KR101624538B1 - 송이버섯 추출물을 함유하는 혈전증 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 송이버섯 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증(thrombosis)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 송이버섯의 물 추출물, 압착액, 드립(drip), 이들의 유기 용매 분획물 또는 물 잔류물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품에 관한 것이다. 본 발명의 송이버섯 추출물, 특히 송이버섯 물 추출물, 압착액, 드립, 이들의 유기용매 분획물 또는 물 잔류물은 우수한 혈소판 응집 저해활성을 나타내어, 혈전 생성을 효율적으로 억제할 수 있는 효과가 있으며, 혈행개선을 통해 허혈성 뇌졸중 및 출혈성 뇌졸중과 같은 혈전증의 예방 및 치료용으로 사용할 수 있는 뛰어난 효과가 있다. 뿐만 아니라, 본 발명의 송이버섯 추출물은 인간 적혈구에 대한 용혈활성이 없어 안전하게 이용할 수 있으며, 열 안정성이 우수하고, pH 2의 산성조건 및 인간 혈장 내에서도 활성의 손실이 나타나지 않아, 추출액, 크림, 분말, 환, 정 등의 다양한 형태로 가공되어 제약산업 및 식품산업상 매우 유용하게 이용될 수 있다.

Description

송이버섯 추출물을 함유하는 혈전증 예방 또는 치료용 약학적 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING THE EXTRACT OF TRICHOLOMA MATSUDAKE FOR PREVENTION AND CONTROL OF THROMBOSIS}

본 발명은 송이버섯 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증(thrombosis)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 송이버섯의 물 추출물, 압착액, 드립(drip), 이들의 유기 용매 분획물 또는 물 잔류물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품에 관한 것이다.

인체 구성성분으로 혈액은 산소, 영양분, 노폐물의 운반 기능과 완충작용, 체온유지, 삼투압 조절 및 이온 평형유지, 수분 일정유지, 액성 조절작용, 혈압의 유지 및 조절, 생체방어 등 다양한 기능들을 가지고 있다. 따라서, 혈액 및 혈액 순환은 인간의 생존에 필수사항이며, 혈관의 손상시에는 재빨리 혈전을 생성하여 혈액손실을 방지해야 한다. 그러나, 혈관 내의 과다한 혈전 생성은 혈액 순환을 방해하며, 심한 경우 혈관을 막아 심혈관계 및 뇌 조직의 심각한 손상을 나타내어 혈전증을 야기한다. 이러한 혈전증은 1) 혈관내피세포의 이상, 2) 혈액응고인자(XII 인자, XI 인자, IX 인자, X 인자 등) 및 혈액응고효소(트롬빈, 프로트롬빈 효소)의 과다한 응고 활성, 3) 혈소판 응집 및 4) 생성된 혈전의 용해 시스템의 비정상적 작용이 그 원인으로 알려져 있으며, 이러한 원인들은 개별적 또는 복합적으로 작용하여 혈관 내 과도한 혈전생성을 야기한다. 혈전성 질환의 예방과 치료를 위해, 현재 1) 혈액응고인자의 활성을 저해하여 혈전 생성을 억제하는 헤파린, 쿠마린 등의 다양한 항응고제, 2) 혈소판 응집을 저해하여 혈전 생성을 억제하는 아스피린과 같은 항혈소판제, 3) 이미 생성된 혈전을 녹여 혈전생성을 억제하는 유로키네이즈와 같은 혈전용해제 등이 사용되고 있다. 그러나, 이들은 가격이 매우 높을 뿐 아니라 출혈성 부작용과 위장장해 및 과민반응 등으로 그 사용이 한정되고 있는 실정이다.

한편, 송이버섯(Tricholoma matsudake)은 담자균 송이과 송이속의 버섯으로, 우리나라를 비롯하여 중국, 사할린, 일본, 대만 등 동양에서만 생산된다. 국내에서는 주로 태백산맥과 소백산맥을 중심으로 한 지역에서 생산되며，여름 장마 직후에 소량 산출되고 가을에 주로 산출된다. 송이의 갓은 지름이 8~20cm이고，처음에는 구형이나 차차 퍼져서 중앙부가 돌출한 편평형으로 담황갈색 또는 담갈색의 섬유상 인편이 있고, 오래되면 흑갈색으로 되어 방사상으로 갈라져 백색의 살이 보이기도 한다. 살은 백색, 치밀하고 특유한 향기가 있다. 현재까지 송이버섯은 인공재배가 되지 않아 자연에서의 채취에 전적으로 의존하고 있어 그 생산량이 매우 한정되어 있으며, 실제 품질 등급에 따라 수십만원~수백만원/kg의 가격대가 형성되어 있어 일부 사람들의 기호식품으로 인식되어 왔다.

송이버섯은 저장성이 매우 낮아 생송이로 판매되는 경우를 제외하면 대부분 냉동송이 형태로 유통되고 있으며, 최근 일부 송이버섯 자실체 이용 가공제품이 개발되고 있다. 그러나, 자연으로부터 채취하는 송이버섯 자실체는 그 가격이 매우 높을 뿐 아니라, 품질이 다양하고, 생산이 제한적이고, 한시적이라서 이를 이용한 가공제품 역시 산업화에는 한계가 있다. 최근, 년 중 생산 가능하면서도, 균일한 품질을 얻을 수 있는 송이버섯 균사체 배양에 관심이 집중되고 있으나, 균사체 배양의 경우에도 배양기간이 길며, 효모 추출물(yeast extract)과 같은 고가의 원료배지성분을 고농도로 요구하며, 배양 후 얻을 수 있는 균사체 향이 매우 적은 문제가 있다.

자연에서 채취하는 송이버섯의 경우 저장성이 낮아 채취 후 바로 유통하지 않는 경우 냉동 저장하게 되며, 또한 점차 증가되고 있는 수입산 송이 역시 냉동된 상태로 유통된다. 이 경우 해동단계에서 반드시 드립(drip)이 발생하게 되며, 드립에는 상당량의 영양성분과 생리활성물질을 함유하고 있을 것으로 예상됨에도 특별한 용도가 없는 실정이다.

현재까지 송이버섯에 대한 연구로는 송이버섯을 이용한 과립차 제조조건 확립에 관한 연구(동아시아식생활학회지, 17: 689-695. 박미란 2007), 송이버섯과 양송이 분말을 첨가한 데미글라스 소스의 품질 특성(한국조리학회지, 13: 119-127. 최수근 외. 2007), 송이버섯과 키토산을 첨가한 사과 드레싱 소스의 품질에 관한 연구(한국식품저장유통학회지, 16: 60-67. 홍주연 외, 2009) 등이 있으며, 송이버섯 추출물 제조 관련으로는 반응표면분석을 이용한 송이버섯 열수추출조건의 최적화(한국식품영양과학회지 , 39: 1206-1212, 2010, 강복희 외) 연구 등이 있다.

송이버섯의 효능에 대해서는 항산화 활성(Ferreira et al, 2009, Current Med. Chem . 16: 1543-1560), 항암 및 면역증강 활성(Hur et al, 2008, J. Life Sci. 18: 1290-1298), 항염증 활성(Lim et al, 2007, Food Chem. 103: 1337-1342) 및 송이즙의 혈전 용해활성(Kim et al, 2009, J. Korean Soc . Food Sci . Nutr. 38: 555-560)이 알려져 있으며, 송이버섯 균사체의 경우 트립시나아제(tyrosinase) 저해(Woo et al, 2003, Korean J. Biotechnol . Bioeng. 18: 45-50) 및 멜라닌(melanin) 색소 생성억제효과(Choi et al, 2011, Korean J. Food Sci . Technol. 43: 240-242)가 알려져 있다.

한편, 송이버섯과 관련된 특허문헌으로서, 생산 및 저장과 관련된 특허로는 등록특허 제10-0474136호(2005-02-22) 송이균, 이의 배양방법 및 이의 배양액을 이용한 송이버섯 생산방법, 등록번호 제10-0670900호(2007-01-11) 송이버섯의 장기보관방법, 등록번호 제10-0204186호(1999-03-26) 송이버섯의 장기보존방법 및 장기보존된 송이버섯, 등록특허 제10-0465972호(2005-01-03) 천연송이버섯의 향을 재현한 향료 조성물 등이 개시되어 있고, 송이버섯 가공 제품에 대한 특허로는 등록번호 제10-0447419호(2004-08-26) 송이버섯을 이용한 증류주의 제조 방법, 등록번호 제10-0586622호(2006-05-29) 송이주의 제조 방법, 등록번호 제10-0728723호(2007-06-08) 송이버섯 음료 및 이의 제조방법, 등록번호 제10-0769653호(2007-10-17) 송이버섯 가공 부산물인 송이버섯즙을 이용한 기능성송이버섯 국수의 제조 방법, 등록번호 제10- 0863601호(2007-05-15) 송이버섯 피클 및 이의 제조방법, 등록번호 제10-0772293호(2007-01-16) 송이버섯을 이용한 고추장 장아찌 제조방법 등이 개시되어 있다. 또한, 송이 착즙액을 이용하는 특허로는 공개번호 제10-2010-0032467호(2010-03-26) 송이 착즙액과 세절 송이를 이용한 송이차 제조, 등록번호 제10-1170341호(2012-07-26) 보존성이 개선된 송이차 및 그의 제조방법이 알려져 있으며, 송이버섯 및 송이버섯 균사체의 효능에 관련된 특허로는 등록번호 제10-1193725호(2012-10-16) 녹차 다당체 및 송이 버섯 추출물을 함유하는 항염 및 항산화용 화장료 조성물 및 공개번호 제10-2011-0004195호(2011-01-13) 송이 버섯 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈소판 응집 억제 활성을 가지는 조성물(2012-01-20 거절결정)에는 송이버섯 균사체의 메탄올 추출물의 혈소판 응집저해 활성이 알려져 있으며, 등록특허 제10-0392175호(2003-07-08) 버섯으로부터 유래한 혈전용해효소 및 그 제조방법에는 송이버섯 균사체 배양시 생성되는 혈전분해효소에 대한 특허가 알려져 있다.

이에 본 발명자들은 항혈전 및 혈류개선 활성을 나타내는 기능성 소재 개발을 목표로 1,000 여종 이상의 천연물을 분석한 결과, 송이버섯 추출물, 특히 물 추출물, 압착액, 드립, 이들의 유기용매 분획물 또는 물 잔류물에서 강력한 항혈전 활성을 확인하고, 혈장을 이용한 혈전생성 저해활성을 확인하였으며, 인간 적혈구에 대한 용혈활성이 없음을 확인하여 송이버섯 추출물이 기존의 항혈전제를 대치할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

KR 10-0392175 B KR 10-2011-0004195 A

따라서, 본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 송이버섯을 다양한 방법으로 추출, 분리 및 정제하고, 이들 중 강력한 혈소판 응집저해활성을 가지는 것으로 확인된 송이버섯 추출물, 특히 물 추출물, 압착액, 드립, 이들의 유기용매 분획물 또는 물 잔류물을 유효성분으로 하는 혈소판 응집저해용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품을 제공하고자 하는 것이다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 송이버섯(Tricholoma matsudake) 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 송이버섯 추출물은 송이버섯 물(水) 추출물인 것이 바람직하다.

상기 송이버섯 추출물은 송이버섯 압착액인 것이 바람직하다.

상기 송이버섯 추출물은 냉동 송이버섯의 해동시 얻어지는 드립(drip)인 것이 바람직하다.

상기 송이버섯 추출물은 물 추출물, 압착액 또는 드립을 헥센, 에틸아세테이트, 부탄올로 순차 분획하여 얻어진 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물 및 물 잔류물로 이루어지는 군으로부터 1종 이상 선택되는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 송이버섯(Tricholoma matsudake) 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전성 질환의 개선용 건강 기능 식품을 제공한다.

본 발명의 송이버섯 추출물, 특히 송이버섯 물 추출물, 압착액, 드립, 이들의 유기용매 분획물 또는 물 잔류물은 우수한 혈소판 응집 저해활성을 나타내어, 혈전 생성을 효율적으로 억제할 수 있는 효과가 있으며, 혈행개선을 통해 허혈성 뇌졸중 및 출혈성 뇌졸중과 같은 혈전증의 예방 및 치료용으로 사용할 수 있는 뛰어난 효과가 있다. 뿐만 아니라, 본 발명의 송이버섯 추출물은 인간 적혈구에 대한 용혈활성이 없어 안전하게 이용할 수 있으며, 열 안정성이 우수하고, pH 2의 산성조건 및 인간 혈장 내에서도 활성의 손실이 나타나지 않아, 추출액, 크림, 분말, 환, 정 등의 다양한 형태로 가공되어 제약산업 및 식품산업상 매우 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 송이버섯 해동 드립 및 이의 분획물(0.25mg/ml)의 혈소판 응집 저해효과를 나타낸 것이다. 도면의 좌측 컬럼으로부터 DMSO(용매 대조구), 아스피린(0.5mg/ml), 아스피린(0.25mg/ml), 송이버섯 해동 드립, 헥센 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물 및 물 잔류물을 각각 나타낸다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 송이버섯 추출물을 함유하는 혈전증 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 발명자는 송이버섯을 물로 추출하거나, 압착하여 송이버섯 압착액을 얻거나, 냉동 송이버섯을 급속 해동하여 해동 드립을 회수하고, 이들 각각에 대하여 헥센, 에틸아세테이트, 부탄올 등의 유기용매로 순차적으로 분획하여 얻어진 분획물과 물 잔류물을 조제하고, 이들의 혈액응고 효소 저해활성, 응고인자 저해활성 및 혈소판 응집저해 활성을 확인하였다. 또한, 이들은 인간 적혈구 용혈 활성이 나타나지 않아 독성이 없는 것으로 확인하였고, 우수한 열안전성 및 pH 2에서의 내산성, 혈장 안전성을 나타내어 기존의 항혈전제를 대치할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 송이버섯 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품을 제공한다.

본 발명은 송이버섯 추출조건 확립단계; 순차적 유기용매 분획을 통한 활성성분의 정제단계; 활성성분의 안정성 조사단계; 및 인간 적혈구 용혈활성 평가단계를 포함한다.

본 발명에서 사용된 용어인 "송이버섯"은 송이버섯 자실체를 의미하며 송이버섯 균사체를 제외하는 개념이다. 송이는 생송이와 냉동송이를 모두 포함한다.

본 발명에서 사용된 용어인 "추출물"은 물 추출물, 압착액, 드립, 이들의 유기용매 분획물 및 물 잔류물을 포함하는 개념이다.

상기 "물 추출물"은 냉수 또는 열수 추출물을 포함하며, 구체적인 추출방법은 본 발명의 기술분야에서 공지된 어떠한 방법을 사용하더라도 무방하다.

상기 "압착액"은 물리적인 압력을 가하여 산출되는 액상의 물질을 의미한다. 압착액을 얻는 구체적인 방법은 본 발명의 기술분야에서 공지된 어떠한 방법을 사용하더라도 무방하다.

상기 "드립"은 냉동 송이버섯을 급속 해동하여 얻은 드립을 의미하고, 이때 사용되는 송이버섯은 생장정지, 개산품 등의 저품질 송이버섯 또는 냉동 수입송이인 것이 바람직하다. 현재 냉동 송이버섯의 해동 드립은 별도의 용도가 없어 활발히 이용되고 있지 못하며, 송이 착즙액을 이용한 장류 발효, 국수 제조 및 송이 착즙액과 세절 송이를 이용한 송이차 제조(등록번호 제10-1170341호(2012-07-26)가 알려져 있을 뿐이다. 본 발명에 따른 드립을 제조하는 경우에는 드립을 제거한 송이버섯의 경우이 감과 향이 그대로 유지되므로 통상의 송이버섯 용도에 적합하게 사용할 수 있는 부가적인 장점도 있다.

바람직한 구체예로서, 본 발명에서 "드립"은 냉동 송이버섯을 0~95℃의 다양한 온도조건에서 해동하면서 제조할 수 있으며, 높은 활성의 드립을 회수하기 위해서는 전자레인지와 같은 급속 해동 시스템을 이용하여 5분 이내에 해동하여 드립을 회수하는 것이 바람직하다. 추가적으로 해동 송이버섯을 기계적으로 압착하는 경우 초기 냉동 송이버섯 무게대비 65~75%를 회수할 수 있다.

본 발명의 송이버섯 물 추출물, 압착액 또는 드립은 감압증류 및 동결건조, 또는 분무건조 등과 같은 통상적인 분말화 과정을 거쳐 분말로 제조될 수 있다.

본 발명의 송이 버섯 물 추출물, 압착액 또는 드립은 분말화된 후, 추가적으로 다양한 유기 용매로 분획물을 제조할 수 있다.

바람직한 구체예로서, 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올을 이용한 순차적인 유기용매 분획물을 회수할 수 있으며, 물 잔류물을 회수하여 본 발명의 혈소판 응집저해 활성을 평가하였다.

본 발명의 용혈활성이 없으면서 강력한 혈소판 응집저해 활성이 우수한 송이버섯 물 추출물, 압착액, 드립, 이들의 유기용매 분획물 또는 물 잔류물은 혈전증과 관련된 다양한 질환들의 예방 또는 치료용으로 사용될 수 있다. 상기 질환들은, 예를 들어, 동맥 혈전증으로서, 급성 심근 경색증, 가슴 통증, 호흡 곤란, 의식 소실, 허혈성 뇌졸중, 출혈성 뇌졸중, 두통, 운동 이상, 감각 이상, 성격 변화, 시력 저하, 간질 발작, 폐 혈전증, 심부정맥 혈전증, 하지 부종, 통증 및 급성 말초 동맥 폐쇄증 등을 들 수 있고, 정맥 혈전증으로서, 심부정맥 혈전증, 간문맥 혈전증, 급성 신장정맥 폐쇄증, 뇌 정맥동 혈전증 및 중심 망막정맥 폐쇄 등을 들 수 있다.

본 발명의 송이버섯 추출물을 포함하는 약학적 조성물은 각각의 사용 목적에 맞게 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구 제형, 멸균 주사용액의 주사제 등 다양한 형태로 제형화하여 사용할 수 있으며, 경구 투여하거나 정맥 내, 복강 내, 피하, 직장, 국소 투여 등을 포함한 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다. 이러한 약학적 조성물에는 추가적으로 담체, 부형제 또는 희석제 등이 더 포함될 수 있으며, 포함될 수 있는 적합한 담체, 부형제 또는 희석제의 예로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리쓰리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 비정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 충전제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 더 포함할 수도 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

바람직한 구체예로서, 본 발명의 약학적 조성물에서 혈소판 응집저해 활성이 우수한 송이버섯 추출물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 당 1 내지 5,000mg, 바람직하게는 100 내지 3,000mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 다양한 경로를 통하여 대상에 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명에서 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 약학적 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 일반적인 모든 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 유효성분을 표적 세포로 전달할 수 있는 임의의 장치를 이용해 투여될 수도 있다. 본 발명에서 "대상"은, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 인간, 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함하고, 바람직하게는 포유류, 보다 바람직하게는 인간을 의미한다.

또한, 본 발명의 건강 기능 식품은 혈전증의 예방 또는 개선에 효과적인 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 혈소판 응집저해 활성이 우수한 송이버섯 추출물을 포함하는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다. 본 발명의 활성 추출물은 일반적으로 전체 식품 중량의 0.01 내지 15중량%로 가할 수 있으며, 건강음료 조성물은 100 ml를 기준으로 0.02 내지 10g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다. 본 발명의 건강 기능 식품은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 것 외에 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제, 예컨대, 천연 탄수화물 및 다양한 향미제 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 예로는 포도당, 과당 등의 단당류, 말토오스, 수크로오스 등의 이당류 및 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 다당류와 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등의 당알코올이 있다. 상기 향미제로는 타우마틴, 레바우디오시드 A, 글리시르히진, 사카린, 아스파르탐 등을 사용할 수 있다. 상기 향미제의 비율은 본 발명의 건강 기능 식품 100ml당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g을 사용한다. 상기 외에 본 발명의 건강 기능 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물, 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강 기능 식품은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료 등의 제조를 위한 과육을 함유할 수도 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 본 발명의 상기 활성 분획물 100 중량부 당 0.01 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.

< 실시예 >

실시예 1: 냉동 송이버섯으로부터 드립의 제조 및 특성 검토

2012년 국내에서 수확 후 급속냉동 저장된 송이버섯 생장정지품을 이용하여 해동 드립을 제조하였다. 드립 제조시 물 또는 기타 용매는 전혀 첨가하지 않은 상태이며, 해동 이후는 물리적으로 압착하여 최대한의 드립을 회수하였다. 먼저 냉동 송이버섯 1kg을 상온(25℃)에서 6시간 해동하는 경우, 70℃의 가열기에서 30분간 해동하는 경우 및 전자레인지를 이용하여 5분간 급속 해동하는 경우의 드립 수율 및 드립의 품질을 검토하였으며 그 결과는 표 1과 같다.

구분	드립 수율	드립 pH	드립 수용성 고형분 (brix)	관능특성
상온, 6시간 해동	52.2±4.3	4.94	5.6	향이 부드럽고 우수함
70℃, 30분 해동	61.6±5.1	4.82	5.3	향미 손실이 있음
5분 급속해동 (전자레인지)	65.5±6.3	5.08	5.8	향이 부드럽고 우수함

냉동 송이버섯으로부터 드립을 회수할 때, 고온 장시간 해동, 또는 상온 장시간 해동보다는 급속해동을 하는 것이 드립의 수용성 고형분 및 pH 측면에서 우수하며, 높은 수율을 얻을 수 있음을 확인하였다. 급속해동의 경우, 냉동송이의 수분함량이 ~90% 수준임을 감안할 때, 유전가열(전자레인지)을 이용하는 것이 바람직하다. 한편, 냉동송이의 드립을 회수하지 않고 그대로 분쇄하여 얻어진 액의 pH와 수용성 고형분 함량은 5.38 및 5.0으로 드립의 그것보다 낮았다. 따라서, 냉동송이버섯은 유전가열로 5분 이내 최대한 빨리 급속해동하고, 이를 물리적으로 압착하여 얻은 드립을 이용하였다.

조제된 송이버섯 드립의 총 플라보노이드(total flavonoid) 및 총 폴리페놀(total polyphenol) 함량, 총당 및 환원당 함량을 측정하였으며, 총 플라보노이드 함량의 표준품으로는 rutin, 총 폴리페놀 함량의 표준품으로 tannic acid을 사용하였다. 환원당은 DNS법으로, 총당은 phenol-sulfuric acid법을 이용하여 정량하였다. 대조구로는 냉동 송이버섯에 10배의 에탄올(95%, 덕산, 한국)을 가하여 12시간 추출하여 조제된 에탄올 추출물과, 상온에서 5배의 물을 가하여 2시간 교반 추출하여 조제된 물 추출물을 사용하였으며, 각각의 추출물은 60℃에서 감압농축하여 분말로 조제하였다. 본 발명의 드립과 각각의 추출물의 추출효율 및 성분 분석결과는 표 2에 나타내었으며, 가장 높은 수율은 급속해동한 드립에서 나타났으며, 에탄올 추출, 상온 물 추출의 순으로 나타났다. 성분 분석 결과, 상온 물 추출에서 가장 높은 폴리페놀, 플라보노이드, 총당 및 환원당 함량이 나타났으며, 에탄올 추출물, 드립의 순으로 나타났다. 그러나 관능적 측면에서는 드립 및 드립 제거 이후의 송이버섯에서 향미가 가장 우수하여, 드립 제거후의 송이버섯은 다른 에탄올 추? 및 물 추출물과 달리 통상의 송이버섯 용도로 사용 가능하였다.

한편, 에탄올 추출물의 효율이 상온 물 추출물보다 높음을 볼 때 송이버섯에 상당량의 지용성 성분이 포함되어 있음을 알 수 있으며, 드립의 경우 냉동송이가 해동되면서 수용성 당류 및 지용성 유기물이 동시에 유출되어 높은 수율을 나타냄을 알 수 있었다.

구분	회수율 (%)	함량 (mg/g)
		총 플라보노이드	총 폴리페놀	총당	환원당
송이버섯 드립	4.95±0.2	0.4±0.01	4.7±0.02	94.6±3.03	55.9±1.02
에탄올 추출물	3.9±0.1	0.4±0.02	8.1±0.27	76.0±5.11	43.5±2.89
상온 물 추출물	2.5±0.2	0.8±0.07	10.9±0.58	168.9±7.17	53.4±3.62

실시예 2: 송이버섯 드립의 유기용매 분획물 및 물 잔류물의 조제

송이버섯 드립을 대상으로 헥센, 에틸아세테이트, 부탄올을 이용하여 순차적 유기용매 분획을 실시하였으며, 최종적으로 물 잔류물을 회수하였다. 송이버섯 드립 중량대비 각각의 분획물의 수율과 성분 분석 결과는 표 3에 나타내었다.

구분	회수율/ 분획율(%)	함량 (mg/g)
		총 플라보노이드	총 폴리페놀	총당	환원당
송이버섯 드립	4.95±0.2	0.36±0.01	4.71±0.02	94.62±3.03	55.86±1.02
헥센 분획물	0.4±0.1	0.69±0.02	1.00±0.04	25.85±0.87	10.43±0.96
에틸아세테이트 분획물	1.5±0.2	0.76±0.07	4.50±0.08	89.21±0.72	75.62±0.36
부탄올 분획물	30.0±1.7	0.49±0.04	5.46±0.13	101.67±0.29	69.16±0.72
물 잔류물	75.4±3.9	0.38±0.03	3.38±0.90	92.63±0.65	80.68±1.50

송이버섯 드립의 75% 이상은 물 잔류물로 이행되었으며, 헥센 및 에틸아세테이트 분획은 드립의 2% 미만으로 나타났다. 드립의 물 잔류물은 송이버섯 드립과 유사하게 양호한 폴리페놀 및 플라보노이드 함량을 나타내었으며, 환원당 함량은 드립보다 1.5배 높게 나타났다.

실시예 3: 송이버섯 드립 및 분획물의 항혈전 활성 평가

송이버섯 드립 및 분획물들을 DMSO(dimethylsulfoxide)에 녹인 후 적당한 농도로 희석하여 인간 혈장을 이용하여 트롬빈 타임(thrombin time), 프로트롬빈 타임(prothrombin time)과 에이피티 타임(aPTT)을 측정하였다. 항혈전 활성은 기존에 보고된 방법에 준해 평가하였다(류 등 2010. J. Life Science, 20. 922-928). 혈장은 시판 control plasma(MD Pacific Hemostasis, MD Pacific, 중국)를 구입하여 사용하였다. 각각의 혈액응고 저해활성 평가법은 다음과 같다.

트롬빈 타임( Thrombin Time )

37℃에서 0.5U 트롬빈(Sigma Co., USA) 50μl와 20mM CaCl₂ 50μl, 다양한 농도의 시료 추출액 10μl를 Amelung coagulometer KC-1A(Japan)의 튜브에 혼합하여 2분간 반응시킨 후, 혈장 100μl를 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였다. 대조로는 아스피린(Sigma Co., USA)과 헤파린(heparin; Sigma Co., USA)을 사용하였으며, 용매 대조구로는 시료 대신 DMSO를 사용하였다. DMSO의 경우 32.1초의 응고시간을 나타내었다. 열 안정성 측정의 경우에는 다양한 농도의 시료용액을 100℃에서 30분간 열처리하고, 실온에서 1시간 방냉한 후, 잔존활성을 측정하였다. 트롬빈 저해 효과는 3회 이상 반복한 실험의 평균치로 나타내었으며, 시료 첨가시의 응고시간을 용매 대조구의 응고시간으로 나눈 값으로 나타내었다.

프로트롬빈 타임( prothrombin time )

표준혈장(MD Pacific Co., China) 70μl와 다양한 농도의 시료액 10μl를 Amelung coagulometer KC-1A(Japan)의 튜브에 첨가하여 37℃에서 3분간 가온 후, 130μl의 PT reagent를 첨가하고 혈장이 응고될 때까지의 시간을 3회 반복한 실험의 평균치로 나타내었다. 대조로는 아스피린(Sigma Co., USA)을 사용하였으며, 용매 대조구로는 시료 대신 DMSO를 사용하였다. DMSO의 경우 18.1초의 응고시간을 나타내었다. 프로트롬빈 저해효과는 3회 이상 반복한 실험의 평균치로 나타내었으며, 시료 첨가시의 응고시간을 용매 대조구의 응고시간으로 나눈 값으로 나타내었다.

aPTT ( activated Partial Thromboplastin Time )

혈장 100μl와 다양한 농도의 시료 추출액 10μl를 Amelung coagulometer KC-1A(Japan)의 튜브에 첨가하여 37℃에서 3분간 가온한 후, 50μl의 aPTT reagent(Sigma, ALEXIN^TM)를 첨가하고 다시 37℃에서 3분간 배양하였다. 이후 50μl CaCl₂(35mM)을 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였다. 용매 대조구로는 시료 대신 DMSO를 사용하였으며, 이 경우 55.1초의 응고시간을 나타내었다. aPTT의 결과는 3회 반복한 실험의 평균치로 나타내었으며, 시료 첨가시의 응고시간을 용매 대조구의 응고시간으로 나눈 값으로 나타내었다.

먼저 송이버섯 드립 및 분획물들의 혈액 응고저해활성은 표 4에 나타내었다. 대조구로 사용된 아스피린(1.5mg/ml)은 양호한 트롬빈, 프로트롬빈, 혈액응고인자 저해를 나타내어 각각 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임, 에이피티 타임을 가각 2.0배, 1.7배 및 1.9배 연장시켰으나, 송이버섯 드립(5mg/ml)에서는 연장효과가 나타나지 않았다. 그러나 분획물(5mg/ml)의 경우 에틸아세테이트 분획, 부탄올 분획에서 양호한 트롬빈 저해가 나타났으며, 에틸아세테이트 분획에서는 에이피티 타임을 1.4배 연장시키는 혈액응고저해 활성을 나타내었다. 또한 물 잔류물에서도 미약한 트롬빈 저해에 따른 혈액응고저해가 나타났다. 그러나, 전체적으로 실제 임상에서 사용되고 있는 항혈전제인 아스피린과 비교할 때 강력한 활성은 나타내지 못하였다.

구분		농도 (mg/ml)	혈액응고 저해활성*
			트롬빈 타임	프로트롬빈 타임	에이피티 타임
송이 버섯	송이버섯 드립	5	1.1±0.0	1.0±0.0	1.0±0.0
	헥센 분획물	5	1.1±0.0	1.0±0.0	1.0±0.0
	에틸아세테이트 분획물	5	1.9±0.1	1.1±0.0	1.4±0.1
	부탄올 분획물	5	1.5±0.2	1.0±0.0	1.0±0.0
	물 잔류물	5	1.2±0.1	1.0±0.1	1.0±0.0
디엠에스오 (DMSO)		-	1.0±0.0	1.0±0.0	1.0±0.0
아스피린 (Aspirin)		1.5	2.0±0.0	1.7±0.1	1.9±0.0

*) 시료 처리시 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임, 또는 에이피티 타임을 각각의 대조구 처리시 대응하는 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임, 또는 에이피티 타임으로 나눈 값

실시예 4: 송이버섯 드립 및 분획물의 혈소판 응집저해 활성

조제된 송이버섯 드립 및 분획물들을 이용하여 인간 혈소판 응집저해 활성을 평가하였다. 혈소판은 다양한 혈구세포와 함께 혈관을 순환하는 원반형의 작은 세포로서, 핵이 없는 대신 혈관손상보호 및 혈소판 응집과 관련된 다양한 물질을 고농도로 포함하는 cytoplasmic granule을 가지고 있으며, 혈관내벽의 손상이 나타나는 경우 응집인자들을 분비하고, 내피세포의 손상으로 노출된 collagen 등과 결합하여 1차 지혈 플러그(primary hemostatic plug)를 형성하여 혈전생성을 개시하는 중요한 세포이다, 따라서 혈소판 응집저해는 혈전 생성을 방지하는 매우 중요한 활성이다. 혈소판 응집저해 활성은 다음의 방법에 준해 평가하였다.

혈소판 응집저해 활성( Platelet aggregation inhibition activity )

혈소판은 건강한 인간의 전혈로부터 3.2% sodium citrate 용액과 1:9의 비율로 혼합한 후, 1.100rpm에서 10분간 원심분리하여 상층의 PRP(platelet rich plasma)를 취하고, 이를 washing buffer(138mM NaCl, 2.7mM KCl, 12mM NaHCO₃, 0.36mM NaH₂PO₄, 5.5mM Glucose, 1mM EDTA, pH 6.5)로 1회 세척하였다. 이후, suspending buffer(138mM NaCl, 2.7mM KCl, 12mM NaHCO₃, 0.36mM NaH₂PO₄, 5.5mM Glucose, 0.49mM MgCl₂, 0.25% gelatin, pH 7.4)에 재 현탁한 후, 3,000rpm에서 10분간 원심분리한 후 다시 suspending buffer에 재 현탁하였으며, 이때 혈소판 수는 4x10⁹/ml이 되도록 조정하였다. 이후 1ml 현탁액에 2.5μl collagen을 가해 5분간 반응시키고, whole-blood aggregometer(Chrono-log, USA)를 사용하여 37℃에서 혈소판 응집을 측정하였다.

혈소판 응집저해능 평가결과는 표 5 및 도 1에 나타내었다. 아스피린은 농도의존적으로 우수한 혈소판 응집저해 효과를 나타내었으며, 평가시료 중 송이버섯 드립 및 헥센 분획물은 0.25mg/ml 농도에서 85.5~103.2%의 응집능을 나타내어 항혈전 효과가 미약한 것으로 나타났다. 분획물 중 에틸아세테이트 및 부탄올 분획에서는 동일농도(0.25mg/ml)의 아스피린보다 강력한 혈소판 응집저해 활성을 나타내었고, 특히 물 잔류물의 경우 0.25mg/ml 농도에서 혈소판 응집을 95% 이상 저해함을 확인하였다. 이러한 강력한 저해효과는 농도의존적으로 나타났으며, 드립의 물 잔류물 비율이 75% 임을 고려할 때 전혀 예상하지 못한 결과로, 송이버섯 드립에는 혈소판 응집저해 활성을 억제하는 물질이 포함되어 있음을 의미한다. 물 잔류물이 정제되지 않은 상태임에도 불구하고, 혈소판 응집저해 활성은 아스피린보다 강력하여 송이버섯 드립 및 이의 분획물, 특히 물 잔류물은 기존의 항혈전제를 대치할 수 있음을 보여주며, 아주 낮은 농도로도 혈액순환 개선이 필요한 피부조직, 혈관계에 성공적으로 사용 가능하리라 판단된다.

시료/대조구	강도 (Amplitude: ohm)	기울기 (Slope)	연장시간 (Lag time:초)	하강면적 (Area under)	혈소판 응집능(%)
디엠에스오 (DMSO: 용매)	16	3	14	126.3	100.0±2.0
	16	3	14	121.4
아스피린 0.5 mg/ml	11	1	114	59.5	48.0
아스피린 0.25 mg/ml	13	2	46	91.2	73.6
드립 (0.25 mg/ml)	16	3	24	105.9	85.5
헥센 분획물 (0.25 mg/ml)	17	3	15	127.8	103.2
에틸아세테이트 분획물 (0.25 mg/ml)	13	2	29	76.6	61.8
부탄올 분획물 (0.25 mg/ml)	11	2	23	72.8	58.8
물 잔류물 (0.25 mg/ml)	1	0	206	6.2	5.0
물 잔류물 (0.18 mg/ml)	15	2	24	95.2	76.9
물 잔류물 (0.12 mg/ml)	17	2	24	108.8	87.8

실시예 5: 송이버섯 드립 및 분획물의 인간 적혈구 용혈활성

송이버섯 드립 및 분획물의 적혈구 용혈활성을 평가한 결과는 표 6에 나타내었다. 먼저 대조구로 사용된 DMSO와 물은 용혈활성이 없었으며, triton X-100은 0.1% 농도에서 적혈구를 100% 용혈시킴을 확인하였다. 0.5mg/ml 농도에서, 송이버섯 시료 중에서는 드립의 헥센 분획물에서만 20.9%의 용혈활성이 나타나 잠재적인 독성이 있는 것으로 나타났으며, 그 외의 시료는 용혈활성이 나타나지 않았다. 그러나 송이버섯은 식용으로 등재되어 있으며, 드립에서 헥센 분획물이 차지하는 비율이 0.4% 임을 고려할 때, 송이버섯 드립은 별도의 독성을 나타내지는 않을 것으로 판단된다. 상기의 결과들을 종합할 때, 송이버섯 드립 및 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분힉물 및 물 잔류물은 항혈전제로 유망하며, 특히 부작용이 없으면서, 강력한 혈소판 응집효과를 나타내는 물 잔류물은 건강기능식품, 화장품, 의약품 산업에 항혈전제로 사용 가능하리라 판단된다.

구분	시료/대조구	인간 적혈구 용혈활성 (%)
송이버섯 (0.5 mg/ml)	드립	1.2±1.4
	헥센 분획물	20.9±2.3
	에틸아세테이트 분획물	7.4±2.4
	부탄올 분획물	-1.3±0.2
	물 잔류물	1.4±2.0
대조구	증류수	0.0±0.9
대조구	용매(DMSO)	1.1±1.5
대조구	Triton X-100	100±1.7

실시예 6: 송이버섯 드립 및 물 잔류물의 안정성

상기 실시예의 송이버섯 물 잔류물을 각각 100℃에서 1시간 처리, pH 2 (0.01M HCl)에서의 2시간 처리, 혈장에서 2시간 처리 후 잔존 혈소판 응집저해 활성을 평가한 결과, 상기의 처리시에 모두 초기 활성을 유지함을 확인하여, 상기의 활성 분획물들이 산, 열, 및 혈장 처리시 높은 안정성을 나타냄을 알 수 있었다(결과 미제시).

Claims (6)

1. 송이버섯(Tricholoma matsudake)을 압착하여 회수한 드립(drip)을 헥센, 에틸아세테이트 및 부탄올의 유기용매로 순차 분획한 후 남은 물 잔류물을 유효성분으로 함유하는 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 드립은 냉동 송이버섯을 해동시킨 후 물리적으로 압착하여 회수하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
3. 송이버섯(Tricholoma matsudake)을 압착하여 회수한 드립(drip)을 헥센, 에틸아세테이트 및 부탄올의 유기용매로 순차 분획한 후 남은 물 잔류물을 유효성분으로 함유하는 혈전성 질환의 개선용 건강 기능 식품.
4. 제 3항에 있어서, 상기 드립은 냉동 송이버섯을 해동시킨 후 물리적으로 압착하여 회수하는 것을 특징으로 하는 건강 기능 식품.
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6. 삭제

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