KR20190047865A - 꾸지뽕 열매 추출물 유래의 혈행개선 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 꾸지뽕 열매 추출물 유래의 혈행개선 조성물에 관한 것으로서 좀 더 구체적으로는 꾸지뽕 열매 추출물에서 유래한 클로로제닉산, 시린지산, 페룰릭산을 유효 성분으로 포함하는 혈행개선용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 꾸지뽕 유래의 유효 성분들은 혈행개선 작용, 항혈전 작용, 혈중 중성지방 개선 작용, 항고지혈증 작용과 항고혈압 작용을 나타내는 것이 확인되어 이를 요하는 건강 기능성 식품 또는 의약으로 유용하게 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 꾸지뽕 열매 추출물 유래의 혈행개선 조성물에 관한 것으로서 좀 더 구체적으로는 꾸지뽕 열매 추출물에서 유래한 클로로제닉산, 시린지산, 페룰릭산을 유효 성분으로 포함하는 혈행개선용 조성물에 관한 것이다.
꾸지뽕(Cudrania tricuspidata)은 속명으로서 구지뽕 나무, 굿가시 나무, 활뽕 나무라 불리우며 뽕과 나무에 속하는 낙엽 교목으로서, 우리나라 중부 이남(경상남북도, 충청도, 전라남북도)의 들이나 산지에 자생하고 뿌리는 황색이고 가지는 가시가 많으며 어린가지에는 털이 있다.
꾸지뽕 나무의 뿌리껍질, 나무질부, 나무껍질 및 잎에는 인체에 유효한 다양한 성분이 포함되어 있어서, 전래로부터 꾸지뽕 나무는 그 뿌리, 껍질, 줄기, 잎, 나무껍질, 열매 등 부위에 따라 혈압강하제, 결핵치료제, 해열제, 건해제, 거담제, 이뇨제, 지혈제, 거풍제 등의 약재로 이용되었으며, 항진균제로서 무좀에 사용되고 소화기관의 허약에 의한 만성소화불량에 이용되고 있다.
또한, 꾸지뽕 나무의 열매는 취과로 둥글며 지름이 2.5 cm 내외이고, 9월~10월에 적색으로 성숙하며, 과육은 달고 식용이 가능하다. 상기 열매에는 비타민B, 비타민B1, 비타민B2, 비타민C, 리놀레인산, 포도당, 말토스, 후럭토스, 사과산, 레몬산, 등 유용한 유기물질이 포함되어 있는 것으로 알려져 있다.
또한, 꾸지뽕 나무는 항암효과가 있는 것으로 알려진 플라보노이드를 함유하고 있어 약재로 사용되고 있음이 동의보감, 약성감, 본초강목 등에서 고대로부터 널리 알려져 있으며, 최근에도 지속적인 연구가 이루어지고 있다.
이러한 생리활성기능이 탁월한 꾸지뽕을 이용하여 차로 제조할 수 있는데, 기존에 알려진 꾸지뽕 차의 제조방법으로는 국내공개특허 제10-2010-0076159호가 유일하게 개시되어 있지만, 살청, 유념 및 8차에 걸친 덖음과정을 거친 후, 증숙하여 이후 5~6개월간 발효숙성시키는 과정을 포함하므로 그 제조공정이 무척 복잡하고 장기간이 요구되는 문제가 있다. 더욱이 이러한 방법에 의해 제조된 꾸지뽕차의 경우 발효숙성 기간 및 조건에 따라 관능적 품질이 균일하지 않으며, 다양한 소비자층의 기호에도 탄력적으로 부응할 수 없는 한계가 있어 왔다.
따라서, 꾸지뽕의 유익한 성분들이 최적으로 추출되어 함유된 기능성 제품의 개발이 필요한 상태이다.
본 발명자들은 꾸지뽕의 유익한 성분들을 최적으로 추출하여 이를 유익한 기능성 물질을 탐색하고자 예의 연구한 결과, 후술하는 바와 같이 꾸지뽕을 추출하고 추출된 유효 성분들이 혈행개선 및 항혈전 등의 기능을 가짐을 예기치 않게 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
따라서, 본 발명의 목적은, 일면에 있어서, 꾸지뽕 열매 추출물 유래의 클로로제닉산, 시린지산 또는 페룰릭산 또는 이들의 혼합물을 유효 성분으로서 포함하는 것을 특징으로 하는 혈행개선용 조성물를 제공하는데에 있다.
본 발명에 따른 꾸지뽕 유래의 유효 성분들은 혈행개선 작용, 항혈전 작용, 혈중 중성지방 개선 작용, 항고지혈증 작용과 항고혈압 작용을 나타내는 것이 확인되어 이를 요하는 건강 기능성 식품 또는 의약으로 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 꾸지뽕 추출물 중의 페놀계 산 및 플라보노이드의 HPLC 크로마토그램이다.
도 2는 클로로제닉산의 In vitro 항혈전 효과 및 피브린클롯 에세이의 결과를 나타내는 도면이다.
도 3은 In vitro turbidity assay 결과를 나타내는 도면이다.
도 4는 In vitro blood clot assay를 나타낸 결과도이다.
도 5는 Thrombin, FXa, 및 FXIIIa assay 결과이다.
도 6은 피브린 클롯 형성에 관한 시린지산의 효과를 나타내는 도면이다.
도 7은 피브린 클롯 형성에 관한 시린지산의 효과를 나타내는 도면이다.
도 8은 시린지산의 피브린 폴리머 형성 및 혈액응괴의 억제를 나타내는 도면이다.
도 9는 In vitro 혈액 클롯 에세이 결과를 나타내는 도면이다.
도 10은 트롬빈 및 FXa 에세이 결과를 나타낸다.
도 11 및 12는 시린지산의 과립 분비 억제에 관한 영향을 나타내는 도면이다.
도 13은 시린지산의 클롯 응축에 미치는 영향을 나타내는 도면이다.
도 14는 시린지산의 in vitro PAR1/DEP-1/PTP1B 시그널링 패스웨이를 억제를 나타내는 결과도이다.
도 15는 시린지산의 in vitro αIIbβ3/FIB 시그널링 패스웨이를 억제를 나타내는 결과도이다.
도 16 및 17은 시린지산의 in vitro 키나아제 시그널링 패스웨이를 억제를 나타내는 결과도이다.
도 18은 트롬빈 억제제 존재하에서 시린지산의 in vitro PAR1/DEP-1/PTP1B 시그널링 패스웨이를 억제를 나타내는 결과도이다.
도 19는 트롬빈 억제제 존재하에서 시린지산의 in vitro αIIbβ3/FIB 시그널링 패스웨이를 억제를 나타내는 결과도이다.
도 20 및 21은 트롬빈 억제제 존재하에서 시린지산의 in vitro 키나아제 시그널링 패스웨이를 억제를 나타내는 결과도이다.
도 22는 시린지산의 in vitro DEP-1/PTP1B 시그널링 패스웨이를 억제를 나타내는 결과도이다.
도 23은 시린지산의 in vitro αIIbβ3/FIB 시그널링 패스웨이를 억제를 나타내는 결과도이다.
도 24 및 25는 시린지산의 in vitro 키나아제 시그널링 패스웨이를 억제를 나타내는 결과도이다.
도 26은 시린지산의 in vivo DEP-1/PTP1B 시그널링 패스웨이를 타겟팅함으로써 혈소판 활성화의 감쇠를 나타내는 결과도이다.
도 27은 시린지산의 in vivo αIIbβ3/FIB 시그널링 패스웨이를 타겟팅함으로써 혈소판 활성화의 감쇠를 나타내는 결과도이다.
도 28 및 29는 시린지산의 in vivo 키나아제 시그널링 패스웨이를 타겟팅함으로써 혈소판 활성화의 감쇠를 나타내는 결과도이다.
도 30은 시리지산 매개 클롯팅 및 혈전 형성을 나타내는 결과도이다.
도 31은 쥐에서 동맥 혈전의 전개 억제에 관한 시린지산의 영향을 나타내는 결과도이다.
도 32는 페룰릭산의 헤모사이토메터 계수에 의한 혈소판의 영향을 나타내는 도면이다.
도 33은 클롯 응축에 관한 페룰릭산의 영향을 나타내는 도면이다.
도 34는 과립 분비에 관한 페룰릭산의 영향을 나타내는 도면이다.
도 35는 과립 분비에 미치는 페룰릭산의 영향을 나타내는 결과도이다.
도 36은 칼슘 재첨가 시간에 미치는 페룰릭산의 영향을 나타내는 결과도이다.
도 37 및 38은 트롬빈 유발 급성 색전에서 신호화 인자에 미치는 페룰릭산의 영향을 나타내는 도면이다.
도 2는 클로로제닉산의 In vitro 항혈전 효과 및 피브린클롯 에세이의 결과를 나타내는 도면이다.
도 3은 In vitro turbidity assay 결과를 나타내는 도면이다.
도 4는 In vitro blood clot assay를 나타낸 결과도이다.
도 5는 Thrombin, FXa, 및 FXIIIa assay 결과이다.
도 6은 피브린 클롯 형성에 관한 시린지산의 효과를 나타내는 도면이다.
도 7은 피브린 클롯 형성에 관한 시린지산의 효과를 나타내는 도면이다.
도 8은 시린지산의 피브린 폴리머 형성 및 혈액응괴의 억제를 나타내는 도면이다.
도 9는 In vitro 혈액 클롯 에세이 결과를 나타내는 도면이다.
도 10은 트롬빈 및 FXa 에세이 결과를 나타낸다.
도 11 및 12는 시린지산의 과립 분비 억제에 관한 영향을 나타내는 도면이다.
도 13은 시린지산의 클롯 응축에 미치는 영향을 나타내는 도면이다.
도 14는 시린지산의 in vitro PAR1/DEP-1/PTP1B 시그널링 패스웨이를 억제를 나타내는 결과도이다.
도 15는 시린지산의 in vitro αIIbβ3/FIB 시그널링 패스웨이를 억제를 나타내는 결과도이다.
도 16 및 17은 시린지산의 in vitro 키나아제 시그널링 패스웨이를 억제를 나타내는 결과도이다.
도 18은 트롬빈 억제제 존재하에서 시린지산의 in vitro PAR1/DEP-1/PTP1B 시그널링 패스웨이를 억제를 나타내는 결과도이다.
도 19는 트롬빈 억제제 존재하에서 시린지산의 in vitro αIIbβ3/FIB 시그널링 패스웨이를 억제를 나타내는 결과도이다.
도 20 및 21은 트롬빈 억제제 존재하에서 시린지산의 in vitro 키나아제 시그널링 패스웨이를 억제를 나타내는 결과도이다.
도 22는 시린지산의 in vitro DEP-1/PTP1B 시그널링 패스웨이를 억제를 나타내는 결과도이다.
도 23은 시린지산의 in vitro αIIbβ3/FIB 시그널링 패스웨이를 억제를 나타내는 결과도이다.
도 24 및 25는 시린지산의 in vitro 키나아제 시그널링 패스웨이를 억제를 나타내는 결과도이다.
도 26은 시린지산의 in vivo DEP-1/PTP1B 시그널링 패스웨이를 타겟팅함으로써 혈소판 활성화의 감쇠를 나타내는 결과도이다.
도 27은 시린지산의 in vivo αIIbβ3/FIB 시그널링 패스웨이를 타겟팅함으로써 혈소판 활성화의 감쇠를 나타내는 결과도이다.
도 28 및 29는 시린지산의 in vivo 키나아제 시그널링 패스웨이를 타겟팅함으로써 혈소판 활성화의 감쇠를 나타내는 결과도이다.
도 30은 시리지산 매개 클롯팅 및 혈전 형성을 나타내는 결과도이다.
도 31은 쥐에서 동맥 혈전의 전개 억제에 관한 시린지산의 영향을 나타내는 결과도이다.
도 32는 페룰릭산의 헤모사이토메터 계수에 의한 혈소판의 영향을 나타내는 도면이다.
도 33은 클롯 응축에 관한 페룰릭산의 영향을 나타내는 도면이다.
도 34는 과립 분비에 관한 페룰릭산의 영향을 나타내는 도면이다.
도 35는 과립 분비에 미치는 페룰릭산의 영향을 나타내는 결과도이다.
도 36은 칼슘 재첨가 시간에 미치는 페룰릭산의 영향을 나타내는 결과도이다.
도 37 및 38은 트롬빈 유발 급성 색전에서 신호화 인자에 미치는 페룰릭산의 영향을 나타내는 도면이다.
본 발명은, 일면에 있어서, 꾸지뽕 열매 추출물 유래의 클로로제닉산, 시린지산 또는 페룰릭산 또는 이들의 혼합물을 유효 성분으로서 포함하는 것을 특징으로 하는 혈행개선용 조성물를 제공한다.
이하, 본 발명에 따른 꾸지뽕 열매 추출물을 포함하는 기능성 식품의 제조 방법을 첨부된 도면을 참고하여 더욱 상세하게 설명한다.
본 발명에 따른 혈행개선용 조성물에서 유효 성분인 꾸지뽕 열매 추출물 유래의 클로로제닉산, 시린지산 또는 페룰릭산은 후술하는 실시예 및 실험예의 결과로 부터 각각 단독으로도 뛰어난 혈행 개선능을 가지나 이들의 혼합물 역시 혈행 개선능을 조성물로서 유용하게 이용될 수 있음은 물론이다.
본 발명에 따른 꾸지뽕 추출물 유래의 유효 성분을 주성분으로 포함하는 기능성 식품 조성물은 화학 합성제가 아닌 천연물의 추출물을 포함하고 있으므로 후술하는 실시예 및 시험예의 결과로부터 잘 알 수 있는 바와 같이 자극성이나 독성이 없어서 안정성이 우수하며, 항산화 효능, 혈행개선 작용, 항혈전 작용, 혈중 중성지방 개선 작용, 항고지혈증 작용과 항고혈압 작용 등의 탁월한 기능성이 있으므로 이러한 기능성을 요하는 식품의 성분으로 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 조성물을 의약 또는 건강 기능성 식품으로 이용될 수 있다.
상기 건강기능성 식품은 일반 건강식품 또는 다이어트나 피로회복, 숙취해소용 등의 다목적 기능을 갖는 기능성 건강 식품으로도 이용될 수 있다.
본 발명에 따른 기능성 식품 조성물은 당해 분야에서의 통상적인 방법에 따라, 예를 들면 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 액상 또는 음료 형태를 포함하는 제형으로 제공할 수 있다.
본 발명의 식품 또는 의약의 조성물의 섭취량은 그 제제 형태, 투여 방법, 사용 목적 및 이것에 적용되는 개체의 연령, 체중, 증상에 따라서 적절히 설정되고, 일정하지 않지만 일반적으로는 제제 중에 함유되는 유효성분의 양은 성인 1일당, 예컨대 25 mg∼5,000 ㎎/㎏이다. 물론 복용량은, 각종 조건에 의해서 변동하기 때문에, 상기 섭취량보다 적은 양으로 충분한 경우도 있고, 또는 범위를 초과하여 필요한 경우도 있다.
또한, 본 발명의 조성물이 기능성 식품(건강기능식품 및 일반 식품) 조성물로 제조되는 경우에는 식품에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 감미료, 예를 들면 감초, 비타민 C, 구연산, 니코틴산, 안식향산나트륨, 아스파탐, 사카린, 펙틴, 말리톨, 솔비톨, 자일리톨, 구아검, 탈지분유 및 올리고당으로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 성분을 추가하여 기호도나 미감을 증대시킬 수 있다.
이들은 본 발명의 조성물의 전체 중량을 기준으로 약 0.01~20 중량%로 사용하는 것이 적절하다.
음료수는, 예를 들면, 상기 꾸지뽕 추출물을 0.01~20 중량%으로 넣고, 감초 0.01~2 중량%, 구연산을 0.01~2 중량%, 사과산 0.01~2 중량%, 타우린 0.1∼2 중량%, 비타민 C 0.01~2 중량%, 비타민 B1 0.01~2 중량%, 바이오틴 0.01~2 중량%, 액상과당 0.01~20 중량% 폴리덱스트로스 0.1~3 중량%, 배농축액 0.1~1 중량%, 벌꿀 0.1~0.5중량%, 젖산칼슘 0.01~1 중량%, 향료 0.1~1 중량%, 색소 0.01~0.05 중량%, 구연산나트륨 0.01~0.5중량%, 스테비텐후레쉬 0.01~0.5 중량%, 니코틴산아미드 0.01~0.5 중량%, 로얄제리추출물 0.01~0.5 중량%, L-멘톨 0.0001~0.5 중량%등을 단독 또는 혼합하여 첨가하여 기능성 음료수로 제조할 수 있다.
<실시예>
이하, 본 발명은 다음의 대표적인 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명되나, 본 발명이 이들 실시예에 의해 어떤 식으로든 제한되는 것은 아니다. 각 값은 3회 반복 시험한 것을 평균 ± 표준 편차로 나타내었다.
실시예
1:
꾸지뽕
열매
열수
추출물의 제조
꾸지뽕 열매를 엄선하여 100kg을 세척한 후, 세척된 꾸지뽕 열매를 60℃의 온도로 열풍 건조시겼다. 건조된 꾸지뽕 열매에 중량을 기준으로 20 배수의 정제수를 가하여 0.5 기압 및 70℃의 온도에서 8시간 동안 추출하여 추출물을 얻었다. 꾸지뽕의 수율은 78.5%이고, brix는 3.21%이었다.
이어서, 추출물을 종이 여과지로 여과하여 이물질을 걸러낸 후, 여액을 60℃의 온도에서 -0.08 MPA의 감압하에서 8시간 동안 농축하였다. 고형분의 brix는 45로 측정되었다. 이어서, 농축물을 진공하에서 60℃의 온도에서 24시간 동안 건조시키고, 이를 핀밀로 100 메쉬로 분쇄한 후 일정 단위로 소분하였다.
실시예
2:
꾸지뽕
열매 주정 추출물의 제조
1 ton 추출기를 사용하여 꾸지뽕을 200 Kg을 세척한 후, 세척된 꾸지뽕 열매를 60℃의 온도로 열풍 건조시겼다. 건조된 꾸지뽕 열매에 중량을 기준으로 20 배수의 주정을 가하여 0.5 기압 및 65℃의 온도에서 4시간 동안 추출하여 추출물을 얻었다. 꾸지뽕의 수율은 79.5%이고, brix는 3.1%이었다.
이어서, 추출물을 종이 여과지로 여과하여 이물질을 걸러낸 후, 여액을 60℃의 온도에서 -0.08 MPA의 감압하에서 8시간 동안 농축하였다. 고형분의 brix는 43으로 측정되었다. 이어서, 농축물을 진공하에서 60℃의 온도에서 24시간 동안 건조시키고, 이를 핀밀로 100 메쉬로 분쇄한 후 일정 단위로 소분하였다.
실시예
3: 에탄올을 이용한 유효 성분의 분리
꾸지뽕 중에 함유된 생리활성 성분들을 조사하기 위하여 꾸뽕의 유효성분의 추출을 위한 적정 용매 선정을 위하여 ethanol 농도를 달리한 수용액을 용매로 하여 꾸지뽕 열매를 추출하였을 때 추출물 중에 함유된 phenolic acid 및 flavonoids의 조성 및 함량을 분석한 결과하고 그 결과는 표 1과 같다.
| Water | EtOH concentration (%) | |||||
| 20 | 40 | 60 | 80 | 95 | ||
| Protocatechuic | 50.6 | 52.0 | 128.2 | 56.9 | 69.4 | 38.8 |
| p-Hydroxybenzoic | 511.4 | 461.3 | 804.5 | 892.3 | 1066.8 | 1024.3 |
| Chlorogenic | 57.9 | 117.6 | 256.8 | 307.9 | 354.4 | 315.4 |
| Syringic | 45.3 | 64.6 | 72.2 | 79.0 | 84.5 | 81.1 |
| Isovanillic | 195.7 | 41.4 | 165.8 | 186.5 | 128.9 | 112.9 |
| Rutin | 184.0 | 111.5 | 134.7 | 307.8 | 223.0 | 178.5 |
| Taxifolin | 80.0 | 83.3 | 680.1 | 106.5 | 87.7 | 51.4 |
| Quercetin | 104.9 | 92.7 | 53.2 | 67.4 | 283.6 | 149.5 |
| Keampferol | 35.4 | 43.4 | 25.4 | 42.4 | 53.4 | 51.1 |
| Total | 1265.2 | 1067.8 | 2320.9 | 1946.7 | 2351.7 | 2003.5 |
Phenolic acid류 중에서는 p- hydroxybenzoic acid 및 chlorogenic acid가 많이 검출되었고, flavonoid류 중에서는 rutin이 많이 검출되었다. 추출용매 중 ethanol 농도의 영향을 비교했을 때에는 추출용매중의 ethanol의 비율이 증가할수록 phenolic acid 및 flavonoids의 추출 수율이 증가하는 경향을 보였다. 시린지산은 에탄올 농도 80~99%에서, 클로로제닉산은 에탄올 농도 60~95%에서 최적의 추출 함량을 보였다.
실시예
4: 메탄올을 이용한 유효 성분의 분리
본 실험에서 꾸지뽕나무 열매를 methanol로 추출한 다음 HPLC 분석에 의한 머무름 시간 비교에 의해 11종의 phenolic acid와 flavonoid를 확인하고 그 결과를 도 1 및 표 2에 나타내었다.
도 1은 꾸지뽕 추출물 중의 페놀계 산 및 플라보노이드의 HPLC 크로마토그램이다. A: mixture of authentic standards, B: C. tricuspidata fruits extract. 1. gallic acid, 2. protocatechuic acid, 3. chlorogenic acid, 4. p-hydroxybenzoic acid, 5. caffeic acid, 6. isovanillic acid, 7. rutin, 8. p-coumaric acid, 9. ferulic acid, 10. taxifolin, 11. trans-coumaric acid, 12. rosmarinic acid, 13. quecertin, 14. trans-cinnamic acid, 15. kaempferol.
| Compouds | Content |
| Protocatechuic acid | 101.98 |
| Chlorogenic acid | 708.83 |
| p-Hydroxybenzoic acid | 40.67 |
| Isovanillic acid | 125.13 |
| Rutin | 88.28 |
| Ferulic acid | 75.69 |
| Taxifolin | 24.28 |
| trans-Coumaric acid | 8.25 |
| Quecertin | 7.77 |
| trans-Cinnamic acid | 9.35 |
| Kaempferol | 3.19 |
양적으로는 phenolic acid인 chlorogenic acid와 protocatechuic acid, isovanillic acid 및 ferulic acid가 많이 검출되었고 flavonoid류로서는 rutin이 비교적 많이 검출되었다. Jeong et al. (2009)은 꾸지뽕 나무 잎의 물 추출물을 분석한 결과 phenolic acid 류로서는 gallic acid, flavonoid 류 중에서는 quercetin이 많이 검출되어 검출되었다 보고한 점을 고려하면 꾸지뽕 나무는 부위에 따라 phenolic acid 류와 flavonoid 류의 조성이나 그들의 함량이 다르다는 것을 나타내 주고 있다.
본 발명자들은 상기 실시예 3, 4의 결과로부터 그 기능성이 비교적 알려지지 않은 성분인 클로로제닉산, 시린지산, 페룰릭산에 대하여 그 기능성을 확인하고자 후속 연구를 더 수행하였다.
이하의 시험예에서는 상기 실시예의 꾸지뽕 열매 추출물로부터 분리된 클로로제닉산, 페룰릭산, 또는 시리지산을 포함한 유효성분을 이용하여 thrombin assay, Activated factor X assay, Pulmonary thromboembolism-induced model 제작 및 효과 분석, FeCl3-induced arterial thrombosis model 제작 및 효과 분석 뿐만 아니라 Turbidity assay, Fibrin clot 억제능 분석, In vitro 항혈전능 분석, 칼슘재첨가시간 측정, APTT, PT를 이용한 응고시간 측정, 항혈소판능 분석, Clot retraction assay, ATP release assay, Serotonin secretion assay, Collagen 및 epinephrine으로 유도한 혈소판 활성화 억제능 기전 분석, Thrombin으로 유도한 혈소판 활성화 억제능 기전 분석, Mouse pulmonary thromboembolism-induced model에서 혈소판 활성화 억제능 기전 분석을 추가적으로 수행하여 추출물 및 유효 물질의 항혈전, 항혈소판, 항응고 등을 포함한 혈행 개선에 대한 in vitro 및 in vivo 효과 검증, 관련된 유전자 발현 연구를 수행하였다. 각 시험 방법에 대한 시험 절차는 다음과 같다.
(1) Oil Red O 염색
6-well plate에 분주된 세포를 시료와 함께 처리를 끝 후 PBS로 세척한다. 10% formalin 용액으로 30분간 고정하고 증류수로 1회 세척한다. 0.3% Oil Red O 용액으로 1시간 처리한 후, 60% isopropanol로 1회 세척하여 현미경으로 지방 축적 정도를 현미경을 이용하여 관찰하였다.
(2) 중성지방 및 콜레스테롤 함량 분석
콜레스테롤 함량은 Assay kit에 지시되어 있는 정량법에 따라 수행한다. 세포에 시료를 농도별로 처리한 후 PBS로 세척하고 cell lysate를 만들어 kit 정량법에 따라 처리한 후 ELISA reader를 이용하여 측정하고 그 결과를 control 값에 대한 비율로 계산하였다.
(3) HMG-CoA reductase activity assay
시료의 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA (HMGCoA)reductase activity 억제를 확인하기 위해 assay kit를 사용하고 kit 정량법에 따라 처리한 후 ELISA reader를 이용하여 측정하고 그 결과를 control 값에 대한 비율로 계산하였다.
(4) NBT assay를 이용한 ROS 함량 측정하였다.
세포의 ROS 생성량을 측정하기 위하여 먼저 24-well에 배양 및 분화된 3T3-L1 세포의 배양액을 제거한 후 멸균된 PBS(Phosphate buffer saline, pH 7.4)를 이용하여 2회 세척, 0.2% NBT 용액 0.2 mL를 첨가하여 CO2 incubator안에서 90분간 반응시킨다. 지방세포 내에 축적된 ROS들은 NBT 용액과 반응하여 dark blue formazan을 생성하게 되며, 100% acetic acid를 이용하여 이들 dark blue formazan을 모두 용출 시켜 570 nm에서 흡광도를 측정한다.
(5) Proinflammatory cytokine 측정
세포의 증식과 지방축적이 종료된 후 수거된 배지에서 지방세포의 연증반응에서 기여하는 M2 (anti-inflammation effects)형 마커로 IL-10을, M1(proinflammation effect)형 마커로 IL-6, TNF-a의 분비량 변화여부를 ELISA kit를 이용하여 확인하였다. 세포의 증식과 지방축적이 80%정도 이루어졌을 때 시료를 24시간동안 처리한 후 LPS를 18시간 처리함. 종료된 후 수거된 배지에서 ELISA kit를 이용하여 확인하였다.
(6) 관련된 유전자 발현 연구
처리가 끝난 cell에 lysis buffer를 첨가하여 lysis 시킨 후 BCA kit로 단백질을 정량한다. SDS-PAGE에 loading하여 전기영동 한 후 단백질은 PVDF membrane으로 transfer buffer를 사용하여 transfer시킨다. 5% non-fat skim milk solution으로 blocking한 후 primary antibody와 secondary antibody 붙인다. antibody 반응이 끝난 membrane에 ECL detection kit로 처리하고 X-ray film에 노출하여 현상하여 생성된 band를 이용하여 발현량을 확인하였다.
(7) Turbidity assay
Fibrin clot의 밀도를 실시간 추적하여 시료의 억제활성을 분석.
100 mM NaCl)를 포함하는 1% human fibrinogen (prepared in 50 mM Tris-HCl (pH 7.4) 90 μl 에 10 μl of 10 U/ml thrombin과 다양한 농도의 시료를 동시에 첨가한 후 수회 pipetting하여 완전히 섞은 mixture를 96-well microplate에 loading하여 24시간 동안 350nm와 405nm로 측정. 대조군은 시료를 첨가하지 않은 mixture를 같은 조건으로 반응시킨 후 측정. Microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 측정하였다.
(8) Fibrin clot 억제능 분석
Fibrin clot 을 형성시키기 위해 모든 재료를 첨가한 mixture와 다양한 농도의 시료를 동시에 반응시키거나 각 재료와 다양한 시간으로 미리 반응시켜 fibrin 형성에 대한 억제활성을 분석. 90 μl of 1% human fibrinogen (prepared in 20 mM Tris-HCl (pH 7.4) containing 100 mM NaCl)에 10 μl of 0.5 U/ml thrombin과 다양한 농도의 시료를 동시에 또는 미리 반응시킨 것을 첨가한 후 수회 pipetting하여 완전히 섞은 mixture를 6시간 동안 반응시켜 형성된 fibrin clot의 무게를 측정하여 억제 효능을 분석. 대조군은 시료를 첨가하지 않은 mixture를 같은 조건으로 반응시킨 후 측정하였다.
위와 같은 방법으로 Alexa Fluor 488 fibrinogen (0.4 μM)을 준비하고 반응물과 함께 처리. 처리 후 형광현미경 (Nikon, Eclipse TE 2000-U, Japan)으로 형광 광도를 ImageJ 1.46b image analysis software (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)로 분석하여 억제 효능을 분석. 대조군은 시료를 첨가하지 않은 mixture를 같은 조건으로 반응시킨 후 측정하였다.
(9) In vitro 항혈전능 분석
실험동물로부터 분리한 mouse 또는 rat blood을 이용한 시료의 혈전억제활성을 분석. 다양한 농도의 시료를 각 blood 300 μL에 첨가한 후 37 ℃에 1시간 반응시켜 상층액을 분리하여 410 nm에서 흡광도 값을 측정하고 이를 이용하여 항혈전능 분석. 대조군은 시료를 첨가하지 않고 saline을 첨가 후 같은 조건으로 반응시킨 것을 비교하였다.
(10) Thrombin assay
Fibrinogen plate assay와 Amidolytic activity assay를 통해 시료의 thrombin 억제활성을 분석. 적정 시료와 human thrombin (0.5 U/ml, in 20 mM Tris-HCl (pH 7.4))을 다양한 시간으로 전처리한 후 fibrinogen plate에 침적하여 fibrin 형성 정도를 측정하고 이를 통해 시료의 thrombin 억제활성을 분석. Fibrinogen plate는 agarose (1% (w/v) (in 20 mM Tris-HCl (pH 7.4) containing 100 mM NaCl)와 human fibrinogen (2.4 mg/ml)을 첨가하여 준비. 적정 시료와 human thrombin (0.5 U/ml, in 20 mM Tris-HCl (pH 7.4))을 10분간 전처리한 후 chromogenic substrate(S-2238, H-D-Phe-Pip-Arg-pNA)를 이용하여 Amidolytic activity를 측정하고 이를 통해 시료의 thrombin 억제활성을 분석. 대조군은 시료를 첨가하지 않은 mixture를 같은 조건으로 반응시킨 후 측정하였다.
(11) Factor X activated assay
Amidolytic activity assay를 통해 시료의 factor X activated 억제활성을 분석. 적정 시료와 factor X activated (1 U) (in 20 mM Tris-HCl (pH 7.4)) 을 10분간 전처리한 후 chromogenic substrate (S-2222, Bz-Ile-Glu-(OR)-Gly-Arg-pNA; S-2765, Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA·2HCl) 를 이용하여 Amidolytic activity를 측정하고 이를 통해 시료의 factor X activated 억제활성을 분석. 대조군은 시료를 첨가하지 않은 mixture를 같은 조건으로 반응시킨 후 측정하였다.
(12) 칼슘재첨가시간 측정
Human blood에서 2000 x g로 10분간 원심분리하여 얻은 plasma를 이용하여 칼슘재첨가 시간을 측정함으로 억제활성을 분석. Plasma 30 μl에 시료 30 μl (0.05-0.2 mM dissolved in 20 mM Tris-HCl (pH 7.4))을 첨가하여 10분간 37℃에서 반응. 여기에 37℃에 미리 반응시킨 25 mM CaCl2 30 μl을 첨가한 후 20초 간격으로 30분 동안 650 nm으로 측정. 대조군은 시료를 첨가하지 않은 mixture를 같은 조건으로 반응시킨 후 측정. Microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 측정하였다.
(13) APTT, PT를 이용한 응고시간 측정
혈액의 응고반응에 미치는 영향을 분석하기 위해, Human plasma에 다양한 시료를 전처리 또는 동시에 처리하여 APTT, PT, TT를 응고분석기에 측정하였다.
(14) 항혈소판능 분석
시료의 항혈소판능을 분석하기 위해, rodent blood (3.2 % sodium citrate)를 이용하고 다양한 농도의 시료를 5분 전처리한 후 collagen/epinephrine cartridge(Dade Behring, Marburg, Germany)에 준비하여 platelet function analyzer (PFA-100)로 closure time (CT)를 분석. 대조군은 시료를 첨가하지 않은 blood를 같은 조건으로 반응시킨 후 측정하여 비교하였다.
시료가 혈소판 수에 미치는 영향을 관찰하기 위해, 분리된 PRP를 희석액으로 1:20의 비율로 희석하고, 현미경 하에서 헤모 사이토 미터의 4개의 커다란 (1 mm2) 코너 사각형을 이용하여 측정. 100㎕의 세척된 혈소판(0.1 mL, 103/mL)을 다양한 농도의 시료로 10 분간 처리 후 분석하였다.
(15) Clot retraction assay
시료의 혈전응축능에 미치는 영향을 분석하기 위해, rodent blood로부터 혈소판을 분리 시 Tyrode's buffer (pH 7.4)를 이용하여 2.5 x 108/mL의 농도로 준비하고 다양한 농도의 시료와 fibrinogen (0.1 mg/mL)과 1 mM CaCl2, thrombin (0.25 U/mL)을 60분 동안 처리 후 clot density를 ImageJ 1.46b image analysis software로 분석. 대조군은 시료를 첨가하지 않은 같은 조건으로 반응시킨 후 측정하여 비교하였다.
(16) ATP release assay
시료가 혈소판 활성화 중 dense granule (분비과립)의 ATP 분비에 미치는 영향을 분석하기 위해, 2.5 x 108/mL 농도의 0.1 mL의 분리된 혈소판을 이용하여 시료를 5분간 전처리 후 collagen + epinephrine 또는 thrombin을 37℃에서 5분간 처리하여 혈소판 자극. 자극 후 원심분리하여 상층액을 이용하여 ATP assay kit로 ATP 농도를 분석. 대조군은 시료를 첨가하지 않은 같은 조건으로 반응시킨 후 측정하여 비교하였다.
(17) Serotonin secretion assay
시료가 혈소판 활성화 중 dense granule (분비과립)의 serotonin 분비에 미치는 영향을 분석하기 위해, 2.5 x 108/mL 농도의 0.1 mL의 분리된 혈소판을 이용하여 시료를 5분간 전처리 후 collagen + epinephrine 또는 thrombin을 ℃에서 5분간 처리하여 혈소판 자극. 자극 후 원심분리하여 상층액을 이용하여 Serotonin assay kit로 serotonin 농도를 분석. 대조군은 시료를 첨가하지 않은 같은 조건으로 반응시킨 후 측정하여 비교하였다.
(18) Collagen, epinephrine으로 유도한 혈소판 활성화 억제능 기전 분석
시료가 혈소판 활성화에 관여하는 기전에 어떤 영향을 미치는지 분석하기 위해, 다음과 같은 대조군 및 실험군을 설계하였다.
-Group1: saline만 처리한 일반대조군; -Group2: 혈소판 활성화 유도체인 Collagen + epinephrine를 처리 후 saline을 처리한 음성대조군; -Group3: 시료만 처리한 일반대조군; -Group4: 혈소판 활성화 유도체인 Collagen + epinephrine를 처리 후 시료를 처리한 실험군 1; -Group5: 혈소판 활성화 유도체인 Collagen + epinephrine를 처리 후 시료를 처리한 실험군2.
분리된 혈소판을 이용하여 시료를 5분간 전처리 후 collagen + epinephrine을 37℃에서 5분간 처리하여 혈소판 자극. 자극 후 17700 x g로 15분간 원심분리하여 혈소판 추출액을 제조하고. Western blot 수행하여 pERK, pP38, pJNK, pPI3K, pAMPKα1/2, PAR-1, DEP-1, PTP1B, fibrinogen, αIIbβ3, pAKT 유전자 발현을 분석. Beta-actin을 loading control로 사용하였다.
(19) Thrombin으로 유도한 혈소판 활성화 억제능 기전 분석
시료가 혈소판 활성화에 관여하는 기전에 어떤 영향을 미치는지 분석하기 위해, 다음과 같은 대조군 및 실험군을 설계하였다.
-Group1: saline만 처리한 일반대조군; -Group2: 혈소판 활성화 유도체인 thrombin을 처리 후 saline을 처리한 음성대조군; -Group3: 시료만 처리한 일반대조군; -Group4: 혈소판 활성화 유도체인 thrombin을 처리 후 시료를 처리한 실험군1; -Group5: 혈소판 활성화 유도체인 thrombin을 처리 후 시료를 처리한 실험군2.
또한, thrombin의 특이적인 저해제인 hirudin을 이용하여 시료의 억제능 특징을 분석하기 위해, 다음과 같은 대조군 및 실험군을 설계하였다.
-Group1: saline만 처리한 일반대조군; -Group2: hirudin만 처리한 일반대조군; -Group3: 혈소판 활성화 유도체인 thrombin을 처리 후 saline을 처리한 음성대조군; -Group4: 혈소판 활성화 유도체인 thrombin를 처리 후 시료를 처리한 실험군1; -Group5: 혈소판 활성화 유도체인 thrombin를 처리 후 시료를 처리한 실험군2.
분리된 혈소판을 이용하여 시료를 5분간 전처리 후 thrombin을 37℃에서 5분간 처리하여 혈소판 자극. 자극 후 17700g로 15분간 원심분리하여 혈소판 추출액을 제조. Western blot 수행하여 pERK, pP38, pJNK, pPI3K, pAMPKα1/2, PAR-1, DEP-1, PTP1B, fibrinogen, αIIbβ3, pAKT 유전자 발현을 분석. Beta-actin을 loading control로 사용하였다.
(20) 마우스 폐색전증 유도 모델(Mouse pulmonary thromboembolism-induced model)
A. Percentage of protection
Collagen (200 μg/ml)와 epinephrine (15 μg/ml)을 첨가한 0.1 ml mixture (in saline buffer)을 tail vein에 주사하여 thromboembolism을 유도. 다양한 농도의 시료를 thromboembolism 유도 1시간 전에 intraperitoneal injection으로 처리. Thromboembolism 유도 후 15 분 동안 mortality 나 paralysis를 관찰하고 15 분 이후에 mortality 나 paralysis가 관찰되지 않은 실험동물의 수를 측정하여 시료의 thromboembolism에 대한 보호효과를 분석. 대조군은 시료를 처리하지 않고 같은 조건으로 thromboembolism을 유도하여 비교분석하였다.
Percentage of protection (%) = mortality나 paralysis가 없는 실험동물 수/thromboembolism를 유도한 실험동물 수 X 100
(21) 마우스 폐색전증 유도 모델에서 혈소판 활성화 억제능 기전 분석
시료가 혈소판 활성화에 관여하는 기전에 어떤 영향을 미치는지 분석하기 위해, 다음과 같은 대조군 및 실험군을 설계하였다.
-Group1: saline만 처리한 일반대조군; -Group2: 혈소판 활성화 유도체인 thrombin 또는 collagen + epinephrine를 처리 후 saline을 처리한 음성대조군; -Group3: 혈소판 활성화 유도체인 thrombin 또는 collagen + epinephrine를 처리 후 aspirin을 처리한 양성대조군; -Group4: 혈소판 활성화 유도체인 thrombin 또는 collagen + epinephrine를 처리 후 시료를 처리한 실험군1; -Group5: 혈소판 활성화 유도체인 thrombin 또는 collagen + epinephrine를 처리 후 시료를 처리한 실험군2.
분리된 혈소판을 이용하여 시료를 5분간 전처리 후 thrombin 또는 collagen + epinephrine을 37 ℃에서 5분간 처리하여 혈소판 자극하고, 자극 후 17700 x g로 15분간 원심분리하여 혈소판 추출액을 제조하였다. Western blot 수행하여 pERK, pP38, pJNK, pPI3K, pAMPKα1/2, PAR-1, DEP-1, PTP1B, fibrinogen, αIIbβ3, pAKT 유전자 발현을 분석하였다. Beta-actin을 loading control로 사용하였다.
(22) FeCl3-induced arterial thrombosis
경동맥혈전 유발 동물모델을 제작하기 위해 FeCl3를 이용하여 경동맥혈전을 유발. 다양한 농도의 시료를 thrombosis 유도 1시간 전 intraperitoneal injection으로 처리. 동물 실험실에서 일주일 적응시킨 mouse를 마취 후 수술대에 고정하고, 목의 정중부를 절개를 하고 미주신경이 손상되지 않도록 주의하여 우측 총경동맥 (common carotid, CCA)을 찾아 확인한 후 노출. 혈관에 filter paper(2 mm square)를 3분 간 35% FeCl3를 가한 후 3분이 지나면 filter paper를 제거하고 경동맥을 세척하고 30분간 관찰하였다. 적정시간 지난 후 혈전이 형성이 되며 30분 후 혈관을 분리하여 4% paraformaldehyde로 고정하고 Cryosection을 수행함. HE염색 후 현미경으로 사진결과를 도출하고 ImageJ로 혈전형성 정도를 분석하였다.
시험예
1:
꾸지뽕
열매 추출물로부터 분리된
chlorogenic
acid의
항혈전
, 항응고,
항혈소판
효능 분석
1-1: Fibrin clot assay
Fibrin clot assay법은 fibrin clot을 형성시킬 때 sample을 처리하여 시료의 fibrin clot 형성억제 효능을 평가하기 위한 실험이다. Chlorogenic acid 과 fibrin clot 형성의 주요 인자들을 동시에 처리 후 1시간 및 적정시간 동안 반응시킨 후 형성된 fibrin clot의 무게 및 밀도를 측정하여 chlorogenic acid의 fibrin clot 형성억제 효능을 분석하였다.
결과 분석을 위해 음성대조군은 fibrinogen에 아무것도 처리하지 않은 음성대조군1과 fibrinogen에 thrombin만 처리하여 fibrin clot을 형성시킨 음성대조군2를 포함하고, 양성대조군은 실험군과 동일한 조건에서 t-PA를 처리한 대조군, 실험군은 fibrin clot 형성 시 다양한 농도의 chlorogenic acid을 처리한 군으로 실험을 수행하였다.
도 2는 클로로제닉산의 In vitro 항혈전 효과 및 피브린클롯 에세이의 결과를 나타내는 도면이다. 그 결과, 음성대조군 negative control을 통해 fibrin clot이 강하게 형성된 것을 확인하였고 human fibrinogen과 human thrombin만 반응시킨 음성대조군2 negative control의 억제 효능을 0 %라고 볼 때, 양성대조군 positive control인 5 U t-PA에서 약 100 %의 fibrin clot 형성억제 효능을 확인하였다(도 2). Chlorogenic acid 10 ㎍, 20 ㎍, 30 ㎍의 농도로 처리한 실험군에서는 순서대로, 16 ± 7 %, 33 ± 5 %, 39 ± 7 %의 fibrin clot 형성억제 효능을 확인하였다(도 2).
Fibrin clot assay를 통해 혈전 (thrombus)의 주요 구성물인 fibrin clot은 fibrinogen과 thrombin에 의해 강하게 형성되지만, chlorogenic acid에서 16-39 %의 억제율을 보이는 fibrin clot 형성억제 효능이 존재함을 확인하였고, t-PA의 효능보다 낮았지만 과도한 혈전 형성을 억제할 수 있는 fibrin clot 형성억제 효능을 확인하였다.
1-2: Turbidity assay
Turbidity assay법은 혈전(thrombus)의 주요 구성물인 fibrin clot을 형성시키기 위한 주요 인자 human fibrinogen과 human thrombin을 이용한 실험이며, chlorogenic acid과 fibrin clot 형성의 주요 인자들을 동시에 처리 후 405 nm에서 fibrin clot을 실시간 fibrin clot의 밀도를 추적하여 chlorogenic acid가 갖는 fibrin clot 형성 억제효능을 분석하고자 하였다.
도 3은 In vitro turbidity assay 결과를 나타내는 도면이다. 이 결과로 부터, human fibrinogen과 human thrombin만 반응시킨 음성대조군 negative control에서 60분 동안 지속적으로 fibrin clot의 밀도가 증가하여 약 0.68의 OD405 value를 확인하였고, human fibrinogen과 human thrombin에 20 U t-PA를 첨가한 양성대조군 positive control에서는 반응 시작 후 fibrin clot 밀도가 증가하지 않았고 fibrin clot 형성이 강하게 억제된 것을 확인하였으며, 60 분 후 0.00의 OD405 value를 확인하였다(도 3).
Chlorogenic acid 10 ㎍, 20 ㎍, 30 ㎍의 농도로 처리한 실험군에서 순서대로, 0.44, 0.43, 0.11의 OD405 value가 확인되었다(도 3A). 시료의 농도 증가로 인해 fibrin clot의 실시간 밀도가 낮아지는 경향을 보였다. 이는 human fibrinogen과 human thrombin만 반응시킨 대조군 negative control의 fibrin clot 밀도 (OD405 value = 0.68)와 비교해볼 때 chlorogenic acid 10 ㎍, 20 ㎍, 30 ㎍의 농도에서 각각 35.29%, 36.76%, 83.82%의 fibrin clot 억제 효능이 확인되었다(도 3B).
기존의 혈전증 관련 임상에 이용되고 있는 t-PA를 이용한 대조군 positive control의 억제효능 (100.0%)과 chlorogenic acid의 억제효능을 비교해보면, chlorogenic acid의 억제효능은 t-PA의 억제효능 보다 다소 낮았지만 모든 농도에서 35 % 이상의 억제효능을 보였고 고농도에서 가장 높은 억제효능 (83.82 %)을 보였다. 이러한 결과를 통해, chlorogenic acid에는 fibrin clot의 형성을 약 35-84 % 억제시키는 항혈전능이 있음을 확인하였다.
1-3: Anti-thrombotic activity assay
Anti-thrombotic activity assay법은 실험동물의 혈액에서 유도한 혈전 (rodent blood)을 이용한 항혈전 효능 평가법이며, 혈액 채취 후 자연응고 후 형성되는 혈전에 시료를 적정시간 처리 후 남은 혈전의 양과 반응액을 분석하여 시료의 혈전제거 효능을 평가하는 실험이다. Chlorogenic acid와 rodent blood를 1 시간 및 적정시간 동안 반응시킨 후 남은 blood clot의 무게 및 반응액의 흡광도를 측정하여 chlorogenic acid의 혈전제거와 항혈전 효능을 분석하였다. 결과 분석을 위해 음성대조군(blood에 아무것도 처리하지 않은 대조군), 양성대조군(실험군과 동일한 조건에서 t-PA를 처리한 대조군), 실험군(blood에 다양한 농도로 시료를 처리한 군)으로 실험을 수행하였다.
도 4는 In vitro blood clot assay를 나타낸 결과도이다. Chlorogenic acid 10 ㎍, 30 ㎍, 50 ㎍, 100 ㎍의 농도로 처리한 실험군에서는 순서대로 410 nm에서 0.43 ± 0.04, 0.47 ± 0.05, 0.54 ± 0.06, 0.60 ± 0.03의 흡광도가 확인되었다(도 4). 시료 대신 생리식염수를 처리한 음성대조군의 흡광도는 0.403 ± 0.06 이며, 양성대조군인 t-PA는 10 U 농도에서 0.46 ± 0.02, 20 U에서 0.78 ± 0.03으로 나타났다. Chlorogenic acid를 처리한 실험군 중 30 ㎍, 50 ㎍, 100 ㎍에서 10 U t-PA의 반응액 흡광도보다 chlorogenic acid 30 ㎍, 50 ㎍, 100 ㎍ 순서대로, 2.17 %, 17.39 %, 30.43 % 높게 나타났으나, 20 U t-PA의 반응액 흡광도보다는 모든 농도에서 낮은 흡광도가 측정되었다. Chlorogenic acid 30 ㎍, 50 ㎍, 100 ㎍의 효능이 10 U t-PA의 혈전용해능 보다 약 2-30 % 높아 우수한 혈전제거 및 항혈전능을 보였다.
Anti-thrombotic activity assay를 통해, 실험동물 혈액의 혈전 형성 후 chlorogenic acid가 우수한 혈전용해능을 가지며, 30-100 ㎍ 농도에서 10 U t-PA 보다 높은 혈전제거능을 보였다. 따라서, chlorogenic acid는 실험동물의 혈액에 작용하여 과도한 혈전형성 예방을 통해 응고계 (coagulation system) 조절 및 혈행개선 효과를 기대할 수 있을 것으로 보인다.
1-4: Thrombin,
FXa
,
FXIIIa
assay
Chlorogenic acid와 Thrombin, FXa, FXIIIa을 10분 동안 반응시킨 후 Thrombin, FXa, FXIIIa의 효소활성을 측정하여 chlorogenic acid의 Thrombin, FXa, FXIIIa 효소억제 효능을 분석하였다. 결과 분석을 위해 양성대조군 (Thrombin, FXa, FXIIIa만 처리한 양성대조군), 실험군 (Thrombin, FXa, FXIIIa에 다양한 농도로 제조한 chlorogenic acid를 처리한 군)으로 실험을 수행하였다.
Thrombin, FXa, FXIIIa만 반응시킨 양성대조군에서 각 효소와 효소에 특이적인 substrate가 반응하여 얻어진 각 효소활성을 100%로 하여 비교분석하였다. Chlorogenic acid는 1 μg, 5 μg, 10 μg의 농도로 처리하였고 반응액은 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.
도 5는 Thrombin, FXa, 및 FXIIIa assay 결과이다. 먼저 thrombin 활성을 보면, 무처리의 음성대조군(Con)에서는 100 %의 효소활성을 확인하였고 chlorogenic acid에서는 5 μg에서 81.1 %, 10 μg에서 67.6 %의 효소활성이 확인되었다. 이는 chlorogenic acid가 thrombin 활성을 각 농도 (5 μg, 10 μg)에서 18.9 ± 1.0 %, 32.4 ± 1.9 % 억제하였다(도 5).
또한, FXa 활성을 보면, 무처리의 음성대조군(Con)에서는 100 %의 효소활성을 확인하였고 chlorogenic acid에서는 5 μg에서 94.3 %, 10 μg에서 82.1 %의 효소활성이 확인되었다. 이는 chlorogenic acid가 FXa 활성을 각 농도 (5 μg, 10 μg)에서 5.7 ± 0.6 %, 17.9 ± 0.9 % 억제하였다(도 5).
FXIIIa 활성을 보면, 무처리의 음성대조군(Con)에서는 100 %의 효소활성을 확인하였고 chlorogenic acid에서는 5 μg에서 91.3 %, 10 μg에서 88.5%의 효소활성이 확인되었다. 이는 chlorogenic acid가 FXIIIa 활성을 각 농도 (5 μg, 10 μg)에서 8.7 ± 0.6 %, 11.5 ± 0.6 % 억제하였다(도 5).
Chlorogenic acid의 가장 높은 농도에서 약 32%의 thrombin 억제율, 약 18%의 FXa 억제율, 약 12%의 FXIIIa 억제율을 나타냈다.
Thrombin, FXa, FXIIIa assay를 통해, Chlorogenic acid가 혈전의 응고인자인 Thrombin, FXa, FXIIIa의 효소활성을 약 12-32 % 억제시키는 응고인자효소 저해능을 갖고 있으며, 5 μg에서 효능에 관찰되었고 고농도에서 비교적 높은 억제효능을 확인하였다.
1-5:
APTT
, PT,
TT를
이용한 항응고 효과 분석
고지혈증 및 심혈관질환은 혈액의 응고 성질 때문에 몸 안에서 혈액이 응고되어 혈전이 형성되고 결국 혈관을 막거나 혈전 부스러기가 미세한 혈관으로 날아가 혈관을 막는 뇌경색(뇌졸중, 중풍)과 같은 색전증으로 발병된다. 따라서, 혈액 응고 작용을 억제시켜 혈전이 잘 생성되지 않도록 하는 시료의 항응고 효능을 확인하기 위해 chlorogenic acid의 응고 저해 효능을 분석하였다.
APTT와 PT, TT 실험을 통해 chlorogenic acid가 응고계의 외인성과 내인성 및 공통경로 factor 중 어떤 응고계 factor에 작용하여 항응고 효과를 보이는지 분석하고자 하였다.
결과 분석을 위해 음성대조군 (human plasma에 아무것도 처리하지 않은 대조군), 실험군 (human plasma에 다양한 농도의 시료를 처리한 군)으로 실험을 수행하였다. 다음 표3에 클로제닉산의 항 응고 효과를 나타냈다.
| APTT (sec) | PT (sec) | TT (sec) | ||
| 대조군 | 31.3 ± 0.1 | 16.8 ± 0.2 | 9.4 ± 0.3 | |
| Chlorogenic acid (μg) |
1 | 31.5 ± 0.2 | 16.8 ± 0.2 | 11.5 ± 0.3 |
| 5 | 31.4 ± 0.2 | 16.9 ± 0.1 | 12.2 ± 0.4* | |
| 10 | 32.5 ± 0.1** | 16.9 ± 0.2 | 13.8 ± 0.6 | |
| 20 | 32.9 ± 0.3** | 18.1 ± 0.3** | 15.2 ± 0.5* | |
Chlorogenic acid의 항응고 활성을 분석하기 위해 내인성 응고계 검사인 APTT, 외인성 응고계 검사인 PT, 공통경로 응고계 검사인 TT를 측정한 결과, 먼저 APTT의 결과는 chlorogenic acid 1 μg, 5 μg, 10 μg, 20 μg 순서대로, 1 μg에서 31.5 ± 0.2 sec, 5 μg에서 31.4 ± 0.2 sec, 10 μg에서 32.5 ± 0.1 sec, 20 μg에서 32.9 ± 0.3 sec의 APTT가 측정되었다. 대조군의 정상 APTT 응고시간은 31.3 ± 0.1 sec으로 측정되었다. 이는 chlorogenic acid를 처리한 실험군에서는 10 μg에서 1.04 배, 20 μg에서 1.05 배의 APTT 지연 효능을 확인하였다(표 3).
PT 결과에서 대조군의 정상응고시간 16.8 ± 0.02 sec와 비교할 때, chlorogenic acid 20 μg에서 18.1 ± 0.3 sec의 PT가 측정되었다. 이는 chlorogenic acid를 처리한 실험군 20 μg에서 1.08 배의 PT 지연 효능을 확인하였다(표 3).
TT 결과에서 대조군의 정상응고시간 9.4 ± 0.3 sec와 비교할 때, chlorogenic acid 1 μg, 5 μg, 10 μg, 20 μg 순서대로, 1 μg에서 11.5 ± 0.3 sec, 5 μg에서 12.2 ± 0.4 sec, 10 μg에서 13.8 ± 0.6 sec, 20 μg에서 15.2 ± 0.5 sec의 TT가 측정되었다. 이는 chlorogenic acid를 처리한 실험군 5 μg에서 1.30 배, 20 μg에서 1.62 배의 TT 지연 효능을 확인하였다(표 3).
Chlorogenic acid의 APTT 지연능으로 APTT가 약 33초 이상으로 지연된 결과를 통해 내인성 경로의 응고인자들 (I, II, V, X, XII, XI, IX, VIII 응고인자, 프리칼리크레인(prekallikrein), 고분자중량 키니노겐(high molecular weight kininogen, HMWK)과 반응하여 혈액응고를 상당히 지연시켰음을 확인하였다. 또한, chlorogenic acid를 통해 PT가 약 18초 이상으로 지연되어 정상수치보다 약 9초 이상으로 지연된 결과를 통해 외인성 경로에서 혈전을 형성시키는 응고인자들 (I, II, V, VII, X)과 반응하여 혈액응고를 지연시켰음을 확인하였다.
Chlorogenic acid의 TT 지연능을 통해 공통 경로의 인자들이 영향을 받아서 응고작용에 중요한 구성물인 혈전에 직접적으로 작용하는 thrombin 및 FXa와 반응하여 혈액응고를 지연시켰음을 확인하였다. APTT와 PT, TT assay를 통해, chlorogenic acid가 human plasma의 응고시간을 내인성, 외인성, 공통 경로 응고계에서 최대 약 62% 지연시켰으며, 특히 고농도와 공통 경로에서 가장 높은 지연효능을 보였다. Chlorogenic acid는 human plasma에 작용하여 혈액응고 지연을 통해 응고계 조절 및 혈행개선 효과를 기대할 수 있을 것으로 보인다.
1-6: PFA-100을 이용한
항혈소판능
분석
PFA-100 system은 혈소판기능 이상을 검사하기 위해 사용되는 장비이다. 여기에 사용되는 카트리지막은 혈소판 부착을 위해 collagen이 존재하여 혈소판이 collagen에 붙으면서 최초 자극이 일어나고 카트리지막 내 epinephrine이 혈소판 응집을 유발하여 응고가 유도되는 system이다. 이 카트리지막에 사용할 혈액과 다양한 농도의 시료를 전처리하여 혈액에 미치는 collagen/epinephrine의 자극 및 혈소판 응집에 어떤 영향을 미치는지 분석하였다. 결과 분석을 위해 음성대조군 (whole blood에 아무것도 처리하지 않은 대조군), 실험군 (whole blood에 다양한 농도의 시료를 처리한 군)으로 실험을 수행하였다. 그 결과를 표 4에 나타내었다.
| Closure time (sec) | ||
| Control | 121.3 ±11.8 | |
| Chlorogenic acid (μg) | 1 | 123.1 ±8.9 |
| 5 | 125.9 ±12.1 | |
| 10 | 129.5 ±10.3 | |
| 20 | 143.4 ±19.2 | |
Chlorogenic acid의 항혈소판 활성을 분석하기 위해 closure time (CT)를 측정한 결과, chlorogenic acid 1 μg, 5 μg, 10 μg, 20 μg 순서대로, 1 μg에서 123.1 ± 8.9 sec, 5 μg에서 125.9 ± 12.1 sec, 10 μg에서 129.5 ± 10.3 sec, 20 μg에서 143.4 ± 19.2 sec의 CT가 측정되었다(표 4). 대조군의 정상 CT 응고시간은 121.3 ± 11.8 sec으로 측정되었다. 이는 chlorogenic acid를 처리한 실험군에서는 1 μg에서 2.3 %, 5 μg에서 3.8 %, 10 μg에서 6.8 %, 20 μg에서 18.2 %의 CT 지연 효능을 확인하였다.
이러한 결과는 chlorogenic acid가 혈액 내에서 내인성 혈소판 활성을 감소시키거나 Von Willebrand disease (VWD)와 유사한 영향을 미쳐 혈소판 응집이 지연되었을 것으로 추측되며, human plasma에 작용하여 혈액응고 지연을 통해 응고계 조절 및 혈행개선 효과를 기대할 수 있을 것으로 보인다.
1-7: Collagen and epinephrine-induced acute
thromboembolism
model
Collagen and epinephrine-induced acute thromboembolism model을 통해 chlorogenic acid가 collagen과 epinephrine에 의해 유도된 폐혈전색전증에 대해 보호 효과를 보이는지 분석하고자 하였다.
결과 분석을 위해 음성대조군(model 처치 전 saline을 처리한 대조군), 양성대조군(model 처치 전 실험군과 동일한 조건에서 aspirin을 처리한 대조군), 실험군(model 처치 전 다양한 농도의 시료를 처리한 군)으로 실험을 수행하였다. 그 결과를 표 5에 나타내었다.
| Experimental group | Aspirin 20 mg/kg |
Chlorogenic acid (mg/kg) |
|
| 5 | 10 | ||
| Protection (%) |
60 | 30 | 40 |
| No. paralyzed or dead / No. tested | 4/10 | 7/10 | 6/10 |
Chlorogenic acid의 collagen+epinephrine-induced acute thromboembolism model에서 폐혈전색전증 보호 효과를 분석한 결과, 양성대조군인 aspirin 20 mg/kg에서 60%, 실험군 chlorogenic acid 5 mg/kg에서 30 %, 10 mg/kg에서 40 % (Table 4)로 분석되었다. 모든 농도에서 30 % 이상의 보호 효과를 보였지만 고농도에서 양성대조군인 aspirin의 보호효과에 미치지 못하였다.
시험예
2:
꾸지뽕
열매 추출물로부터 분리된
syringic
acid의
항혈전
,
항혈
소판, 항응고 효능 및 관련 기작 분석
2-1: Fibrin clot assay
Syringic acid와 fibrin clot 형성의 주요 인자들을 동시에 처리 후 1 시간 및 적정시간 동안 반응시킨 후 형성된 fibrin clot의 무게 및 밀도를 측정하여 syringic acid의 fibrin clot 형성억제 효능을 분석하였다. 결과 분석을 위해 음성대조군은 fibrinogen에 아무것도 처리하지 않은 음성대조군1과 fibrinogen에 thrombin만 처리하여 fibrin clot을 형성시킨 음성대조군2를 포함하고, 양성대조군은 실험군과 동일한 조건에서 t-PA를 처리한 대조군, 실험군은 fibrin clot 형성 시 다양한 농도의 syringic acid을 처리한 군으로 실험을 수행하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6은 피브린 클롯 형성에 관한 시린지산의 효과를 나타내는 도면이다.
그 결과, 음성대조군 negative control을 통해 fibrin clot이 강하게 형성된 것을 확인하였고 human fibrinogen과 human thrombin만 반응시킨 음성대조군2 negative control의 억제 효능을 0%라고 볼 때, 양성대조군 positive control인 5 U t-PA에서 약 100 %의 fibrin clot 형성억제 효능을 확인하였다(도 6B, C). Syringic acid 5 ㎍, 10 ㎍, 20 ㎍의 농도로 처리한 실험군에서는 순서대로, 9.1 %, 17.4 %, 47.2 %의 fibrin clot 형성억제 효능을 확인하였다(도 6C).
Fibrin clot assay를 통해 혈전(thrombus)의 주요 구성물인 fibrin clot은 fibrinogen과 thrombin에 의해 강하게 형성되지만, syringic acid에서 9-47 %의 억제율을 보이는 fibrin clot 형성억제 효능이 존재함을 확인하였고, t-PA의 효능보다 낮았지만 과도한 혈전 형성을 억제할 수 있는 fibrin clot 형성억제 효능을 확인하였다.
2-2: Turbidity assay
Syringic acid와 fibrin clot 형성의 주요 인자들을 동시에 처리 후 405 nm에서 fibrin clot을 실시간 fibrin clot의 밀도를 추적하여 syringic acid가 갖는 fibrin clot 형성 억제효능을 분석하고자 하였다. 도 7은 피브린 클롯 형성에 관한 시린지산의 효과를 나타내는 도면이다.
그 결과, human fibrinogen과 human thrombin만 반응시킨 음성대조군 negative control에서 60분 동안 지속적으로 fibrin clot의 밀도가 증가하여 약 0.74의 OD405 value를 확인하였고, human fibrinogen과 human thrombin에 20 U t-PA를 첨가한 양성대조군 positive control에서는 반응 시작 후 fibrin clot 밀도가 증가하지 않았고 fibrin clot 형성이 강하게 억제된 것을 확인하였으며, 60 분 후 0.11의 OD405 value를 확인하였다(도 7A).
Syringic acid 5 ㎍, 10 ㎍, 20 ㎍의 농도로 처리한 실험군에서 순서대로, 0.72, 0.68, 0.33의 OD405 value가 확인되었다(도 7A). Syringic acid의 농도 증가로 인해 fibrin clot의 실시간 밀도가 낮아지는 경향을 보였으며, human fibrinogen과 human thrombin만 반응시킨 대조군 negative control의 fibrin clot 밀도 (OD405 value = 0.74)와 비교해볼 때 syringic acid 5 ㎍, 10 ㎍, 20 ㎍의 농도에서 각각 2.7 %, 8.1 %, 55.4 %의 fibrin clot 억제 효능이 확인되었다(도 7B).
임상에서 혈전증에 이용되고 있는 t-PA를 이용한 대조군 positive control의 억제효능 (85.1%)과 syringic acid의 억제효능을 비교해보면, syringic acid의 억제효능은 t-PA의 억제효능 보다 다소 낮았지만 고농도에서 우수한 억제효능 (55.4 %)을 보였다. 이러한 결과를 통해, syringic acid에는 fibrin clot의 형성을 약 3-55 % 억제시키는 항혈전 효능이 있음을 확인하였다.
2-3:
Alexa
Fluor
488 fibrinogen을 이용한 형광현미경 분석
Alexa Fluor 488 fibrinogen을 이용한 형광현미경 분석법은 fibrin clot을 형성시킬 때 lexa Fluor 488 fibrinogen와 시료를 처리하여 시료의 fibrin clot 형성억제 효능을 형광 광도로 수치화 및 시각화를 통해 평가하기 위한 실험이다. Syringic acid와 fibrin clot 형성의 주요 인자들 및 Alexa Fluor 488 fibrinogen을 동시에 처리 후 적정시간 동안 반응시킨 후 형성된 fibrin clot의 형광사진 및 밀도를 측정하여 syringic acid의 fibrin clot 형성억제 효능을 분석하였다.
결과 분석을 위해 음성대조군은 fibrinogen에 아무것도 처리하지 않은 음성대조군1과 fibrinogen에 thrombin만 처리하여 fibrin clot을 형성시킨 음성대조군2를 포함하고, 양성대조군은 실험군과 동일한 조건에서 t-PA를 처리한 대조군, 실험군은 fibrin clot 형성 시 다양한 농도의 syringic acid을 처리한 군으로 실험을 수행하였다. 도 8은 시린지산의 피브린 폴리머 형성 및 혈액응괴의 억제를 나타내는 도면이다.
그 결과, 음성대조군 negative control을 통해 fibrin clot이 강하게 형성된 것을 확인하였고 human fibrinogen과 human thrombin만 반응시킨 음성대조군2 negative control의 억제 효능을 0 %라고 볼 때, 양성대조군 positive control인 10 U t-PA에서 약 80 %의 fibrin clot 형성억제 효능을 확인하였다(도 8A,B). Syringic acid 5 ㎍, 10 ㎍, 20 ㎍의 농도로 처리한 실험군에서는 순서대로, 15.1 %, 28.3 %, 51.5 %의 fibrin clot 형성억제 효능을 확인하였다(도 8B).
2-4: Blood clot assay
Syringic acid와 rodent blood를 1시간 및 적정시간 동안 반응시킨 후 남은 blood clot의 무게 및 반응액의 흡광도를 측정하여 syringic acid의 혈전제거와 항혈전 효능을 분석하였다. 결과 분석을 위해 음성대조군(blood에 아무것도 처리하지 않은 대조군), 양성대조군(실험군과 동일한 조건에서 t-PA를 처리한 대조군), 실험군(blood에 다양한 농도로 시료를 처리한 군)으로 실험을 수행하였다. 도 9는 In vitro 혈액 클롯 에세이 결과를 나타내는 도면이다.
Syringic acid 10 ㎍, 20 ㎍, 50 ㎍, 100 ㎍의 농도로 처리한 실험군에서는 순서대로 410 nm에서 0.4288 ± 0.063, 0.4597 ± 0.041, 0.5260 ± 0.0632, 0.5848 ± 0.050의 흡광도가 확인되었다(도 9). 시료 대신 생리식염수를 처리한 음성대조군의 흡광도는 0.4121 ± 0.0512 이며, 양성대조군인 t-PA는 10 U 농도에서 0.5130 ± 0.0258, 20 U에서 0.7215 ± 0.0417로 나타났다. Syringic acid를 처리한 실험군 중 50 ㎍, 100 ㎍에서 10 U t-PA의 반응액 흡광도보다 2.53 %, 14.00 % 높게 나타났으나, 20 U t-PA의 반응액 흡광도보다는 모든 농도에서 낮은 흡광도가 측정되었다. Syringic acid 50 ㎍, 100 ㎍의 효능이 10 U t-PA의 혈전용해능보다 약 3-14 % 높아 우수한 혈전제거 및 항혈전능을 보였다.
Blood clot assay를 통해 실험동물 혈액의 혈전 형성 후 syringic acid가 비교적 우수한 혈전용해능을 가지며, 50-100 ㎍ 농도에서 10 U t-PA 보다 높은 혈전제거능을 보였다. 따라서, syringic acid는 실험동물의 혈액에 작용하여 과도한 혈전형성 예방을 통해 응고계 조절 및 혈행개선 효과를 기대할 수 있을 것으로 보인다.
2-5: Thrombin and
FXa
assay
Syringic acid와 Thrombin, FXa을 10분 동안 반응시킨 후 Thrombin, FXa의 효소활성을 측정하여 syringic acid의 Thrombin, FXa 효소억제 효능을 분석하였다. 결과 분석을 위해 양성대조군(Thrombin, FXa만 처리한 양성대조군), 실험군 (Thrombin, FXa에 다양한 농도로 제조한 syringic acid를 처리한 군)으로 실험을 수행하였다.
Thrombin, FXa만 반응시킨 양성대조군에서 각 효소와 효소에 특이적인 substrate가 반응하여 얻어진 각 효소활성을 U/min의 농도로 도출하여 비교분석하였다. Syringic acid는 1 μg, 5 μg, 10 μg의 농도로 처리하였고 반응액은 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 도 10에 나타낸다. 도 10은 트롬빈 및 FXa 에세이 결과를 나타낸다.
그 결과, 먼저 thrombin 활성을 보면, 무처리의 음성대조군(Con)에서는 0.227 ± 0.02043 U/min의 효소활성을 확인하였고 syringic acid에서는 1 μg에서 0.21792 ± 0.019613 U/min, 5 μg에서 0.18387 ± 0.016548 U/min, 10 μg에서 0.14982 ± 0.013484 U/min의 효소활성이 확인되었다. 이는 syringic acid가 thrombin 활성을 각 농도 (1 μg, 5 μg, 10 μg)에서 4 %, 19 %, 34 % 억제하였다 (도 10). 또한, FXa 활성을 보면, 무처리의 음성대조군(Con)에서는 0.321 ± 0.02889 U/min의 효소활성을 확인하였고 syringic acid에서는 1 μg에서 0.30174 ± 0.027157 U/min, 5 μg에서 0.28569 ± 0.025712 U/min, 10 μg에서 0.24075 ± 0.021668 U/min의 효소활성이 확인되었다. 이는 syringic acid가 FXa 활성을 각 농도(1 μg, 5 μg, 10 μg)에서 6 %, 11 %, 25 % 억제하였다(도 10). Syringic acid의 가장 높은 농도에서 약 34%의 thrombin 억제율, 약 25%의 FXa 억제율을 나타냈다.
Thrombin, FXa assay를 통해, syringic acid가 혈전의 응고인자인 Thrombin, FXa의 효소활성을 약 4-34 % 억제시키는 응고인자효소 저해능을 갖고 있으며, 고농도에서 비교적 높은 억제효능을 확인하였다.
2-6: ATP release assay
Syringic acid가 혈소판 활성화 과정에서 분비과립의 ATP 분비에 미치는 영향을 분석하기 위해, 2.5 x 108/mL 농도의 0.1 mL의 분리된 혈소판과 syringic acid를 전처리 후 collagen + epinephrine 또는 thrombin을 처리하여 혈소판을 자극하고 분비된 ATP 농도를 분석하였다. 결과 분석을 위해 음성대조군1(혈소판에 vehicle만 처리한 대조군), 음성대조군2 (혈소판에 collagen + epinephrine 또는 thrombin만 처리한 대조군), 양성대조군 (혈소판에 collagen + epinephrine 또는 thrombin 처리 전 aspirin을 전처리한 대조군), 실험군 (혈소판에 collagen + epinephrine 또는 thrombin 처리 전 syringic acid를 전처리한 실험군)으로 실험을 수행하였다. 그 결과를 도 11에 나타냈다. 도 11은 시린지산의 과립 분비 억제에 관한 영향을 나타내는 도면이다.
Collagen + epinephrine을 이용한 혈소판 자극으로 분비과립에서 분비된 ATP 농도를 측정한 결과, vehicle만 처리한 음성대조군1에서는 3.02 ± 0.25 nM의 ATP 농도를 보였고 collagen + epinephrine 자극 후 아무것도 처리하지 않은 음성대조군2에서는 5.74 ± 0.31 nM의 ATP 농도를 보였다. Syringic acid를 전처리한 실험군에서는 1 μg 농도의 전처리에서 5.81 ± 0.22 nM, 5 μg 농도의 전처리에서 5.66 ± 0.18 nM, 10 μg 농도의 전처리에서 5.12 ± 0.19 nM의 농도를 보였다 (도 11A). 또한, aspirin 10μg을 전처리한 양성대조군에서는 5.49 ± 0.27 nM의 농도를 보였다. Collagen + epinephrine에 의한 혈소판 자극은 ATP 분비를 1.90 배 증가시켰으나, aspirin은 ATP 분비 증가를 9.19 % 감소시켰다. Syringic acid를 전처리한 실험군에서는 1 μg 농도의 전처리에서 ATP 분비 증가를 -2.57 % 감소, 5 μg 농도의 전처리에서 ATP 분비 증가를 2.94 % 감소, 10 μg 농도의 전처리에서 ATP 분비 증가를 22.79% 감소시켰다.
Thrombin을 이용한 혈소판 자극으로 분비과립에서 분비된 ATP 농도를 측정한 결과, vehicle만 처리한 음성대조군1에서는 3.02 ± 0.25 nM의 ATP 농도를 보였고 thrombin 자극 후 아무것도 처리하지 않은 음성대조군2에서는 6.17 ± 0.25 nM의 ATP 농도를 보였다. Syringic acid를 전처리한 실험군에서는 1 μg 농도의 전처리에서 6.15 ± 0.27 nM, 5 μg 농도의 전처리에서 5.88 ± 0.22 nM, 10 μg 농도의 전처리에서 4.93 ± 0.18 nM의 농도를 보였다(도 11B). 또한, aspirin 10μg을 전처리한 양성대조군에서는 5.92 ± 0.31 nM의 농도를 보였다. Thrombin에 의한 혈소판 자극은 ATP 분비를 2.04 배 증가시켰으나, aspirin은 ATP 분비 증가를 7.94 % 감소시켰다. Syringic acid를 전처리한 실험군에서는 1 μg 농도의 전처리에서 ATP 분비 증가를 0.63 % 감소, 5 μg 농도의 전처리에서 ATP 분비 증가를 9.21 % 감소, 10 μg 농도의 전처리에서 ATP 분비 증가를 39.37 % 감소시켰다.
ATP release assay를 통해, syringic acid가 collagen + epinephrine 또는 thrombin에 의해 유도되는 혈소판 활성화 반응에서 분비되는 ATP를 약 1-40 % 억제시키는 혈소판 활성화 억제능을 갖고 있으며, 양성대조군으로 처리했던 aspirin의 억제능보다 높게 분석되었고 syringic acid 고농도에서 비교적 높은 억제효능을 확인하였다.
2-7:
Serotonin
release assay
Syringic acid가 혈소판 활성화 과정에서 분비과립의 serotonin 분비에 미치는 영향을 분석하기 위해, 2.5 x 108/mL 농도의 0.1 mL의 분리된 혈소판과 syringic acid를 전처리 후 collagen + epinephrine 또는 thrombin을 처리하여 혈소판을 자극하고 분비된 serotonin 농도를 분석하였다. 결과 분석을 위해 음성대조군1 (혈소판에 vehicle만 처리한 대조군), 음성대조군2 (혈소판에 collagen + epinephrine 또는 thrombin만 처리한 대조군), 양성대조군 (혈소판에 collagen + epinephrine 또는 thrombin 처리 전 aspirin을 전처리한 대조군), 실험군 (혈소판에 collagen + epinephrine 또는 thrombin 처리 전 syringic acid를 전처리한 실험군)으로 실험을 수행하였다. 그 결과를 도 12에 나타냈다. 도 12는 시린지산의 과립 분비 억제에 관한 영향을 나타내는 도면이다.
Collagen + epinephrine을 이용한 혈소판 자극으로 분비과립에서 분비된 serotonin 농도를 측정한 결과, vehicle만 처리한 음성대조군1에서는 5.28 ± 0.56 nM의 serotonin 농도를 보였고 collagen + epinephrine 자극 후 아무것도 처리하지 않은 음성대조군2에서는 53.32 ± 3.19 nM의 serotonin 농도를 보였다. Syringic acid를 전처리한 실험군에서는 1 μg 농도의 전처리에서 50.11 ± 1.96 nM, 5 μg 농도의 전처리에서 43.49 ± 2.21 nM, 10 μg 농도의 전처리에서 39.87 ± 3.05 nM의 농도를 보였다(도 12A). 또한, aspirin 10μg을 전처리한 양성대조군에서는 14.98 ± 2.43 nM의 농도를 보였다. Collagen + epinephrine에 의한 혈소판 자극은 serotonin 분비를 10.10 배 증가시켰으나, aspirin은 serotonin 분비 증가를 79.81 % 감소시켰다. Syringic acid를 전처리한 실험군에서는 1 μg 농도의 전처리에서 serotonin 분비 증가를 6.68 % 감소, 5 μg 농도의 전처리에서 serotonin 분비 증가를 20.46 % 감소, 10 μg 농도의 전처리에서 serotonin 분비 증가를 28.0 % 감소시켰다.
Thrombin을 이용한 혈소판 자극으로 분비과립에서 분비된 serotonin 농도를 측정한 결과, vehicle만 처리한 음성대조군1에서는 5.28 ± 0.56 nM의 serotonin 농도를 보였고 thrombin 자극 후 아무것도 처리하지 않은 음성대조군2에서는 38.53 ± 3.47 nM의 serotonin 농도를 보였다. Syringic acid를 전처리한 실험군에서는 1 μg 농도의 전처리에서 35.18 ± 3.17 nM, 5 μg 농도의 전처리에서 26.93 ± 2.42 nM, 10 μg 농도의 전처리에서 22.75 ± 2.05 nM의 농도를 보였다(도 12B). 또한, aspirin 10μg을 전처리한 양성대조군에서는 32.82 ± 2.95 nM의 농도를 보였다. Thrombin에 의한 혈소판 자극은 serotonin 분비를 7.30 배 증가시켰으나, aspirin은 serotonin 분비 증가를 17.17 % 감소시켰다. Syringic acid를 전처리한 실험군에서는 1 μg 농도의 전처리에서 serotonin 분비 증가를 10.08 % 감소, 5 μg 농도의 전처리에서 serotonin 분비 증가를 34.89 % 감소, 10 μg 농도의 전처리에서 serotonin 분비 증가를 47.46% 감소시켰다.
Serotonin release assay를 통해, syringic acid가 collagen + epinephrine 또는 thrombin에 의해 유도되는 혈소판 활성화 반응에서 분비되는 serotonin을 약 7-47 % 억제시키는 혈소판 활성화 억제능을 갖고 있으며, 양성대조군으로 처리했던 aspirin의 억제능보다 thrombin 자극에서는 높게 분석되었으나 collagen + epinephrine 자극에서는 낮게 분석되었고 syringic acid 고농도에서 비교적 높은 억제효능을 확인하였다.
2-8: Clot retraction assay
Syringic acid의 혈전응축능에 미치는 영향을 분석하기 위해, rodent blood로부터 혈소판 분리 후 다양한 농도의 syringic acid와 fibrinogen, CaCl2, thrombin을 60분 동안 처리한 후 clot density를 ImageJ 1.46b image analysis software로 분석하였다. 결과 분석을 위해 음성대조군1 (fibrinogen + thrombin에 혈소판을 첨가하지 않은 대조군), 음성대조군2 (fibrinogen + thrombin에 혈소판을 첨가한 대조군), 양성대조군 (fibrinogen + thrombin에 혈소판을 첨가 후 hirudin을 처리한 대조군), 실험군1 (fibrinogen + thrombin에 혈소판을 첨가 후 syringic acid를 처리한 실험군), 실험군2 (fibrinogen + thrombin에 혈소판을 첨가 후 syringic acid + hirudin을 처리한 실험군)으로 실험을 수행하였다. Hirudin은 thrombin inhibitor로서 thrombin 활성을 감소시켜 혈전응축능 평가에 양성대조군으로 사용하였다. 실험군2는 thrombin inhibitor와 syringic acid의 thrombin 활성 억제로 인한 혈전응축 저해능을 동시에 평가하기 위해 사용하였다. 도 13은 시린지산의 클롯 응축에 미치는 영향을 나타내는 도면이다.
Fibrinogen + thrombin에 혈소판을 첨가하지 않은 음성대조군1 (Con1)에서 fibrin clot이 강하게 형성되었고 응축이 일어나지 않았음을 확인하였다. 음성대조군2에서는 fibrinogen + thrombin에 혈소판을 첨가하여 혈전응축이 유도되어 시험관 튜브 상단에 응축된 fibrin clot을 확인하였다(도 13A). 음성대조군1에서 형성된 fibrin clot을 밀도값을 100 %로 하여 대조군과 실험군의 밀도값을 도출한 결과, fibrinogen + thrombin에 혈소판을 첨가한 음성대조군2의 fibrin clot 값은 58.32 ± 6.42 %, fibrinogen + thrombin에 혈소판을 첨가 후 syringic acid를 처리한 실험군1에서 syringic acid 1 μg를 처리한 fibrin clot 값은 61.31 ± 6.13 %, 2 μg를 처리한 fibrin clot 값은 72.24 ± 7.22 %, 5 μg를 처리한 fibrin clot 값은 77.45 ± 8.52 %로 분석되었다(도 13B). 이는 양성대조군에서 hirudin의 처리는 혈전응축을 68.68% 감소시켰고, 실험군에서 syringic acid 1 μg의 처리는 7.16 % 감소, syringic acid 2 μg의 처리는 33.39 % 감소, syringic acid 5 μg의 처리는 45.88 % 감소, hirudin과 syringic acid 5 μg의 동시처리는 혈전응축을 50.46 % 감소시켰다. Clot retraction assay를 통해, syringic acid가 혈소판 활성에 의해 유도되는 혈전응축반응을 약 7-46 % 억제시키는 혈소판 혈전응축 억제능을 갖고 있으며, 양성대조군으로 처리했던 hirudin의 억제능보다 낮게 분석되었고 syringic acid 고농도에서 비교적 높은 억제효능을 확인하였다.
2-9:
Syringic
acid의
APTT
, PT,
TT를
이용한 항응고 효과 분석
APTT와 PT, TT 실험을 통해 syringic acid가 응고계의 외인성과 내인성 및 공통경로 factor 중 어떤 응고계 factor에 작용하여 항응고 효과를 보이는지 분석하고자 하였다. 결과 분석을 위해 음성대조군(human plasma에 아무것도 처리하지 않은 대조군), 실험군 (human plasma에 다양한 농도의 syringic acid를 처리한 군)으로 실험을 수행하였다. 그 결과를 표 6에 나타냈다.
| APTT (sec) | PT (sec) | TT (sec) | ||
| Control | 31.3 ± 0.2 | 16.8 ± 0.3 | 9.4 ± 0.2 | |
| Aspirin 100 μg | 54.5 ± 0.9* | 29.1 ± 0.3** | 11.5 ± 0.4** | |
| Chlorogenic acid (μg) |
1 | 32.5 ± 0.3** | 16.7 ± 0.2 | 9.5 ± 0.2 |
| 5 | 33.8 ± 0.1** | 18.1 ± 0.2** | 10.7 ± 0.3** | |
| 10 | 35.2 ± 0.3** | 21.9 ± 0.3** | 11.2 ± 0.5** | |
| 20 | 35.9 ± 0.2** | 24.0 ± 0.4** | 13.5 ± 0.3** | |
Syringic acid의 항응고 활성을 분석하기 위해 내인성 응고계 검사인 APTT, 외인성 응고계 검사인 PT, 공통경로 응고계 검사인 TT를 측정한 결과, 먼저 APTT의 결과는 syringic acid 1 μg, 5 μg, 10 μg, 20 μg 순서대로, 1 μg에서 32.5 ± 0.3 sec, 5 μg에서 33.8 ± 0.1 sec, 10 μg에서 35.8 ± 0.1 sec, 20 μg에서 35.9 ± 0.2 sec의 APTT가 측정되었다. 대조군의 정상 APTT 응고시간은 31.3 ± 0.2 sec으로 측정되었다. 이는 syringic acid를 처리한 실험군에서는 1 μg에서 1.04 배, 5 μg에서 1.08 배, 10 μg에서 1.12 배, 20 μg에서 1.15 배의 APTT 지연 효능을 확인하였다(표 5). Aspirin의 APTT 시간은 54.5 ± 0.9 sec로 정상 응고시간에 비해 1.74 배 지연되었다.
PT 결과에서 대조군의 정상응고시간 16.8 ± 0.03 sec와 비교할 때, syringic acid 1 μg에서 16.7 ± 0.2 sec, 5 μg에서 18.1 ± 0.2 sec, 10 μg에서 21.9 ± 0.3 sec, 20 μg에서 24.0 ± 0.4 sec의 PT가 측정되었다. 이는 syringic acid를 처리한 실험군 1 μg에서 0.99 배, 5 μg에서 1.08 배, 10 μg에서 1.30 배, 20 μg에서 1.43 배의 PT 지연 효능을 확인하였다(표 5). Aspirin의 PT 시간은 29.1 ± 0.3 sec로 정상 응고시간에 비해 1.73 배 지연되었다.
TT 결과에서 대조군의 정상응고시간 9.2 ± 0.2 sec와 비교할 때, syringic acid 1 μg에서 9.5 ± 0.2 sec, 5 μg에서 10.7 ± 0.3 sec, 10 μg에서 11.2 ± 0.5 sec, 20 μg에서 13.5 ± 0.3 sec의 TT가 측정되었다. 이는 syringic acid를 처리한 실험군 1 μg에서 1.03 배, 5 μg에서 1.16 배, 10 μg에서 1.22 배, 20 μg에서 1.47 배의 TT 지연 효능을 확인하였다(표 5). Aspirin의 TT 시간은 11.5 ± 0.4 sec로 정상 응고시간에 비해 1.25 배 지연되었다.
APTT와 PT, TT assay를 통해, syringic acid가 human plasma의 응고시간을 내인성, 외인성, 공통 경로 응고계에서 약 4-47 % 지연시켰으며, 공통 경로에서 가장 높은 지연효능을 보였다. Syringic acid는 human plasma에 작용하여 혈액응고 지연을 통해 응고계 조절 및 혈행개선 효과를 기대할 수 있을 것으로 보인다.
2-10: PFA-100을 이용한
syringic
acid의
항혈소판능
분석
Collagen/epinephrine 카트리지막에 혈액과 다양한 농도의 syringic acid를 전처리하여 혈액에 미치는 collagen/epinephrine의 자극 및 혈소판 응집에 어떤 영향을 미치는지 분석하였다. 결과 분석을 위해 음성대조군 (whole blood에 아무것도 처리하지 않은 대조군), 실험군 (whole blood에 다양한 농도의 syringic acid를 처리한 군)으로 실험을 수행하였다. 그 결과를 표 7에 나타냈다.
| Closure time (sec) | ||
| Control | 122.1 ± 3.3 | |
| Aspirin 100 μg | 159.2 ± 5.5* | |
| Syringic acid (μg) |
1 | 122.8 ± 5.9 |
| 5 | 127.1 ± 6.5 | |
| 10 | 131.3 ± 7.3 | |
| 20 | 148.9 ± 6.2* | |
Syringic acid의 항혈소판 활성을 분석하기 위해 closure time (CT)를 측정한 결과, syringic acid 1 μg에서 122.8 ± 5.9 sec, 5 μg에서 127.1 ± 6.5 sec, 10 μg에서 131.3 ± 7.3 sec, 20 μg에서 148.9 ± 6.2 sec의 CT가 측정되었다(표 6). 대조군의 정상 CT 응고시간은 121.1 ± 3.3 sec으로 측정되었다. 이는 syringic acid를 처리한 실험군에서는 1 μg에서 0.6 %, 5 μg에서 4.1 %, 10 μg에서 7.5 %, 20 μg에서 21.9 %의 CT 지연 효능을 확인하였다. Aspirin의 CT는 159.2 ± 5.5 sec로 측정되었고 정상시간에 비해 30.4 % 지연되었다.
이러한 결과는 syringic acid가 human plasma에 작용하여 혈액응고 지연을 통해 응고계 조절 및 혈행개선 효과를 기대할 수 있을 것으로 보인다.
2-11: Thrombin으로 유도한 혈소판 활성화에 대한
in vitro
억제능
기전 분석
시료가 혈소판 활성화에 관여하는 기전에 어떤 영향을 미치는지 분석하기 위해, saline만 처리한 일반대조군, 혈소판 활성화 유도체인 thrombin을 처리 후 saline을 처리한 음성대조군, 시료만 처리한 일반대조군, 혈소판 활성화 유도체인 thrombin을 처리 후 시료를 처리한 실험군1, 혈소판 활성화 유도체인 thrombin을 처리 후 시료를 처리한 실험군2로 실험을 수행하였다.
Syringic acid를 전처리한 혈소판에 thrombin으로 혈소판 자극 및 활성화시켰다. 자극 후 혈소판 추출액을 제조하여 western blot으로 pERK, pP38, pJNK, pAKT, pPI3K, pAMPKα1/2의 인산화 정도를 분석하고 PAR-1, DEP-1, PTP1B, fibrinogen, αIIbβ3의 발현 정도를 분석하였다. Beta-actin은 loading control로 사용하였다. 도 14는 시린지산의 in vitro PAR1/DEP-1/PTP1B 시그널링 패스웨이를 억제를 나타내는 결과도이고, 도 15는 시린지산의 in vitro αIIbβ3/FIB 시그널링 패스웨이를 억제를 나타내는 결과도이며, 도 16 및 17은 시린지산의 in vitro 키나아제 시그널링 패스웨이를 억제를 나타내는 결과도이다.
Thrombin은 thrombin 수용체인 protease activated receptor-1 (PAR1)과 protein tyrosine phosphatase (PTP) 유사 수용체인 DEP-1/CD148, protein tyrosine phosphatase 1B 수용체를 통해 혈소판을 활성화시켰으며, saline만 처리한 일반대조군과 혈소판 활성화 유도체인 thrombin을 처리 후 saline을 처리한 음성대조군을 비교한 결과, PAR1 수용체의 발현은 thrombin의 자극에 의해 97.82 % 증가하였고 DEP-1 수용체의 발현은 3.77 %, PTP1B 수용체의 발현은 128.19 % 증가하였다(도 14).
또한, syringic acid만 처리한 일반대조군에서 PAR1 수용체의 발현은 syringic acid만 처리에 의해 12.27 % 증가하였고 DEP-1 수용체는 43.52 % 감소, PTP1B 수용체는 25.43 % 감소하였다. Syringic acid의 두 농도로 전처리한 혈소판에 thrombin 자극을 준 실험군1,2에서 PAR1 수용체의 발현은 5 μg 농도에서 -23.31 %, 10 μg 농도에서 132.27% 감소하였고 DEP-1 수용체는 5 μg 농도에서 19.44 %, 10 μg 농도에서 14.27% 감소하였으며, PTP1B 수용체는 5 μg 농도에서 68.15 %, 10 μg 농도에서 76.77% 감소하였다.
Saline만 처리한 일반대조군과 혈소판 활성화 유도체인 thrombin을 처리 후 saline을 처리한 음성대조군을 비교한 결과, αIIbβ3 수용체의 발현은 thrombin의 자극에 의해 112.77 % 증가하였고 이 수용체의 리간드인 fibrinogen (FIB)의 발현은 20.36% 증가하였다(도 15).
또한, syringic acid 만 처리한 일반대조군에서 αIIbβ3 수용체의 발현은 syringic acid만 처리에 의해 8.26% 감소하였고 리간드인 fibrinogen은 64.62 % 감소하였다. Syringic acid의 두 농도로 전처리한 혈소판에 thrombin 자극을 준 실험군1,2에서 αIIbβ3 수용체의 발현은 5 μg 농도에서 39.38%, 10 μg 농도에서 59.38% 감소하였고 리간드인 fibrinogen은 5 μg 농도에서 57.21%, 10 μg 농도에서 68.15% 감소하였다.
ERK의 인산화 정도는 thrombin의 자극에 의해 4.38 % 증가하였고 JNK의 인산화 정도는 73.69% 증가하였으며, P38의 인산화 정도는 -16.32% 증가하였다(도 16).
또한, syringic acid만 처리한 일반대조군에서 ERK의 인산화 정도는 syringic acid만 처리에 의해 85.15% 감소하였고 JNK의 인산화 정도는 23.29 % 감소하였으며 P38의 인산화 정도는 42.15% 증가하였다. Syringic acid의 두 농도로 전처리한 혈소판에 thrombin 자극을 준 실험군1,2에서 ERK의 인산화 정도는 5 μg 농도에서 73.08%, 10 μg 농도에서 98.54% 감소하였고 JNK의 인산화 정도는 5 μg 농도에서 86.15%, 10 μg 농도에서 80.28% 감소하였으며, P38의 인산화 정도는 5 μg 농도에서 8.63 %, 10 μg 농도에서 60.42% 감소하였다.
AKT의 인산화 정도는 thrombin의 자극에 의해 83.85% 증가하였고 PI3K의 인산화 정도는 -14.21% 증가하였으며, AMPKα1/2의 인산화 정도는 86.84% 증가하였다(도 17).
또한, syringic acid만 처리한 일반대조군에서 AKT의 인산화 정도는 syringic acid만 처리에 의해 14.87 % 증가하였고 PI3K의 인산화 정도는 35.80 % 감소하였으며 AMPKα1/2의 인산화 정도는 2.72 % 증가하였다. Syringic acid의 두 농도로 전처리한 혈소판에 thrombin 자극을 준 실험군1,2에서 AKT의 인산화 정도는 5 μg 농도에서 57.41 %, 10 μg 농도에서 97.66 % 감소하였고 PI3K의 인산화 정도는 5 μg 농도에서 -5.71 %, 10 μg 농도에서 40.99 % 감소하였으며, AMPKα1/2의 인산화 정도는 5 μg 농도에서 35.43 %, 10 μg 농도에서 3.31 % 감소하였다.
2-12: Thrombin 억제제인
hirudin을
활용한
in vitro
억제능
기전 분석
시료가 혈소판 활성화에 관여하는 기전에 어떤 영향을 미치는지 분석하기 위해, 위 실험과 동일한 일반대조군, 음성대조군, 실험군1, 실험군2로 실험을 수행하였으며 thrombin 억제제인 hirudin을 활용하여 시료가 갖는 억제능을 비교 분석하였다.
Syringic acid, hirudin 및 Syringic acid + hirudin을 전처리한 혈소판에 thrombin으로 혈소판 자극 및 활성화시켰다. 자극 후 혈소판 추출액을 제조하여 western blot으로 pERK, pP38, pJNK, pAKT, pPI3K, pAMPKα1/2의 인산화 정도를 분석하고 PAR-1, DEP-1, PTP1B, fibrinogen, αIIbβ3의 발현 정도를 분석하였다. Beta-actin은 loading control로 사용하였다.
도 18은 트롬빈 억제제 존재하에서 시린지산의 in vitro PAR1/DEP-1/PTP1B 시그널링 패스웨이를 억제를 나타내는 결과도이고, 도 19는 트롬빈 억제제 존재하에서 시린지산의 in vitro αIIbβ3/FIB 시그널링 패스웨이를 억제를 나타내는 결과도이며, 도 20 및 21은 트롬빈 억제제 존재하에서 시린지산의 in vitro 키나아제 시그널링 패스웨이를 억제를 나타내는 결과도이다.
Thrombin은 thrombin 수용체인 protease activated receptor-1 (PAR1)과 protein tyrosine phosphatase (PTP) 유사 수용체인 DEP-1/CD148, protein tyrosine phosphatase 1B 수용체를 통해 혈소판을 활성화시켰으며, saline만 처리한 일반대조군과 혈소판 활성화 유도체인 thrombin을 처리 후 saline을 처리한 음성대조군을 비교한 결과, PAR1 수용체의 발현은 thrombin의 자극에 의해 55.81 % 증가하였고 DEP-1 수용체의 발현은 -1.92 %, PTP1B 수용체의 발현은 41.74 % 증가하였다(도 18).
또한, thrombin 억제제인 hirudin만 처리한 일반대조군에서 PAR1 수용체의 발현은 hirudin 처리에 의해 31.60 % 감소하였고 DEP-1 수용체는 61.27 % 감소, PTP1B 수용체는 23.94 % 감소하였다. hirudin으로 전처리한 혈소판에 thrombin 자극을 준 실험군1, hirudin + syringic acid로 전처리한 혈소판에 thrombin 자극을 준 실험군2에서 PAR1 수용체의 발현은 hirudin 전처리에서 101.37 %, hirudin + syringic acid 전처리에서 40.56 % 감소하였고 DEP-1 수용체는 hirudin 전처리에서 25.70 %, hirudin + syringic acid 전처리에서 32.11 % 감소하였으며, PTP1B 수용체는 hirudin 전처리에서 41.02 %, hirudin + syringic acid 전처리에서 19.06 % 감소하였다.
Saline만 처리한 일반대조군과 혈소판 활성화 유도체인 thrombin을 처리 후 saline을 처리한 음성대조군을 비교한 결과, αIIbβ3 수용체의 발현은 thrombin의 자극에 의해 17.31 % 증가하였고 이 수용체의 리간드인 fibrinogen (FIB)의 발현은 135.99% 증가하였다(도 19).
또한, thrombin 억제제인 hirudin만 처리한 일반대조군에서 αIIbβ3 수용체의 발현은 hirudin 처리에 의해 41.53 % 감소하였고 리간드인 fibrinogen은 98.68 % 감소하였다. Hirudin을 전처리한 혈소판에 thrombin 자극을 준 실험군1, hirudin + syringic acid를 전처리한 혈소판에 자극을 준 실험군2에서 αIIbβ3 수용체의 발현은 hirudin 전처리에서 62.08%, hirudin + syringic acid 전처리에서 75.08% 감소하였고 리간드인 fibrinogen은 hirudin 전처리에서 17.94 %, hirudin + syringic acid 전처리에서 170.79 % 감소하였다.
ERK의 인산화 정도는 thrombin의 자극에 의해 45.47 % 증가하였고 JNK의 인산화 정도는 36.20% 증가하였으며, P38의 인산화 정도는 -14.65% 증가하였다 (도 20).
또한, thrombin 억제제인 hirudin만 처리한 일반대조군에서 ERK의 인산화 정도는 hirudin 처리에 의해 15.38 % 감소하였고 JNK의 인산화 정도는 -12.77 % 감소하였으며 P38의 인산화 정도는 3.19 % 감소하였다. Hirudin을 전처리한 혈소판에 thrombin 자극을 준 실험군1, hirudin + syringic acid를 전처리한 혈소판에 자극을 준 실험군2에서 ERK의 인산화 정도는 hirudin 전처리에서 -16.88 %, hirudin + syringic acid 전처리에서 16.96 % 감소하였고 JNK의 인산화 정도는 hirudin 전처리에서 64.44 %, hirudin + syringic acid 전처리에서 84.56 % 감소하였으며, P38의 인산화 정도는 hirudin 전처리에서 -5.18 %, hirudin + syringic acid 전처리에서 33.16 % 감소하였다.
AKT의 인산화 정도는 thrombin의 자극에 의해 13.62 % 증가하였고 PI3K의 인산화 정도는 42.32 % 증가하였으며, AMPKα1/2의 인산화 정도는 43.00% 증가하였다(도 21). 또한, thrombin 억제제인 hirudin만 처리한 일반대조군에서 AKT의 인산화 정도는 hirudin 처리에 의해 36.90 % 감소하였고 PI3K의 인산화 정도는 19.52 % 감소하였으며 AMPKα1/2의 인산화 정도는 31.99 % 증가하였다. Hirudin을 전처리한 혈소판에 thrombin 자극을 준 실험군1, hirudin + syringic acid를 전처리한 혈소판에 자극을 준 실험군2에서 AKT의 인산화 정도는 hirudin 전처리에서 4.17 %, hirudin + syringic acid 전처리에서 96.72 % 감소하였고 PI3K의 인산화 정도는 hirudin 전처리에서 -7.85 %, hirudin + syringic acid 전처리에서 51.01 % 감소하였으며, AMPKα1/2의 인산화 정도는 hirudin 전처리에서 104.48%, hirudin + syringic acid 전처리에서 50.02% 감소하였다.
2-13: Collagen과 epinephrine으로 유도한 혈소판 활성화에 대한
in vitro
억제능 기전 분석
시료가 혈소판 활성화에 관여하는 기전에 어떤 영향을 미치는지 분석하기 위해, saline만 처리한 일반대조군, 혈소판 활성화 유도체인 collagen + epinephrine을 처리 후 saline을 처리한 음성대조군, 시료만 처리한 일반대조군, 혈소판 활성화 유도체인 collagen + epinephrine을 처리 후 시료를 처리한 실험군1, 혈소판 활성화 유도체인 collagen + epinephrine을 처리 후 시료를 처리한 실험군2로 실험을 수행하였다.
Syringic acid를 전처리한 혈소판에 collagen + epinephrine으로 혈소판 자극 및 활성화시켰다. 자극 후 혈소판 추출액을 제조하여 western blot으로 pERK, pP38, pJNK, pAKT, pPI3K, pAMPKα1/2의 인산화 정도를 분석하고 DEP-1, PTP1B, fibrinogen, αIIbβ3의 발현 정도를 분석하였다. Beta-actin은 loading control로 사용하였다.
도 22는 시린지산의 in vitro DEP-1/PTP1B 시그널링 패스웨이를 억제를 나타내는 결과도이고, 도 23은 시린지산의 in vitro αIIbβ3/FIB 시그널링 패스웨이를 억제를 나타내는 결과도이며, 도 24 및 25는 시린지산의 in vitro 키나아제 시그널링 패스웨이를 억제를 나타내는 결과도이다.
Collagen + epinephrine은 protein tyrosine phosphatase (PTP) 유사 수용체인 DEP-1/CD148, protein tyrosine phosphatase 1B 수용체를 통해 혈소판을 활성화시켰으며, saline만 처리한 일반대조군과 혈소판 활성화 유도체인 collagen + epinephrine을 처리 후 saline을 처리한 음성대조군을 비교한 결과, DEP-1 수용체의 발현은 collagen + epinephrine의 자극에 의해 87.66 %, PTP1B 수용체의 발현은 39.81% 증가하였다(도 22). 또한, syringic acid만 처리한 일반대조군에서 DEP-1 수용체의 발현은 syringic acid만 처리에 의해 13.85 % 감소하였고 PTP1B 수용체는 5.58 % 감소하였다. Syringic acid의 두 농도로 전처리한 혈소판에 collagen + epinephrine 자극을 준 실험군1,2에서 DEP-1 수용체는 5 μg 농도에서 -18.94 %, 10 μg 농도에서 -24.45 % 감소하였으며, PTP1B 수용체는 5 μg 농도에서 28.70 %, 10 μg 농도에서 46.86% 감소하였다.
Saline만 처리한 일반대조군과 혈소판 활성화 유도체인 collagen + epinephrine을 처리 후 saline을 처리한 음성대조군을 비교한 결과, αIIbβ3 수용체의 발현은 collagen + epinephrine의 자극에 의해 17.44 % 증가하였고 이 수용체의 리간드인 fibrinogen (FIB)의 발현은 14.73 % 증가하였다(도 23).
또한, syringic acid만 처리한 일반대조군에서 αIIbβ3 수용체의 발현은 syringic acid만 처리에 의해 16.06 % 감소하였고 리간드인 fibrinogen은 -3.80 % 감소하였다. Syringic acid의 두 농도로 전처리한 혈소판에 collagen + epinephrine자극을 준 실험군1,2에서 αIIbβ3 수용체의 발현은 5 μg 농도에서 20.86 %, 10 μg 농도에서 34.40 % 감소하였고 리간드인 fibrinogen은 5 μg 농도에서 33.45 %, 10 μg 농도에서 47.09 % 감소하였다.
ERK의 인산화 정도는 collagen + epinephrine의 자극에 의해 165.63 % 증가하였고 JNK의 인산화 정도는 5.83 % 증가하였으며, P38의 인산화 정도는 12.65 % 증가하였다(도 24).
또한, syringic acid만 처리한 일반대조군에서 ERK의 인산화 정도는 syringic acid만 처리에 의해 12.62 % 감소하였고 JNK의 인산화 정도는 12.82 % 감소하였으며 P38의 인산화 정도는 0.92 % 감소하였다. Syringic acid의 두 농도로 전처리한 혈소판에 collagen + epinephrine 자극을 준 실험군 1,2에서 ERK의 인산화 정도는 5 μg 농도에서 97.72 %, 10 μg 농도에서 97.41% 감소하였고 JNK의 인산화 정도는 5 μg 농도에서 -6.71 %, 10 μg 농도에서 5.42% 감소하였으며, P38의 인산화 정도는 5 μg 농도에서 28.09 %, 10 μg 농도에서 55.89% 감소하였다.
AKT의 인산화 정도는 collagen + epinephrine의 자극에 의해 28.53 % 증가하였고 PI3K의 인산화 정도는 -20.66 % 증가하였으며, AMPKα1/2의 인산화 정도는 37.31 % 증가하였다(도 25).
또한, syringic acid만 처리한 일반대조군에서 AKT의 인산화 정도는 syringic acid만 처리에 의해 17.73 % 감소하였고 PI3K의 인산화 정도는 53.34 % 감소하였으며 AMPKα1/2의 인산화 정도는 13.00 % 감소하였다. Syringic acid의 두 농도로 전처리한 혈소판에 collagen + epinephrine 자극을 준 실험군1,2에서 AKT의 인산화 정도는 5 μg 농도에서 54.07 %, 10 μg 농도에서 81.39 % 감소하였고 PI3K의 인산화 정도는 5 μg 농도에서 -13.91 %, 10 μg 농도에서 4.98 % 감소하였으며, AMPKα1/2의 인산화 정도는 5 μg 농도에서 62.84 %, 10 μg 농도에서 79.70 % 감소하였다.
2-14: Collagen과 epinephrine으로 유도한 혈소판 활성화에 대한
in
vivo
억제능
기전 분석
시료가 생체 내 혈소판 활성화에 관여하는 기전에 어떤 영향을 미치는지 분석하기 위해, 위 실험과 동일한 일반대조군, 실험군1, 실험군2로 실험을 수행하였고 aspirin을 이용한 양성대조군을 추가하여 비교 분석하였다.
Syringic acid를 전처리한 혈소판에 collagen + epinephrine으로 혈소판 자극 및 활성화시켰다. 자극 후 혈소판 추출액을 제조하여 western blot으로 pERK, pP38, pJNK, pAKT, pPI3K, pAMPKα1/2의 인산화 정도를 분석하고 DEP-1, PTP1B, fibrinogen, αIIbβ3의 발현 정도를 분석하였다. Beta-actin은 loading control로 사용하였다.
도 26은 시린지산의 in vivo DEP-1/PTP1B 시그널링 패스웨이를 타겟팅함으로써 혈소판 활성화의 감쇠를 나타내는 결과도이고, 도 27은 시린지산의 in vivo αIIbβ3/FIB 시그널링 패스웨이를 타겟팅함으로써 혈소판 활성화의 감쇠를 나타내는 결과도이며, 도 28 및 29는 시린지산의 in vivo 키나아제 시그널링 패스웨이를 타겟팅함으로써 혈소판 활성화의 감쇠를 나타내는 결과도이고, 도 30은 시리지산 매개 클롯팅 및 혈전 형성을 나타내는 결과도이다.
Collagen + epinephrine은 protein tyrosine phosphatase (PTP) 유사 수용체인 DEP-1/CD148, protein tyrosine phosphatase 1B 수용체를 통해 혈소판을 활성화시켰으며, saline만 처리한 일반대조군과 혈소판 활성화 유도체인 collagen + epinephrine을 처리 후 saline을 처리한 음성대조군을 비교한 결과, DEP-1 수용체의 발현은 collagen + epinephrine의 자극에 의해 59.76 %, PTP1B 수용체의 발현은 944.46 % 증가하였다(도 26).
또한, aspirin을 전처리한 혈소판에 collagen + epinephrine 자극을 준 양성대조군에서 DEP-1 수용체의 발현은 10.78 % 감소하였고 PTP1B 수용체는 0 % 감소하였다. Syringic acid의 두 농도로 전처리한 혈소판에 collagen + epinephrine 자극을 준 실험군1,2에서 DEP-1 수용체는 5 μg 농도에서 -72.26 %, 10 μg 농도에서 92.70 % 감소하였으며, PTP1B 수용체는 5 μg 농도에서 841.71 %, 10 μg 농도에서 851.20 % 감소하였다.
Saline만 처리한 일반대조군과 혈소판 활성화 유도체인 collagen + epinephrine을 처리 후 saline을 처리한 음성대조군을 비교한 결과, αIIbβ3 수용체의 발현은 collagen + epinephrine의 자극에 의해 37.11 % 증가하였고 이 수용체의 리간드인 fibrinogen (FIB)의 발현은 95.62 % 증가하였다(도 27). 또한, aspirin을 전처리한 혈소판에 collagen + epinephrine 자극을 준 양성대조군에서 αIIbβ3 수용체의 발현은 16.38 % 감소하였고 리간드인 fibrinogen은 42.15 % 감소하였다. Syringic acid의 두 농도로 전처리한 혈소판에 collagen + epinephrine자극을 준 실험군1,2에서 αIIbβ3 수용체의 발현은 5 μg 농도에서 43.27 %, 10 μg 농도에서 80.06 % 감소하였고 리간드인 fibrinogen은 5 μg 농도에서 47.60 %, 10 μg 농도에서 78.20 % 감소하였다.
ERK의 인산화 정도는 collagen + epinephrine의 자극에 의해 441.83 % 증가하였고 JNK의 인산화 정도는 400.20 % 증가하였으며, P38의 인산화 정도는 430.68 % 증가하였다(도 28).
또한, aspirin을 전처리한 혈소판에 collagen + epinephrine 자극을 준 양성대조군에서 ERK의 인산화 정도는 297.53 % 감소하였고 JNK의 인산화 정도는 264.57 % 감소하였으며 P38의 인산화 정도는 288.08 % 감소하였다. Syringic acid의 두 농도로 전처리한 혈소판에 collagen + epinephrine 자극을 준 실험군1,2에서 ERK의 인산화 정도는 5 μg 농도에서 169.51 %, 10 μg 농도에서 187.82 % 감소하였고 JNK의 인산화 정도는 5 μg 농도에서 63.13 %, 10 μg 농도에서 255.02 % 감소하였으며, P38의 인산화 정도는 5 μg 농도에서 140.62 %, 10 μg 농도에서 52.34 % 감소하였다.
AKT의 인산화 정도는 collagen + epinephrine의 자극에 의해 415.92 % 증가하였고 PI3K의 인산화 정도는 666.43 % 증가하였으며, AMPKα1/2의 인산화 정도는 223.18 % 증가하였다(도 29).
또한, aspirin을 전처리한 혈소판에 collagen + epinephrine 자극을 준 양성대조군에서 AKT의 인산화 정도는 206.57% 감소하였고 PI3K의 인산화 정도는 459.23% 감소하였으며 AMPKα1/2의 인산화 정도는 84.44 % 감소하였다. Syringic acid의 두 농도로 전처리한 혈소판에 collagen + epinephrine 자극을 준 실험군1,2에서 AKT의 인산화 정도는 5 μg 농도에서 178.34 %, 10 μg 농도에서 372.27 % 감소하였고 PI3K의 인산화 정도는 5 μg 농도에서 170.19 %, 10 μg 농도에서 279.58 % 감소하였으며, AMPKα1/2의 인산화 정도는 5 μg 농도에서 207.73 %, 10 μg 농도에서 243.05 % 감소하였다.
Thrombin 및 collagen + epinephrine으로 유도한 혈소판 활성화에 대해 syringic acid의 in vitro와 in vivo 억제능 기전은 다음의 그림으로 종합하여 기전 요약도 결과를 도출하였다(도 30).
2-15: Mouse pulmonary
thromboembolism
-induced model을 이용한
항혈전색전
증 활성 분석
위에서 수행한 Collagen과 epinephrine을 이용한 in vivo 억제능 기전 분석과 같이 수행된 실험이며 실험동물의 다리운동 장애 및 치사 여부를 생존율로 결과를 도출하여 항혈전색전증 활성을 분석하였다. 위 기전분석 실험과 동일한 음성대조군, 양성대조군, 실험군1, 실험군2로 실험을 수행하였다.
| Experimental group | Aspirin 20 mg/kg |
Syringic acid (mg/kg) |
|
| 5 | 10 | ||
| Protection (%) |
60 | 20 | 30 |
| No. paralyzed or dead / No. tested | 4/10 | 8/10 | 7/10 |
Syringic acid의 collagen+epinephrine-induced acute thromboembolism model에서 폐혈전색전증 보호 효과를 분석한 결과, 양성대조군인 aspirin 20 mg/kg에서 60 %, 실험군 syringic acid 5 mg/kg에서 20 %, 10 mg/kg에서 30%(표 7)로 분석되었다. 두 농도에서 20 % 이상의 보호 효과를 보였지만 양성대조군인 aspirin의 보호효과에 미치지 못하였다.
2-16:
FeCl
3
-induced arterial thrombosis model 제작 및
항혈전
효과 분석
결과 분석을 위해 대조군(염화철을 처리하지 않은 일반 model), 음성대조군(Thrombosis model에 saline을 처리한 대조군), 양성대조군(실험군과 동일한 조건에서 t-PA를 처리한 대조군), 실험군(Thrombosis model에 다양한 농도의 시료를 처리한 군)으로 실험을 수행하였다. 그 결과를 도 31에 나타냈다. 도 31은 쥐에서 동맥 혈전의 전개 억제에 관한 시린지산의 영향을 나타내는 결과도이다.
FeCl3-induced arterial thrombosis model에서 syringic acid의 혈전증 보호효과를 분석한 결과, 먼저 염화철을 이용하여 경동맥 내 혈전을 유도시킨 후 saline을 처리한 음성대조군을 통해 경동맥 혈관 내 혈전이 강하게 유도된 것을 확인하였다(도 31A). 또한, 양성대조군을 통해 현재 혈전증 치료에 이용하고 있는 t-PA의 혈전형성 억제 효과를 확인하였다. Syringic acid의 경동맥 내 혈전생성 억제효능은 각각 5 mg/kg 농도에서 4.66 %, 10 mg/kg 농도에서 19.35 %의 혈전생성 억제효능을 보였다(도 31B). 5000 U/kg 농도로 처리한 t-PA 양성대조군에서는 39.49 %의 혈전생성 억제효능이 확인되었다.
시험예
3:
꾸지뽕
열매 추출물로부터 분리된
ferulic
acid의
항혈전
,
항혈소
판, 항응고 효능 및 관련
기작
분석
3-1:
Ferulic
acid가 혈소판 수에 미치는 영향
꾸지뽕 열매 추출물로부터 분리된 ferulic acid가 혈소판 수에 미치는 영향을 분석하기 위해, 혈액으로부터 분릴된 PRP를 이용하였으며 분리된 PRP를 1:20의 비율로 희석하고, 현미경에서 혈소판을 다양한 농도의 시료로 10분간 전처리 후 혈소판 수를 측정 및 분석하였다. 비교분석을 위해, 시료를 처리하지 않은 일반대조군, 다양한 농도의 시료를 처리한 실험군으로 실험을 수행하였다. 그 결과를 도 32에 나타냈다. 도 32는 페룰릭산의 헤모사이토메터 계수에 의한 혈소판의 영향을 나타내는 도면이다.
그 결과, 시료를 처리하지 않은 일반대조군의 혈소판 수를 100 %로 하여 비교하였고 300 μg/mL 농도 이하에서는 유의미한 결과가 나타나지 않았으며, 500 μg/mL 농도에서 약 15 %의 감소를 보였다(도 32). 따라서, ferulic acid 300 μg/mL 농도까지는 혈소판 수에 영향을 주지 않는다는 것을 확인하였다.
3-2: PFA-100을 이용한
ferulic
acid의
항혈소판능
분석
Collagen/epinephrine 카트리지막에 혈액과 다양한 농도의 ferulic acid를 전처리하여 혈액에 미치는 collagen/epinephrine의 자극 및 혈소판 응집에 어떤 영향을 미치는지 분석하였다. 결과 분석을 위해 음성대조군(whole blood에 아무것도 처리하지 않은 대조군), 실험군(whole blood에 다양한 농도의 ferulic acid를 처리한 군)으로 실험을 수행하였다.
| Closure time (sec) | ||
| Control | 126.2 ±5.7 | |
| Aspirin 100 μg | 148.8 ±7.1* | |
| Ferulic acid (μg) |
1 | 125.9 ±3.2a |
| 2 | 126.8 ±5.3a | |
| 5 | 134.1 ±8.9 | |
| 10 | 154.4 ±9.5** | |
Ferulic acid의 항혈소판 활성을 분석하기 위해 closure time (CT)를 측정한 결과, ferulic acid 1 μg에서 125.9 ± 3.2 sec, 2 μg에서 126.8 ± 5.3 sec, 5 μg에서 134.1 ± 8.9 sec, 10 μg에서 154.4 ± 9.5 sec의 CT가 측정되었다(표 8). 대조군의 정상 CT 응고시간은 126.2 ± 5.7 sec으로 측정되었다. 이는 ferulic acid를 처리한 실험군에서는 1 μg에서 -0.2 %, 2 μg에서 0.5 %, 5 μg에서 6.3 %, 10 μg에서 22.3 %의 CT 지연 효능을 확인하였다. Aspirin의 CT는 148.8 ± 7.1 sec로 측정되었고 정상 시간에 비해 17.9 % 지연되었다. 이러한 결과는 ferulic acid가 human plasma에 작용하여 혈액응고 지연을 통해 응고계 조절 및 혈행개선 효과를 기대할 수 있을 것으로 보인다.
3-3 :
Ferulic
acid의
APTT
, PT,
TT를
이용한 항응고 효과 분석
APTT와 PT, TT 실험을 통해 ferulic acid가 응고계의 외인성과 내인성 및 공통경로 factor 중 어떤 응고계 factor에 작용하여 항응고 효과를 보이는지 분석하고자 하였다. 결과 분석을 위해 음성대조군 (human plasma에 아무것도 처리하지 않은 대조군), 실험군 (human plasma에 다양한 농도의 ferulic acid를 처리한 군)으로 실험을 수행하였다.
| APTT (sec) | PT (sec) | TT (sec) | ||
| Control | 24.5 ±1.7 | 12.2 ±0.9 | 9.1 ±0.4 | |
| Aspirin 100 μg | 29.3 ±2.8 | 15.5 ±1.8* | 12.6 ±1.1** | |
| Ferulic acid (μg) |
1 | 24.6 ±0.7 | 12.8 ±0.5 | 9.5 ±0.2a |
| 2 | 25.0 ±0.4 | 13.1 ±0.7 | 9.8 ±0.3a | |
| 5 | 27.9 ±1.2 | 13.6 ±0.4 | 10.3 ±0.5a | |
| 10 | 38.8 ±2.5*a | 15.9 ±1.0** | 11.6 ±0.8** | |
Ferulic acid의 항응고 활성을 분석하기 위해 내인성 응고계 검사인 APTT, 외인성 응고계 검사인 PT, 공통경로 응고계 검사인 TT를 측정한 결과, 먼저 APTT의 결과는 ferulic acid 1 μg, 2 μg, 5 μg, 10 μg 순서대로, 1 μg에서 24.6 ± 0.7 sec, 2 μg에서 25.0 ± 0.4 sec, 5 μg에서 27.9 ± 1.2 sec, 10 μg에서 38.8 ± 2.5 sec의 APTT가 측정되었다. 대조군의 정상 APTT 응고시간은 24.5 ± 1.7 sec으로 측정되었다. 이는 ferulic acid를 처리한 실험군에서는 1 μg에서 1.004 배, 2 μg에서 1.020 배, 5 μg에서 1.139 배, 10 μg에서 1.584 배의 APTT 지연 효능을 확인하였다(표 10). Aspirin의 APTT 시간은 29.3 ± 2.8 sec로 정상 응고시간에 비해 1.20 배 지연되었다.
PT 결과에서 대조군의 정상응고시간 12.2 ± 0.9 sec와 비교할 때, ferulic acid 1 μg에서 12.8 ± 0.5 sec, 2 μg에서 13.1 ± 0.7 sec, 5 μg에서 13.6 ± 0.4 sec, 10 μg에서 15.9 ± 1.0 sec의 PT가 측정되었다. 이는 ferulic acid를 처리한 실험군 1 μg에서 1.050 배, 2 μg에서 1.074 배, 5 μg에서 1.115 배, 10 μg에서 1.303 배의 PT 지연 효능을 확인하였다(표 10). Aspirin의 PT 시간은 15.5 ± 1.8 sec로 정상 응고시간에 비해 1.270 배 지연되었다.
TT 결과에서 대조군의 정상응고시간 9.1 ± 0.4 sec와 비교할 때, ferulic acid 1 μg에서 9.5 ± 0.2 sec, 2 μg에서 9.8 ± 0.3 sec, 5 μg에서 10.3 ± 0.5 sec, 10 μg에서 11.6 ± 0.8 sec의 TT가 측정되었다. 이는 ferulic acid를 처리한 실험군 1 μg에서 1.044 배, 2 μg에서 1.077 배, 5 μg에서 1.132 배, 10 μg에서 1.275 배의 TT 지연 효능을 확인하였다(표 8). Aspirin의 TT 시간은 12.6 ± 1.1 sec로 정상 응고시간에 비해 1.385 배 지연되었다.
APTT와 PT, TT assay를 통해, ferulic acid가 human plasma의 응고시간을 내인성, 외인성, 공통 경로 응고계에서 약 0.4-58.4 % 지연시켰으며, 내인성 경로에서 가장 높은 지연효능을 보였다. Ferulic acid는 human plasma에 작용하여 혈액응고 지연을 통해 응고계 조절 및 혈행개선 효과를 기대할 수 있을 것으로 보인다.
3-4: Clot retraction assay
Ferulic acid의 혈전응축능에 미치는 영향을 분석하기 위해, rodent blood로부터 혈소판 분리 후 다양한 농도의 ferulic acid와 fibrinogen, CaCl2, thrombin을 60분 동안 처리 후 clot density를 ImageJ 1.46b image analysis software로 분석하였다. 결과 분석을 위해 음성대조군1 (fibrinogen + thrombin에 혈소판을 첨가하지 않은 대조군), 음성대조군2 (fibrinogen + thrombin에 혈소판을 첨가한 대조군), 양성대조군 (fibrinogen + thrombin에 혈소판을 첨가 후 aspirin을 처리한 대조군), 실험군 (fibrinogen + thrombin에 혈소판을 첨가 후 ferulic acid를 처리한 실험군)으로 실험을 수행하였다. 도 33은 클롯 응축에 관한 페룰릭산의 영향을 나타내는 도면이다.
Fibrinogen + thrombin에 혈소판을 첨가하지 않은 음성대조군1 (Con1)에서 fibrin clot이 강하게 형성되었고 응축이 일어나지 않았음을 확인하였다. 음성대조군2에서는 fibrinogen + thrombin에 혈소판을 첨가하여 혈전응축이 유도되어 시험관 튜브 상단에 응축된 fibrin clot을 확인하였다(도 33). 음성대조군1에서 형성된 fibrin clot을 밀도값을 100 %로 하여 대조군과 실험군의 밀도값을 도출한 결과, fibrinogen + thrombin에 혈소판을 첨가한 음성대조군2의 fibrin clot 값은 47.61 ± 4.15 %, fibrinogen + thrombin에 혈소판을 첨가 후 ferulic acid를 처리한 실험군에서 ferulic acid 1 μg를 처리한 fibrin clot 값은 34.53 ± 4.09 %, 2 μg를 처리한 fibrin clot 값은 50.81 ± 3.28 %, 5 μg를 처리한 fibrin clot 값은 56.02 ± 4.58 %, 10 μg를 처리한 fibrin clot 값은 65.52 ± 5.27 %로 분석되었고 양성대조군에서 aspirin은 84.71 %로 분석되었다(도 33). 이는 양성대조군에서 aspirin의 처리는 혈전응축을 70.81 % 감소시켰고, 실험군에서 ferulic acid 1 μg의 처리는 0% 감소, ferulic acid 2 μg의 처리는 6.11% 감소, ferulic acid 5 μg의 처리는 16.05%, ferulic acid 10 μg의 처리는 34.19% 감소시켰다. Clot retraction assay를 통해, ferulic acid가 혈소판 활성에 의해 유도되는 혈전응축반응을 약 6-34 % 억제시키는 혈소판 혈전응축 억제능을 갖고 있으며, 양성대조군으로 처리했던 aspirin의 억제능보다 낮게 분석되었고 ferulic acid 고농도에서 비교적 높은 억제효능을 확인하였다.
3-5: ATP release assay
결과 분석을 위해 음성대조군1 (혈소판에 vehicle만 처리한 대조군), 음성대조군2 (혈소판에 thrombin만 처리한 대조군), 양성대조군 (혈소판에 thrombin 처리 전 aspirin을 전처리한 대조군), 실험군 (혈소판에 thrombin 처리 전 ferulic acid를 전처리한 실험군)으로 실험을 수행하였다. 도 34는 과립 분비에 관한 페룰릭산의 영향을 나타내는 도면이다.
Thrombin을 이용한 혈소판 자극으로 분비과립에서 분비된 ATP 농도를 측정한 결과, vehicle만 처리한 음성대조군1에서는 2.89 ± 0.25 nM의 ATP 농도를 보였고 thrombin 자극 후 아무것도 처리하지 않은 음성대조군2에서는 5.52 ± 0.31 nM의 ATP 농도를 보였다. Ferulic acid를 전처리한 실험군에서는 1 μg 농도의 전처리에서 5.70 ± 0.22 nM, 5 μg 농도의 전처리에서 5.43 ± 0.25 nM, 10 μg 농도의 전처리에서 5.05 ± 0.29 nM의 농도를 보였다(도 34). 또한, aspirin 10 μg을 전처리한 양성대조군에서는 5.39 ± 0.27 nM의 농도를 보였다. Thrombin에 의한 혈소판 자극은 ATP 분비를 1.91 배 증가시켰으나, aspirin은 ATP 분비 증가를 4.94 % 감소시켰다. Ferulic acid를 전처리한 실험군에서는 1 μg 농도의 전처리에서 ATP 분비 증가를 0 % 감소, 5 μg 농도의 전처리에서 ATP 분비 증가를 3.42 % 감소, 10 μg 농도의 전처리에서 ATP 분비 증가를 17.87 % 감소시켰다.
ATP release assay를 통해, ferulic acid가 thrombin에 의해 유도되는 혈소판 활성화 반응에서 분비되는 ATP를 약 3-18 % 억제시키는 혈소판 활성화 억제능을 갖고 있으며, 양성대조군으로 처리했던 aspirin의 억제능보다 높게 분석되었고 ferulic acid 고농도에서 비교적 높은 억제효능을 확인하였다.
3-6:
Serotonin
release assay
결과 분석을 위해 음성대조군1 (혈소판에 vehicle만 처리한 대조군), 음성대조군2(혈소판에 thrombin만 처리한 대조군), 양성대조군 (혈소판에 thrombin 처리 전 aspirin을 전처리한 대조군), 실험군 (혈소판에 thrombin 처리 전 ferulic acid를 전처리한 실험군)으로 실험을 수행하였다. 도 35는 과립 분비에 미치는 페룰릭산의 영향을 나타내는 결과도이다.
Thrombin을 이용한 혈소판 자극으로 분비과립에서 분비된 serotonin 농도를 측정한 결과, vehicle만 처리한 음성대조군1에서는 5.71 ± 0.56 nM의 serotonin 농도를 보였고 thrombin 자극 후 아무것도 처리하지 않은 음성대조군2에서는 40.55 ± 3.19 nM의 serotonin 농도를 보였다. Ferulic acid를 전처리한 실험군에서는 1 μg 농도의 전처리에서 39.92 ± 1.96 nM, 5 μg 농도의 전처리에서 37.56 ± 2.21 nM, 10 μg 농도의 전처리에서 30.18 ± 3.05 nM의 농도를 보였다(도 35). 또한, aspirin 10μg을 전처리한 양성대조군에서는 11.37 ± 2.43 nM의 농도를 보였다. Thrombin에 의한 혈소판 자극은 serotonin 분비를 7.10 배 증가시켰으나, aspirin은 serotonin 분비 증가를 83.75% 감소시켰다. Ferulic acid를 전처리한 실험군에서는 1 μg 농도의 전처리에서 serotonin 분비 증가를 1.81 % 감소, 5 μg 농도의 전처리에서 serotonin 분비 증가를 8.58 % 감소, 10 μg 농도의 전처리에서 serotonin 분비 증가를 29.76% 감소시켰다.
Serotonin release assay를 통해, ferulic acid가 thrombin에 의해 유도되는 혈소판 활성화 반응에서 분비되는 serotonin을 약 2-30% 억제시키는 혈소판 활성화 억제능을 갖고 있으며, 양성대조군으로 처리했던 aspirin의 억제능보다 thrombin 자극에서 낮게 분석되었다.
3-7:
칼슘재첨가시간
분석
항응고 효능 평가를 위해, human 유래 plasma와 CaCl2을 이용한 칼슘재첨가 시간측정법 (recalcification time assay)을 수행하여 ferulic acid의 항응고 효능을 분석하였다. Ferulic acid를 처리하지 않은 plasma 대조군과 다양한 농도의 ferulic acid를 10 분간 전처리된 plasma 실험군을 동시에 CaCl2를 첨가 후 30분 동안 650 nm에서 plasma의 밀도를 추적하였다. 또한, plasma 밀도의 최고점의 절반에 도달하는 시간을 측정하여 비교분석 하였다. 시료를 처리하지 않은 대조군에서는 30 분 후 plasma의 밀도인 OD650 value가 약 0.13으로 확인되었으며 이 값을 100%로 하여 분석하였다. 도 36은 칼슘 재첨가 시간에 미치는 페룰릭산의 영향을 나타내는 결과도이다.
그 결과, ferulic acid 5 μg에서 88.2 ± 2.7 %, 10 μg에서 83.6 ± 3.2 %로 나타났고, 양성대조군으로 이용한 aspirin에서는 98.5 ± 1.4 %로 나타났다(도 36A, B). 이러한 Plasma의 흡광도분석을 통해, ferulic acid 5 μg에서 11.8 %, 10 μg에서 16.4 %, aspirin에서는 1.5 %의 응고 지연 효능이 확인되었다(도 36B).
또한, 도 36C를 통해 plasma 밀도 최고점의 1/2(반값)에 도달하는 시간을 분석한 결과, 대조군의 도달시간은 457.24 sec로 확인되었고 ferulic acid 5 μg에서 620.53 ± 19.00 sec, 10 μg에서 661.17 ± 25.31 sec로 측정됐다(도 36C). Aspirin은 733.58 ± 10.43 sec로 나타났다. 이는 시료를 처리하지 않은 대조군에 비해 최고점의 절반 도달시간을 36-45 % 지연시키는 항응고 효능을 확인하였으며 aspirin의 지연능보다 다소 낮은 것으로 확인되었다. 결국, Recalcification time assay를 통해 ferulic acid에서 칼슘재첨가로 유도한 인간유래 plasma의 응고반응을 억제하는 항응고 효과가 있음을 확인하였다.
3-8: Thrombin으로 유도한 혈소판 활성화에 대한
in
vivo
억제능
기전 분석
시료가 생체 내 혈소판 활성화에 관여하는 기전에 어떤 영향을 미치는지 분석하기 위해, 위 실험과 동일한 일반대조군, 실험군1, 실험군2로 실험을 수행하였고 aspirin을 이용한 양성대조군을 추가하여 비교 분석하였다. saline만 처리한 일반대조군, 혈소판 활성화 유도체인 thrombin을 처리 후 saline을 처리한 음성대조군, 시료만 처리한 일반대조군, 혈소판 활성화 유도체인 thrombin을 처리 후 시료를 처리한 실험군1, 혈소판 활성화 유도체인 thrombin을 처리 후 시료를 처리한 실험군2로 실험을 수행하였다.
도 37 및 38은 트롬빈 유발 급성 색전에서 신호화 인자에 미치는 페룰릭산의 영향을 나타내는 도면이다.
Ferulic acid를 전처리한 혈소판에 thrombin으로 혈소판 자극 및 활성화시켰다. 자극 후 혈소판 추출액을 제조하여 western blot으로 pAKT, pPI3K의 인산화 정도를 분석하고 fibrinogen, αIIbβ3의 발현 정도를 분석하였다. Beta-actin은 loading control로 사용하였다. Thrombin은 αIIbβ3 수용체를 통해 혈소판을 활성화시켰으며, saline만 처리한 일반대조군과 혈소판 활성화 유도체인 thrombin을 처리 후 saline을 처리한 음성대조군을 비교한 결과, αIIbβ3 수용체의 발현은 thrombin의 자극에 의해 45.20% 증가하였고 이 수용체의 리간드인 fibrinogen (FIB)의 발현은 84.02 % 증가하였다(도 37). Ferulic acid의 두 농도로 전처리한 혈소판에 thrombin 자극을 준 실험군1,2에서 αIIbβ3 수용체의 발현은 10 μg 농도에서 16.53 %, 20 μg 농도에서 33.10% 감소하였고 리간드인 fibrinogen은 10 μg 농도에서 73.63%, 20 μg 농도에서 98.20% 감소하였다.
AKT의 인산화 정도는 thrombin의 자극에 의해 293.67 % 증가하였고 PI3K의 인산화 정도는 831.78% 증가하였다(도 38). Ferulic acid의 두 농도로 전처리한 혈소판에 thrombin 자극을 준 실험군1,2에서 AKT의 인산화 정도는 10 μg 농도에서 240.95 %, 20 μg 농도에서 187.01 % 감소하였고 PI3K의 인산화 정도는 10 μg 농도에서 -539.31 %, 20 μg 농도에서 -289.19 % 감소하였다.
본 결과를 통해, ferulic acid가 thrombin 자극에 의해 발현이 증가된 αIIbβ3 수용체와 그 리간드인 fibrinogen, AKT의 인산화를 부분적으로 억제하였으며, PI3K의 인산화는 억제하지 못하였다. 대조군으로 이용하였던 aspirin의 억제능과 비교 시 ferulic acid는 관련 유전자의 유사한 억제능을 보이거나 낮은 억제능을 보였다.
3-9: Mouse pulmonary
thromboembolism
-induced model을 이용한
항혈전색전증
활성 분석
위에서 수행한 thrombin을 이용한 in vivo 억제능 기전 분석과 같이 수행된 실험이며 실험동물의 다리운동 장애 및 치사 여부를 생존율로 결과를 도출하여 항혈전색전증 활성을 분석하였다. 위 기전분석 실험과 동일한 음성대조군, 양성대조군, 실험군1, 실험군2로 실험을 수행하였다.
| Experimental group | Aspirin 20 mg/kg |
Ferulic acid (mg/kg) |
|
| 10 | 20 | ||
| Protection (%) |
50 | 20 | 30 |
| No. paralyzed or dead / No. tested | 5/10 | 8/10 | 7/10 |
Ferulic acid의 thrombin-induced acute thromboembolism model에서 폐혈전색전증 보호 효과를 분석한 결과, 양성대조군인 aspirin 20 mg/kg에서 50%, 실험군 ferulic acid 10 mg/kg에서 20%, 20 mg/kg에서 30%(표 11)로 분석되었다. 두 농도에서 20% 이상의 보호 효과를 보였지만 양성대조군인 aspirin의 보호효과에 미치지 못하였다.
이상, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 일 실시예를 설명하였지만, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 그 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 일 실시예는 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 결과물은 농림축산식품부의 재원으로 농림수산식품기술기획평가원의 고부가가치식품기술개발사업의 지원을 받아 연구되었습니다(116024-3).
Claims (4)
- 꾸지뽕 열매 추출물 유래의 클로로제닉산, 시린지산 또는 페룰릭산을 유효 성분으로서 포함하는 것을 특징으로 하는 혈행개선용 조성물.
- 꾸지뽕 열매 추출물 유래의 클로로제닉산, 페룰릭산 및 시린지산의 혼합물을 유효 성분으로서 포함하는 것을 특징으로 하는 혈행개선용 조성물.
- 청구항 1 또는 2에 있어서,
상기 조성물은 식품 또는 의약 조성물인 것을 특징으로 하는 혈행개선용 조성물. - 청구항 1 또는 2에 있어서,
상기 혈행개선은 항혈전능, 피브린 클롯 억제능, 항혈소판능, 혈소판 활성화 억제능, 또는 항응고능으로 이루어진 기능 중에서 선택된 것을 특징으로 하는 혈행개선용 조성물.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020170142200A KR20190047865A (ko) | 2017-10-30 | 2017-10-30 | 꾸지뽕 열매 추출물 유래의 혈행개선 조성물 |
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| Publication Number | Publication Date |
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| KR20190047865A true KR20190047865A (ko) | 2019-05-09 |
Family
ID=66545436
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| KR1020170142200A KR20190047865A (ko) | 2017-10-30 | 2017-10-30 | 꾸지뽕 열매 추출물 유래의 혈행개선 조성물 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20190047865A (ko) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20220065248A (ko) | 2020-11-13 | 2022-05-20 | 가톨릭관동대학교산학협력단 | 이소데론을 유효성분으로 함유하는 혈전성질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 |
| KR20220153434A (ko) * | 2021-05-11 | 2022-11-18 | 가톨릭관동대학교산학협력단 | 쿠드락산톤 b를 포함하는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 |
| KR20220158880A (ko) * | 2021-05-24 | 2022-12-02 | 극동대학교 산학협력단 | 데론을 유효성분으로 함유하는 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 조성물 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101342240B1 (ko) | 2013-01-16 | 2013-12-16 | 강원도 고성군 (관리부서 농업기술센터) | 꾸지뽕 분말차 조성물 |
-
2017
- 2017-10-30 KR KR1020170142200A patent/KR20190047865A/ko not_active Application Discontinuation
Patent Citations (1)
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