내는 산마늘 추출물.
제 4항에 있어서, 상기 산마늘 추출물은 건조된 전초를 분쇄하고 15~50℃에서 시료 부피의 2~5 배 용량의 에탄올에 24~96 시간 침적하여 추출하는 방법에 의해 수득되는 것을 특징으로 하는 산마늘 추출물.
산마늘 추출물을 유효 성분으로 하며 혈중 지질 및 콜레스테롤 감소 활성을 갖는 기능성 식품.
제 7항에 있어서, 상기 산마늘 추출물은 건조된 전초를 분쇄하고 15~50℃에서 시료 부피의 2~5 배 용량의 에탄올에 24~96 시간 침적하여 추출하는 방법에 의해 수득되는 것을 특징으로 하는 기능성 식품.