KR101469351B1 - 무청 추출물의 부탄올 분획물을 유효성분으로 함유하는 혈전증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품 - Google Patents

무청 추출물의 부탄올 분획물을 유효성분으로 함유하는 혈전증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품 Download PDF

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Abstract

본 발명은 무청 (무우의 지상부: Raphanus sativus L. leaves) 추출물의 부탄올 분획물을 유효성분으로 함유하는 혈전성 질환(Diseases related to thrombosis)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는, 무청의 에탄올 추출물로부터 분획 조제된 부탄올 분획물을 유효성분으로 함유하는 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 상기 부탄올 분획물을 포함하는 건강 기능 식품에 관한 것이다. 본 발명의 무청 추출물의 부탄올 분획물을 유효성분으로 함유하는 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품은, 본 명세서의 실시예를 통해 증명된 바와 같이, 강력한 혈소판 응집 저해를 나타내어 혈전 생성을 효율적으로 억제할 수 있는 효과가 있으며, 특히, 본 발명의 약학적 조성물 및 건강 기능 식품의 유효성분인 무청 추출물의 부탄올 분획물은 급성경구독성이 나타나지 않으며, 열 안정성이 우수하고, pH 2의 산성조건 및 혈장 내에서도 혈액응고 저해능의 손실이 나타나지 않아, 추출액, 분말, 환, 정 등의 다양한 형태로 가공되어 상시 복용이 가능한 형태로 조제할 수 있는 뛰어난 효과가 있으므로 제약 산업 및 식품 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Description

무청 추출물의 부탄올 분획물을 유효성분으로 함유하는 혈전증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품{A PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING THE BUTANOL FRACTION OF RAPHANUS SATIVUS L. LEAVES EXTRACT AS AN EFFECTIVE COMPONENT FOR PREVENTION OR TREATMENT OF DISEASES RELATED TO THROMBOSIS AND A HEALTH FUNCTIONAL FOOD COMPRISING THE SAME}
본 발명은 무청(무우의 지상부: Raphanus sativus L. leaves) 추출물의 부탄올 분획물을 유효성분으로 함유하는 혈전성 질환(Diseases related to thrombosis)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는, 무청의 에탄올 추출물로부터 분획 조제된 부탄올 분획물을 유효성분으로 함유하는 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 상기 부탄올 분획물을 포함하는 건강 기능 식품에 관한 것이다.
인체 구성성분으로 혈액은 산소, 영양분, 노폐물의 운반 기능과, 완충작용, 체온유지, 삼투압 조절 및 이온 평형유지, 수분 일정유지, 액성 조절작용, 혈압의 유지 및 조절, 생체방어 등 다양한 중요 기능들을 수행한다. 혈액은 응고반응과 용해반응이 평형을 이루고 있으며, 정상적인 혈액 순환 동안에는 혈전(핏덩어리)이 생성되지 않는다. 그러나, 외부적 혈관손상, 패혈증 및 혈관 내 세균성 독소에 의해 혈전이 생성되며, 또한, 내부적 혈액응고인자 및 혈전 용해인자의 불균형으로 인해 혈전이 생성되기도 한다. 이 경우, 인체는 심각한 손상을 입게 되며, 특히, 최근에는 고령인구 및 성인병의 증가로 혈전생성 과다가 증대되면서 심혈관, 뇌혈관 질환이 증가되고 있어, 과다한 혈전생성 억제를 위한 예방 및 치료제 개발이 절실하다.
혈액 응고 반응은 혈관손상, 또는 내부적 혈액응고인자/용해인자의 불균형으로 혈관벽에 혈소판이 점착, 응집하여 혈소판 혈전을 형성한 후, 혈액 응고계가 활성화되어 혈소판 응집괴를 중심으로 피브린 혈전이 형성된다. 이때 수많은 혈액 응고인자들의 여러 단계의 반응을 거쳐 트롬빈이 활성화되어, 피브리노겐으로부터 피브린 단량체를 생성하게 하며, 피브린 단량체들은 칼슘에 의해 중합되어, 혈소판과 내피세포에 결합하게 되며 XIII 인자에 의해 교차 결합된 피브린 폴리머를 형성하면서 영구적인 혈전을 생성하게 된다. 혈전생성에 관련되는 효소, 인자 및 혈소판 응집 저해를 나타내는 물질은 과다한 혈액응고 이상으로 발생하는 다양한 혈전성 질환에 매우 유용한 예방 및 치료제로 사용될 수 있다. 현재까지 혈전성 질환의 예방과 치료에 헤파린, 쿠마린, 아스피린, 유로키네이즈 등의 다양한 항응고제, 항혈소판제, 혈전용해제 등이 사용되고 있으나, 이들은 가격이 매우 높을 뿐 아니라 출혈성 부작용과 위장장해 및 과민반응 등으로 그 사용이 한정되고 있는 실정이다. 최근에는 안전하면서도 항혈전 활성이 있는 식용, 약용작물 유래의 천연물로부터 항혈전제 개발이 집중적으로 진행되고 있는데, 특히 마늘의 아조엔(ajoene), 은행나무 잎의 플라보노이드, 로즈마리 정유, 밤나무의 아에스신(aescin) 등이 대표적인 경우이다.
한편, 무(Raphanus sativus L.)는 쌍떡잎 식물, 양귀비목, 겨자과에 속하는 한해살이 또는 두해살이 초본으로, 품종에 따라 비대한 지하부 뿌리(무)와 지상부 엽채(무청)를 함께 식용으로 사용하기도 하고, 뿌리만 또는 무청만 식용하기도 한다. 한국에서는 지역에 따라 무우, 무수, 무시 등으로 불리기도 하며, 주로 3종류가 재배되고 있다. 중국을 통해 들어온 재래종(조선무)은 김치, 깍두기, 무말랭이 등으로 주로 생산 소비되며, 중국에서 일본을 거쳐 들어온 일본무 계통은 주로 단무지로, 유럽을 통해 들어온 샐러드용 무는 주로 샐러드로 이용된다. 우리나라 대표 채소중의 하나인 무는 수분함량이 93%, 조단백 1%, 당질 3%를 함유하며, 다량의 비타민C와 미네랄을 포함하는 것으로 알려져 있어 겨울철 비타민 공급원으로 주요한 역할을 해왔다(Ku 등, 2008. J. Korean Soc. Food Sci . Nutr. 37: 390-395). 또한, 무씨는 내복자, 나복자 등으로 불리며, 한방에서는 약용으로 사용하기도 한다. 한편, 무청은 건조하여 국이나 나물로 조리하여 이용하였으며, 실제 과거 채소가 귀했던 겨울철에 단백질, 비타민, 미네랄, 식이섬유 등을 공급해온 주요 식품이었다. 그러나, 최근 도시와 농촌의 격리, 산업화의 정착, 식생활 습관의 변화 등으로 인해 무가 대량생산되는 시기에 무청은 제대로 이용되지 못하고 폐기되고 있는 실정이다. 그러나 무청을 말린 우거지의 경우 35% 이상이 식이섬유이고 20%의 높은 단백질 함량과 미네랄을 가지고 있음(Ku 등, 2006. J. Korean Soc . Food Sci . Nutr. 34: 780-785)이 알려지면서 점차 무청의 효율적인 이용에 관심이 증가되고 있다.
무에 대한 연구로는, 무 재배, 저장, 가공 등에 대한 연구가 주로 이루어져 왔으며, 생리활성으로는 무 추출물의 항산화 활성(Beevi, S. S 등, 2012. Nat . Prod . Res. 26: 557-563), 항세균 활성(Beevi, S. S. 등, 2009. Foodborne Pathog . Dis. 6: 129-136), 인간 암세포에 대한 성장억제 활성(Beevi, S. S. 등, 2010. Plant Food Hum . Nutr. 65: 200-209), 무 식이섬유에 의한 배변 촉진 활성(Shimotoyodome, A., S. 2001, Digest . Dis. Sci . 46: 1482-1489] 및 항염증 활성 (Sim 등, 2010, J. Korean Soc . Food Sci . Nutr. 39: 1097-1101) 등이 알려져 있다. 한편, 무청에 대한 연구로는 조리방법에 따른 미네랄 함량 변화, 열풍건조에 따른 품질 특성변화, 무청의 건조방법에 따른 미생물 변화(Ku 등, 2006. Korean Soc . Food Sci . Nutr . 35: 649-654) 등이 알려져 있으며, 생리활성에 대한 보고로는 무청의 항고혈압 활성(Chung 등, 2012. Nutr . Res . Pract . 6: 308-314), 유방암 및 폐암세포 성장억제활성(Yim 등, 2004. J. Korean Soc . Food Sci . Nutr. 33: 287-290), 항산화 활성 및 콜레스테롤 축적 억제효과 (Rhee 등, 2005. J. Korean Soc . Food Sci . Nutr. 34: 1157-1163), 장기능 개선 및 혈중 지질 개선 효과(Jang 등, 2008. J. Korean Soc . Food Sci . Nutr. 37: 1258-1263) 등이 있다. 그러나, 재래종 조선무의 무청에 대한 항혈전 활성에 대한 보고는 없으며 활성분획물 및 활성물질에 대한 연구는 아직 미미한 상태이다.
한편, 무와 관련된 특허로는, 대한민국 등록특허 제10-1152905호(등록일자: 2012.5.29) "쌈무의 제조방법", 대한민국 특허 제10-0881635호(등록일자: 2009.02.03) "무 및 무잎을 이용한 음료 및 의 제조방법", 대한민국 특허 제10-1028865호(등록일자: 2011.04.12) "무로부터 설포라펜을 분리하는 방법 및 이의 용도" 등이 알려져 있으며, 무청과 관련된 특허로는 대한민국 등록특허 제10-0636366호(등록일자: 2006.10.12) "철의 흡수능이 개선되고 식이섬유가 풍부하며, 간암억제효능을 갖는 무청농축물의 제조방법", 대한민국 등록특허 제10-0738680호(등록일자: 2007.07.05) "식이섬유가 강화된 무청의 제조방법 및 이를 이용한 식품", 대한민국 등록특허 제 10-1027128호(등록일자: 2011.03.29) "시래기 제조방법 및 그 제조장치", 대한민국 등록특허 제 10-0901254호(등록일자: 2009.05.29) "즉석식 시래기 제조방법" 등이 알려져 있다. 그러나, 현재까지 무청 추출물의 유기용매 분획물의 항혈전제 관련 특허는 보고된 바 없다.
KR 10-0881635 B
본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 대량으로 재배되면서도 대부분 폐기되고 있는 식용 무청으로부터 부탄올에 추출되는 유효성분을 함유하는 혈소판 응집 저해활성에 따른 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 상기 부탄올 분획물을 포함하는 건강 기능 식품을 제공하고자 하는 것이다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 무청(Raphanus sativus L. leaves) 추출물의 부탄올 분획물을 유효성분으로 함유하는 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 무청 추출물은 물, 주정, 및 탄소수 1~4의 무수 또는 함수 알코올로 이루어지는 군으로부터 선택된 용매로 추출되는 것이 바람직하다.
상기 무청 추출물은 에탄올로 추출되는 것이 바람직하다.
상기 혈전성 질환은 급성 심근 경색증, 가슴 통증, 호흡 곤란, 의식 소실, 허혈성 뇌졸중, 출혈성 뇌졸중, 두통, 운동 이상, 감각 이상, 성격 변화, 시력 저하, 간질 발작, 폐 혈전증, 심부정맥 혈전증, 하지 부종, 통증, 급성 말초 동맥 폐쇄증, 심부정맥 혈전증, 간문맥 혈전증, 급성 신장정맥 폐쇄증, 뇌 정맥동 혈전증 및 중심 망막정맥 폐쇄로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 본 발명의 상기 무청 추출물의 부탄올 분획물을 포함하는 건강 기능 식품을 제공한다.
본 발명의 무청 추출물의 부탄올 분획물을 유효성분으로 함유하는 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품은, 본 명세서의 실시예를 통해 증명된 바와 같이, 강력한 혈소판 응집 저해를 나타내어 혈전 생성을 효율적으로 억제할 수 있는 효과가 있으며, 특히, 본 발명의 약학적 조성물 및 건강 기능 식품의 유효성분인 무청 추출물의 부탄올 분획물은 급성경구독성이 나타나지 않으며, 열 안정성이 우수하고, pH 2의 산성조건 및 혈장 내에서도 혈액응고 저해능의 손실이 나타나지 않아, 추출액, 분말, 환, 정 등의 다양한 형태로 가공되어 상시 복용이 가능한 형태로 조제할 수 있는 뛰어난 효과가 있으므로 제약 산업 및 식품 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.
도 1은 무청의 에탄올 추출물 및 이의 분획물의 인간 혈소판 응집저해 활성을 평가한 결과를 나타낸 그래프이다. 도면의 좌측으로부터 1: 용매 대조구(DMSO), 2: 아스피린(0.50mg/ml), 3: 무청 에탄올 추출물(0.25mg/ml), 4: 무청 헥센 분획물(0.25mg/ml), 5: 무청 에틸아세테이트 분획물(0.25mg/ml), 6: 무청 부탄올 분획물(0.25mg/ml) 및 7: 무청 물 잔류물(0.25mg/ml)을 각각 나타낸다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 무청 추출물의 부탄올 분획물을 유효성분으로 함유하며, 혈소판 응집 저해효과에 의한 혈전성 질환의 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있는 약학적 조성물과 건강 기능 식품에 관한 것이다.
본 발명의 발명자들은 일정 방법으로 수득한 무청 추출물로부터 혈소판 응집 저해능을 가진 부탄올 분획을 회수하였고, 이러한 성분은 경구급성독성이 나타나지 않으면서, 열 안정성과 산 안정성이 우수한 특징을 가짐을 확인함으로써 상기 성분을 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품으로 활용하고자 하였다.
구체적으로, 본 발명자들은 무청을 이용하여 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품을 개발하기 위하여 무청의 에탄올 추출물을 조제하고, 이를 헥센, 에틸아세테이트 및 부탄올로 순차 분획하여 각 분획물들을 수득하고, 이를 각각 인간 혈장과 시판 혈장을 이용하여 혈액응고와 관련된 트롬빈 직접저해(Thrombin Time), 프로트롬빈 저해(Prothrombin Time) 및 활성부분 트롬보플라스틴 타임(activated Partial Thromboplastin Time: aPTT) 및 혈소판 응집저해능을 각각 평가하였다. 그 결과, 무청 에탄올 추출물의 부탄올 분획에서 현재 사용되고 있는 의약품인 아스피린(시판 항혈전제)보다 강력한 혈소판 응집 저해효과를 확인하였다. 또한, 무청 추출물의 부탄올 분획물은 열 및 산 안정성이 우수하였을 뿐만 아니라, 흰쥐에 경구투여시 급성독성이 나타나지 않아, 상기 분획물이 독성이 없음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 무청 추출물의 부탄올 분획물을 유효성분으로 함유하는 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품을 제공한다.
이하에서는, 본 발명의 무청 추출물의 부탄올 분획물을 제조하는 방법 및 효능 실험 등을 보다 구체적으로 설명한다.
본 발명은 무청으로부터 추출물을 조제하는 단계; 상기 무청 추출물로부터 부탄올 분획물을 조정제하는 단계; 상기 부탄올 분획물의 효능 및 안정성 조사단계; 및 상기 부탄올 분획물의 급성 독성을 검사하는 단계를 포함한다.
본 발명의 조성물에 포함되는 "무청 추출물"은 조선무의 지상부를 열풍건조하여 추출에 적합하도록 분쇄한 후 물, 유기용매 또는 물과 유기용매의 혼합용매로 추출하는 단계, 상기 추출액을 0.06mm 이하의 여과망을 사용하여 여과하고, 이를 감압 농축하는 단계에 의해 수득될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용매는 물(냉수 또는 열수); 주정, 탄소수 1~4의 무수 또는 함수 저급 알코올(메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올)과 같은 유기용매; 또는 상기 물과 유기용매의 혼합용매 등을 이용할 수 있으며, 식품원료 제조에 사용 가능한 에탄올이 가장 바람직하다.
본 발명에서는, 먼저, 무청 에탄올 추출물 및 각 분획물을 조제하여 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임 및 에이피티 타임을 측정하였다. 그 결과 무청 에탄올 추출물 5mg/ml의 농도에서의 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임 및 에이피티 타임은 무첨가구에 비교하여 각각 1.7배, 1.3배 및 1.4배 증가함을 확인하였다. 분획물 중에서는 에틸아세테이트 분획물을 제외한 모든 분획물에서 의미있는 혈액응고 저해활성이 나타나지 않았으나, 에틸아세테이트 분획물의 경우 5mg/ml의 농도에서의 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임 및 에이피티 타임이 무첨가구에 비교하여 각각 2.4배, 2.4배 및 15배 이상 증가함을 확인하였다.
다음으로, 무청의 에탄올 추출물 및 이의 각 분획물에 대한 혈소판 응집 활성을 평가하였다. 그 결과, 무청 에탄올 추출물 및 이의 분획물 중에서 부탄올 분획물>물 잔류물>에틸아세테이트 분획물 순으로 혈소판 응집저해 활성을 나타내었으며, 헥센 분획물의 경우 오히려 혈소판 응집 촉진효과를 나타남을 확인하였다. 이러한 결과는 무청 추출물의 부탄올 분획물이 혈전 저해제로서 사용되기는 하지만, 위장장해와 같은 부작용이 보고된 아스피린과 같은 항혈전제를 대치할 수 있음을 제시한다.
본 발명의 무청 추출물의 부탄올 분획물은 감압증류 및 동결건조, 또는 분무건조 등과 같은 통상적인 분말화 과정을 거쳐 분말로 제조될 수 있다. 이들은 100℃의 열처리와 pH 2의 인체 위 내의 pH에서도 활성을 유지한다.
본 발명의 무청 추출물의 부탄올 분획물은 혈전성 질환과 관련된 다양한 질환들의 예방 또는 치료용으로 사용될 수 있다. 상기 질환들은, 예를 들어, 동맥 혈전증으로서, 급성 심근 경색증, 가슴 통증, 호흡 곤란, 의식 소실, 허혈성 뇌졸중, 출혈성 뇌졸중, 두통, 운동 이상, 감각 이상, 성격 변화, 시력 저하, 간질 발작, 폐 혈전증, 심부정맥 혈전증, 하지 부종, 통증 및 급성 말초 동맥 폐쇄증 등을 들 수 있고, 정맥 혈전증으로서, 심부정맥 혈전증, 간문맥 혈전증, 급성 신장정맥 폐쇄증, 뇌 정맥동 혈전증 및 중심 망막정맥 폐쇄 등을 들 수 있다.
본 발명의 무청 추출물의 부탄올 분획물을 포함하는 약학적 조성물은 각각의 사용 목적에 맞게 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구 제형, 멸균 주사용액의 주사제 등 다양한 형태로 제형화하여 사용할 수 있으며, 경구 투여하거나 정맥 내, 복강 내, 피하, 직장, 국소 투여 등을 포함한 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다.
이러한 약학적 조성물에는 추가적으로 담체, 부형제 또는 희석제 등이 더 포함될 수 있으며, 포함될 수 있는 적합한 담체, 부형제 또는 희석제의 예로는 물, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리쓰리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 비정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 충전제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 더 포함할 수도 있다.
바람직한 구체예로서, 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 약학적 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 혼합하여 제형화한다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 등과 같은 윤활제가 사용될 수도 있다.
바람직한 구체예로서, 경구용 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 예시될 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
바람직한 구체예로서, 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액제, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제, 좌제 등을 예시할 수 있다. 비수성용제, 현탁제에는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 포함될 수 있다. 주사제에는 용해제, 등장화제, 현탁화제, 유화제, 안정화제, 방부제 등과 같은 종래의 첨가제가 포함될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
바람직한 구체예로서, 본 발명의 약학적 조성물에서 무청 추출물의 에틸아세테이트 분획물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 ㎏ 당 1 내지 5,000mg, 바람직하게는 100 내지 3,000mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 다양한 경로를 통하여 대상에 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에서 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 약학적 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 일반적인 모든 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 유효성분을 표적 세포로 전달할 수 있는 임의의 장치를 이용해 투여될 수도 있다.
본 발명에서 "대상"은, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 인간, 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함하고, 바람직하게는 포유류, 보다 바람직하게는 인간을 의미한다.
또한, 본 발명의 건강 기능 식품은 혈전성 질환의 예방 또는 개선에 효과적인 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 무청 추출물의 부탄올 분획물을 포함하는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.
본 발명의 무청 추출물의 부탄올 분획물은 일반적으로 전체 식품 중량의 0.01 내지 15중량%로 가할 수 있으며, 건강음료 조성물은 100ml를 기준으로 0.02 내지 10g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다.
본 발명의 건강 기능 식품은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 것 외에 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제, 예컨대, 천연 탄수화물 및 다양한 향미제 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상기 천연 탄수화물의 예로는 포도당, 과당 등의 단당류, 말토오스, 수크로오스 등의 이당류 및 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 다당류와 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등의 당알코올이 있다.
상기 향미제로는 타우마틴, 레바우디오시드 A, 글리시르히진, 사카린, 아스파르탐 등을 사용할 수 있다.
상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강 기능 식품 100ml 당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g을 사용한다. 상기 외에 본 발명의 건강 기능 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물, 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강 기능 식품은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료 등의 제조를 위한 과육을 함유할 수도 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 본 발명의 무청 추출물 100중량부 당 0.01 내지 약 20중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 바람직한 하나의 구체예일뿐이며, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예의 범위로 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
실시예 1: 무청 추출물 및 유기용매 분획물의 조제
2011년 경북 안동에서 생산된 조선무의 무청을 구입하여 이를 50℃ 건조기에서 2일간 건조한 후, 추출에 적합하도록 분말화한 후, 무청 분말에 대해 10배 부피의 에탄올(95%, 대정화학, 한국)을 가하고, 상온에서 2일간 3회 추출하였다. 추출물은 감압 농축하여 분말로 제조하고 사용 전까지 저온 밀봉 보관하였다. 분획물 조제를 위해서는, 추출물을 증류수에 현탁한 후, 헥센, 에틸아세테이트, 부탄올로 순차적 분획하였으며, 최종적으로 물 잔류물을 얻었다. 이때 에탄올 추출물의 수득율은 5.6%였으며, 무청 추출물의 에틸아세테이트 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물 및 물 잔류물의 수득율은 각각 25.3%, 3.6%, 19.4% 및 51.7%였다. 추출물의 50% 이상이 물 잔류물로 이행되었다. 또한 조선무 지하부가 수분함량 94.3%, 조단백질, 조지방, 탄수화물 및 회분 함량이 각각 0.8±0.2%, 0.1±0.01%, 4.4±0.1%, 및 0.4±0.03%로 나타난 것에 비해, 조선무 무청의 경우 수분함량은 90.5±1.3%이었으며, 조단백질, 조지질, 탄수화물 및 회분 함량은 각각2.3±0.3%, 0.2±0.05%, 4.5±0.2% 및 1.5±0.1%로 나타나, 무의 지하부에 비해 무청이 영양적으로도 우수함을 확인하였다.
조제된 무청 추출물 및 분획물들의 총 플라보노이드(total flavonoid), 총 폴리페놀(total polyphenol), 총 당 및 환원당 함량을 측정하였다. 총 플라보노이드 함량 측정은 각각의 시료를 18시간 메탄올 교반 추출하고, 여과한 추출 검액 400μl에 90% diethylene glycol 4ml를 첨가하고 다시 1N NaOH 40μl를 넣고 37℃에서 1시간 반응 후 420nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준시약으로는 rutin을 사용하였다. 총 폴리페놀 함량은 추출 검액 400μl에 50μl의 Folin-ciocalteau, 100μl의 Na2CO3 포화용액을 넣고 실온에서 1시간 방치한 후 725nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준시약으로는 tannic acid를 사용하였다. 환원당은 DNS법으로, 총당은 phenol-sulfuric acid법을 이용하여 정량하였다. 그 결과는 다음 [표 1]에 나타내었다.
무청의 에탄올 추출물 및 분획물의 수율 및 이들의 성분 분석
추출물/분획물 추출 및
분획효율(%)		 함량 (mg/g)
총 폴리페놀 총 플라보노이드 총 당 환원당
에탄올 추출물 5.6 25.00±0.05 29.53±3.01 114.77±3.14 60.72±12.91
헥센 분획 25.3 20.04±0.72 71.29±2.84 53.85±1.72 37.89±0.62
에틸아세테이트 분획 3.6 97.57±0.86 152.91±12.21 96.98±4.29 37.64±2.39
부탄올 분획 19.4 45.32±0.72 49.64±0.33 118.21±2.29 74.59±0.88
물 잔류물 51.7 12.12±0.19 7.99±0.00 155.32±0.00 82.28±3.27
상기 [표 1]에 나타난 바와 같이, 무청 에탄올 추출물 및 유기용매 분획물들의 총 폴리페놀 함량 및 총 플라보노이드 함량 측정결과, 에틸아세테이트 분획물에서 각각 97.5mg/g및 152.9mg/g으로 매우 높음을 확인하였으며, 부탄올 및 헥센 분획물에서도 각각 20~45mg/g 및 49~71mg/g의 비교적 높은 함량을 나타내었다. 한편 총당의 경우 물 잔류물 > 부탄올 분획 > 에틸아세테이트 분획 > 헥센 분획 순으로 나타냈으며, 환원당의 경우도 유사한 패턴으로 나타났다. 항산화 활성 평가결과 역시 에틸아세테이트 분획물에서 매우 강력한 항산화능을 확인하였으며, 이는 폴리페놀의 높은 함량때문으로 판단되었다(결과 미제시). 상기 결과는 무청이 영양적으로 또한 생리활성적으로 매우 우수한 식품소재임을 제시하고 있다.
실시예 2: 무청 추출물 및 분획물의 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임 및 에이피티 타임 평가
실시예 1의 무청 추출물 및 유기용매 분획물에 대한 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임, 에이피티 타임을 측정하였다. 혈장은 지원자의 전혈로부터 조제하였으며, 채혈 후 즉시 4℃에서 5,000g로 5분 동안 원심분리하여 혈장을 분리하고 냉동한 상태로 보관하였으며(신선동결혈장), 필요시 상온에서 해동하여 사용하였다. 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임과 에이피티 타임 측정법은 다음과 같은 과정으로 수행되었으며, 그 결과를 다음 [표 2]에 나타내었다.
트롬빈 타임( Thrombin Time )
37℃에서 0.5U 트롬빈(Sigma Co., USA) 50μl와 20mM CaCl2 50μl, 다양한 농도의 시료 추출액 10μl를 Amelung coagulometer KC-1A(Japan)의 튜브에 혼합하여 2분간 반응시킨 후, 혈장 100μl를 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였다. 대조로는 아스피린(Sigma Co., USA)을 사용하였으며, 용매 대조구로는 시료 대신 DMSO를 사용하였다. DMSO의 경우 33.6초의 응고시간을 나타내었다. 열 안정성 측정의 경우에는 다양한 농도의 시료용액을 100℃에서 30분간 열처리하고, 실온에서 1시간 방냉한 후, 잔존활성을 측정하였다. 트롬빈 타임 측정은 3회 이상 반복한 실험의 평균치로 나타내었다.
프로트롬빈 타임( prothrombin time )
표준혈장(MD Pacific Co., China) 70μl와 다양한 농도의 시료액 10μl를 Amelung coagulometer KC-1A(Japan)의 튜브에 첨가하여 37℃에서 3분간 가온 후, 130μl의 PT reagent를 첨가하고 혈장이 응고될 때까지의 시간을 3회 반복한 실험의 평균치로 나타내었다. 대조로는 아스피린(Sigma Co., USA)을 사용하였으며, 용매 대조구로는 시료 대신 DMSO를 사용하였다. DMSO의 경우 18.6초의 응고시간을 나타내었다. 프로트롬빈 타임 측정은 3회 이상 반복한 실험의 평균치로 나타내었다.
aPTT ( activated Partial Thromboplastin Time )
혈장 100μl와 다양한 농도의 시료액 10μl를 Amelung coagulometer KC-1A(Japan)의 튜브에 첨가하여 37℃에서 3분간 가온한 후, 50μl의 aPTT reagent(Sigma, ALEXINTM)를 첨가하고 다시 37℃에서 3분간 가온하였다. 이후 50μl CaCl2(35mM)을 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였다. 용매 대조구로는 시료 대신 DMSO를 사용하였으며, 이 경우 40.5초의 응고시간을 나타내었다. aPTT의 결과는 3회 반복한 실험의 평균치로 나타내었다.
무청 에탄올 추출물 및 이의 분획물의 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임 및 에이피티 타임 활성
시료 농도 (mg/ml) 혈전생성 시간 (초)
트롬빈 타임 프로트롬빈 타임 에이피티 타임
DMSO(용매) - 33.6±0.6 18.6±0.5 40.5±1.1
아스피린 5.0 >480 >280 >800
1.5 66.5±1.3 33.8±2.7 110.5±10.5
에탄올 추출물 5.0 57.8±7.0 23.8±0.5 55.9±4.0
헥센분획 5.0 38.6±1.0 21.7±0.5 83.0±8.9
에틸아세테이트 분획 5.0 81.6±12.2 45.0±3.9 > 600
부탄올 분획 5.0 42.3±5.3 23.6±0.3 52.6±2.8
물 잔류물 5.0 24.2±2.6 16.6±0.4 44.1±3.2
상기 [표 2]에 나타난 바와 같이, 대조구로 사용된 아스피린(상품명: 프로텍트)은 5mg/ml 농도에서 무첨가구에 비해 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임과 에이피티 타임 모두 무첨가구에 비해 15배 이상 연장된 혈액 응고시간을 나타내어 우수한 항혈전 효과를 나타내었으며, 1.5mg/ml의 농도에서는 무첨가구에 비해 각각 2.0배, 1.8배, 및 2.7배 연장된 혈액 응고시간을 나타내었다. 한편 무청의 에탄올 추출물 및 순차적 분획물들은 5mg/ml 농도에서는 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임 및 에이피티 타임을 최대 1.7배 정도 연장시킴을 확인할 수 있었다.
실시예 3: 무청 추출물, 순차적 유기용매 분획물의 인간 혈소판 응집 저해활성
무청 추출물 및 분획물의 항혈전 활성 평가의 일환으로 인간 혈소판에 대한 응집저해활성을 다음의 방법에 준해 평가하였으며, 그 결과는 [표 3] 및 도 1에 나타내었다.
혈소판 응집저해 활성( Platelet aggregation inhibition activity )
혈소판은 건강한 인간의 전혈로부터 3.2% sodium citrate 용액과 1:9의 비율로 혼합한 후, 1,100rpm에서 10분간 원심분리하여 상층의 PRP(platelet rich plasma)를 취하고, 이를 washing buffer(138mM NaCl, 2.7mM KCl, 12mM NaHCO3, 0.36mM NaH2PO4, 5.5mM Glucose, 1mM EDTA, pH 6.5)로 1회 세척하였다. 이후, suspending buffer(138mM NaCl, 2.7mM KCl, 12mM NaHCO3, 0.36mM NaH2PO4, 5.5mM Glucose, 0.49mM MgCl2, 025% gelatin, pH 7.4)에 재현탁한 후, 3,000rpm에서 10분간 원심분리한 후 다시 suspending buffer에 재현탁 하였으며, 이때 혈소판 수는 4x109/ml 되도록 조정하였다. 이후 1ml 현탁액에 2.5μl collagen을 가해 5분간 반응시키고, whole-blood aggregometer(Chrono-log, USA)를 사용하여 37℃에서 혈소판 응집을 측정하였다.
무청 에탄올 추출물 및 이의 분획물의 인간 혈소판 응집저해 활성
시료/대조구 강도
(Amplitude:ohm)		 기울기
(Slope)		 연장시간
(Lag time:초)		 하강면적
(Area under)
DMSO(용매) 22 3 32 191.5
아스피린 (0.50 mg/mL) 8 1 112 40.2
아스피린 (0.25 mg/mL) 15 2 45 85.2
에탄올 추출물 (0.25 mg/mL) 16 3 11 177.6
헥센 분획물(0.25 mg/mL) 27 6 6 342.4
에틸아세테이트 분획물
(0.25 mg/mL)		 15 3 6 148.2
부탄올 분획물 (0.25 mg/mL) 6 1 59 53.9
물 잔류물 (0.25 mg/mL) 11 2 29 107.5
*하강면적이 작을수록 혈소판 응집이 나타나지 않음을 의미
[표 3]에 나타난 바와 같이, 먼저 아스피린 첨가구는, 0.25mg/ml 농도에서 무첨가구에 비해44.5%의 혈소판 응집, 0.5mg/ml농도에서는 20.9%의 응집을 나타내어 우수한 인간 혈소판 응집저해 활성을 나타내었으며, 농도의존적인 응집저해 활성을 확인하였다.
한편 무청 에탄올 추출물, 헥센 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물 및 물 잔류물의 경우 0.25mg/ml 농도에서 무첨가구에 비해 각각, 92.7%, 178.8%, 77.4%, 28.1% 및 56.1%의 혈소판 응집을 나타내어 부탄올 분획물이 시판 아스피린에 비해서도 우수한 혈소판 응집저해 활성을 나타냄을 확인하였다.
따라서 본 실시예를 통해, 무청 추출물의 부탄올 분획물은 혈소판 응집 저해 효과에 의한 혈전생성 억제제로 기존의 아스피린을 대치할 수 있음을 확인하였다.
실시예 4: 무청 추출물의 부탄올 분획물의 안정성
상기 실시예 1에서 얻은 무청 추출물의 부탄올 분획물을 대상으로 열 안정성, 산 안정성 및 혈장 안정성을 확인하였다. 각각의 시료들은 100℃에서 2시간 처리, pH 2(0.01M HCl)에서의 2시간 처리, 혈장에서 2시간 처리시에도 혈액응고인자 저해 및 혈소판 응집저해 활성의 감소가 나타나지 않아 높은 안정성을 나타내었다.
실시예 5: 무청 추출물의 부탄올 분획물의 마우스 단회 경구독성 시험
상기 실시예 1에서 얻은 무청 추출물의 부탄올 분획물을 대상으로 마우스 단회 경구독성을 평가하였다. 먼저 4주령의 흰쥐(Slc, ICR Mouse)를 (주)중앙실험동물로부터 공급받아 온도 23±3℃, 상대습도 50±10%, 150~300Lux의 조도로 12시간 간격(오전 8시~오후 8시)으로 조절되는 동물실험실에서 14일간 순화시켰다. 이후 실시예 1로부터 얻은 부탄올 분획물을 옥수수유에 녹인 후, 400, 800, 1500, 2000mg/kg 농도로 각각 3마리씩 경구투여 후, 일주일 간 생존 여부와 병적 이상 증후를 관찰하였다. 대조구로는 옥수수유만을 경구투여하였다. 그 결과 생존율은 100%였으며, 병적 이상 징후는 나타나지 않았다. 따라서, 약용으로 사용되어 온 무청으로부터 분리한 부탄올 분획물은 저독성 또는 무독성으로 구분되며, 이의 낮은 농도의 사용은 부가적인 문제점을 야기하지 않으리라 판단되었다.

Claims (5)

  1. 무청(Raphanus sativus L. leaves) 추출물의 부탄올 분획물을 유효성분으로 함유하는 급성 심근 경색증, 폐 혈전증, 심부정맥 혈전증, 급성 말초 동맥 폐쇄증, 심부정맥 혈전증, 간문맥 혈전증, 급성 신장정맥 폐쇄증, 뇌 정맥동 혈전증 및 중심 망막정맥 폐쇄로 이루어지는 군으로부터 선택되는 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 무청 추출물은 물, 주정, 및 탄소수 1~4의 무수 또는 함수 알코올로 이루어지는 군으로부터 선택된 용매로 추출되는 것을 특징으로 하는 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 무청 추출물은 에탄올로 추출되는 것을 특징으로 하는 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 삭제
  5. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 무청 추출물의 부탄올 분획물을 포함하는 급성 심근 경색증, 폐 혈전증, 심부정맥 혈전증, 급성 말초 동맥 폐쇄증, 심부정맥 혈전증, 간문맥 혈전증, 급성 신장정맥 폐쇄증, 뇌 정맥동 혈전증 및 중심 망막정맥 폐쇄로 이루어지는 군으로부터 선택되는 혈전성 질환의 예방 또는 개선용 건강 기능 식품.
KR1020130025340A 2013-03-08 2013-03-08 무청 추출물의 부탄올 분획물을 유효성분으로 함유하는 혈전증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품 KR101469351B1 (ko)

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