KR101922972B1 - 항혈전 활성을 나타내는 비오일성 들깨 종피 추출물 및 이의 용도 - Google Patents

항혈전 활성을 나타내는 비오일성 들깨 종피 추출물 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 들깨(Perilla fruescens) 종피 추출물을 유효성분으로 함유하는 항혈전(anti-thrombosis) 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는, 수세 후 냉풍 건조한 비파쇄 및 비가열된 들깨 종자를 95% 에탄올로 10~24시간 실온에서 종피 성분만을 추출하여 조제된 추출물 및 이의 활성 분획물을 유효성분으로 함유하는 항혈전 용도의 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 항혈전성 조성물의 유효성분으로서의 비마쇄 및 비가열된 들깨 종자로부터 얻어진 들깨 종피 에탄올 추출물은 본 명세서의 실시예를 통해 증명된 바와 같이, 인간 혈전생성 효소 및 혈전생성인자를 특이적으로 저해하며, 특히, 열 안정성이 우수하고, pH 2의 산성조건 및 혈장 내에서도 상기 활성의 감소가 나타나지 않아, 추출액, 분말, 환, 정 등의 다양한 형태로 가공되어 항혈전성 식품, 건강 기능 식품, 약학 조성물 또는 의약품 첨가제 등의 용도에 적용되기에 매우 유용한 발명이다.

Description

항혈전 활성을 나타내는 비오일성 들깨 종피 추출물 및 이의 용도{THE NON-OILY EXTRACTS HAVING ANTI-THROMBOSIS ACTIVITY EXTRACTED FROM PERILLA FRUESCENS SEED COAT AND THE USE THEREOF}
본 발명은 들깨(Perilla fruescens) 종피 추출물을 유효성분으로 함유하는 항혈전(anti-thrombosis) 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는, 수세 후 냉풍 건조한 비파쇄 및 비가열된 들깨 종자를 95% 에탄올로 10~24시간 실온에서 종피 성분만을 추출하여 조제된 추출물 및 이의 활성 분획물을 유효성분으로 함유하는 항혈전 용도의 조성물에 관한 것이다.
인체 구성 성분으로서의 혈액은 산소, 영양분, 노폐물의 운반 기능과 완충 작용, 체온 유지, 삼투압 조절 및 이온 평형 유지, 수분 일정 유지, 액성 조절 작용, 혈압의 유지 및 조절, 생체 방어 등 다양한 중요 기능들을 가지고 있다. 정상적인 혈액 순환은 체내에서의 혈액 응고 반응계와 혈전 용해 반응계가 상호 보완적으로 조절되면서 혈액 순환을 용이하게 하며, 이들 중 혈액 응고 반응계의 기작은 혈관벽에 혈소판이 점착, 응집하여 혈소판 혈전을 형성한 후, 혈액 응고계가 활성화되어 혈소판 응집괴를 중심으로 피브린 혈전이 형성되는 것으로 보고되어 있다.
한편, 피브린 혈전의 생성은 수많은 혈액 응고 인자들의 여러 단계 반응을 거쳐 피브린 응고에 관여하는 트롬빈이 활성화되어, 최종적으로 피브리노겐으로부터 피브린 단량체를 생성하게 하며, 피브린 단량체들은 칼슘에 의해 중합되어, 혈소판과 내피세포에 결합하게 되며 XIII 인자에 의해 교차 결합된 피브린 폴리머를 형성하면서 영구적인 혈전을 생성하게 된다. 또한, 트롬빈은 혈소판, V 인자, VII 인자들을 활성화시켜 혈액 응고 반응을 촉진시키는 등 혈전 생성에 중추적 역할을 하게 된다. 따라서, 트롬빈의 활성 저해물질은 과다한 혈액 응고 이상으로 발생하는 다양한 혈전성 질환에 매우 유용한 예방 및 치료제로 사용될 수 있다. 한편, 내인성 혈전 생성 경로에는 XII 인자, XI 인자, XII 인자, IX 인자, X 인자의 순차적 활성화에 이은 프로트롬빈의 활성화가 최종적으로 트롬빈을 활성화하는 것으로 알려져 상기의 혈액 응고 인자의 특이적 저해 역시 중요한 혈전성 질환 치료제의 개발 타겟이 되고 있으며, 외인성 혈전 생성경로의 경우, factor II (prothrombin), V 인자, VII 인자, X 인자의 활성화에 따른 혈전 생성이 알려져 있다. 현재까지, 혈전성 질환의 예방과 치료에 헤파린, 쿠마린, 아스피린, 유로키네이즈 등의 다양한 항응고제, 항혈소판제, 혈전용해제 등이 사용되고 있으나, 이들은 가격이 매우 높을 뿐 아니라, 출혈성 부작용과 위장 장해 및 과민 반응 등으로 그 사용이 한정되고 있는 실정이다.
한편, 들깨(Perilla fruescens)는 꿀풀과(Labiatae)에 속하는 일년생 초본과 식물로, 임자 또는 수임자로 불리기도 하며, 우리나라, 중국, 일본 및 인도에서 대량으로 재배되고 있다. 종실은 둥글며 큰 것은 2.5~2.3mm이고, 작은 것은 길이가 1mm이다. 종자는 매우 작아서 1,000개의 무게가 약 4g 정도이다. 종자의 색은 회백색~진한 갈색~흑색으로 다양하며, 종피의 색에 따라 다양한 색이 나타난다. 종자 내부에는 다량의 기름을 함유하고 있으며, 착유용 들깨는 종피 비율이 낮은 대유들깨를 사용한다.
들깨는 향신식물 및 유지식물로 매우 중요하며, 들깨 종자는 40% 이상의 기름을 포함하고 있어 이를 볶아 착유하여 식물성 기름을 채취하는데 주로 사용되며, 주로 perillene, elscholzia ketone, linoleic acid, palmitic acid 등의 성분이 알려져 있다. 들깨는 조리식품에서는 통깨 및 볶은 깨로 이용되며, 들깨죽 및 깨강정 등 한과 재료로도 이용된다. 또한, 들깨는 참깨와는 달리 잎을 식용하며, 잎에는 0.4% 정도의 휘발성 기름이 들어 있는데, 그 주성분은 페닐라케톤(C10H14O2)로서 특이한 냄새가 난다. 또한, 들깨잎은 perilla aldehyde 라는 특유의 향미 성분을 함유하고 있어 비린내를 없애고 향기를 더해주어 다양한 쌈채소 및 절임식품으로 애용되고 있다. 따라서, 들깨는 종자와 잎을 동시에 이용하므로, 쌀보다 2.0배, 참깨보다 2.7배의 소득증대를 나타내고 있다.
국내에서 들깨유는 약용 및 식용으로 이용되고 있으며, palmitic acid(C16:0), stearic acid(C18:0), oleic acid(C18:1), linoleic acid(C18:2), linolenic acid(C18:3) 등으로 구성되어 있으며, 전체적으로 불포화지방산이 90% 이상을 차지하며, 그 중 알파-리놀렌산이 60%를 차지하는 것으로 알려져 있다. 최근 들깨유의 콜레스테롤 축적 억제, 지방축적 감소 및 체중감소 효과(Kang MH 등, The Korean Nutrition 2005. 38: 3-10), 혈소판 응집저해 및 혈전 생성 억제(채경미, 2014. 충북대학교 수의학과 석사논문) 등이 보고되면서 그 수요가 빠르게 증가되고 있으며, 이러한 들깨유의 콜레스테롤 축적 억제, 지방축적 감소, 체중 감소, 지질 대사개선 및 혈소판 응집 저해 및 혈전 생성 억제는 대부분 들깨유의 알파-리놀렌산에 의한 효과로 확인되고 있다.
한편, 알파-리놀렌산을 포함한 들깨유의 고도 불포화지방산은 포화지방산에 비해 산패가 빠르게 진행되며, 고온에서 볶은 들깨로부터 제조한 들깨유는 가열 볶음 과정 중에 필수 지방산 함량이 감소하며, 특히, 알파-리놀렌산 함유량은 63%에서 3.9%로 감소하는 경우도 알려져 있다(강희정 김정상, 1998, 식품산업과 영양 3: 65-72). 따라서, 최근에는 들깨 종자를 수세, 선별 후, 냉풍건조, 저온착유, 저온 침지 등의 과정을 통해 필수지방산의 산패 및 분해가 최소화 되도록 제조된 생들깨유에 관심이 집중되고 있다. 그러나, 저온에서 생들깨유 제조시에는 볶은 들깨를 이용하는 경우보다 착유 수율이 낮으며, 유용성분의 회수율이 상대적으로 낮은 문제점이 있으며, 생들깨유 착유 후의 들깨박에는 우수한 유용성분, 영양성분이 다량 존재하여 경제성 측면에서 문제가 있다.
한편, 들깨의 유용 성분 및 유용 활성에 대한 연구로는 암세포 성장 억제, 대장암 예방 효과 및 혈중 지질개선 활성(강희정 외, 1998. 식품산업과 영양 3: 65-72)이 보고되었으며, 들깨 메탄올 추출물의 항산화 및 항균 활성(문영건, 허문수, 2007. 한국생물공학회지 22: 78-83), 들깨박 에탄올 추출물의 항산화 활성(손종연 외, 2014. 한국식품조리과학회지 29, 407-416) 및 착유한 들기름의 메탄올 추출물의 항산화 효과도 보고(신경아 외, 1998. Korean J. Food Sci. Technol. 30: 1045-1050)된 바 있다. 한편, 이유나 등은 in vitro 실험에서 생들깨 및 볶은 들깨의 에탄올 추출물이 모두 항염증 활성을 유사하게 나타낸 반면, 동물실험에서는 볶은 들깨 에탄올 추출물만이 항염증 활성을 나타냄을 보고하여, 생들깨 및 볶은 들깨의 성분과 생리활성이 서로 상이함을 보고한 바 있다(Lee Y, 2014, Korean J. Food Sci. Technol. 46, 61-67). 또한, 볶은 들깨박의 암 예방효소 활성성분(홍은영 외. 1997. 한국식품영양과학회지 26, 193-197) 및 들깨박의 메탄올 추출물이 항산화능을 매개로 노화촉진 마우스에서 인지기능 향상 효과(엄민영 외, 2004. 한국식품과학회지 36, 637-642) 및 메탄올 추출물의 acetylcholine esterase 억제활성(최원희 등, 2004. 한국식품과학회지 36, 1026-1031) 등이 알려져 있다. 기타 들깨박을 이용한 가공식품 개발연구로는 들깨박을 첨가한 제과제빵의 품질 특성에 관한 연구 및 들깨 다식(한정아 외, 2015, 한국식품영양과학회지 44, 1832-1838) 연구가 알려져 있다(유지선, 2010,부산대학교 석사논문).
한편, 들깨와 관련된 특허문헌으로는 [생들깨유 제조와 관련된 효소처리와 같은 전처리 기술에 의해 추출수율이 극대화된 생들기름의 제조방법] (등록특허 제10-1429143호), [생 들기름 및 그 제조방법] (등록특허 제10-1674076호), [생들깨, 생산초로부터 오메가 지방산을 추출하는 방법] (등록특허 제10-1649255호) 등이 알려져 있으며, 들깨의 효능으로는 [들깨박 추출물을 유효성분으로 함유하는 인지기능 장애예방 및 개선용 조성물] (등록특허 제10-0614970호), [뉴라미니데이즈 억제활성을 가지는 들깨 추출물] (등록특허 제10-1153870호), [항염증 효과가 있는 암조건에서 최아된 들깨새싹 추출물] (등록특허 제10-1694660호)이 알려져 있다. 한편, 들깨에 대한 공개특허로는 제10-1992-0000083호 [참깨 박 또는 들깨 박에서 아임계 또는 초임계유체에 의한 참기름 또는 들기름을 추출 분리하는 방법], 공개특허 제10-2016-0132288호 [풋내가 제거된 생들깨 추출물의 제조 방법], 공개특허 제10-2012-0086919호 [발아들깨유의 제조방법]이 알려져 있다. 또한, 공개특허 제10-2000-0003500호 [들깨기름을 유효성분으로 포함하는 혈액내 지방 강하제] 공개특허 제10-2001-0076113호 [들깨기름을 유효성분으로 포함하는 혈압 강하제], 공개특허 제10-2001-0076112호 [들깨기름을 유효성분으로 포함하는 혈소판 응집 저해제]가 공개되어 있으나, 상기 공개특허에는 들깨 기름이 혈소판 응집을 억제하며, 혈전 생성을 감소시킨다고 언급하고 있을 뿐, 이와 관련된 실험 결과나 증빙자료는 제시되어 있지 않다.
이와 같이, 현재까지는 비마쇄 및 볶음 과정없이 냉풍건조한 들깨로부터 유기용매 추출하여 제조된 들깨 종피 추출물과 이의 순차적 유기용매 분획물을 유효성분으로 함유하는 항혈전 조성물에 관해서는 알려진 바 없다.
KR 10-2001-0076112 A
채경미, 2014. 충북대학교 수의학과 석사논문. 들깨유의 혈소판응집 및 혈전생성 억제를 통한 출혈성 뇌졸중 개선효과
본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 정선, 수세한 들깨 종자를 냉풍 건조 후 마쇄하거나, 가열처리(볶음) 과정 없이 에탄올을 이용하여 10~24시간 추출하여 제조된 들깨 종피 에탄올 추출물 및 이의 활성 분획물을 유효성분으로 함유하는 항혈전 조성물을 제공하고자 하는 것이다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 들깨(Perilla fruescens) 종피 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 들깨 종피 추출물은 비파쇄 및 비가열된 들깨 종자의 에탄올 추출물인 것이 바람직하다.
상기 들깨 종피 추출물은 비파쇄 및 비가열된 들깨 종자의 에탄올 추출물의 헥센 분획물, 에틸아테이트 분획물 또는 부탄올 분획물인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물의 유효성분을 함유하는 항응고제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물의 유효성분을 포함하는 혈전증의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품을 제공한다.
본 발명의 항혈전성 조성물의 유효성분으로서의 비마쇄 및 비가열된 들깨 종자로부터 얻어진 들깨 종피 에탄올 추출물은 본 명세서의 실시예를 통해 증명된 바와 같이, 인간 혈전생성 효소 및 혈전생성인자를 특이적으로 저해하며, 특히, 열 안정성이 우수하고, pH 2의 산성조건 및 혈장 내에서도 상기 활성의 감소가 나타나지 않아, 추출액, 분말, 환, 정 등의 다양한 형태로 가공되어 항혈전성 식품, 건강 기능 식품, 약학 조성물 또는 의약품 첨가제 등의 용도에 적용되기에 매우 유용한 발명이다.
도 1은 본 발명의 실시예에서 사용된 들깨유, 들깨박, 들깨 종피의 에탄올 추출물의 제조 공정도를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 발명자들은 들깨 종자를 대상으로 항혈전 활성을 검정하기 위하여, 통상의 방법으로 볶은 들깨 종자로부터 착유한 볶은 들깨유 및 이의 들깨박, 냉풍 건조, 저온 착유로 얻어진 생들깨유 및 이의 들깨박을 제조하고, 이후 볶은 들깨박 및 생들깨박의 에탄올 추출물을 조제하였다. 조제된 볶은 들깨유, 생들깨유, 볶은 들깨박 에탄올 추출물 및 생들깨박 에탄올 추출물을 대상으로 혈전 생성과 관련된 인간 트롬빈, 프로트롬빈 효소 및 혈액응고인자의 저해활성을 평가한 결과, 모든 추출물에서 의미있는 항혈전 활성은 확인되지 않았다.
이후, 비마쇄, 비가열 들깨 종자에 에탄올을 가하고 10~24시간 추출하여 들깨 종피 에탄올 추출물을 조제하여 상기 항혈전 활성 평가 결과, 매우 강력한 항혈전 활성을 확인하였으며, 상기 들깨 종피 에탄올 추출물의 헥센 분획물, 에틸아세테이트 분획물 및 부탄올 분획물도 에탄올 추출물과 마찬가지로 우수한 항혈전 활성을 나타내었다.
또한, 종피 추출한 이후의 들깨 종자를 다시 착유한 결과, 들깨유 수율은 종피를 추출하지 않은 들깨 종자에 비해 추출 효율이 1% 정도 감소할 뿐이었으므로, 종피 추출시 들깨 종자 내부의 기름 성분은 추출되지 않음을 확인하였다.
상기 들깨 종피 추출물과 이의 활성 분획물들은 인간 적혈구에 대해 용혈 활성은 전혀 나타내지 않으면서도 열 안정성과 산 안정성이 우수한 특징을 가짐을 확인함으로써 상기 비마쇄, 비가열 들깨로부터 조제된 종피 추출물 및 이의 유기용매 분획물들을 항혈전 조성물로 활용하고자 하였다.
따라서, 본 발명은 들깨(Perilla fruescens) 종피 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 들깨 종피 추출물은 비파쇄 및 비가열된 들깨 종피 추출물일 수 있다.
또한, 상기 들깨 종피 추출물에 사용되는 추출 용매는 주정, 탄소수 1~4의 무수 또는 함수 저급 알코올(메탄올, 에탄올, 주정, 프로판올, 부탄올 등), 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매 등을 이용할 수 있으며, 95% 에탄올 추출물인 것이 바람직하다.
또한, 상기 들깨 종피 추출물은 비파쇄 및 비가열된 들깨 종자의 에탄올 추출물의 헥센 분획물, 에틸아테이트 분획물 또는 부탄올 분획물인 것이 바람직하다.
바람직한 구체예로서, 상기 유기용매 분획물들은 들깨 종자의 에탄올 추출물을 헥센, 에틸아세테이트 및 부탄올로 순차 분획하여 수득될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물의 유효성분을 함유하는 항응고제를 제공한다.
상기 항응고제는 혈액 응고 저해 활성을 나타내는 약학적 조성물을 의미할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물의 유효성분을 포함하는 혈전증의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품을 제공한다.
이하에서는, 본 발명의 들깨 종피 추출물의 제조 방법 및 효능 실험 등을 보다 구체적으로 설명한다.
본 발명의 들깨 종피 추출물 및 효능 실험은 들깨 종자를 선별, 수세하는 단계; 들깨 종자를 냉풍 건조하는 단계; 건조 들깨 종자로부터 추출물을 조제하는 단계; 상기 추출물의 순차적 유기용매 분획물의 조제 단계; 상기 추출물 및 분획물의 항혈전 활성을 평가하는 단계; 및 활성 물질의 안정성 조사 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물에 포함되는 "비마쇄 및 비가열된 들깨 종자의 종피 추출물"은 성숙 들깨의 종자를 채취하여 세척하는 단계, 이를 15 내지 20℃의 냉풍으로 건조하는 냉풍 건조단계, 건조 들깨 종자에 10배의 에탄올을 가하여 종피 성분을 용매 추출하는 단계 및 상기 추출액을 0.06mm 이하의 여과망을 사용하여 여과하고, 이를 감압농축하는 단계에 의해 수득될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용매는 주정, 탄소수 1~4의 무수 또는 함수 저급 알코올(메탄올, 에탄올, 주정, 프로판올, 부탄올 등), 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매 등을 이용할 수 있으며, 95% 에탄올 추출이 가장 바람직하다.
또한, 상기 종피 추출물은 헥센, 에틸아세테이트 및 부탄올의 유기 용매로 순차 또는 각각 분획하여 헥센 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물 및 물 잔류물을 추가적으로 수득할 수도 있다.
본 발명에서는, 먼저 기존의 공지된 방법대로 들깨유와 들깨박 추출물을 조제하고 이들의 항혈전 활성을 평가하였다. 볶은 들깨유는 통상의 방법대로 열풍건조한 들깨를 190℃에서 15~20분간 볶은 후, 이를 550 내지 600 kgf/㎠의 압력으로 착유하여 제조하였으며, 이후 부산물로 얻어진 볶은 들깨박은 에탄올 추출 및 감압농축하여 볶은 들깨박 에탄올 추출물을 조제하였다. 생들깨유는 대한민국 등록특허 10-1674076호 [생 들기름 및 그 제조방법]에서 개시한 방법대로, 수세한 들깨 종자를 15 내지 20℃의 냉풍으로 건조하는 냉풍 건조 단계; 건조된 들깨를 메쉬 구조를 가지는 천에 담아 15 내지 20℃의 온도에서 압력을 가하여 생 들기름을 얻는 착유단계; 및 상기 착유된 생 들기름을 5 내지 10℃의 온도에서 정치시키는 정제 단계를 통해 얻었으며, 이후 부산물로 얻어진 생들깨박은 에탄올 추출 및 감압 농축하여 생들깨박 에탄올 추출물을 조제하였다.
조제된 4종의 추출물들을 5mg/ml의 농도로 하여 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임, 에이피티 타임을 각각 측정한 결과, 생들깨유 및 볶은 들깨유는 트롬빈 타임에서는 변화를 나타내지 않았으며, 프로트롬빈 타임 및 에이피티 타임은 오히려 감소시켜 혈전 생성을 촉진함을 알 수 있었다. 즉, 기름 성분으로 구성된 볶은 들깨유 및 생들깨유는 트롬빈 활성에는 영향을 미치지 않았으며, 프로트롬빈 및 혈액응고인자들에는 활성화 효과를 나타내어 혈전 생성을 촉진함을 확인하였다. 반면, 생들깨박 추출물 및 볶은 들깨박 추출물의 항혈전 활성을 측정한 결과, 생들깨박 추출물은 무첨가구에 비해 각각 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임, 에이피티 타임을 1.35배, 1.10배, 1,23배 연장시켜 미약한 항응고 활성이 나타났으며, 볶은 들깨박 추출물은 무첨가구에 비해 각각 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임, 에이피티 타임을 1.34배, 0.92배, 0.93배 연장시켜 미약한 트롬빈 저해 활성이 나타났다. 이러한 결과는 들깨 착유 기름에는 혈액 응고 효소 및 혈액 응고 인자 저해를 나타내는 항혈전 활성이 없으며, 들깨박의 경우 생들깨박에서 부분적인 항혈전 활성물질을 포함하며, 들깨 종자의 항혈전 성분은 들깨 내부의 기름 성분이 아닌 종피에서 기인함을 의미하였다.
따라서, 본 발명에서는 비마쇄, 비가열한 상태의 들깨 종자의 종피 성분만을 추출하고자 하였으며, 냉풍 건조한 들깨 종자에 10배 부피의 에탄올을 가해 종피 에탄올 추출물을 조제하고, 이후 이의 유기 용매 분획물을 조제하였다. 조제된 에탄올 추출물 및 유기 용매 분획물을 5mg/ml의 농도로 하여 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임, 에이피티 타임을 각각 측정한 결과, 에탄올 추출물에서 매우 강력한 항혈전 활성을 확인하였으며, 종피 추출물의 헥센 분획물, 에틸아세테이트 분획물 및 부탄올 분획물에서도 매우 강력한 트롬빈, 프로트롬빈, 혈액응고인자 저해 활성에 의한 항혈전 활성을 확인하였다. 이때, 들깨 종자로부터 0.8% 수율로 종피 추출물을 회수하였으며, 종피 추출물을 회수한 후의 들깨 종자는, 들깨를 저온 착유한 경우와 거의 유사하게 35%의 들기름을 착유할 수 있었다. 따라서, 들깨의 항혈전 활성 성분은 들깨 종자의 종피에 존재하며, 에탄올 추출시 마쇄 또는 가열처리되지 않는 들깨 종자를 이용하여 종피 성분만을 추출하는 것이 필수적임을 확인하였다.
본 발명의 들깨 종자의 종피 추출물 및 이의 활성 분획물들은 감압건조 및 동결건조, 또는 분무건조 등과 같은 통상적인 분말화 과정을 거쳐 분말로 제조될 수 있다. 이들은 혈장 내의 다양한 분해효소에 분해되지 않으며, 100℃의 열처리와 pH 2의 인체 위 내의 pH에서도 활성을 유지한다.
본 발명의 약학적 조성물의 유효성분은 혈전증과 관련된 다양한 질환들의 예방 또는 치료용으로 사용될 수 있다. 상기 질환들은, 예를 들어, 동맥 혈전증으로서, 급성 심근 경색증, 가슴 통증, 호흡 곤란, 의식 소실, 허혈성 뇌졸중, 출혈성 뇌졸중, 두통, 운동 이상, 감각 이상, 성격 변화, 시력 저하, 간질 발작, 폐 혈전증, 심부정맥 혈전증, 하지 부종, 통증 및 급성 말초 동맥 폐쇄증 등을 들 수 있고, 정맥 혈전증으로서, 심부정맥 혈전증, 간문맥 혈전증, 급성 신장정맥 폐쇄증, 뇌 정맥동 혈전증 및 중심 망막정맥 폐쇄 등을 들 수 있다.
본 발명의 유효 성분을 포함하는 약학적 조성물 및 항응고제는 각각의 사용 목적에 맞게 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구 제형, 멸균 주사용액의 주사제 등 다양한 형태로 제형화하여 사용할 수 있으며, 경구 투여하거나 정맥 내, 복강 내, 피하, 직장, 국소 투여 등을 포함한 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다.
이러한 약학적 조성물 및 항응고제에는 추가적으로 담체, 부형제 또는 희석제 등이 더 포함될 수 있으며, 포함될 수 있는 적합한 담체, 부형제 또는 희석제의 예로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리쓰리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 비정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물 및 항응고제는 충전제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 더 포함할 수도 있다.
바람직한 구체예로서, 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 약학적 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 혼합하여 제형화한다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 등과 같은 윤활제가 사용될 수도 있다.
바람직한 구체예로서, 경구용 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 예시될 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
바람직한 구체예로서, 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액제, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제, 좌제 등을 예시할 수 있다. 비수성용제, 현탁제에는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 포함될 수 있다. 주사제에는 용해제, 등장화제, 현탁화제, 유화제, 안정화제, 방부제 등과 같은 종래의 첨가제가 포함될 수 있다.
본 발명의 유효 성분은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물 및 항응고제는 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
바람직한 구체예로서, 본 발명의 약학적 조성물 및 항응고제에서 유효성분의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 ㎏ 당 1 내지 5,000mg, 바람직하게는 100 내지 3,000mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물 및 항응고제는 다양한 경로를 통하여 대상에 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에서 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 약학적 조성물 및 항응고제의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 일반적인 모든 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물 및 항응고제는 유효성분을 표적 세포로 전달할 수 있는 임의의 장치를 이용해 투여될 수도 있다.
본 발명에서 "대상"은, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 인간, 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함하고, 바람직하게는 포유류, 보다 바람직하게는 인간을 의미한다.
상기 본 발명의 유효성분은 상기 설명된 약학적 조성물 및 항응고제의 용도 이외에도 다음과 같은 건강 기능 식품의 용도로도 적용될 수 있다.
본 발명의 건강 기능 식품은 혈전증의 예방 또는 개선에 효과적인 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 유효성분을 포함하는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.
본 발명의 유효성분은 일반적으로 전체 식품 중량의 0.01 내지 15중량%로 가할 수 있으며, 건강음료 조성물은 100ml를 기준으로 0.02 내지 10g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다.
본 발명의 건강 기능 식품은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 것 외에 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제, 예컨대, 천연 탄수화물 및 다양한 향미제 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상기 천연 탄수화물의 예로는 포도당, 과당 등의 단당류, 말토오스, 수크로오스 등의 이당류 및 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 다당류와 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등의 당알코올이 있다.
상기 향미제로는 타우마틴, 레바우디오시드 A 또는 글리시르히진과 같은 스테비아 등의 천연 향미제 및 사카린, 아스파르탐 등의 합성 향미제를 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강 기능 식품 100ml 당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g을 사용한다. 상기 외에 본 발명의 건강 기능 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물, 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강 기능 식품은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료 등의 제조를 위한 과육을 함유할 수도 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 본 발명의 유효성분 100중량부 당 0.01 내지 약 20중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 바람직한 하나의 구체예일뿐이며, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예의 범위로 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
실시예 1: 들깨유 , 들깨박 에탄올 추출물, 들깨 종자의 종피 추출물의 제조
2016년 10월 경북 안동에서 수확한 들깨를 구입하여, 흐르는 물에 수세하여 이물질을 제거한 후, 들깨유 및 들깨박의 에탄올 추출물을 조제하였다. 볶은 들깨유는 열풍건조한 들깨를 190℃에서 15~20분간 볶은 후, 이를 550 내지 600 kgf/㎠의 압력으로 착유하여 제조하였으며, 이후 부산물로 얻어진 볶은 들깨박은 에탄올 추출 및 감압농축하여 볶은 들깨박 추출물을 조제하였다. 생들깨유는 수세한 들깨 종자를 15~20℃의 냉풍으로 건조하는 냉풍 건조단계; 건조된 들깨를 메쉬 구조를 가지는 천에 담아 15~20℃의 온도에서 압력을 가하여 생 들기름을 얻는 착유단계; 및 상기 착유된 생 들기름을 5~10℃의 온도에서 정치시키는 정제단계를 통해 얻었으며, 이후 부산물로 얻어진 생들깨박은 에탄올 추출 및 감압농축하여 생들깨박 추출물을 조제하였다. 한편, 들깨 종자의 종피 추출물은 마쇄 또는 가열처리(볶음) 하지 않은 들깨 종자를 수세한 후 15~20℃의 냉풍으로 건조하고, 이후 들깨 종자에 10배 부피의 에탄올을 가해 종피 에탄올 추출물을 조제하였다. 또한, 조제된 볶은 들깨박 에탄올 추출물, 생들깨박 에탄올 추출물 및 들깨 종자의 종피 추출물은 감압 농축하여 분말로 제조하였다(도 1 참조).
이때, 생들깨유의 회수율은 34.5%, 볶은 들깨유의 회수율은 42.5%로 나타났으며, 들깨박의 에탄올 추출물의 수율은 볶음과 무관하게 11.1~11.2%를 나타내었으며, 들깨 종자의 종피 추출물 수율은 0.8% 이하를 나타내었다.
실시예 2: 들깨, 들깨유 , 들깨박의 영양학적 성분 분석
실시예 1에서 제조된 들깨유 및 들깨박의 영양성분을 분석하였다. 실험에 사용된 들깨, 착유된 들깨유, 부산물로 생성된 들깨박의 수분함량, 조단백, 조지질, 조탄수화물, 조회분 함량을 식품공전에서 정한 방법대로 각각 분석하였으며, 그 결과는 표 1에 나타내었다.
Figure 112017033178385-pat00001
그 결과, 들깨를 볶는 경우, 수분함량 및 조단백 함량은 감소하고 조지질 및 조탄수화물 함량은 증가하는 것으로 나타났으며, 회분 함량은 변화가 없었다. 저온 착유하여 제조된 생들깨유의 경우 영양성분 측면에서는 볶은 들깨유와 거의 유사하였다. 한편, 생들깨박은 볶은 들깨박에 비해 조지질 함량은 1.33배 높았으나, 조단백 함량은 약 63% 수준으로 낮았으며, 조탄수화물 함량은 생들깨박이 61%, 볶은 들깨박이 67% 수준을 나타내었다.
실시예 3: 들깨유 , 들깨박 추출물, 들깨 종자의 종피 추출물의 성분 분석
실시예 1에서 조제된 들깨유, 들깨박 에탄올 추출물, 들깨 종피 추출물의 성분 분석으로 총 폴리페놀, 총 플라보노이드, 총 당 및 환원당 함량을 측정하였다. 총 폴리페놀 함량은 추출 검액 400μl에 50μl의 Folin-ciocalteau, 100μl의 Na2CO3 포화용액을 넣고 실온에서 1시간 방치한 후 725nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준시약으로는 tannic acid를 사용하였다. 총 플라보노이드 함량은 각각의 시료를 18시간 메탄올 교반 추출하고, 여과한 추출 검액 400μl에 90% diethylene glycol 4ml를 첨가하고, 다시 1N NaOH 40μl를 넣고 37℃에서 1시간 반응 후 420nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준시약으로는 rutin을 사용하였다. 환원당은 DNS법으로, 총 당은 phenol-sulfuric acid법을 이용하여 정량하였다.
Figure 112017033178385-pat00002
그 결과, 표 2에 나타낸 바와 같이, 들깨를 볶아 착유하는 경우, 저온착유하는 경우보다 약 8% 수율 증가가 나타났으며, 볶은 들깨유는 생들깨유보다 총플라보노이드 함량이 높게 나타났다. 생들깨유 및 볶은 들깨유 모두 폴리페놀 함량은 분석 검출한계 미만이었다. 한편, 들깨박 추출물은 높은 폴리페놀 함량과 총당 함량을 보였으며, 특히, 볶은 들깨박 에탄올 추출물에서는 매우 높은 폴리페놀 함량과 총당 함량을 보였다. 수율이 매우 낮은 종피 추출물은 13.8mg/g의 폴리페놀 함량과 7.4mg/g의 플라보노이드 함향을 나타내어 들깨박 추출물보다 높은 플라보노이드 함량을 나타내었다.
실시예 4: 들깨유 , 들깨박 추출물, 들깨 종자의 종피 추출물의 혈액 응고 저해 활성 평가
실시예 1에서 제조된 들깨유, 들깨박 추출물, 들깨 종자의 종피 추출물의 혈액응고 저해활성(혈전생성 억제활성)을 평가하였으며, 기존에 보고된 방법(Sohn et al., 2004. Kor. J. Pharmacogn 35. 52-61; Kwon et al., 2004. J. Life Science, 14. 509-513; 류 등 2010. J. Life Science, 20. 922-928)과 동일하게, 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임, 에이피티 타임을 측정하여 평가하였다. 혈장은 시판 control plasma(MD Pacific Technology Co., Ltd, Huayuan Industrial Area, China)를 사용하였으며 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임과 에이피티 타임 측정법은 다음과 같은 과정으로 수행되었다.
트롬빈 타임(Thrombin Time)
37℃에서 0.5U 트롬빈(Sigma Co., USA) 50μl와 20mM CaCl2 50μl, 다양한 농도의 시료 추출액 10μl를 Amelung coagulometer KC-1A(Japan)의 튜브에 혼합하여 2분간 반응시킨 후, 혈장 100μl를 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였다. 대조로는 아스피린(Sigma Co., USA)을 사용하였으며, 용매 대조구로는 시료 대신 DMSO를 사용하였다. DMSO의 경우 26.5초의 응고시간을 나타내었다. 트롬빈 저해 효과는 3회 이상 반복한 실험의 평균치로 나타내었으며, 트롬빈 저해 활성은 시료 첨가시의 응고시간을 용매 대조구의 응고시간으로 나눈 값으로 나타내었다.
프로트롬빈 타임( prothrombin time)
표준혈장(MD Pacific Co., China) 70μl와 다양한 농도의 시료액 10μl를 Amelung coagulometer KC-1A(Japan)의 튜브에 첨가하여 37℃에서 3분간 가온 후, 130μl의 PT reagent를 첨가하고 혈장이 응고될 때까지의 시간을 3회 반복한 실험의 평균치로 나타내었다. 대조로는 아스피린(Sigma Co., USA)을 사용하였으며, 용매 대조구로는 시료 대신 DMSO를 사용하였다. DMSO의 경우 16.8초의 응고시간을 나타내었다. 프로트롬빈 저해활성은 시료 첨가시의 응고시간을 용매 대조구의 응고시간으로 나눈 값으로 나타내었다.
aPTT (activated Partial Thromboplastin Time)
혈장 100μl와 다양한 농도의 시료 추출액 10μl를 Amelung coagulometer KC-1A(Japan)의 튜브에 첨가하여 37℃에서 3분간 가온한 후, 50μl의 aPTT reagent(Sigma, ALEXINTM)를 첨가하고 다시 37℃에서 3분간 배양하였다. 이후 50μl CaCl2(35mM)을 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였다. 용매 대조구로는 시료 대신 DMSO를 사용하였으며, 이 경우 55.2초의 응고시간을 나타내었다. aPTT의 결과는 3회 반복한 실험의 평균치로 나타내었으며, 혈액응고인자 저해활성은 시료 첨가시의 aPTT를 용매 대조구의 aPTT로 나눈 값으로 나타내었다.
Figure 112017033178385-pat00003
그 결과, 표 3에 나타난 바와 같이, 생들깨유 및 볶은 들깨유는 5mg/ml 농도에서 트롬빈 타임에는 변화가 없었으나, 프로트롬빈 타임 및 에이피티 타임은 단축되어 오히려 혈전 생성을 촉진하는 것으로 나타났으며, 생들깨박 및 볶은 들깨박의 에탄올 추출물(5mg/ml)은 용매 대조구에 비해 미약한 트롬빈 저해가 나타났다. 그러나, 들깨 종자의 종피 추출물은 유의적인 트롬빈 저해, 프로트롬빈 저해, 혈액응고인자 저해를 나타내었으며, 각각 2.05배, 1.34배, 및 3.31배 연장된 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임, 에이피티 타임을 보여 우수한 항혈전 활성을 나타내었다. 이때, 대조구로 사용된 아스피린은 1.5mg/ml 농도에서 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임, 에이피티 타임을 각각 1.43배, 1.53배 및 1.40배 연장시켰다. 이러한 결과는 들깨의 항혈전 활성 물질은 종피에 존재함을 의미하고 있다.
실시예 5: 들깨 종피 추출물의 유기용매 순차적 분획물 조제 및 이들의 성분 분석
상기 실시예 1에서 제조된 들깨 종피 에탄올 추출물을 대상으로 헥센, 에틸아세테이트, 부탄올로 순차적 유기용매 분획하였으며, 최종적으로 물 잔류물을 각각 회수하였다. 이때, 추출효율, 유기용매 분획 효율, 추출물/분획물의 성분 분석 결과는 표 4에 나타내었다.
Figure 112017033178385-pat00004
그 결과, 표 4에 나타낸 바와 같이, 들깨 종자의 종피 추출물의 분획물은 헥센 분획물이 77.5%, 물 잔류물이 15.0%로 많은 양을 차지한 반면, 에틸아세테이트 분획물은 9.8%, 부탄올 분획물은 3.0%로 적은 양을 차지하였다. 분획물들의 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량 측정결과, 총 폴리페놀 함량은 물 잔류물을 제외하면 모든 분획물에서 33~46mg/g을 나타내어 매우 높은 함량을 나타내었다. 특히, 헥센 분획이 이례적으로 33mg/g의 폴리페놀 함량을 나타내었다. 반면, 총 플라보노이드 함량은 에틸아세테이트 분획물에 45.3mg/g의 높은 함량을 보였다. 총당의 경우 물 잔류물 > 부탄올 분획 ≥ 에틸아세테이트 분획물 > 헥센 분획물 순으로 나타났으며, 환원당의 전체적으로 6.9~16.7mg/g으로 상대적으로 낮은 함량을 보였다.
실시예 6: 들깨 종자의 종피 추출물 및 이의 분획물의 혈액응고 저해활성 평가
실세예 5에서 제조한 들깨 종자의 종피 추출물의 분획물을 이용하여 실시예 4의 항혈전 활성 평가와 동일한 방법으로 혈액응고 저해활성을 측정하였다. 그 결과는 표 5에 나타내었으며, 들깨 종자의 종피 추출물은 혈액응고인자 저해 활성이 우수하였으며, 종피 추출물의 헥센 분획물은 트롬빈 저해활성이 강력하였다. 또한, 에틸아세테이트 분획물 및 부탄올 분획물(5.0mg/ml)은 아스피린(1.5mg/ml)보다 우수한 항응고 활성을 나타내었다. 이러한 항응고 활성은 농도의존적으로 증대되었으며, 헥센 분획물, 에틸아세테이트 분획물 및 부탄올 분획물은 7mg/ml 농도에서는 실제적으로 이용 가능한 매우 강력한 항응고 활성을 나타내었다. 이러한 결과는 들깨 종자의 종피 추출물 및 이의 헥센 분획물, 에틸아세테이트 분획물 및 부탄올 분획물은 위장장해 등의 부작용이 심한 아스피린을 대체할 수 있는 항혈전제로 사용 가능함을 제시하고 있다.
Figure 112017033178385-pat00005
실시예 7: 들깨 종자의 종피 추출물, 이의 헥센 분획물 , 에틸아세테이트 분 획물 및 부탄올 분획물의 혈장, 산 및 열 안정성 평가
들깨 종자는 생으로, 또한 볶은 들깨로 이용되며, 착유한 들깨유와 착유 부산물로 발생하는 들깨박도 식용으로 이용되고 있는 안전성이 확보된 식품원재료이다. 항혈전 활성이 강력한 들깨 종피 추출물 및 이의 헥센 분획물, 에틸아세테이트 분획물 및 부탄올 분획물을 대상으로 항응고 활성에 대한 혈장 안정성, 열 안정성 및 산 안정성을 확인하였다. 상기 종피 추출물 및 활성 분획물들은 100℃에서 1시간 열 처리, pH 2(0.01M HCl)에서의 1시간 처리, 혈장에서 1시간 처리시에도 항응고 활성의 소실이 없이 우수한 활성을 나타내었다. 따라서, 실시예 5의 분획물의 성분 분석 결과와 유기용매 분획 특성 및 상기의 안정성 결과를 고려할 때, 들깨 종장의 종피 추출물 및 활성 분획물은 종피의 페놀성 화합물의 배당체로 예상된다.

Claims (5)

  1. 들깨(Perilla fruescens) 종피 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈액 응고 저해제.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 들깨 종피 추출물은 비파쇄 및 비가열된 들깨 종자의 에탄올 추출물인 것을 특징으로 하는 혈액 응고 저해제.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 들깨 종피 추출물은 비파쇄 및 비가열된 들깨 종자의 에탄올 추출물의 헥센 분획물, 에틸아테이트 분획물 또는 부탄올 분획물인 것을 특징으로 하는 혈액 응고 저해제.
  4. 삭제
  5. 삭제
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