KR101497818B1 - 우슬의 유기용매 분획물을 유효성분으로 함유하는 혈전증 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품 - Google Patents

우슬의 유기용매 분획물을 유효성분으로 함유하는 혈전증 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품 Download PDF

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Abstract

본 발명은 우슬(Achyranthes Radix)의 뿌리로부터 에탄올 추출후 순차적 분획하여 얻어지는 헥센 분획물 또는 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 혈전증(thrombosis)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는, 토우슬(Achyranthes japonica Nakai) 및 회우슬(Achyranthes bidentata Blume) 뿌리로부터 에탄올 추출물을 얻고 이의 헥센 분획물 및 에틸아세테이트 분획물을 회수하고, 회수된 헥센 분획물 또는 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 혈전증 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 상기 분획물을 포함하는 건강 기능 식품에 관한 것이다. 본 발명의 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품의 유효성분으로서의 우슬 활성분획은, 본 명세서의 실시예를 통해 증명된 바와 같이, 우슬을 에탄올로 추출하여 추출물을 조제한 후, 헥센, 에틸아세테이트를 이용하여 순차적으로 분획하여 조제되며, 이 중 우수한 트롬빈 직접저해, 프로트롬빈 저해 및 혈액응고인자 저해효과에 의한 항혈전 활성을 나타내는 헥센 또는 에틸아세테이트 분획은 혈전 생성을 효율적으로 억제할 수 있는 효과가 있으며, 혈행개선을 통해 허혈성 뇌졸중 및 출혈성 뇌졸중과 같은 혈전증의 예방 및 치료용으로 사용할 수 있는 뛰어난 효과가 있다. 특히, 본 발명의 우슬은 식품으로 사용되며, 에탄올 추출물의 헥센 분획물 및 에틸아세테이트 분획물은 열 안정성이 우수하고, pH 2의 산성조건 및 혈장 내에서도 항혈전 효과의 손실이 나타나지 않아, 추출액, 분말, 환, 정 등의 다양한 형태로 가공되어 상시 복용이 가능한 형태로 조제할 수 있는 뛰어난 효과가 있으므로 제약산업 및 식품산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Description

우슬의 유기용매 분획물을 유효성분으로 함유하는 혈전증 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품{PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING THE ORGANIC SOLVENT FRACTION OF ACHYRANTHIS RADIX AS AN EFFECTIVE COMPONENT FOR PREVENTION OR TREATMENT OF THROMBOSIS AND HEALTH FUNCTIONAL FOOD COMPRISING THE SAME}
본 발명은 우슬(Achyranthes Radix) 뿌리의 에탄올 추출물로부터 얻어진 유기 용매 분획물들을 유효성분으로 함유하는 혈전증(thrombosis)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는, 국내산 토우슬(Achyranthes japonica Nakai) 또는 중국산 회우슬(Achyranthes bidentata Blume) 뿌리의 에탄올 추출물로부터 유기 용매로 순차 분획된 헥센 분획물 또는 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 상기 분획물을 포함하는 건강 기능 식품에 관한 것이다.
혈액은 산소, 영양분, 노폐물의 운반 기능과 완충작용, 체온유지, 삼투압 조절 및 이온 평형유지, 수분 일정유지, 액성 조절작용, 혈압의 유지 및 조절, 생체방어 등 다양한 중요 기능들을 가지고 있다. 정상적인 혈액 순환은 혈액응고 반응계와 혈전용해 반응계가 상호 보완적으로 조절되면서 혈액 순환을 용이하게 하며, 만약 상호조절이 원활하지 못한 경우 혈전증을 나타내게 된다.
혈전증은 심장 및 혈관 내에서 혈액이 응고하여 혈전(응혈 덩어리, 응집괴)을 생성하여 야기되는 질병으로, 혈전증 사망률은 모든 종류의 암 및 감염성 질환의 사망율보다 높게 나타나고 있다. 심장 및 혈관의 혈전은 조직과 장기에 혈액 공급을 저해하여 허혈성 손상을 나타내며, 심한 경우 혈관이 막힌 상태에서 혈압이 상승하여 혈관이 파괴는 출혈성 손상을 야기한다. 이러한 혈전 생성은 혈관내피의 손상, 혈류의 변화, 및 혈액구성성분의 변화가 원인이 되며, 혈소판 응집인자 활성화, 프로트롬빈 및 혈액응고인자 활성화를 거쳐, 최종 단계는 트롬빈의 활성화와 혈소판의 응집과정을 거친다. 따라서, 적합한 혈소판 응집인자 저해, 트롬빈, 프로트롬빈, 혈액응고인자의 저해는 혈전 생성을 억제하여 혈전증을 예방하는 데 도움이 되는 것으로 알려져 있으며, 혈전 생성의 최종단계에 작용하는 트롬빈 저해물질은 과다한 혈액응고 이상으로 발생하는 다양한 혈전성 질환에 매우 유용한 예방 및 치료제로 사용될 수 있다. 현재까지 혈전성 질환의 예방과 치료에 헤파린, 쿠마린, 아스피린, 유로키네이즈 등의 다양한 항응고제, 항혈소판제, 혈전용해제 등이 사용되고 있으나, 이들은 가격이 매우 높을 뿐 아니라 출혈성 부작용과 위장장해 및 과민반응 등으로 그 사용이 한정되고 있는 실정이다.
한편, 우슬(Achyranthes Radix)은 비름과(Amaranthaceae)에 속하는 다년생 식물로 한국, 중국, 일본 등에 분포하며, 민간에서는 쇠무릎이라 불릴 만큼 관절염에 효과가 있다고 알려져 있다. 우슬은 기원식물이 국가마다 달라, 국내산 우슬의 경우 토우슬(Achyranthes japonica Nakai)을 사용하며, 중국에서는 회우슬(Achyranthes bidentata Blume), 천우슬(Cyathula officinalis Kuan) 및 마우슬(Cyathula capitata Moq)을 사용하고 있다(Kor. J. Herbology. 2007 22:71-79, Kim 등). 그러나, 현재 우리나라 대한약전에서는, 국내 자생하는 토우슬과 중국원산의 회우슬의 2종을 우슬로 규정하고 있으며, 국내에서는 특별한 용도구분 없이 사용되고 있다. 우슬은 한방 약용재료이면서도 식품원재료로 사용가능하며, 세포독성 및 유전독성이 없다고 보고(우슬의 13주 반복투여 및 유전독성시험연구, 한국화학시험연구원, 2007, 성하정 외)되어 있으나, 현재 이를 이용한 가공식품 개발 및 상업화는 거의 이루어지지 않은 상태이며, 일부 민간에서 우슬 보리차, 우슬 식혜 등이 이용되고 있는 정도이다.
한방에서의 우슬은 성미가 평하며, 쓴맛과 신맛을 가지고, 신장과 간장의 작용하여 어혈을 제거하며, 혈액순환을 촉진하고, 혈액을 생성하는 효능과 열을 떨어뜨리는 효능이 알려져 있다(대한한방부인과학회지 2005. 18: 110-126, 김경수 외). 우슬의 주요 약리성분으로는 oleanolic acid, inocosterone, ecdysterone, beta-sitosterol, stigmasterol, feruloyl tyramine glycoside 등이 알려져 있다(Chin. J. Nat. Med. 10: 16-19, Yang 등). 우슬에 대한 연구는, 과거에는 주로 다량 증식을 위한 기내배양 연구가 이루어져 왔으나, 최근에는 우슬의 효율적인 이용을 위한 유용생리활성 탐색으로 전환되고 있으며, 보고된 생리활성으로는 항산화 활성(Kor. J. Herbology 2007. 22: 155-167, Park 등) 항균 및 항말라리아 활성(Korean J. Biotechnol. Bioeng. 2002. 17: 537-542. Cai 등), 항염증 활성, 중금속 제거 및 해독효과(Kor. J. Oriental Physiol. Pathol. 2004. 18: 1784-1794. Kang 등), 관절염 완화 및 경조직 재생효과(The J. Appl. Pharmcol. 2002. 10: 253-257, Kim 등), 파골세포 분화억제효과(J. Orient. Obster. Gynecol. 2012. 25: 1-10. Choi 등), 허혈성 뇌손상에 대한 보호효과(Kor. J. Herbology 2012. 27: 77-83. Oh 등), 혈류개선 효과(J. Tradit. Chin. Med. 2001. 21: 225-231, Xie 등) 등이 보고되어 있다.
우슬과 관련된 특허문헌으로는, 대한민국 등록특허 제10-1251389호 우슬 발효주 및 그의 제조방법, 대한민국 등록특허 제10-0429595호 생약 추출물을 포함하는 관절염 치료 및 예방용 조성물의 제조방법 및 그의 조성물, 대한민국 등록특허 제10-1248378호 관절염 치료 및 예방용 약학조성물, 대한민국 등록특허 제10-0415815호 우슬, 오공, 두충, 오가피, 방풍을 주성분으로 함유하는 의약 조성물 및 이를 주성분으로 함유하는 약학적제제(골다공증, 류마티스 관절염, 디스크증상의 예방과 치료) 등이 개시된 바 있으며, 특히 항혈전 활성과 관련하여 대한민국 등록특허 제10-0784339호에는 [혼합 생약재 추출물을 유효성분으로 함유하는 항혈전제]가 개시되어 있다. 그러나, 상기 등록특허 제10-0784339호에서 공개된 바와 같이, 현재까지 우슬과 관련된 항혈전 보고는 우슬 단독이 아닌 홍화, 당귀, 도인, 적작약, 모란, 목단피, 금은화, 석곡, 황기, 향부자, 부자, 육계, 세신 등 다양한 한약제를 포함하는 복방 한약탕제에서 보고[우슬이 포함한 한방 복방탕제의 예: 혈부축어탕-대한한방내과학회지, 2000, 21: 819-827, 가미보양환오탕-대한한방성인병 학회지 1998, 4:133-162, 우슬산-대한한방부인과학회지 2005, 18: 110-126, 소경활혈탕-경희한의대논문집 1984. 7:23-35, 신통축어탕-대한한방 내과학회지 1997, 18: 69-85]되어 있으나, 우슬 단독추출물의 조정제된 분획물에서 인간 트롬빈 효소, 프로트롬빈 효소, 혈액응고 관련인자들의 직접저해 및 혈소판 응집저해를 통한 혈전생성 저해효과는 보고된 바 없다. 아래에 상세히 설명될 것이지만, 실제 본 출원의 발명자들에 의하여 밝혀진 바에 의하면, 우슬 추출물의 유기 용매 분획물이 아닌 단순한 우슬 열수 추출물 및 에탄올 추출물에서는 항혈전 효과는 확인되지 않으며, 오직 우슬 추출물의 헥센 및 에틸아세테이트 분획물에서 혈전생성 저해효과가 나타난다.
따라서, 본 발명자들은 항혈전 및 혈류개선 활성을 나타내는 기능성 식품 소재 개발을 목표로, 우슬 추출물과 이의 순차적 유기용매 분획물을 조제한 후, 인간 혈장과 인간 트롬빈, 프로트롬빈, 혈액응고인자들을 이용하여 혈전생성 저해활성을 평가하고, 인간 농축혈소판을 이용한 우슬의 혈소판 응집저해 활성을 측정하여, 우슬 뿌리의 에탄올 추출물로부터 순차 분획된 헥센 및 에틸아세테이트 분획물에서 기존의 예상과는 달리, 혈소판 응집저해 활성이 없이, 트롬빈, 프로트롬빈, 혈액응고인자들을 저해하는 방식으로 매우 강력한 항혈전 활성을 나타냄을 확인하였다.
KR 10-0784339 B
대한한방부인과학회지 2005. 18: 110-126, 김경수 외, 우슬산의 항혈전작용에 대한 실험적 연구 대한한방내과학회지 2000. 2: 819-827, 김영선 외, 혈부축어탕(血府逐瘀湯)이 혈전생성관여인자에 미치는 영향
본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 식용 및 약용으로 이용되고 있는 우슬 뿌리의 에탄올 추출물로부터 순차 분획되어 얻어진 헥센 분획물 또는 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 인간 트롬빈 직접저해, 프로트롬빈 저해, 내인성 혈액응고인자 저해에 따른 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 상기 분획물을 포함하는 건강 기능 식품을 제공하고자 하는 것이다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 우슬(Achyranthes Radix) 뿌리의 에탄올 추출물로부터 얻어진 유기 용매 분획물을 유효성분으로 함유하는 혈전증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 우슬(Achyranthes Radix)은 토우슬(Achyranthes japonica Nakai) 또는 회우슬(Achyranthes bidentata Blume)인 것이 바람직하다.
상기 유기 용매 분획물은 우슬(Achyranthes Radix) 뿌리의 에탄올 추출물을 헥센 및 에틸아세테이트로 순차 분획하여 얻어진 헥센 분획물 또는 에틸아세테이트 분획물인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 우슬(Achyranthes Radix) 뿌리의 에탄올 추출물로부터 얻어진 유기 용매 분획물을 포함하는 건강 기능 식품을 제공한다.
본 발명의 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품의 유효성분으로서의 우슬 뿌리의 에탄올 추출물로부터 얻어진 유기 용매 분획물은, 본 명세서의 실시예를 통해 증명된 바와 같이, 우슬을 에탄올 등으로 추출하여 추출물을 조제한 후, 헥센 및 에틸아세테이트를 이용하여 순차적으로 분획하여 조제되며, 이 중 우수한 혈액응고인자 저해효과에 의한 항혈전 활성을 나타내는 헥센 분획물 또는 에틸아세테이트 분획물은 혈전 생성을 효율적으로 억제할 수 있는 효과가 있으며, 혈행개선을 통해 허혈성 뇌졸중 및 출혈성 뇌졸중과 같은 혈전증의 예방 및 치료용으로 사용할 수 있는 뛰어난 효과가 있다. 특히, 본 발명의 우슬 뿌리 에탄올 추출물로부터 순차 분획되어 얻어진 유기 용매 분획물들은 열 안정성이 우수하고, pH 2의 산성조건 및 혈장 내에서도 인간트롬빈 직접저해, 프로트롬빈 저해, 혈액응고인자 저해 효과의 손실이 나타나지 않아, 추출액, 분말, 환, 정 등의 다양한 형태로 가공되어 상시 복용이 가능한 형태로 조제할 수 있는 뛰어난 효과가 있으므로 제약 산업 및 식품 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.
본 발명은 우슬 뿌리의 에탄올 추출물로부터 순차 분획된 유기 용매 분획물을 유효 성분으로 함유하는 인간 트롬빈 직접저해, 프로트롬빈 저해, 내인성 혈액응고인자 저해활성을 갖는 혈전증 예방 또는 치료용 약학적 조성물과 건강 기능 식품에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명의 발명자들은 일정 방법으로 수득한 우슬 추출물로부터 항혈전 활성 성분인 유기 용매 분획물을 회수하였고, 이러한 성분은 열 안정성과 산 안정성이 우수한 특징을 가짐을 확인함으로써 상기 분획물들을 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품으로 활용하고자 하였다.
구체적으로, 본 발명자들은 우슬을 이용하여 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품을 개발하기 위하여 우슬 뿌리의 에탄올 추출물을 조제하고, 이를 다양한 유기 용매들로 순차 분획하여 헥센 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물 및 물 잔류물 등을 수득하고, 이를 각각 인간 혈장과 인간 트롬빈에 대한 트롬빈 직접저해(Thrombin Time), 프로트롬빈 저해(Prothrombin Time) 및 활성부분 트롬보플라스틴 타임(activated Partial Thromboplastin Time: aPTT), 혈소판 응집 저해능을 평가하였다. 그 결과, 우슬 뿌리의 에탄올 추출물로부터 순차 분획되어 얻어진 헥센 분획물 또는 에틸아세테이트 분획물이 5.0 mg/ml 농도에서 매우 강력한 트롬빈, 프로트롬빈 및 혈액응고인자 저해활성을 보임을 확인하였다. 특히, 회우슬의 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획에서는 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임 및 에이피티 타임을 각각, 용매대조구에 비해 15 배, 15 배, 6 배 이상 연장키는 강력한 혈전생성 억제활성을 확인하였으며, 토우슬의 에탄올 추출물의 헥센 분획에서 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임 및 에이피티 타임을 각각, 용매대조구에 비해 2.6 배, 1.7 배, 15 배 이상 연장키는 강력한 혈전생성 억제활성을 확인하였다. 또한, 우슬을 포함하는 한방 복방탕제에 관한 기존의 연구에서의 예측과는 달리, 우슬 단독의 추출물 및 분획물들은 인간 혈소판 응집저해활성이 거의 나타나지 않아, 우슬의 항혈전 효과는, 아스피린(시판 항혈전제)보다 강력한 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임, 에이피티 타임 연장효과에 기인함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
이와 같은 우슬의 효과를 확인하기 위하여, 본 발명의 발명자들은 우슬 추출물 및 이의 유기 용매 분획물을 제조하고, 이의 총폴리페놀, 총플라보노이드 등의 유용성분을 분석하고, 추출물 및 분획물의 인간트롬빈 직접저해 효과, 프로트롬빈 저해효과, 혈액응고인자(8 인자, 9 인자, 11 인자 및 12 인자) 저해에 의한 활성부분 트롬보플라스틴 타임 연장효과, 농축 인간혈소판을 이용하여 혈소판 응집저해효과를 평가하여, 본 발명의 우슬 활성 분획물이 상업적으로 이용되고 있는 항혈전제 아스피린(상품명: 프로텍트)과 유사 또는 우월한 항혈전 활성을 가짐을 확인하였으며, 나아가, 우슬 활성 분획물의 열, 및 산 안정성 및 혈장 안정성을 조사하여, 안정성이 높음을 추가적으로 확인하였다.
따라서, 본 발명은 우슬 뿌리의 에탄올 추출물로부터 얻어진 유기 용매 분획물을 유효성분으로 함유하는 혈전증 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품을 제공한다.
바람직한 구체예로서, 상기 우슬 뿌리의 에탄올 추출물은 토우슬 또는 회우슬 에탄올 추출물인 것이 바람직하며, 상기 우슬 뿌리의 에탄올 추출물로부터 얻어진 헥센 분획물 및 에틸아세테이트 분획물은 우슬 뿌리의 에탄올 추출물을 헥센으로 분획 후, 에틸아세테이트로 순차 분획하여 얻어질 수 있다.
이하에서는, 본 발명의 우슬 뿌리의 에탄올 추출물로부터 얻어진 헥센 분획물 또는 에틸아세테이트 분획물의 제조 방법 및 효능 실험 등을 보다 구체적으로 설명한다.
본 발명은 시판 건조 우슬의 뿌리로부터 우슬 추출물을 조제하는 단계; 상기 우슬 추출물로부터 헥센, 에틸아세테이트, 부탄올 등의 유기용매 분획물 및 물 잔류물로 조정제하는 단계; 상기 추출물 및 분획물의 항혈전 효능 및 안정성 조사단계; 및 상기 활성 분획물의 안정성 평가단계를 포함한다.
본 발명의 조성물에 포함되는 "우슬 추출물"은 토우슬 및 회우슬의 뿌리를 세척한 후 건조하는 단계, 건조된 우슬 뿌리를 유기용매로 추출하는 단계 및 상기 추출액을 0.06 mm 이하의 여과망을 사용하여 여과하고, 이를 감압농축하는 단계에 의해 수득될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 유기용매는 물(냉수, 열수), 주정, 탄소수 1~4의 무수 또는 함수 알코올(메탄올, 에탄올, 주정, 프로판올, 부탄올 등), 상기 알코올과 물과의 혼합용매 등을 이용할 수 있으며, 80~95 % 에탄올이 가장 바람직하다.
본 발명에서는, 토우슬 및 회우슬의 열수 및 에탄올 추출물 및 이들의 순차적 유기용매 분획물(전체 20 종 시료)을 조제하여 5.0 mg/ml의 농도에서 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임 및 에이피티 타임을 측정한 결과, 열수 추출물보다 에탄올 추출물에서 강한 활성을 확인하였다. 특히, 토우슬 에탄올 추출물 및 분획물의 경우 헥센 분획물에서 강력한 활성이 나타났으며, 특히 에이피티 타임을 용매 대조구에 비해 15 배 이상 연장시켜 매우 강력한 혈액응고인자의 저해를 나타냄을 확인하였다. 또한, 회우슬의 에탄올 추출물 및 분획물의 경우, 헥센 분획물 및 에틸아세테이트 분획에서 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임 및 에이피티 타임을 연장시키는 효과가 나타났으며, 특히, 토우슬과는 달리 회우슬의 에틸아세테이트 분획에서는 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임 및 에이피티 타임을 용매 대조구에 비해 각각 15 배, 15 배, 6 배 이상 연장시켜 매우 강력한 항혈전 활성을 확인하였다. 현재 항혈전제로 사용되는 아스피린이 1.5 mg/ml 농도에서 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임 및 에이피티 타임을 각각 1.7 배, 1.6 배 및 1.5 배 연장시키는 효과를 가짐을 비교할 때, 우슬 에탄올 추출물의 헥센 분획물 또는 에틸아세테이트 분획물은 아스피린보다 더욱 강력한 항혈전효과를 나타냄을 의미하며, 상기 활성분획물은 위장장해와 같은 부작용이 보고된 아스피린과 같은 항응고제를 대치할 수 있음을 제시한다.
본 발명의 우슬 뿌리의 에탄올 추출물로부터 얻어진 헥센 분획물 또는 에틸아세테이트 분획물은 감압증류 및 동결건조, 또는 분무건조 등과 같은 통상적인 분말화 과정을 거쳐 분말로 제조될 수 있다. 이들은 100 ℃의 열처리와 pH 2의 인체 위 내의 pH에서도 활성을 유지하며, 혈장 내에서도 안정하게 유지된다.
본 발명의 우슬 뿌리의 에탄올 추출물로부터 순차 분획되어 얻어진 헥센 분획물 또는 에틸아세테이트 분획물은 혈전증과 관련된 다양한 질환들의 예방 또는 치료용으로 사용될 수 있다. 상기 질환들은, 예를 들어, 동맥 혈전증으로서, 급성 심근 경색증, 가슴 통증, 호흡 곤란, 의식 소실, 허혈성 뇌졸중, 출혈성 뇌졸중, 두통, 운동 이상, 감각 이상, 성격 변화, 시력 저하, 간질 발작, 폐 혈전증, 심부정맥 혈전증, 하지 부종, 통증 및 급성 말초 동맥 폐쇄증 등을 들 수 있고, 정맥 혈전증으로서, 심부정맥 혈전증, 간문맥 혈전증, 급성 신장정맥 폐쇄증, 뇌 정맥동 혈전증 및 중심 망막정맥 폐쇄 등을 들 수 있다.
본 발명의 우슬 에탄올 추출물의 헥센 및 에틸아세테이트 분획물을 포함하는 약학적 조성물은 각각의 사용 목적에 맞게 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구 제형, 멸균 주사용액의 주사제 등 다양한 형태로 제형화하여 사용할 수 있으며, 경구 투여하거나 정맥 내, 복강 내, 피하, 직장, 국소 투여 등을 포함한 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다.
이러한 약학적 조성물에는 추가적으로 담체, 부형제 또는 희석제 등이 더 포함될 수 있으며, 포함될 수 있는 적합한 담체, 부형제 또는 희석제의 예로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리쓰리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 비정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 충전제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 더 포함할 수도 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
바람직한 구체예로서, 본 발명의 약학적 조성물에서 우슬 에탄올 추출물의 헥센 분획물 또는 에틸아세테이트 분획물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 ㎏ 당 1 내지 5,000 mg, 바람직하게는 100 내지 3,000 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 다양한 경로를 통하여 대상에 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에서 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 약학적 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 일반적인 모든 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 유효성분을 표적 세포로 전달할 수 있는 임의의 장치를 이용해 투여될 수도 있다.
본 발명에서 "대상"은, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 인간, 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함하고, 바람직하게는 포유류, 보다 바람직하게는 인간을 의미한다.
또한, 본 발명의 건강 기능 식품은 혈전증의 예방 또는 개선에 효과적인 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 우슬 뿌리의 에탄올 추출물로부터 순차 분획되어 얻어진 헥센 분획물 또는 에틸아세테이트 분획물을 포함하는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.
본 발명의 우슬 뿌리의 에탄올 추출물로부터 순차 분획되어 얻어진 헥센 분획물 또는 에틸아세테이트 분획물은 일반적으로 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강음료 조성물은 100 ml를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.
본 발명의 건강 기능 식품은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 것 외에 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제, 예컨대, 천연 탄수화물 및 다양한 향미제 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상기 천연 탄수화물의 예로는 포도당, 과당 등의 단당류, 말토오스, 수크로오스 등의 이당류 및 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 다당류와 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등의 당알코올이 있다.
상기 향미제로는 타우마틴, 레바우디오시드 A, 글리시르히진, 사카린, 아스파르탐 등을 사용할 수 있다. 상기 향미제의 비율은 본 발명의 건강 기능 식품 100 ml당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g을 사용한다. 상기 외에 본 발명의 건강 기능 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물, 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강 기능 식품은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료 등의 제조를 위한 과육을 함유할 수도 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 본 발명의 우슬 뿌리의 에탄올 추출물로부터 순차 분획되어 얻어진 헥센 분획물 또는 에틸아세테이트 분획물 100 중량부 당 0.01 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 바람직한 하나의 구체예일뿐이며, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예의 범위로 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
실시예 1: 우슬 추출물 및 유기용매 분획물의 조제
2012 년 경북 안동의 약업사에서 건조된 토우슬과 회우슬을 각각 구입하였다. 에탄올 추출물을 조제하기 위하여, 각각의 우슬에 대해 10 배 부피의 에탄올(95 %, 덕산, 한국)을 가하고, 상온에서 8 시간씩 3 회 추출하였다. 열수 추출물은 건조 우슬에 10 배 부피의 물을 가하고 100 ℃에서 1 시간씩 3 회 고온 추출하였다. 각각의 추출액은 필터기를 사용하여 이물질을 제거한 후 회수하고, 이를 감압 농축하여 분말로 제조하고 사용 전까지 저온 밀봉 보관하였다. 이후, 에탄올 추출물 및 열수 추출물을 증류수에 현탁한 후, 헥센, 에틸아세테이트, 부탄올로 순차적 분획하였으며, 최종적으로 물 잔류물을 얻었다.
이때 토우슬의 에탄올 추출물 및 열수 추출물의 수득율은 53.9±3.12 % 및 5.0±0.12 %로 나타나 열수 추출물이 에탄올 추출물이 10 배 이상 많았다. 토우슬 에탄올 추출물 및 열수 추출물의 헥센 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물 및 물 잔류물의 수득율은 표 1에 나타낸 바와 같으며, 열수 추출물의 77 %가 물 잔류물인데 비해, 에탄올 추출물의 경우 부탄올 분획물과 물 잔류물이 각각 42.4 % 및 47.3 %를 나타내어 열수 추출물은 주로 수용성 당류를 포함하는 것으로 나타났다.
반면, 회우슬의 에탄올 추출물 및 열수 추출물의 수득율은 5.1±0.05 % 및 47.6±4.55 %로 나타나 열수 추출물이 에탄올 추출물보다 9 배 이상 많았다. 회우슬 에탄올 추출물 및 열수 추출물의 헥센 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물 및 물 잔류물의 수득율은 표 1에 나타내었다. 역시 열수 추출물의 경우 물 잔류물이 88.2 %로 압도적으로 많은 반면, 에탄올 추출물의 경우 부탄올 분획물과 물 잔류물이 각각 32.0 % 및 64.2 %를 나타내었다. 특히 회우슬은 토우슬에 비해 헥센 및 에틸아세테이트 분획물의 양이 매우 적게 나타났다.
토우슬 및 회우슬 에탄올 추출물 및 열수 추출물의 수율
우슬 추출효율 또는 분획효율(%)
추출용매 추출물 헥센 분획 에틸아세테이트 분획 부탄올 분획 물 잔류물
토우슬 열수 53.9±3.12 1.0 0.4 17.7 77.0
에탄올 5.0±0.12 2.3 6.2 42.4 47.3
회우슬 열수 47.6±4.55 0.2 0.4 10.4 88.2
에탄올 5.1±0.05 0.8 2.8 32.0 64.2
실시예 2: 우슬 추출물 및 유기용매 분획물의 성분 분석
조제된 우슬 추출물 및 분획물 20 종을 대상으로 총 플라보노이드(total flavonoid), 총 폴리페놀(total polyphenol), 총당 및 환원당 함량을 측정하였다. 총 플라보노이드 함량 측정은 각각의 시료를 18 시간 메탄올 교반 추출하고, 여과한 추출 검액 400 μl에 90 % diethylene glycol 4 ml를 첨가하고 다시 1 N NaOH 40 μl를 넣고 37 ℃에서 1 시간 반응 후 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준시약으로는 rutin을 사용하였다. 총 폴리페놀 함량은 추출 검액 400 μl에 50 μl의 Folin-ciocalteau, 100 μl의 Na2CO3 포화용액을 넣고 실온에서 1 시간 방치한 후 725 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준시약으로는 tannic acid를 사용하였다. 환원당은 DNS법으로, 총당은 phenol-sulfuric acid법을 이용하여 정량하였다. 그 결과는 다음 표 2에 나타내었다.
우슬 추출물 및 유기용매 분획물의 성분 분석
우슬/
추출용매		 시료 함량 (mg/g)
총플라보노이드 총 폴리페놀 총당 환원당
토우슬/
열수		 열수 추출물 0.09±0.01 3.20±0.11 354.80±0.16 191.62±0.00
헥센 분획물 0.49±0.08 3.26±0.15 301.32±0.63 123.19±3.01
에틸아세테이트
분획물		 2.92±0.18 4.72±0.19 153.32±3.49 59.28±2.52
부탄올 분획물 0.10±0.00 4.18±0.10 382.27±0.63 348.39±0.72
물 잔류물 0.02±0.01 2.67±0.11 295.94±4.12 134.92±0.36
토우슬/
에탄올 		에탄올 추출물 0.11±0.10 3.53±0.09 384.17±0.48 342.44±3.37
헥센 분획물 2.61±0.52 4.60±0.25 40.94±0.75 29.44±0.48
에틸아세테이트
분획물		 0.72±0.22 4.66±0.13 330.81±0.48 276.82±2.88
부탄올 분획물 0.04±0.14 3.67±0.08 363.43±1.27 328.67±3.13
물 잔류물 0.06±0.03 2.38±0.05 371.17±1.43 334.96±2.40
회우슬/
열수		 열수 추출물 0.84±0.03 4.76±0.16 662.78±0.56 211.94±2.41
헥센 분획물 2.78±0.11 1.64±0.00 9.86±0.00 6.78±0.48
에틸아세테이트
분획물		 9.51±0.28 34.95±1.83 68.16±0.78 23.88±0.00
부탄올 분획물 0.86±0.07 5.14±0.00 475.08±5.08 245.15±2.17
물 잔류물 0.73±0.02 3.58±0.00 554.87±0.00 192.79±5.06
회우슬/
에탄올 		에탄올 추출물 1.71±0.07 6.79±0.12 553.08±3.10 430.04±3.85
헥센 분획물 3.39±0.09 7.22±0.06 25.72±0.21 20.70±0.48
에틸아세테이트
분획물		 19.05±0.42 8.32±0.06 80.27±0.63 38.06±0.24
부탄올 분획물 0.58±0.24 7.22±0.20 500.82±1.41 439.23±4.33
물 잔류물 0.71±0.00 4.91±0.02 544.30±2.54 126.23±6.50
표 2에 나타낸 바와 같이, 열수 추출물의 경우 토우슬보다 회우슬에서 총플라보노이드, 총폴리페놀 및 총당 함량이 높았으며, 분획물에서도 유사한 패턴을 나타내었다. 그러나, 총당의 경우 회우슬의 분획물 중에서는 부탄올 분획 및 물 잔류물로 이행되었으나, 토우슬의 경우 다양한 분획으로 나뉘어져 토우슬의 당류들이 다양한 물질들과 결합되어 있는 것으로 판단되었다. 가장 큰 차이는 에틸아세테이트 분획에서 나타났는데, 토우슬의 에틸아세테이트 분획이 대부분이 당류로 구성되어 있는 반면, 회우슬의 경우 플라보노이드 및 폴리페놀 물질이 매우 높은 비율을 나타내었다. 실제 회우슬의 에틸아세테이트 분획의 경우 플라보노이드 및 폴리페놀 물질의 총합은 토우슬의 그것보다 5.8 배 이상 높게 나타났다.
실시예 3: 우슬 추출물 및 유기용매 분획물의 혈액응고저해 활성 평가
다음으로, 우슬 추출물 및 분획물들의 혈액응고 저해활성을 평가하였다. 혈액응고 저해활성은 기존에 보고된 방법에 준해 평가하였으며(류 등 2010. J. Life Science, 20. 922-928), 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임과 에이피티 타임을 측정하였다. 혈장은 지원자의 전혈로부터 조제하였으며, 채혈 후 즉시 4 ℃에서 5,000 g로 5 분 동안 원심분리하여 혈장을 분리하고 냉동한 상태로 보관하였으며(신선동결혈장), 필요시 상온에서 해동하여 사용하였다. 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임과 에이피티 타임은 다음과 같은 과정으로 수행되었다.
트롬빈 타임( Thrombin Time )
37 ℃에서 0.5 U 트롬빈(Sigma Co., USA) 50 μl와 20 mM CaCl2 50 μl, 다양한 농도의 시료 추출액 10 μl를 Amelung coagulometer KC-1A(Japan)의 튜브에 혼합하여 2 분간 반응시킨 후, 혈장 100 μl를 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였다. 대조로는 아스피린(Sigma Co., USA)을 사용하였으며, 용매 대조구로는 시료 대신 DMSO를 사용하였다. DMSO의 경우 32.1 초의 응고시간을 나타내었다. 트롬빈 저해 효과는 3 회 이상 반복한 실험의 평균치로 나타내었으며, 시료 첨가시의 응고시간을 용매 대조구의 응고시간으로 나눈 값으로 나타내었다.
프로트롬빈 타임( prothrombin time )
표준혈장(MD Pacific Co., China) 70 μl와 다양한 농도의 시료액 10 μl를 Amelung coagulometer KC-1A(Japan)의 튜브에 첨가하여 37 ℃에서 3 분간 가온 후, 130 μl의 PT reagent를 첨가하고 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였다. 대조로는 아스피린(Sigma Co., USA)을 사용하였으며, 용매 대조구로는 시료 대신 DMSO를 사용하였다. DMSO의 경우 18.1 초의 응고시간을 나타내었다. 프로트롬빈 저해 효과는 3 회 이상 반복한 실험의 평균치로 나타내었으며, 시료 첨가시의 응고시간을 용매 대조구의 응고시간으로 나눈 값으로 나타내었다.
에이피티 타임 ( aPTT : activated Partial Thromboplastin Time )
혈장 100 μl와 다양한 농도의 시료 추출액 10 μl를 Amelung coagulometer KC-1A(Japan)의 튜브에 첨가하여 37 ℃에서 3 분간 가온한 후, 50 μl의 aPTT reagent(Sigma, ALEXINTM)를 첨가하고 다시 37 ℃에서 3 분간 배양하였다. 이후 50 μl CaCl2(35 mM)을 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였다. 용매 대조구로는 시료 대신 DMSO를 사용하였으며, 이 경우 55.1 초의 응고시간을 나타내었다. 에이피티 타임의 결과는 3 회 반복한 실험의 평균치로 나타내었으며, 시료 첨가시의 응고시간을 용매 대조구의 응고시간으로 나눈 값으로 나타내었다.
20종의 우슬 추출물 및 분획물을 5 mg/ml 농도에서 상기 설명된 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임과 에이피티 타임 측정법에 따른 혈액응고 저해활성 측정 결과는 다음 표 3에 나타내었다.
우슬 추출물 및 유기용매 분획물의 혈액응고 저해 활성
우슬/
추출용매		 시료
(5 mg/ml)		 혈액응고 저해활성*
트롬빈 타임 프로트롬빈 타임 에이피티 타임
토우슬/
열수		 열수 추출물 1.0±0.1 1.0±0.0 1.1±0.1
헥센 분획물 1.0±0.0 1.0±0.0 1.1±0.1
에틸아세테이트
분획물		 1.2±0.1 1.0±0.0 1.9±0.2
부탄올 분획물 1.3±0.1 1.0±0.0 1.3±0.0
물 잔류물 1.1±0.1 0.9±0.0 1.1±0.0
토우슬/
에탄올 		에탄올 추출물 1.2±0.1 1.0±0.0 1.2±0.1
헥센 분획물 2.6±0.2 1.7±0.1 >15.0
에틸아세테이트
분획물		 1.4±0.1 1.0±0.0 2.3±0.2
부탄올 분획물 1.2±0.1 0.9±0.0 1.3±0.1
물 잔류물 1.1±0.0 0.9±0.0 1.0±0.1
회우슬/
열수		 열수 추출물 1.1±0.1 1.0±0.0 1.1±0.1
헥센 분획물 1.2±0.1 1.1±0.0 1.0±0.1
에틸아세테이트
분획물		 1.7±0.1 1.3±0.0 1.2±0.0
부탄올 분획물 1.9±0.0 1.3±0.0 1.3±0.1
물 잔류물 1.4±0.1 1.1±0.0 1.0±0.0
회우슬/
에탄올 		에탄올 추출물 1.1±0.1 1.0±0.0 1.1±0.1
헥센 분획물 1.7±0.1 1.4±0.1 3.5±0.1
에틸아세테이트
분획물		 >15.0 >15.0 6.0±0.0
부탄올 분획물 1.1±0.1 1.0±0.0 1.1±0.1
물 잔류물 1.1±0.1 1.0±0.1 1.1±0.1
디엠에스오 (DMSO) 1.0±0.0 1.0±0.0 1.0±0.0
아스피린 (1.5mg/ml) 1.7±0.0 1.6±0.0 1.5±0.0
혈액응고 저해활성* : 시료 첨가시의 응고시간을 용매 대조구의 응고시간으로 나눈 값
표 3에 나타낸 바와 같이 먼저 항혈전제로 사용되고 있는 아스피린은 1.5 mg/ml 농도에서 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임, 에이피티 타임을 각각 1.7 배, 1.6 배, 1.5 배 연장시켜 우수한 혈액응고저해 활성을 확인하였다.
한편, 토우슬의 열수 추출물 및 분획물의 경우, 토우슬 부탄올 분획에서 약한 트롬빈 타임 및 에이피티 타임 연장 효과가 나타났으며, 에틸아세테이트 분획에서 에이피티 타임을 용매 대조구에 비해 1.9 배 연장시키는 활성이 확인되었다. 그러나, 회우슬의 열수 추출물 및 분획물의 경우, 에틸아세테이트 분획, 부탄올 분획 및 물 잔류물에서 우수한 트롬빈 타임 연장활성이, 에틸아세테이트 분획과 부탄올 분획에서 약한 프로트롬빈 타임 연장활성이 나타났다. 반면, 에틸아세테이트 분획에서는 에이피티 타임 연장효과가 미미하였다.
토우슬의 에탄올 추출물 및 분획물의 경우, 헥센 분획물에서 강력한 연장활성이 나타났으며, 특히 에이피티 타임을 용매 대조구에 비해 15 배 이상 연장시켜 매우 강력한 혈액응고인자의 저해를 나타냄을 확인하였다. 에틸아세테이트 분획에서도 트롬빈 저해 및 혈액응고인자의 저해를 확인하였다. 회우슬의 에탄올 추출물 및 분획물의 경우, 헥센 분획물 및 에틸아세테이트 분획에서 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임 및 에이피티 타임을 연장시키는 효과가 나타났으며, 특히 토우슬과는 달리 회우슬의 에틸아세테이트 분획에서 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임 및 에이피티 타임을 용매 대조구에 비해 각각 15 배, 15 배, 6 배 이상 연장시켜 매우 강력한 항혈전 활성을 확인하였다.
이러한 결과는 혈액응고 저해를 통한 항혈전 효과가 토우슬의 에탄올 추출물로부터 순차 분획되어 얻어진 헥센 분획물 및 회우슬의 에탄올 추출물로부터 순차 분획되어 얻어진 에틸아세테이트 분획물에서 가장 강력함을 의미하는데, 이는 우슬 추출물의 순차 분획되어 얻어진 본 발명과 같은 유기 용매 분획물이 아닌, 단순한 우슬의 열수 또는 유기용매 추출물로는 혈액응고 저해활성을 발견할 수 없으며, 적합한 용매를 이용한 특정 유기 용매 분획물에서만 우수한 항혈전 활성을 나타냄을 확인할 수 있다. 또한, 표 2에 제시된 성분분석결과와 비교시, 항혈전 활성물질은 폴리페놀성 물질임을 강력히 시사하고 있다.
실시예 4: 우슬 추출물 및 유기용매 분획물의 인간 혈소판 응집 저해활성
우슬 추출물 및 분획물의 항혈전 활성 평가의 일환으로 인간 혈소판에 대한 응집저해활성을 평가하였으며, 평가방법은 다음과 같다.
혈소판 응집저해 활성( Platelet aggregation inhibition activity )
혈소판은 건강한 인간의 전혈로부터 3.2 % sodium citrate 용액과 1:9의 비율로 혼합한 후, 1,100 rpm에서 10 분간 원심분리하여 상층의 PRP(platelet rich plasma)를 취하고, 이를 washing buffer(138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 12 mM NaHCO3, 0.36 mM NaH2PO4, 5.5 mM Glucose, 1 mM EDTA, pH 6.5)로 1 회 세척하였다. 이후, suspending buffer(138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 12 mM NaHCO3, 0.36 mM NaH2PO4, 5.5 mM Glucose, 0.49 mM MgCl2, 0.25 % gelatin, pH 7.4)에 재 현탁한 후, 3,000 rpm에서 10 분간 원심분리한 후 다시 suspending buffer에 재현탁하였으며, 이때 혈소판 수는 4x109/ml 되도록 조정하였다. 이후 1 ml 현탁액에 2.5 μl collagen을 가해 5 분간 반응시키고, whole-blood aggregometer(Chrono-log, USA)를 사용하여 37 ℃에서 혈소판 응집을 측정하였으며, 응집강도, 기울기, 연장시간 및 하강면적으로 나타내었다.
20종의 우슬 추출물 및 분획물을 0.25 mg/ml 농도에서 상기 설명된 혈소판 응집저해능을 측정한 결과는 다음 표 4에 나타내었다.
우슬 추출물 및 유기용매 분획물의 인간 혈소판 응집저해 활성
우슬/
추출
용매		 시료
(0.25 mg/ml)		 혈소판 응집 저해 활성*
강도
(Amplitude:
ohm)		 기울기
(Slope)		 연장시간
(Lag time:
초)		 하강면적
(Area
under)		 상대 응집율
(%)
토우슬/ 열수 열수 추출물 27 5 19 215.6 174.5
헥센 분획물 21 3 20 161.0 130.3
에틸아세테이트 분획물 27 5 13 219.3 177.5
부탄올 분획물 27 5 16 221.8 179.5
물 잔류물 28 5 18 217.0 175.6
토우슬/ 에탄올 에탄올 추출물 25 5 11 208.9 169.1
헥센 분획물 27 16 2 293.6 237.6
에틸아세테이트 분획물 26 7 6 256.0 207.2
부탄올 분획물 23 5 12 190.9 154.5
물 잔류물 19 3 38 131.0 106.0
회우슬/
열수		 열수 추출물 28 6 13 246.6 199.6
헥센 분획물 25 17 2 263.5 213.3
에틸아세테이트 분획물 25 6 4 229.1 185.4
부탄올 분획물 23 4 24 183.4 148.4
물 잔류물 24 5 28 191.5 155.0
회우슬/ 에탄올 에탄올 추출물 26 4 0:15 192.3 154.7
헥센 분획물 20 8 0:02 170.5 137.1
에틸아세테이트 분획물 26 13 0:02 274.3 220.6
부탄올 분획물 22 3 0:20 157.8 126.9
물 잔류물 20 30 0:24 142.6 114.7
디엠에스오 (DMSO) 18 3 16 124.3 100.0
아스피린 (0.25 mg/ml) 8 1 52 49.8 40.3
아스피린 (0.5 mg/ml) 4 0 83 30.1 24.4
혈소판 응집 저해 활성*: 응집강도, 기울기, 하강면적이 각각 작을수록 응집저해가 우수하며, 연장시간이 길수록 응집저해가 우수함.
표 4에 나타낸 바와 같이, 먼저 아스피린은 우수한 인간 혈소판 응집저해 활성을 나타내었으며, 농도의존적인 응집저해 활성을 확인하였다. 그러나 기존에 알려진 바와 달리, 토우슬, 회우슬의 열수 추출물 및 이의 분획물, 에탄올 추출물 및 이의 분획물 시료 20종에서 혈소판 응집저해 활성은 나타나지 않았다. 이러한 결과는 기존의 많은 혈소판 응집저해 활성을 보고한 우슬을 포함하는 한방탕약들이 홍화, 도인 적작약, 당귀, 목단, 목단피 등을 포함하는 복방으로 구성(대한한방부인과학회지 2005. 18: 110-126, 김경수 외, 대한한방내과학회지 2000. 2: 819-827, 김영선 외, 한방성인병학회지 1998. 4: 133-162, 설인찬 외)되어 있는 점을 감안하면, 우슬 자체로는 혈소판 응집저해 활성이 없으며, 다른 약재에 의해 혈소판 응집저해가 나타남을 의미하며, 실제 우슬의 항혈전 활성은 헥센 분획물 또는 에틸아세테이트 분획물에 존재하는 성분에 의한 트롬빈, 프로트롬빈 및 혈액응고인자 저해에 의한 것임을 확인하였다.

Claims (4)

  1. 우슬(Achyranthes Radix) 뿌리의 에탄올 추출물을 헥센 및 에틸아세테이트로 순차 분획하여 얻어진 헥센 분획물 또는 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 혈액응고 저해용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 우슬(Achyranthes Radix)은 토우슬(Achyranthes japonica Nakai) 또는 회우슬(Achyranthes bidentata Blume)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 삭제
  4. 삭제
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