KR101596006B1

KR101596006B1 - 심혈관계 질환의 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101596006B1
Application number: KR1020140004376A
Authority: KR
Inventors: 옥민호; 송수영; 박신희; 윤준성
Original assignee: 목포대학교산학협력단
Priority date: 2014-01-14
Filing date: 2014-01-14
Publication date: 2016-02-19
Anticipated expiration: 2034-01-14
Also published as: WO2015108332A1; KR20150084405A

Abstract

본 발명은 참가시나무 추출물을 포함하는 심혈관계 질환의 치료 및 예방을 위한 조성물에 관한 것으로서, 구체적으로 참가시나무 추출물은 항산화 효능과 함께 혈관보호의 주요 인자인 혈관내피세포형 산화질소 합성효소를 강력하게 활성화하는 동시에 혈관평활근 (vascular smooth muscle)의 수축과 이완을 조절하여 강력한 혈관이완 효과를 나타내어 혈압조절 및 혈관내피세포 기능장애 (endothelial dysfunction)를 개선시키므로, 이를 유효성분으로 함유하는 조성물은 혈관내피세포 기능장애를 포함하는 심혈관계 질환의 예방 및 치료를 위한 약학 조성물 또는 건강기능식품으로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

심혈관계 질환의 예방 및 치료용 조성물 {Composition for Prevention and Treatment of Cardiovascular Diseases}

본 발명은 참가시나무 추출물을 포함하는 심혈관계 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물 및 건강기능식품에 관한 것으로, 상세하게는 산화스트레스를 저해하고, 동시에 혈관내피형 산화질소 합성효소를 활성화시켜 혈관평활근의 수축과 이완을 조절함으로써 혈관내피세포 기능장애 및 관련 심혈관계 질환을 치료 및 예방하는 효과를 가진 참가시나무에 대해 그 잎의 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물에 관한 것이다.

세계보건기구(WHO)의 통계에 의하면 2011 년 심혈관질환에 의한 세계 인구의 사망률이 30% 이상이며 세계 사망률 1 위의 질병이고, 특히 일본, 한국 등 아시아의 증가율이 높다고 보고하고 있다. 이는 고령화 사회로의 접근, 식사 습관 등의 변화로 인한 관상동맥 질환 위험 인자 등의 증가에 기인하는 것으로 추정된다.

혈관내피세포 기능장애 (endothelial dysfunction)는 1990 년 고혈압 환자에서 비이상적인 혈관의 이완이 발견 (Panza JA et al ., New England Journal of Medecine, 323:22-27, 1990)된 이래 고혈압, 동맥경화, 고지혈증, 당뇨, 비만 등 매우 포괄적인 심혈관계 질환을 더욱 가중시키는 주된 기능이상 질환이다. (Brunner H. et al ., J. Hypertens, 2005, 23:233-246). 혈관내피세포는 심장, 혈관 및 림프관의 공동을 따라 줄지어 있는 상피세포로서, 주기능은 혈관확장신경 및 혈관수축신경 매개체를 생산하여 혈관긴장도 및 구조 모두를 조절한다.

심혈관계 질환은 혈관내피세포 기능장애를 비롯한 일정한 증상을 시작으로 종래에는 심장 및 혈관계의 이상이 온 것으로서, 동맥경화, 고혈압, 고지혈, 관상동맥질환(심장마비), 뇌혈관계 질환 (뇌졸증, 치매), 말초혈관질환, 부정맥, 심부전, 울혈정 심장질환, 심근질환 등을 포함하는 심장과 혈관의 이상에 대한 명칭이나, 이에 제한되는 것은 아니다.

심혈관계 질환 발현의 주요 인자로서는 유전적 요인, 생활습관, 당뇨의 합병증 등 매우 다양하게 알려져 있으나 현대의학에 관점에서 내피세포형 산화질소 합성효소 (endothelial type Nitric Oxide Synthase, eNOS)의 활성감소로 인한 산화질소의 감소 및 활성산소종 (Reactive Oxygen Species, ROS)의 증가에 따른 혈관내 산화성 스트레스의 증가에 의한다고 알려져 있다. 내피세포형 산화질소 합성효소에 의해 생성되는 산화질소는 강력한 혈관이완 인자인 동시에 혈소판 응집, 혈관근육세포 증식, 단핵구 세포의 혈관침착, 동맥경화 관련 단백질 발현을 저해하여 전체적인 심혈관계의 항상성 조절에 매우 중요한 역할을 한다 (Forstermann et al ., Circulation, 113:1708-1714, 2006). 그러나 여러 가지 요인으로 인한 혈관내 활성산소종의 생성을 담당하는 다양한 효소들의 활성증가로 인하여 산화질소의 생성은 감소하게 되고 [Gryglewski et al ., Nature, 320:454-456, 1986; Paravicini et al ., Circulation Research, 91:54-61, 2002; Dusting et al ., Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology, 25:S34-41, 1998], 또한 만들어진 활성산소종은 접착 분자 발현의 조절 [Lo et al ., Am. J. Physiol., 264:L406-412, 1993], 혈관평활근세포 (VSMC, vascular smooth muscle cells)의 증식과 이동 자극 [Griendling and Ushio-Fukai, J. Lab. Clin. Med., 132:9-15, 1998], 산화력이 있는 지단백질(lipoprotein) 조절 등을 야기하여 심혈관계 질환을 발생시킨다 [Lynch and Frei, J. Lipid Res., 34:1745-1753, 1993]. 또한 증가된 혈관의 활성산소종의 생성은 아테롬성 동맥경화의 임상적 위험 요소와 관상동맥 질환을 가진 환자의 손상된 혈관내피세포의 산화질소 (nitric oxide, NO) 기능과 관련이 있으며, 근원적으로 혈관의 수축을 야기한다 [Guzik et al ., Cir. Res., 86:E85-90, 2000].

종합적으로, 혈관내피세포형 산화질소 합성효소의 활성유도 및 직접적인 활성산소종의 감소, 활성산소종의 하류 발생 억제는 심혈관계 질환의 예방 및 치료에 있어서 매우 중요한 타겟으로 인식되고 있다 [Forstermann et al ., Circulation, 113:1708-1714, 2006].

현재까지 산화질소 조절제로서 니트로프루시드(nitroprusside), 니트로글리세린(nitroglycerine)이 존재하고 있으나, 임상적 사용에서 내성 및 독성의 문제로 심장마비 등의 응급시에만 사용하고 있다. 또한 비타민C 등의 많은 항산화제가 알려져 있고 다양한 목적으로 사용되고 있으나 항산화 효과 단독으로는 혈관내피세포 기능장애 개선 및 관련 심혈관치료가 어려워 치료제 및 예방제로서의 상업화 및 임상에 전용으로 사용되고 있지는 않다.

한편, 참가시나무 (Quercus salicina)는 참나무 가운데서 겨울철에도 잎이 떨어지지 않는 상록성의 참나무이다. 잎은 어긋나고 바소꼴 또는 긴 타원 모양의 바소꼴이며 길이가 10 내지 14 cm이고 끝이 뾰족하며 윗부분 가장자리에 뾰족한 톱니가 있다. 잎 양면에 털이 있으나 점차 없어지고, 뒷면은 흰색을 띠고, 잎자루는 길이가 1 cm이다. 우리나라에서는 제주도, 울릉도, 완도, 거제도를 비롯한 남쪽의 일부 섬지방과 바닷가 지방 그리고 일본과 중국의 따뜻한 곳에서 많이 자라고 유럽에서는 지중해 연안에 흔하다. 가시나무가 우리나라에서는 귀했던 까닭에 전통한의학에서 약으로 쓴 일은 극히 드물었다. 우리나라 남쪽 섬지방에서도 설사를 멈추게 하거나 피를 멎게 하고 종기나 종창을 치료하는 약으로 민간에서 더러 썼다고 한다. 일본의 시코쿠 지방에서 몸 속에 있는 돌을 없애는 민간요법으로 써 왔던 나무이다. 중국과 일본에서는 설사를 그치게 하고 출혈을 멎게 하며 염증을 없애고 신장과 방광의 기능을 튼튼하게 하며 담낭결석이나 신장결석 등 갖가지 결석을 녹여 없애는 특효약으로 소화기계 및 비뇨기계 관련 질환에 열매, 잎, 어린 줄기 등을 써 왔다. 특히 일본 Nippon Shinyaku(日本新藥)에서는 참가시나무 잎 추출물을 UROCALUN^®으로서 상업화에 성공하였고, 담석 및 요로결석 치료제로서 현재까지 임상에 사용 중이며 그 안정성이 입증되어 있다. 한국에서는 일성신약(주)이 1974 년 이래로 일본신약으로부터 수입하고 있다.

참가시나무의 성분에 대한 연구로서는 주로 탄닌질(tannins)인 몰식자산(gallic acid), 엘라그산 (ellagic acid), 리드로사이드 몰식자산염 (salidroside 6"-O-gallate, salidroside 3"-O-gallate, salidroside 4',6"-di-O-gallate, salidroside 4",6"-di-O-gallate, salidroside 3",4",6"-tri-O-gallate) 등을 분리하였다 (Nonaka, G. et al.: Chem. Pharm. Bull, 30(6), 2061; Nishimara, H. er al.: Chem. Pharm. Bull, 32(5), 1735, 1741, 1750; Nishimara, H. er al.: Chem. Pharm. Bull, 34(8), 3223). 각 분리된 성분의 효능으로는 담낭결석과 신장결석 제거, 히알루로니다제(hyaluronidase) 저해, 항알러지, 아토피 피부염 치료제, 당뇨개선, 항비만 등이 보고되었다 (일본출원특허 제 1970-24109 호, 일본공개특허 제 06-239757 호, 일본공개특허 제 2004-000164 호, 일본공개특허 제 09-227398 호).

그러나, 상기 문헌 중 어느 것에도 참가시나무 추출물에 대한 직접적인 혈관내피세포형 산화질소 합성효소 활성증강, 혈관내 산화스트레스 억제, 혈관 이완효과 및 혈압조절 효과에 대해서는 개시나 교시도 이루어진 문헌은 없다.

일본출원특허 제 1970-24109 호 일본공개특허 제 06-239757 호 일본공개특허 제 2004-000164 호 일본공개특허 제 09-227398 호

Forstermann et al., Circulation, 113:1708-1714, 2006

이에 본 발명자들은 다수의 식물 추출물을 대상으로 항산화 효능 및 혈관이완 효과를 검색하던 중 참가시나무 추출물이 강력한 항산화 효능을 가지고 있으며 동시에 직접적인 혈관내피세포형 산화질소 합성효소 활성증강, 혈관이완 및 혈압조절 효과가 있는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 전술한 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 참가시나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 심혈관계 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

본 발명은 또한 참가시나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 심혈관계 질환의 예방용 건강기능식품을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

본 발명의 심혈관계 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물은 상술한 바와 같은 목적을 달성하기 위하여 참가시나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 참가시나무 추출물은 잎에서 추출할 수 있다.

또한, 상기 참가시나무 추출물은 30 내지 95 중량%의 에탄올 수용액으로 추출할 수 있다.

또한, 상기 참가시나무 추출물은 혈관내피세포형 산화질소 합성효소의 활성증가 효과를 가질 수 있다.

또한, 상기 참가시나무 추출물은 혈관이완 효과를 가질 수 있다.

또한, 상기 참가시나무 추출물은 항산화 효능을 가질 수 있다.

또한, 상기 심혈관계 질환은 혈관내피세포 기능장애, 울혈성 심장병, 관상동맥질환, 고지혈증, 저혈압, 부정맥, 심부전증, 혈관재협착, 뇌혈관질환, 말초혈관질환 및 대사성 질환으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.

한편, 본 발명의 심혈관계 질환의 예방용 건강기능식품은 참가시나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 한다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 참가시나무 추출물은 항산화 효능과 함께 혈관보호의 주요 인자인 혈관내피세포형 산화질소 합성효소를 강력하게 활성화하는 동시에 혈관평활근 (vascular smooth muscle)의 수축과 이완을 조절하여 강력한 혈관이완 및 혈압조절 효과를 나타내므로 혈관내피세포 기능장애 및 관련 심혈관계 질환의 예방 및 치료를 위한 약학 조성물 또는 건강기능식품으로써 유용하게 이용될 수 있다.

도 1 및 도 2는 각각 돼지 관상동맥에 대한 참가시나무 추출물의 혈관이완 활성 및 수축억제 효능을 측정한 도면이다.
도 3은 참가시나무 추출물에 의한 내피 세포형 산화질소 합성효소 (eNOS)의 활성 정도를 측정한 도면이다.
도 4는 참가시나무 추출물의 세포독성 정도를 측정한 도면이다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 또한, 하기의 설명에서는 구체적인 구성요소 등과 같은 많은 특정사항들이 설명되어 있는데, 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것일 뿐 이러한 특정 사항들 없이도 본 발명이 실시될 수 있음은 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명하다 할 것이다. 그리고, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 혹은 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

본 발명의 참가시나무 추출물은 하기와 같이 수득될 수 있다.

상기 참가시나무의 지상부, 더욱 구체적으로 잎은 채취한 것, 양식한 것 또는 시판되는 것 등 제한 없이 사용할 수 있으며, 추출을 위한 용매는 물, C₁ 내지 C₅의 저급알콜 및 그 혼합물로 이루어진 군에서 선택된다. 본 발명자들은 참가시나무 잎을 물로 씻어 이물질 및 염분을 제거하고 건조한 후, 참가시나무 시료 중량의 약 5 내지 50 배, 그리고 30 내지 95 중량%의 에탄올 수용액으로 50 내지 95 ℃에서 1 시간 내지 7 일 동안 추출하는 과정을 2 내지 5 회, 바람직하게는 3 회 반복 수행한 다음 감압농축 및/또는 동결건조하여 참가시나무 추출물을 수득할 수 있다 (Harborne. J.B., Phytochemical medthods : A guide to modern techniques of plant analysis, 3rd Ed., pp.6-7, 1998).

본 발명은 상기의 제법으로 얻어진 참가시나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 심혈관계 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 심혈관계 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물 0.1 내지 99 중량%를 포함한다.

본 발명의 참가시나무 추출물을 포함하는 약학 조성물은 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 추출물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수도 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수도 있다.

본 발명에 따른 추출물을 포함하는 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 및 광물유를 들 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.

경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁액, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수용성제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween), 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서 본 발명의 추출물은 1일 0.0001 내지 100 ㎎/㎏, 바람직하게는 0.001 내지 100 ㎎/㎏으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명은 심혈관계 질환의 예방 효과를 나타내는 상기 추출물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 건강기능식품을 제공한다.

참가시나무 추출물을 첨가할 수 있는 건강기능식품으로는 예를 들어, 각종 일반식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제 등이 있다.

또한, 상기 참가시나무 추출물은 심혈관계 질환의 예방 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 g을 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등의 추가 성분을 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예로는 모노사카라이드, 예를 들어 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토오스, 수크로오스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 솔비톨, 에리스리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제인 타우마틴, 스테비아 추출물, 예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등; 및 합성 향미제, 예를 들어 사카린, 아스파르탐 등을 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 g당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.

상기 외에 본 발명의 추출물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 및 천연 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 추출물들은 천연 과일 쥬스, 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이때, 첨가제의 비율은 그다지 중요하지는 않지만 본 발명의 추출물 100 중량부 당 0.01 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명의 실시예에 대하여 설명한다.

실시예

실시예 : 참가시나무 추출물의 제조

채취한 참가시나무 잎을 물로 씻어 이물질 및 염분을 제거한 후 건조하여 분쇄하고 추출용기에 참가시나무 잎 25 g과 70 중량%의 에탄올 수용액 총 500 ㎖를 가하여 환류 냉각하면서 70 ℃에서 3 시간씩 3 회 반복하여 가열추출한 다음, 거름종이로 여과하고, 그 여액을 40 ℃의 수욕 상에서 감압 농축 및 동결건조하여 참가시나무 잎 추출물 7.0 g을 수득하였다.

시험예 1 : 참가시나무 추출물의 항산화 효능 측정

항산화 활성을 확인하기 위해 DPPH(1,1-diphenyl-2-pycryl-hydrazyl) 방법을 수행하여 항산화 활성을 측정하였다 (Taco, T. et al., Biosci. Biotech. Biochem., 1994, 58,1780-1783; Na, M.K. et al., Nat. Prod. Sci., 2002, 8, 26-29). DPPH는 비교적 안정한 자유 라디칼로서, 라디칼 상태로 존재시 517 nm에서 최대 흡광도를 보이며 소거되면 흡광성을 잃기 때문에 이러한 원리를 이용하여 항산화 활성을 측정할 수 있는 방법이다. 구체적으로, 참가시나무 잎의 추출물을 취해, DMSO (Sigma,USA)를 이용하여 3.125, 6.25, 12.25, 25 및 50 ㎍/㎖로 희석한 후, 96 웰 플레이트에 상기 용액 10 ㎕씩을 각각 넣고 2 ×10^-4 M/㎖ 에탄올 농도의 DPPH (Sigma, USA) 용액 190 ㎕를 넣어 실온에서 30분간 방치한 후, 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 시료 대신 DMSO를 가해 시료의 흡광도 감소 정도를 조사하였다. DPPH 라디칼 소거활성을 하기 수학식 1에 따라 계산하였다. 그 결과 참가시나무 추출물의 농도가 증가함에 따라 항산화 효능이 증가하였으며, 매우 높은 항산화 효능을 가진 물질임을 확인하였다.

A_control : 시료를 첨가하지 않은 대조군의 흡광도

A_sample : 시료를 첨가한 반응군의 흡광도

DPPH 라디칼 소거활성 (%)
1 μg/ml	3 μg/ml	10 μg/ml	30 μg/ml	100 μg/ml
9.5	17.2	35.5	78.9	92.3

시험예 2 : 참가시나무 추출물의 혈관이완 및 혈관수축 억제 효과 측정 (관상동맥)

상기 실시예에 의해 제조된 참가시나무 추출물의 혈관이완 효과를 확인하기 위하여 돼지 심장의 관상동맥의 이완효과를 비교하였고, 그 결과는 도 1 및 표 2에 나타내었다. 관상동맥은 도축장에서 도살 직후의 돼지심장을 구입한 후 적출하여 18 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.1 mM MgSO₄, 1.2 mM KH₂PO₄, 1.5 mM CaCl₂, 25 mM NaHCO₃, 10 mM 글루코스가 들어있는 크렙스(Krebs) 용액 (pH 7.4)에 넣고 연결 조직과 지방을 제거한 후 약 3 ㎜의 길이의 절편으로 만들었다.

준비한 관상동맥 절편을 95 % O₂ 및 5 % CO₂ 기체로 포화시킨 37 ℃의 크렙스 용액에서 고정시킨 후, 등척성 장력 (isometric tension)을 힘-변위 변환기 (force-displacement transducer, HugoSachs, Germany)가 장착된 생리기록계(Grass physiograph, HugoSachs, Germany)를 이용하여 측정하였다. 관상동맥의 경우 먼저 트롬복산 유도체인 U46619 (1-60 nM)로 혈관최고수축의 80 %로 수축시키고 10 분 후, 300 nM의 브레드키닌(Bradykinin)으로 이완 반응시켜 혈관 내피 세포의 안전성을 측정한 다음, 크렙스 용액으로 3 회 세척하고 실험을 수행하였다. 혈관이완 효과 변화 측정은 먼저 약물을 U46619로 수축하였으며, 이어서 참가시나무 추출물에 의한 이완 반응을 농도 의존적으로 시험하였다. 또한 U46619를 용량의존적으로 처리하여 혈관을 수축하기 30분 전에 참가시나무 추출물을 반응시키고 이후에 U46619를 농도의존적으로 처리하여 참가시나무 추출물에 의한 수축억제 효능을 확인하였다.

이 시험은 4 내지 5의 서로 다른 개체에서 적출한 혈관을 가지고 반복시험하였으며, ED50 값은 수축된 혈관이 시료처리에 의해 50 %의 혈관이완을 나타내는 시료의 농도(㎍/㎖)를 가리킨다.

돼지 관상동맥에서 참가시나무 추출물의 이완효과

	ED50 (μg/ml)
참가시나무 추출물	23.7

시험 결과 도 1에 나타난 바와 같이 본 발명의 참가시나무 추출물은 농도 의존적으로 유의하게 이완하기 시작하여 100 ㎍/㎖ 농도에서는 102 ± 4 %이완을 하였다. 표 2에 나타난 바와 같이 참가시나무 추출물은 관상동맥에서 혈관을 이완시키는 정도가 매우 우수한 것을 알 수 있다. 또한 도 2에 나타난 바와 같이 U46619 등의 혈관수축인자에 의한 혈관의 수축을 억제하는 이중 효능을 가짐을 확인하였다.

시험예 3 : 참가시나무 추출물의 혈관내피세포형 산화질소 합성효소 활성 테스트

상기 실시예에 의해 제조된 참가시나무 추출물의 혈관내피세포형 산화질소 합성효소의 활성 증강에 대한 효과를 송아지 혈관내피세포 (Bovine aortic endothelial cells)의 혈관내피세포형 산화질소 합성효소 (eNOS)의 1177 번 세린 잔기 (serine residue) 인산화 정도로서 비교하였고, 그 결과는 도 3에 나타낸 바와 같다.

먼저 혈관내피세포를 DMEM (Dubleco's minimum essential medium) 및 10 % FBS (Fetal bovine serum) 용액과 혼합하여 배양 후 FBS가 제외된 배양액으로 다시 24 시간 동안 배양하였다. 세포가 안정화된 후에 시료를 각 농도별로 처리한 후 30 분 동안 반응시켰다. 이후 단백질을 추출하고 원심분리하고 상등액을 취하여 세포의 파편들을 제거하였다. 추출한 단백질은 SDS-폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamide gel)에 전기영동시킨 후 니트로셀룰로오스 막 (nitrocellulose membrane)으로 겔의 단백질을 블롯시켰다. 3 % BSA로 1 시간 동안 차단(blocking)한 후에 1:1000의 비율로 phospho-eNOS, phospho-Akt 항체 (Cell Signaling, 미국)를 하루 밤 동안 4 ℃에서 배양하였다. 다음으로, 1:2000의 비율로 희석한 2 차 항체를 처리하여 1 시간 상온에서 배양한 후 화학발광법(chemiluminescence)로 현상하였다.

그 결과 도 3에서 보는 바와 같이, 참가시나무 추출물은 산화질소를 생성시키는 혈관내피세포형 산화질소 합성효소의 활성화(phospho-eNOS) 증가 정도가 큰 것을 알 수 있다.

시험예 4 : 참가시나무 추출물의 세포독성 테스트

상기 실시예에 의해 제조된 참가시나무 추출물의 세포독성 정도를 비교하였으며 그 결과는 도 4와 같다.

혈관동맥평활근세포를 MEM (minimum essential medium)과 10 % FBS (Fetal bovine serum) 용액과 혼합하여 24 시간 동안 5 % CO₂/37 ℃의 조건에서 배양하였다. 세포가 안정화된 후에 상기 실시예에서 수득한 참가시나무의 추출물을 처리하여 진탕시킨 후 24 시간 동안 반응시켰다. 이후 MTS 용액 (cellTiter 96 Aqueous One Solution, Promega, USA)을 넣어 1 시간 동안 배양한 후 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.

상기 도 4에 나타난 바와 같이 본 발명의 참가시나무 추출물은 세포의 생존에 어떠한 영향도 미치지 않으며 매우 안전한 약물임을 알 수 있다.

시험예 5 : 통계처리

시험결과의 유의성은 실험결과를 스투던트 t-테스트 및 일원본산 분석 (one-way ANOVA test)을 통하여 p가 0.05 이하인 경우 유의한 차이로 판정하였다.

아래에 본 발명의 추출물을 포함하는 약학 조성물 및 건강기능식품의 제제예를 설명하나, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1 : 산제의 제조

참가시나무 추출물 분말 20 ㎎

유당 100 ㎎

탈크 10 ㎎

상기의 성분들을 혼합하고, 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

제제예 2 : 정제의 제조

참가시나무 추출물 분말 10 ㎎

옥수수 전분 100 ㎎

유당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

제제예 3 : 캅셀제의 제조

참가시나무 추출물 분말 10 ㎎

결정성 셀룰로오스 3 ㎎

락토오스 14.8 ㎎

마그네슘 스테아레이트 2 ㎎

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

제제예 4 : 주사제의 제조

참가시나무 추출물 분말 10 ㎎

만니톨 180 ㎎

주사용 멸균 증류수 2794 ㎎

Na₂HPO₄12H₂O 26 ㎎

통상의 주사제 제조방법에 따라 1 앰플 (2 ㎖)당 상기의 성분 함량으로 제조하였다.

제제예 5 : 액제의 제조

참가시나무 추출물 분말 10 ㎎

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적당량

통상의 액제 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고, 레몬향을 적당량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 후 정제수를 가하여 전체를 100 ㎖로 조절하고 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조하였다.

제제예 6 : 건강 음료의 제조

참가시나무 추출물 분말 10 ㎎

비타민 C 15 g

비타민 E(분말) 100 g

젖산철 19.75 g

산화아연 3.5 g

니코틴산아미드 3.5 g

비타민 A 0.2 g

비타민 B1 0.25 g

비타민 B2 0.3 g

물 적당량

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1 시간 동안 85 ℃에서 교반 가열 후, 만들어진 용액을 여과하고 멸균된 2 ℓ의 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관하여 본 발명에 따른 건강음료 조성물 제조에 사용하였다. 상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층이나 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

이상에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 대해서 설명하였으나, 본 발명은 상술한 특정의 실시예에 한정되지 아니하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본원 발명의 요지를 벗어남이 없이 다양한 변형 실시가 가능함은 물론이다. 따라서, 본 발명의 범위는 위의 실시예에 국한해서 해석되어서는 안되며, 후술하는 특허청구범위 뿐만 아니라 이 특허청구범위와 균등한 것들에 의해 정해져야 할 것이다.

Claims

참가시나무 잎을 에탄올로 추출한 추출물을 유효성분으로 함유하는 고혈압 또는 말초혈관질환의 치료 및 개선용 약학 조성물.
삭제
청구항 1에 있어서,
상기 추출물은 30 내지 95 중량%의 에탄올 수용액으로 추출한 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 참가시나무 추출물은 혈관내피세포형 산화질소 합성효소의 활성증가 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
청구항 1에 있어서,
상기 참가시나무 추출물은 혈관이완 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
삭제
참가시나무 잎을 에탄올로 추출한 추출물을 유효성분으로 함유하는 고혈압 또는 말초혈관질환의 예방용 건강기능식품.