KR101118773B1 - 산마늘 추출물을 포함하는 혈전성 질환 또는 아테롬성 동맥경화증 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
산마늘 추출물을 포함하는 혈전성 질환 또는 아테롬성 동맥경화증 예방 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 산마늘 추출물을 유효성분으로 하는 혈소판 응집 억제 활성 또는 혈관 근육 세포 증식 억제 활성을 갖는 약학적 조성물 또는 기능성 식품에 관한 것이다. 본 발명의 산마늘 추출물 또는 산마늘 부위별 용매별 분획은 혈소판 응집 억제 활성과 혈관 근육 세포의 비정상적인 증식을 억제하는 활성을 모두 나타내어, 급성 관상 동맥 증후군과 심근 경색과 같은 혈전성 질환 또는 아테롬성 동맥 경화증 또는 혈관 형성술 이후 재협착과 같은 질환을 예방 또는 치료하는 약학적 조성물 또는 기능성 식품의 유효 성분으로 사용될 수 있다. 또한, 천연물로서 독성이 없고 쉽게 얻을 수 있으므로 경제적이다.
산마늘 추출물, 혈전성 질환, 아테롬성 동맥 경화증
Description
본 발명은 산마늘 추출물을 유효성분으로 하는 혈소판 응집을 억제하는 활성과 혈관 근육 세포의 증식을 억제하는 활성을 갖는 약학적 조성물 또는 기능성 식품에 관한 것이다.
관상 동맥성 심혈관 질환은 현재 사망 원인의 30% 이상을 차지하고 있어 미국, 유럽 등 선진국에서 심각한 문제가 되고 있으며, 개발도상국에서도 식생활의 서구화, 운동 부족 등의 영향을 받아 증가하고 있는 추세이다. 그 중 동맥경화증은 죽상 경화(atherosclerosis), 중막 경화(medial calcification), 및 세동맥경화(arteriosclerosis)의 3 가지 질환으로 나눌 수 있으며, 흔히 동맥경화증이라고 부르는 질환은 죽상 동맥 경화증을 지칭하는 것으로 쓰인다.
동맥 경화증을 일으키는데에는 수많은 인자가 관여하고 있다. 그 중에서도 혈소판 응집과 혈관 근육 세포 증식은 뇌졸중, 심근 경색 및 혈관형성 수술 후 재협착과 같은 죽상 동맥 혈전의 병리에서 필수적으로 나타난다. 특히, 아테롬성 동 맥경화증은 혈소판 응집과 혈관 근육 세포 증식이 모두 나타난다. 따라서, 아테롬성 동맥경화증은 그 만큼 위험이 높다. 콜라겐, 트롬복산(thromboxane) A2, 트롬빈과 같은 혈소판 활성화 물질 및 혈소판 유래 성장인자(platelet derived growth factor, PDGF), 표피 성장 인자와 종양 괴사 인자 알파 등과 같은 펩티드 성장 인자와 사이토카인이 혈소판 활성화를 촉진하고 혈관 근육 세포 증식 반응을 촉진한다고 알려져 있다. 천연물은 새로운 약물을 개발하기 위한 출발점이 되고 있다. 따라서, 혈소판 응집과 혈관 근육 세포의 증식을 억제하는 활성을 갖는 천연물을 찾는다면, 새로운 약물 개발에 사용될 수 있는 후보 물질로의 가능성이 있을 것이다.
한편, 산마늘(Allium Victorialis Var . Platyphyllum)은 동북 아시아 지역에 분포하고 있으며, 우리나라에서는 주로 울릉도 및 강원도 북부 산간의 고산대에서 많이 자라고 있다. 산마늘의 일반 성분은 수분 77.3%이며 건조 상태에서 조단백 11.6%, 조지방 10.2%, 무기질 46.3%, 섬유소 22.18%를 포함한다. 또한, 잎과 줄기에는 건조물 중량으로 과당이 7.86%, 포도당이 8.89%, 자당이 1.69% 함유되어 감미가 높으며, 비타민 함량도 B2가 0.017%, 나이신 함량은 0.8%이고, 무기물 함량은 칼륨이 3.2%로 가장 많은 함량을 보이고 있다.
본 발명자는 산마늘 추출물 또는 산마늘 부위별 용매별 분획이 혈소판 응집 억제 활성과 혈관 근육 세포 비정상적 증식을 억제하는 활성을 모두 나타내었음을 확인하고, 이에 급성 관상 동맥 증후군과 심근 경색과 같은 혈전성 질환 또는 아테롬성 동맥 경화증 또는 혈관 형성술 이후 재협착과 같은 질환을 예방 또는 치료하는 약학적 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 혈소판 응집을 억제하는 활성을 갖는 식물 추출물 및 이를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 혈관 근육 세포의 증식을 억제하는 활성을 갖는 식물 추출물 및 이를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 혈소판 응집을 억제하는 활성과 혈관 근육 세포의 증식을 억제하는 활성을 모두 갖는 식물 추출물 및 이를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 상기 활성을 갖는 기능성 식품을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 산마늘 추출물을 유효성분으로 하는 혈소판 응집을 억제하는 활성 또는 혈관 근육 세포의 증식을 억제하는 활성을 갖는 약학적 조성물 또는 기능성 식품을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 산마늘 추출물은 산마늘의 뿌리와 함께 지상부 전체를 포함하는 전초로부터 제조될 수 있고, 산마늘의 부위별로 잎, 줄기 또는 뿌리에서 제조될 수 있다. 바람직하게는, 산마늘의 잎, 줄기 또는 뿌리 부위로부터 제조될 수 있다.
본 발명의 산마늘 추출물은 산마늘 각 부위를 열수 추출 또는 유기 용매에 의한 추출에 의해 제조될 수 있다. 바람직하게는, 산마늘 각 부위를 에탄올로 먼저 1회 추출한 다음, 에틸 아세테이트, 클로로포름, n-부탄올, 및 물로 이루어진 군으로부터 선택되는 용매를 사용하여 추출한다. 더 바람직하게는, 산마늘 각 부위를 에틸 아세테이트, 클로로포름, 및 부탄올로 이루어진 군으로부터 선택되는 용매를 사용하여 추출한다. 추출시 사용되는 용매의 양은 추출 시간 및 추출 온도에 따라 적절하게 변화시킬 수 있다. 바람직하게는 추출시 사용되는 용매를 시료 부피의 5-10배 용량을 첨가하여 추출할 수 있다.
일 실시 형태에서, 상기 산마늘 추출물은 산마늘 잎, 줄기 또는 뿌리 부위의 분말 시료에 2-5 배 용량의 용매를 첨가하고 24-96 시간 동안 15-25℃에서 침적한 후 얻어진다.
본 발명의 산마늘 추출물은 바람직하게는 산마늘 잎의 에틸 아세테이트 분획(fraction), 줄기의 클로로포름 분획, 줄기의 에틸 아세테이트 분획, 잎의 클로로포름 분획, 줄기의 클로로포름 분획, 뿌리의 클로로포름 분획 또는 뿌리의 부탄올 분획이다.
본 발명의 산마늘 추출물은 동물에게 투여시 혈소판 응집 억제 활성을 나타내었다. 항혈소판제(혈소판 응집 억제 활성)는 급성 관상 동맥 증후군(acute coronary syndrome)과 심근 경색(myocardial infarction)과 같은 혈전성 질환에 효과가 있는 것으로 보고되었다(Tisdale JE. Antiplatelet therapy in coronary artery disease: review and update of efficacy studies. Am J Health Syt Pharm 55:S8-16, 1998).
본 발명의 산마늘 추출물은 동물에게 투여시 혈관 근육 세포(vascular smooth muscle cell) 증식 억제 활성을 나타내었다. 동맥 벽에서 혈관 근육 세포의 비정상적 증식을 억제하는 물질은 아테롬성 동맥 경화증(atherosclerosis) 및 혈관 형성술 이후 재협착(restenosis after angioplasty)과 같은 질환에서 효과적인 것으로 입증되었다(Ross R. Growth regulatory mechansim and formation of the lesions of atherosclerosis. Ann N Y Acad Sci 748:1-4; discussion-6(1995).
따라서, 본 발명의 산마늘 추출물은 급성 관상 동맥 증후군과 심근 경색과 같은 혈전성 질환을 예방 또는 치료하는 약학적 조성물의 유효 성분으로 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 산마늘 추출물은 아테롬성 동맥 경화증 또는 혈관 형성술 이후 재협착과 같은 질환을 예방 또는 치료하는 약학적 조성물의 유효 성분으로 사용될 수 있다.
특히, 본 발명의 산마늘 추출물은 혈소판 응집 억제 활성과 혈관 근육 세포 비정상적 증식을 억제하는 활성을 모두 나타내었다. 따라서, 본 발명의 산마늘 추출물은 혈소판 응집과 혈관 근육 세포 비정상적 증식의 위험을 모두 갖고 있는 아테롬성 동맥 경화증을 예방 또는 치료하기 위한 약학적 조성물의 유효 성분으로 사용될 수 있다.
상기와 같은 산마늘 추출물의 혈소판 응집 억제 활성과 혈관 근육 세포 증식 억제 활성은 본 발명의 동물 실험을 통해 모두 확인되었다. 본 발명의 실시예에서는 산마늘 잎과 줄기의 에틸 아세테이트 분획과 줄기의 클로로포름 분획은 인 비트로에서 혈소판 응집 유도 물질인 콜라겐, 아라키돈산, U46619 또는 트롬빈으로 유 도된 혈소판 응집을 농도 의존적으로 억제하였음을 확인하였다. 그 중에서도 산마늘 줄기의 에틸 아세테이트 분획이 혈소판 응집을 가장 강력하게 억제하였다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서는 산마늘 잎, 줄기 또는 뿌리의 클로로포름 분획, 뿌리의 부탄올 분획이 혈관 근육 세포 증식을 유의성 있게 억제하였음을 확인하였다. 그 중에서도 산마늘 잎의 클로로포름 분획이 혈관 근육 세포 증식을 가장 강력하게 억제하였음을 확인하였다.
산마늘의 잎, 줄기 또는 뿌리 부위에 따라서, 그리고 추출 용매에 따라서 혈소판 응집을 억제하는 활성과 혈관 근육 세포 증식을 억제하는 활성은 서로 다르게 나타났다. 따라서, 추출하고자 하는 산마늘의 부위와 추출 용매의 선택은 중요하다.
본 발명의 약학적 조성물은 산마늘 전초 추출물 또는 산마늘 부위별 용매별 분획을 유효성분으로 함유한다. 그 중에서도 산마늘 잎과 줄기의 에틸 아세테이트 분획, 잎, 줄기 또는 뿌리의 클로로포름 분획, 또는 뿌리의 클로로포름 분획과 부탄올 분획을 함유한다. 보다 더 바람직하게는 산마늘 줄기의 에틸 아세테이트 분획 또는 잎의 클로로포름 분획을 유효성분으로 함유한다.
본 발명의 약학적 조성물은 산마늘 추출물 또는 산마늘 부위별 용매별 분획 이외에도, 비독성, 불활성인 제약상 적합한 부형제를 포함할 수 있다. 상기 약학적 조성물은 임상 투여시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 또한, 상기 약학적 조성물은 실제 임상 투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 본원 발명의 산마늘 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순히 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드, 파라핀 이외에 여러가지 부형제, 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결 건조제, 좌제 등이 포함된다. 비수성 용제, 현탁용제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸 올레이트와 같은 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명 약학적 조성물에서 유효성분인 산마늘 추출물 또는 부위별 용매별 분획은 전체 약학적 조성물의 약 0.1-99.5 중량%, 바람직하게는 0.5-95 중량%의 양으로 함유된다.
개별 투약 형태는 본 발명에 의한 산마늘 추출물을 약 1 내지 약 80 mg/kg, 바람직하게는 3 내지 30 mg/kg의 투여량으로 투여하는 것이 적합하다. 그러나, 상기 투약량은 변화시킬 필요가 있으며, 특히 치료할 객체의 체질 특이성 및 체중, 질병의 종류 및 심도, 제형의 성질, 의약품 투여의 성질, 및 투여 기간 또는 간격 을 고려해서 변화시킬 수 있다.
본 발명의 실시예에서는 산마늘 부위별 용매별 분획이 랫트에서 5g/kg까지 독성을 나타내지 않았고, 경구 투여 최소 치사량(LD50)은 5g/kg 이상인 안전한 물질임을 확인하였다.
본 발명은 산마늘 추출물을 포함하여 혈소판 응집과 혈관 근육 세포 증식 억제 활성을 갖는 기능성 식품을 제공한다. 상기 기능성 식품은 급성 관상 동맥 증후군과 심근 경색과 같은 혈전성 질환 또는 아테롬성 동맥 경화증 또는 혈관 형성술 이후 재협착과 같은 질환을 예방하는데 사용될 수 있다. 산마늘 추출물을 첨가시킬 수 있는 기능성 식품으로는 예를 들면, 비타민 복합체, 건강보조 식품 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 기능성 식품 분야에서 통상적으로 이용되는 방법에 따라 제조될 수 있다.
본 발명의 산마늘 추출물 또는 산마늘 부위별 용매별 분획은 혈소판 응집 억제 활성과 혈관 근육 세포 비정상적 증식을 억제하는 활성을 모두 나타내어, 급성 관상 동맥 증후군과 심근 경색과 같은 혈전성 질환 또는 아테롬성 동맥 경화증 또는 혈관 형성술 이후 재협착과 같은 질환을 예방 또는 치료하는 약학적 조성물 또는 기능성 식품의 유효 성분으로 사용될 수 있다. 또한, 천연물로서 독성이 없고 쉽게 얻을 수 있으므로 경제적이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명이 하기 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
참고예: 콜라겐, 아라키돈산과 트롬빈은 Chrono-Log Co.,(Havertown, PA, USA)로부터 구입하였다. U46619와 BSA(bovine serum albumin)은 Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. CCK-8(2-(2-메톡시-4-니트로페닐)-3-(4-니트로페닐)-5-(2,4-디술포페닐)-2H-테트라졸리윰 모노소듐염)은 Dojindo, Kumamoto 일본으로부터 구입하였다.
<
실시예
1: 산마늘 추출물의 제조>
본 발명에서는 산마늘의 잎, 줄기 및 뿌리 부분을 추출물을 제조하기 위해 사용하였다. 대한민국 강원도 서림 농장에서 산마늘 전초를 채집하고, 잎, 줄기 및 뿌리 부분으로 나누었다. 각각의 부분을 동결 건조시키고 마쇄하였다. 얻은 건조된 분말은 -60℃에서 냉동 보관하며 사용하였다. 얻은 건조된 산마늘 잎, 줄기 및 뿌리 부분의 분말 시료에 시료 부피의 5 배 용량의 에탄올을 첨가하고 24 시간 동안 실온에서 침적한 후 추출하였다. 얻은 추출액은 회전 증발 건조기 (rotatory evaporator)에서 감압 하에 용매를 증발시켜 용매 에탄올을 제거하였다. 그런 다음 얻은 농축물 시료에 시료 부피의 5 배 용량의 용매 클로로포름, 에틸 아세테이트, n-부탄올, 또는 물을 각각 첨가하였고 24 시간 동안 실온에서 침적한 후 여과하고 용매를 증발시켜, 산마늘 잎, 줄기, 뿌리 부분의 클로로포름, 에틸 아세테이트, n-부탄올, 또는 물 분획을 얻었다.
<실시예 2: 산마늘 추출물이 토끼의 수세 혈소판 응집에 미치는 영향>
2-1: 실험 동물 준비와
수세된
토끼 혈소판 준비
2.5 kg의 웅성 토끼(New Zealand white rabbit: Sam-Tako Animal Co., 대한민국, 오산)를 온도 24℃, 상대 습도 55%, 물과 사료(Samyang Co., 대한민국 원주)를 자유롭게 섭취할 수 있도록 충분히 공급하며 사육하였다. 토끼의 귀 동맥으로부터 혈액을 채취하였고, 혈액 시료에 대해 0.15 부피비(v/v)의 항응고성 시트레이트 덱스트로스(anticoagulant citrate dextrose, ACD)(시트르산 0.8%, 트리소듐 시트레이트 2.2%, 덱스트로스 2%(w/v)를 포함)에 넣었다. 수세 토끼 혈소판은 Jin YR, Cho MR, Ryu CK, et al., J. Pharmacol Exp Ther 312:214-9(2005)에 따라 제조하였다. 구체적으로, 토끼 혈액을 230 x g에서 10분 동안 원심분리하여, 혈소판이 풍부한 혈장(platelet rich plasma, PRP)을 얻었고, 800 x g에서 15분 동안 PRP를 다시 원심분리하여 혈소판을 침전시켰고, 0.35% BSA와 0.4 mM EGTA(에틸렌 글리콜 비스 (β-아미노에틸 에테르)N, N, N', N', (N')-테트라아세트산)을 포함하는 Hepes 완충 용액(137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 5.6 mM 글루코스, 및 3.8 mM Hepes, pH 6.5)으로 수세하였다. 수세된 토끼 혈소판을 상기 Hepes 완충 용액(pH 7.4)에 다시 현탁시켰고, 4 x 108세포/ml로 조정하여 실험에 사용하였다.
2-2: 산마늘 추출물의 혈소판 응집 억제 분석
혈소판 응집 실험은 Born의 비탁 방법(turbidimetry method)(Born GV, Cross MJ. The aggregation of blood platelets, J. Physiol 168:178-95, 1963)에 따라 혈소판 응집능 측정계(aggregometer)(Chrono-Log Co., Havertown, PA, USA)를 사용하여 실시하였다. 구체적으로, 상기에서 제조한 수세된 혈소판 현탁액 (Platelet rich plasma)을 응집능 측정계에서 1,000 rpm에서 교반하면서 37℃에서 배양하였다. 상기 실시예 1에서 제조한 산마늘 잎, 줄기 및 뿌리 부분의 용매별 분획을 다양한 농도(12.5 - 400 μM)로 상기 혈소판 배양액에 첨가하였다. 대조군으로 추출물과 동일한 부피로 증류수를 첨가하였다. 상기 기술한 배양과 동일한 조건에서 혈소판을 3분 동안 배양하였다. 혈소판 응집 유도 물질로 콜라겐(10 ㎍/㎖), 아라키돈산(100 μM), U46619(1 μM), 또는 트롬빈(0.05 U/㎖)을 각각 첨가하여 혈소판 응집을 유도하였다. 혈소판이 응집되는 정도를 상기 비탁 방법에 따라 혈소판 응집능 측정계(aggregometer)(Chrono-Log Co., Havertown, PA, USA)를 사용하여 측정하였다. 산마늘 부위별 용매별 분획에 의해 혈소판 응집이 억제되는 정도를 대조군에 대한 비율로 나타내었다. 산마늘 잎, 줄기 또는 뿌리의 에틸 아세테이트 분획, 클로로포름 분획은 대조군에 비해 유효한 정도로 혈소판 응집을 억제하였다. 그러나, 물 또는 부탄올 분획은 모든 처리 농도에 대해 혈소판 응집을 억제하지 못하였다. 특히, 산마늘 잎의 에틸 아세테이트 분획, 줄기의 클로로포름 분획과 에틸 아세테이트 분획이 혈소판 응집을 억제하는 정도를 도 1에 나타내었다.
도 1에서 나타난 바와 같이, 산마늘 잎과 줄기의 에틸 아세테이트 분획과 줄기의 클로로포름 분획은 인 비트로에서 혈소판 응집 유도 물질인 콜라겐, 아라키돈산, U46619 또는 트롬빈으로 유도된 혈소판 응집을 농도 의존적으로 억제하였다. 산마늘 잎의 에틸 아세테이트 분획, 줄기의 에틸 아세테이트 분획 및 줄기의 클로 로포름 분획의 혈소판 응집에 대한 IC50 값을 하기 표 1에 나타내었다.
<표 1>
| 잎의 에틸 아세테이트 분획 | 줄기의 클로로포름 분획 | 줄기의 에틸 아세테이트 분획 | |
| 콜라겐 | 214.1±12.2 | 134.3±2.5 | 42.6±7.0 |
| 아라키돈산 | 312.4±7.5 | 158.9±1.7 | 82.2±2.7 |
| U46619 | 31.1±2.4 | 48.7±0.3 | 29.7±1.1 |
| 트롬빈 | 36.7±2.4 | 69.1±11.3 | 34.2±0.1 |
산마늘 줄기의 에틸 아세테이트 분획이 혈소판 응집을 가장 강력하게 억제하였다. 산마늘 잎의 에틸 아세테이트 분획은 사용된 혈소판 응집 유도 물질에 대해 혈소판 응집 억제 정도가 달리 나타났다. U46619와 트롬빈에 의해 유도된 혈소판 응집에서는 가장 강력한 혈소판 응집 효과를 나타내었고, 콜라겐과 아라키돈산에 의해 유도된 혈소판 응집에서는 그 효과가 약했다. U46619와 트롬빈은 서로 다른 수용체를 통해 혈소판을 활성화시키지만, 그 수용체들은 모두 G 단백질 계열(G protein super family)에 속한다. 따라서, 산마늘 잎의 에틸 아세테이트 분획은 혈소판 G 단백질-관련된 수용체에 관련된 신호 전달의 억제에 특히 효과가 있는 것으로 판단된다. 도 1의 B와 C에서 나타난 바와 같이, 산마늘 줄기의 클로로포름 분획과 에틸 아세테이트 분획은 혈소판 응집 유도 물질에 대해 동일한 억제 패턴을 나타내었고, 에틸 아세테이트 분획이 클로로포름 분획보다는 혈소판 응집을 보다 강력하게 억제하였다.
<실시예 3: 산마늘 추출물이 혈관 근육 세포 증식에 미치는 영향>
산마늘 추출물이 혈관 근육 세포 증식 억제는 CCK-8-분석 키트를 사용하여 평가하였다. 구체적으로, 혈관 근육 세포(Sam-Tako Animal Co., Osan, Korea) 를 96-웰 플레이트에 50,000-100,000 세포/ml의 농도로 시딩(seeding)하였고, 10% FBS(fetal bovine serum)를 포함하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지에서 48시간 동안 길렀다. 그런 다음, 상기 실시예 1에서 제조한 산마늘 잎, 줄기 또는 뿌리의 용매별 분획을 다양한 농도로 포함하고 있는 무혈청 배지에서 24시간 동안 다시 배양하였다. 그런 다음 5% FBS로 24시간 동안 세포를 다시 자극하였다. 22시간 될 때, CCK-8 시약 10 ㎕를 첨가하였고, 37℃에서 추가로 2시간 더 배양하였다. ELISA reader(Molecular probe, USA)를 사용하여 450nm에서 광학 밀도를 측정하여 생존하고 있는 혈관 근육 세포의 정도를 확인하였다. 비교를 위하여, 산마늘 용매별 분획을 첨가하지 않고 동일한 방법으로 혈관 근육 세포를 길러 생존하고 있는 혈관 근육 세포의 정도를 확인하였다(대조군). 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에서 나타난 바와 같이, 산마늘 잎, 줄기 또는 뿌리의 클로로포름 분획, 뿌리의 부탄올 분획은 5% FBS로 유도된 혈관 근육 세포의 증식을 유의성 있게 억제하였다. 그러나, 줄기의 에틸 아세테이트 분획은 혈관 근육 세포의 증식을 억제하는 정도가 약했다. 그리고, 물 분획은 모든 처리 농도에서 혈관 근육 세포의 증식을 억제하지 못하였다. 잎, 줄기 또는 뿌리의 클로로포름 분획, 뿌리의 부탄올 분획, 줄기의 에틸 아세테이트 분획이 5% FBS로 유도된 혈관 근육 세포의 증식을 억제함에 있어 IC50값을 하기 표 2에 나타내었다. 잎의 클로로포름 분획이 혈관 근육 세포의 증식을 가장 강력하게 억제하였음을 알 수 있다.
<표 2>
| 산마늘 부위별 용매별 분획 | IC50 값(㎍/ml) |
| 잎의 클로로포름 분획 | 1.2±0.4 |
| 줄기의 클로로포름 분획 | 17.1±6.4 |
| 줄기의 에틸 아세테이트 분획 | 237.0±85.6 |
| 뿌리의 클로로포름 분획 | 81.8±33.2 |
| 뿌리의 부탄올 분획 | 40.8±8.0 |
<실시예 4: 산마늘 추출물이 랫트에 대한 경구 독성에 미치는 영향>
6주령의 특정병원부재(SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성 독성 실험을 실시하였다. 군당 암수 3마리씩의 동물에 산마늘 부위별 용매별 분획을 생리 식염수에 용해시켜 부피를 맞춘 다음 5g/kg/10ml의 용량으로 단회 경구 투여하였다. 시험물질 투여 후 동물의 폐사 여부, 임상증상, 체중 변화를 관찰하고, 혈액학적 검사와 혈액 생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강 장기와 흉각 장기의 이상 여부를 관찰하였다. 실험 결과, 실험 물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상 증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중 변화, 혈액 검사, 혈액 생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성 변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과 산마늘 부위별 용매별 분획은 랫트에서 5g/kg까지 독성을 나타내지 않았고, 경구 투여 최소 치사량(LD50)은 5g/kg 이상인 안전한 물질로 판명되었다.
도 1은 산마늘 추출물의 용매 분획을 가한 후 혈소판 응집 유도 물질(콜라겐, 아라키돈산, U46619, 또는 트롬빈)을 가하였을 때, 혈소판이 응집되는 비율을 대조군에 대한 비율로 나타낸 것이다.
(A): 산마늘 잎의 에틸 아세테이트 분획
(B): 산마늘 줄기의 클로로포름 분획
(C): 산마늘 줄기의 에틸 아세테이트 분획
도 2는 산마늘의 부위별 용매별 분획을 가한 후 5% FBS로 유도된 혈관 근육 세포 증식이 억제되는 정도를 대조군에 대한 비율로 나타낸 것이다.
Claims (6)
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- 산마늘(Allium Victorialis Var. Platyphyllum) 추출물을 유효성분으로 하되,상기 산마늘 추출물은 줄기의 에틸 아세테이트 분획 또는 잎의 클로로포름 분획인 것을 특징으로 하는, 혈소판 응집과 혈관 근육 세포(vascular smooth muscle cell)의 증식을 억제하는 아테롬성 동맥경화증(atherosclerosis) 예방 또는 치료용 조성물.
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- 산마늘(Allium Victorialis Var. Platyphyllum) 추출물을 유효성분으로 하되,상기 산마늘 추출물은 줄기의 에틸 아세테이트 분획 또는 잎의 클로로포름 분획인 것을 특징으로 하는, 혈소판 응집과 혈관 근육 세포 증식을 억제하는 활성을 갖는 아테롬성 동맥경화증 개선용 기능성 식품.
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