KR101404168B1 - 참당귀 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품 - Google Patents

참당귀 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품 Download PDF

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Abstract

본 발명은 참당귀(Angelica gigas Nakai) 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증(thrombosis)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는, 참당귀의 에탄올 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 상기 추출물을 포함하는 건강 기능 식품에 관한 것이다. 본 발명의 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품의 유효성분으로서의 참당귀 추출물은, 본 명세서의 실시예를 통해 증명된 바와 같이, 참당귀 지하부를 에탄올 등으로 추출하여 추출물을 조제한 후, 헥센, 에틸아세테이트 및 부탄올을 이용하여 순차적으로 분획하여 조제되며, 이 중 우수한 혈액응고인자 저해효과에 의한 항혈전 활성을 나타내는 부탄올 분획은 혈전 생성을 효율적으로 억제할 수 있는 효과가 있으며, 혈행개선을 통해 허혈성 뇌졸중 및 출혈성 뇌졸중과 같은 혈전증의 예방 및 치료용으로 사용할 수 있는 뛰어난 효과가 있다. 특히, 본 발명의 참당귀 추출물은 급성경구독성이 나타나지 않으며, 열 안정성이 우수하고, pH 2의 산성조건 및 혈장 내에서도 혈액응고인자 저해 및 활성화 효과의 손실이 나타나지 않아, 추출액, 분말, 환, 정 등의 다양한 형태로 가공되어 상시 복용이 가능한 형태로 조제할 수 있는 뛰어난 효과가 있으므로 제약산업 및 식품산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Description

참당귀 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품{PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING THE EXTRACT OF ANGELICA GIGAS NAKAI AS AN EFFECTIVE COMPONENT FOR PREVENTION OR TREATMENT OF THROMBOSIS AND HEALTH FUNCTIONAL FOOD COMPRISING THE SAME}
본 발명은 참당귀(Angelica gigas Nakai) 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증(thrombosis)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는, 참당귀의 에탄올 추출물, 특히 참당귀의 부탄올 분획물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 상기 추출물 또는 분획물을 포함하는 건강 기능 식품에 관한 것이다.
인체 구성성분으로 혈액은 산소, 영양분, 노폐물의 운반 기능과 완충작용, 체온유지, 삼투압 조절 및 이온 평형유지, 수분 일정유지, 액성 조절작용, 혈압의 유지 및 조절, 생체방어 등 다양한 중요 기능들을 가지고 있다. 정상적인 혈액 순환은 체내에서의 혈액 응고 반응계와 혈전 용해 반응계가 상호 보완적으로 조절되면서 혈액 순환을 용이하게 하며, 이들 중 혈액 응고 반응계의 기작은 혈관벽에 혈소판이 점착, 응집하여 혈소판 혈전을 형성한 후, 혈액 응고계가 활성화되어 혈소판 응집괴를 중심으로 피브린 혈전이 형성되는 것으로 보고되어 있다.
한편, 피브린 혈전의 생성은 수많은 혈액응고인자들의 여러 단계 반응을 거쳐 피브린 응고에 관여하는 트롬빈이 활성화되어, 최종적으로 피브리노겐으로부터 피브린 단량체를 생성하게 하며, 피브린 단량체들은 칼슘에 의해 중합되어, 혈소판과 내피세포에 결합하게 되며 XIII 인자에 의해 교차 결합된 피브린 폴리머를 형성하면서 영구적인 혈전을 생성하게 된다. 또한, 트롬빈은 혈소판, V 인자, VII 인자들을 활성화시켜 혈액 응고반응을 촉진시키는 등 혈전 생성에 중추적 역할을 하게 된다. 따라서, 트롬빈의 활성 저해물질은 과다한 혈액응고 이상으로 발생하는 다양한 혈전성 질환에 매우 유용한 예방 및 치료제로 사용될 수 있다. 한편 내인성 혈전생성경로에는 12인자, 11인자, 9인자, 10인자의 순차적 활성화에 이은 프로트롬빈의 활성화가 최종적으로 트롬빈을 활성화하는 것으로 알려져 혈액응고인자의 특이적 저해 역시 중요한 혈전성 질환 치료제의 개발 타겟이 되고 있다. 현재까지 혈전성 질환의 예방과 치료에 헤파린, 쿠마린, 아스피린, 유로키네이즈 등의 다양한 항응고제, 항혈소판제, 혈전용해제 등이 사용되고 있으나, 이들은 가격이 매우 높을 뿐 아니라 출혈성 부작용과 위장장해 및 과민반응 등으로 그 사용이 한정되고 있는 실정이다.
참당귀(Angelica gigas Nakai)는 산형과에 속하는 다년생 풀인 당귀의 뿌리를 말린 것으로, 맛은 달고 매우며, 성질은 따뜻하다. 당귀는 빈혈 예방 및 치료에 주로 사용되며, 각종 부인병에 효과가 좋다고 알려져 있다. 특히, 동의보감에서는 당귀의 효능에 대해 '어혈(瘀血)을 깨뜨리려고 할 때는 머리 쪽의 단단한 마디를 쓰고, 지혈(止血)시키거나 통증을 멈추려는 지통(止痛)이 목표일 때는 잔뿌리를 쓴다. 머리 부분을 쓰면 어혈을 풀고, 잔뿌리를 쓰면 지혈한다. 전체를 다 쓰면 한편으로는 어혈을 풀고, 다른 한편으로는 피를 멎게 하니, 이것을 화혈(和血)한다고 한다'라고 표기하여, 민간에서는 당귀가 지혈기능과 어혈을 푸는 상반되는 두 가지 기능을 동시에 가지고 있음이 알려져 있다. 하지만, 혈전생성을 촉진하는 기능과 혈전생성을 억제하는 기능을 어떻게 동시에 나타내는지에 대한 연구는 전무한 실정이다.
참당귀와 관련된 학술문헌으로는 참당귀의 당뇨개선 효과(박만중 외, 2009. 한국식품영양과학회지, 22: 246-251), 항산화 효과(강순아 외 2004, 한국식품영양과학회지,33: 1112-1118), caspase-3 활성화를 통한 암세포 사멸효과(박경욱 외, 2007. 한국식품유통저장학회지, 14: 655-661), 암세포 생육억제, 돌연변이 유발억제 및 Angiotensin converting enzyme 저해활성(함문선 외, 1996. 한국응용미생물생명공학회 24: 624-629), 마우스 지방대사와 알콜성 간독성의 부분적 개선효과(오석홍 외 1999, 한국농화학회지 42: 29-33), 허혈성 뇌손상 억제작용 및 신경세포 보호효과(전연이 외, 2003, 한국본초학회지, 18: 25-35) 등이 보고되어 있으며, 참당귀의 유용 생리활성물질인 decursin, decursinol angelate의 분석법(강영구 외, 2003. 생약학회지 34: 201-205) 및 당귀 추출물을 이용한 식품제조(장상근 외, 2008. 한국식생활문화학회지, 23: 479-488) 등의 당귀의 식품학적 응용에 대한 연구도 진행되어 있다. 그러나, 현재까지 당귀에 혈행조절에 대한 연구는 거의 이루어진 바 없으며, 이 등이 참당귀의 courmarin계 화합물의 혈소판 응집 저해활성을 보고(이용욱 외, 2003, Arch, Pharm. Res 26: 723-726)한 바 있으나, 참당귀 추출물 및 분획물을 대상으로 인간트롬빈, 프로트롬빈, 혈액응고인자 저해에 따른 혈전 생성억제에 대한 연구보고는 없는 실정이다.
또한, 참당귀와 관련된 특허로는 대한민국 등록특허 10-0829122호(등록일자: 2008년 5월 6일) 당귀추출물 또는 이로부터 분리한 쿠마린계 화합물을 유효성분으로 하는 폐암 예방용 조성물, 대한민국 등록특허 10-0746294호(등록일자: 2007년 7월 30일) 참당귀 유래 다당류를 유효성분으로 포함하는 수지상세포 활성화용 약학조성물이 있으며, 금은화, 우슬, 석곡, 황기, 당귀 등 9종의 혼합 생약재 추출물을 유효성분으로 함유하는 항혈전제(등록특허 10-0784339, 등록일자: 2007년 12월 4일)에 혈소판 응집저해에 따른 항혈전용 조성물이 알려져 있다. 한편, 참당귀 에탄올 추출물로부터 탄수화물 제거공정을 통한 고순도 decursin 함유 당귀 추출물을 조제하는 방법으로 대한민국 등록특허 10-0775741(등록일자: 2007년 11월 5일) 당귀 추출물의 제조방법 및 그 조성물 및 참당귀 에탄올 추출물에 알칼리화제를 첨가한 후, 가온 추출하여 decursinol을 고농도롤 수득하는 방법에 대한 대한민국 등록특허: 10-0749233호(등록일자: 2007년 3월 7일)가 있다. 또한, 대한민국 공고특허 제10-0252194호에서는 당귀의 펙틴질 다당류를 유효성분으로 함유하는 면역 증강제, 등록특허 제10-0336182호에는 당귀 히드록시신남산 유도체를 유효성분으로 함유하는 치매 예방 및 치료제 조성물, 대한민국 공개특허 제2005-0121324호에는 decursin 또는 decursinol angelate를 유효성분으로 이용한 배뇨장애 및 부종 치료제, 공개특허 제2006-0078343호 및 등록특허 제10-0187881호 등에서는 decursin 또는 decursinol angelate를 유효성분으로 하는 항암제 조성물이 공지되어 있다. 그러나 현재까지 참당귀의 추출물 및 분획물의 항혈전 및 지혈촉진 관련 특허는 없으며, 혈소판 응집 저해효과에 의한 항혈전 활성이 아닌, 본 연구와 관련된 당귀의 내인성 경로의 혈액응고인자 저해 활성 및 지혈촉진 활성에 대한 특허는 알려져 있지 않다.
대한민국 등록특허 제10-0784339호
본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 약용으로 이용되고 있는 참당귀 지하부의 추출물을 유효성분으로 함유하는 내인성 혈액응고인자 저해에 따른 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 상기 추출물을 포함하는 건강 기능 식품을 제공하고자 하는 것이다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 참당귀 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 참당귀 추출물은 참당귀 에탄올 추출물인 것이 바람직하다.
또한, 상기 참당귀 추출물은 참당귀 에탄올 추출물의 부탄올 분획물인 것이 바람직하다.
상기 부탄올 분획물은 상기 에탄올 추출물을 헥센, 에틸아세테이트 및 부탄올로 순차 분획하여 얻어지는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명의 참당귀 추출물을 포함하는 건강 기능 식품을 제공한다.
본 발명의 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품의 유효성분으로서의 참당귀 추출물은, 본 명세서의 실시예를 통해 증명된 바와 같이, 참당귀 지하부를 에탄올 등으로 추출하여 추출물을 조제한 후, 헥센, 에틸아세테이트 및 부탄올을 이용하여 순차적으로 분획하여 조제되며, 이 중 우수한 혈액응고인자 저해효과에 의한 항혈전 활성을 나타내는 부탄올 분획은 혈전 생성을 효율적으로 억제할 수 있는 효과가 있으며, 혈행개선을 통해 허혈성 뇌졸중 및 출혈성 뇌졸중과 같은 혈전증의 예방 및 치료용으로 사용할 수 있는 뛰어난 효과가 있다. 특히, 본 발명의 참당귀 추출물은 급성경구독성이 나타나지 않으며, 열 안정성이 우수하고, pH 2의 산성조건 및 혈장 내에서도 혈액응고인자 저해 효과의 손실이 나타나지 않아, 추출액, 분말, 환, 정 등의 다양한 형태로 가공되어 상시 복용이 가능한 형태로 조제할 수 있는 뛰어난 효과가 있으므로 제약 산업 및 식품 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.
본 발명은 참당귀 추출물을 함유하는 혈액응고인자 저해 활성을 갖는 혈전증 예방 또는 치료용 약학적 조성물과 건강 기능 식품에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명의 발명자들은 일정 방법으로 수득한 참당귀 추출물로부터 항혈전 활성 성분을 회수하였고, 이러한 성분은 경구급성독성이 나타나지 않으면서, 열 안정성과 산 안정성이 우수한 특징을 가짐을 확인함으로써 상기 추출물을 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품으로 활용하고자 하였다.
구체적으로, 본 발명자들은 참당귀를 이용하여 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품을 개발하기 위하여 참당귀의 에탄올 추출물을 조제하고, 이를 순차적 유기용매 분획하여 헥센 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물 및 물 잔류물 등을 수득하고, 이를 각각 인간 혈장과 인간 트롬빈에 대한 트롬빈 직접저해(Thrombin Time), 프로트롬빈 저해(Prothrombin Time) 및 활성부분 트롬보플라스틴 타임(activated Partial Thromboplastin Time: aPTT)을 평가하였다. 그 결과, 참당귀 에탄올 추출물에서 트롬빈 타임 연장활성(트롬빈 저해활성) 및 활성부분 트롬보플라스틴 타임 연장활성(혈액응고인자의 특이적 저해활성)을 확인하였으며, 이의 유기용매 분획물 중 특히, 부탄올 분획에서는 트롬빈 타임 및 프로트롬빈 타임의 변화없이 활성부분 트롬보플라스틴 타임만이 무처리구에 비해 15배 이상 연장됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
이와 같은 효과를 확인하기 위하여, 본 발명의 발명자들은 참당귀 추출물 및 유기용매 분획물을 제조하고, 이의 총폴리페놀, 총플라보노이드 등의 유용성분을 분석하고, 추출물 및 분획물의 인간트롬빈 직접저해 효과, 프로트롬빈 저해효과, 혈액응고인자(8인자, 9인자, 11 및 12인자) 저해에 의한 활성부분 트롬보플라스틴 타임 연장효과를 평가하여, 본 발명의 상기 추출물 등이 상업적으로 이용되고 있는 항혈전제 아스피린(상품명: 프로텍트)보다 우수한 항혈전 활성을 가짐을 확인하고, 인간 적혈구 용혈활성이 나타나지 않으며, 상기 물질의 열 및 산 안정성을 조사한 다음, 상기 물질을 흰쥐에 경구투여하여 급성독성검사를 실시함으로써 상기 추출물이 인체 독성이 거의 없음을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 참당귀 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품을 제공한다.
바람직한 구체예로서, 상기 참당귀 추출물은 참당귀 에탄올 추출물인 것이 바람직하다.
또 다른 바람직한 구체예로서, 상기 참당귀 추출물은 참당귀 에탄올 추출물의 유기 용매 분획물 중 부탄올 분획물인 것이 바람직하다. 상기 부탄올 분획물은 상기 에탄올 추출물을 헥센, 에틸아세테이트 및 부탄올로 순차 분획하여 얻어질 수 있다.
이하에서는, 본 발명의 참당귀 추출물의 제조 방법 및 효능 실험 등을 보다 구체적으로 설명한다.
본 발명은 참당귀 지하부로부터 활성 추출물을 조제하는 단계; 참당귀 추출물로부터 헥센, 에틸아세테이드, 부탄올 등의 유기용매 분획물의 조정제하는 단계; 상기 추출물 및 분획물의 효능 및 안정성 조사단계; 및 상기 분획물의 급성 독성검사단계를 포함한다.
본 발명의 조성물에 포함되는 "참당귀 추출물"은 참당귀의 뿌리부분을 세척한 후, 음건하는 단계, 건조 뿌리를 유기용매로 추출하는 단계 및 상기 추출액을 0.06 mm 이하의 여과망을 사용하여 여과하고, 이를 감압농축하는 단계에 의해 수득될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 유기용매는 물(냉수, 열수), 주정, 탄소수 1~4의 무수 또는 함수 저급 알코올(메탄올, 에탄올, 주정, 프로판올, 부탄올 등), 상기 저급알코올과 물과의 혼합용매 등을 이용할 수 있으며, 80~95 % 에탄올이 가장 바람직하다.
본 발명에서는, 참당귀 에탄올 추출물을 5 mg/ml의 농도로 하여 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임 및 에이피티 타임을 측정한 결과, 참당귀 에탄올 추출물은 무첨가구보다 각각 1.7 배, 1 배 및 1.3 배 이상 연장된 혈전 생성 억제 활성을 나타냄을 확인함으로써 참당귀 에탄올 추출물은 전체적으로 항혈전 효과가 있음을 증명하였다. 한편, 분획물 중 헥센 분획물은 5 mg/ml 농도에서 트롬빈 타임을 2.2 배 연장시켰으나, 프로트롬빈 타임 및 에이피티 타임을 각각 및 0.9 배 및 0.5 배로 감소시켰다. 반면, 부탄올 분획의 경우 5 mg/ml 농도에서 트롬빈 타임 및 프로트롬빈 타임은 거의 변화 없이, 에이피티 타임을 무첨가구에 비해 15 배 이상 연장시켰다. 이러한 결과는 참당귀의 부탄올 분획은 혈전생성을 억제(어혈 제거)하는 효과를 가짐을 의미한다. 이러한 결과로부터 민간에서 어혈제거용으로 이용되어 온 참당귀 추출물에는 혈전생성 억제활성물질이 포함되어 있음을 알 수 있으며, 특히, 참당귀의 부탄올 분획은 우수한 혈액응고인자 저해활성으로 항혈전 활성을 나타내며, 기존의 아스피린과 같은 항응고제를 대치할 수 있음을 제시한다.
본 발명의 참당귀 추출물 및 이의 부탄올 분획물은 감압증류 및 동결건조, 또는 분무건조 등과 같은 통상적인 분말화 과정을 거쳐 분말로 제조될 수 있다. 이들은 100 ℃의 열처리와 pH 2의 인체 위 내의 pH에서도 활성을 유지한다.
본 발명의 참당귀 추출물은 혈전증과 관련된 다양한 질환들의 예방 또는 치료용으로 사용될 수 있다. 상기 질환들은, 예를 들어, 동맥 혈전증으로서, 급성 심근 경색증, 가슴 통증, 호흡 곤란, 의식 소실, 허혈성 뇌졸중, 출혈성 뇌졸중, 두통, 운동 이상, 감각 이상, 성격 변화, 시력 저하, 간질 발작, 폐 혈전증, 심부정맥 혈전증, 하지 부종, 통증 및 급성 말초 동맥 폐쇄증 등을 들 수 있고, 정맥 혈전증으로서, 심부정맥 혈전증, 간문맥 혈전증, 급성 신장정맥 폐쇄증, 뇌 정맥동 혈전증 및 중심 망막정맥 폐쇄 등을 들 수 있다.
본 발명의 참당귀 추출물을 포함하는 약학적 조성물은 각각의 사용 목적에 맞게 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구 제형, 멸균 주사용액의 주사제 등 다양한 형태로 제형화하여 사용할 수 있으며, 경구 투여하거나 정맥 내, 복강 내, 피하, 직장, 국소 투여 등을 포함한 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다.
이러한 약학적 조성물에는 추가적으로 담체, 부형제 또는 희석제 등이 더 포함될 수 있으며, 포함될 수 있는 적합한 담체, 부형제 또는 희석제의 예로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리쓰리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 비정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 충전제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 더 포함할 수도 있다.
바람직한 구체예로서, 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 약학적 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 혼합하여 제형화한다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 등과 같은 윤활제가 사용될 수도 있다.
바람직한 구체예로서, 경구용 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 예시될 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
바람직한 구체예로서, 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액제, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제, 좌제 등을 예시할 수 있다. 비수성용제, 현탁제에는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 포함될 수 있다. 주사제에는 용해제, 등장화제, 현탁화제, 유화제, 안정화제, 방부제 등과 같은 종래의 첨가제가 포함될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
바람직한 구체예로서, 본 발명의 약학적 조성물에서 참당귀 추출물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 ㎏ 당 1 내지 5,000 mg, 바람직하게는 100 내지 3,000 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 다양한 경로를 통하여 대상에 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에서 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 약학적 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 일반적인 모든 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 유효성분을 표적 세포로 전달할 수 있는 임의의 장치를 이용해 투여될 수도 있다.
본 발명에서 "대상"은, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 인간, 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함하고, 바람직하게는 포유류, 보다 바람직하게는 인간을 의미한다.
또한, 본 발명의 건강 기능 식품은 혈전증의 예방 또는 개선에 효과적인 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 참당귀 추출물을 포함하는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.
본 발명의 참당귀 추출물은 일반적으로 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강음료 조성물은 100 ml를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.
본 발명의 건강 기능 식품은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 것 외에 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제, 예컨대, 천연 탄수화물 및 다양한 향미제 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상기 천연 탄수화물의 예로는 포도당, 과당 등의 단당류, 말토오스, 수크로오스 등의 이당류 및 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 다당류와 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등의 당알코올이 있다.
상기 향미제로는 타우마틴; 레바우디오시드 A 또는 글리시르히진과 같은 스테비아 등의 천연 향미제 및 사카린, 아스파르탐 등의 합성 향미제를 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강 기능 식품 100 ml당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 gdmf 사용한다. 상기 외에 본 발명의 건강 기능 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물, 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강 기능 식품은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료 등의 제조를 위한 과육을 함유할 수도 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 본 발명의 참당귀 추출물 100 중량부 당 0.01 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 바람직한 하나의 구체예일 뿐이며, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예의 범위로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 참당귀 추출물 및 유기용매 분획물의 조제
2011년 강원도 평창에서 재배된 참당귀의 지하부를 구입하여 참당귀에 대해 5 배의 증류수를 가하고 100 ℃에서 2 시간 가열 추출한 후 방냉하고, 이를 filter 한 후, 감압 농축하여 분말로 제조하여 열수 추출물을 제조하였다.
에탄올 추출물은 참당귀에 대해 10 배 부피의 에탄올(95 %, 덕산, 한국)을 가하고 상온에서 8 시간씩 2 회 추출하였다. 추출물은 감압 농축하여 분말로 제조하였으며, 사용 전까지 저온 밀봉 보관하였다. 이후, 에탄올 추출물을 증류수에 현탁한 후, 헥센, 에틸아세테이트, 부탄올로 순차적 분획하였으며, 최종적으로 물 잔류물을 얻었다.
이때, 열수 추출물의 수득효율은 30.1±0.6 %였으며, 에탄올 추출물의 수득율은 10.2±0.5 %로 나타났다. 에탄올 추출물의 헥센 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물 및 물 잔류물의 수득율은 각각 24.0 %, 38.3 %, 6.0 % 및 5.8 %였다.
조제된 참당귀 추출물들의 총 플라보노이드(total flavonoid), 총 폴리페놀(total polyphenol), 총당 및 환원당 함량을 측정하였다. 총 플라보노이드 함량 측정은 각각의 시료를 18 시간 메탄올 교반 추출하고, 여과한 추출 검액 400 μl에 90 % diethylene glycol 4 ml를 첨가하고 다시 1 N NaOH 40 μl를 넣고 37℃에서 1 시간 반응 후 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준시약으로는 rutin을 사용하였다. 총 폴리페놀 함량은 추출 검액 400 μl에 50 μl의 Folin-ciocalteau, 100 μl의 Na2CO3 포화용액을 넣고 실온에서 1 시간 방치한 후 725 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준시약으로는 tannic acid를 사용하였다. 환원당은 DNS법으로, 총당은 phenol-sulfuric acid법을 이용하여 정량하였다. 그 결과는 다음 표 1에 나타내었다.
참당귀 열수 추출물 및 에탄올 추출물의 수율 및 이들의 성분 분석 (단위: mg/g)
추출물 추출효율(%) 총 폴리페놀 총 플라보노이드 총 당 환원당
열수추출 30.1±0.6 2.77±0.21 6.60±0.09 717.89±4.26 18.74±1.04
에탄올 추출 10.2±0.5 26.19±0.25 18.25±0.82 130.92±4.26 7.05±0.49
참당귀는 열수 추출의 경우 추출효율은 좋으나, 대부분의 성분이 수용성 당으로 나타났으며, 총폴리페놀 및 총플라보노이드 함량은 에탄올 추출물에 비해 각각 10 % 및 36 % 수준을 나타내었다. 이에 반해, 에탄올 추출물은 상당히 높은 폴리페놀 성분을 함유하고 있어 우수한 항산화력과 유용생리활성을 나타낼 것으로 판단되며, 이는 기존에 보고된 참당귀의 항균, 항당뇨, 항암효과 등과 상통하는 부분이다.
다음으로, 참당귀 추출물의 항혈전 활성을 평가하였다. 항혈전 활성은 기존에 보고된 방법에 준해 평가하였으며(Sohn et al., 2004. Kor. J. Pharmacogn 35. 52-61; Kwon et al., 2004. J. Life Science, 14. 509-513; 류 등 2010. J. Life Science, 20. 922-928), 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임과 에이피티티 타임을 측정하였다. 혈장은 지원자의 전혈로부터 조제하였으며, 채혈 후 즉시 4 ℃에서 5,000 g로 5 분 동안 원심분리하여 혈장을 분리하고 냉동한 상태로 보관하였으며(신선동결혈장), 필요시 상온에서 해동하여 사용하였다. 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임과 에이피티티 측정법은 다음과 같은 과정으로 수행되었다.
트롬빈 타임( Thrombin Time )
37 ℃에서 0.5 U 트롬빈 (Sigma Co., USA) 50 μl와 20 mM CaCl2 50 μl, 다양한 농도의 시료 추출액 10 μl를 Amelung coagulometer KC-1A(Japan)의 튜브에 혼합하여 2 분간 반응시킨 후, 혈장 100 μl를 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였다. 대조로는 아스피린(Sigma Co., USA)을 사용하였으며, 용매 대조구로는 시료 대신 DMSO를 사용하였다. DMSO의 경우 32.1 초의 응고시간을 나타내었다. 열 안정성 측정의 경우에는 다양한 농도의 시료용액을 100 ℃에서 30 분간 열처리하고, 실온에서 1 시간 방냉한 후, 잔존활성을 측정하였다. 트롬빈 저해 효과는 3 회 이상 반복한 실험의 평균치로 나타내었으며, 시료 첨가시의 응고시간을 용매 대조구의 응고시간으로 나눈 값에 100을 곱하여 %로 나타내었다.
프로트롬빈 타임( prothrombin time )
표준혈장(MD Pacific Co., China) 70 μl와 다양한 농도의 시료액 10 μl를 Amelung coagulometer KC-1A(Japan)의 튜브에 첨가하여 37 ℃에서 3 분간 가온 후, 130 μl의 PT reagent를 첨가하고 혈장이 응고될 때까지의 시간을 3 회 반복한 실험의 평균치로 나타내었다. 대조로는 아스피린(Sigma Co., USA)을 사용하였으며, 용매 대조구로는 시료 대신 DMSO를 사용하였다. DMSO의 경우 18.1 초의 응고시간을 나타내었다.
aPTT ( activated Partial Thromboplastin Time )
혈장 100 μl와 다양한 농도의 시료 추출액 10 μl를 Amelung coagulometer KC-1A(Japan)의 튜브에 첨가하여 37 ℃에서 3 분간 가온한 후, 50 μl의 aPTT reagent(Sigma, ALEXINTM)를 첨가하고 다시 37 ℃에서 3 분간 배양하였다. 이후 50 μl CaCl2(35 mM)을 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였다. 용매 대조구로는 시료 대신 DMSO를 사용하였으며, 이 경우 55.1 초의 응고시간을 나타내었다. aPTT의 결과는 3 회 반복한 실험의 평균치로 나타내었으며, 시료 첨가시의 응고시간을 용매 대조구의 응고시간으로 나눈 값에 100을 곱하여 %로 나타내었다.
상기 설명된 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임과 에이피티 타임 측정법에 따른 항혈전 측정 결과는 다음 표 2에 나타내었다. 대조구로 사용된 아스피린은 5 mg/ml 농도에서 우수한 항혈전 효과를 나타내었으며, 참당귀의 열수 추출물은 5 mg/ml 농도까지 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임, 에이피 타임을 변화시키지 않았다. 반면, 에탄올 추출물은 트롬빈 타임 및 에이피 타임을 약 1.7 배 및 1.3 배 연장시켰다. 이는 아스피린 1.5~2.0 mg/ml 에 해당하는 항혈전 효과로서 당귀 에탄올 추출물이 항혈전제로 이용 가능함을 제시하며, 아스피린이 나타내는 위장 장해 등과 참당귀 에탄올 추출물이 정제되지 않은 상태임을 고려한다면, 향후 참당귀 유래 항혈전 활성물질 확보시 상업적으로 유용하리라 판단된다.
참당귀 열수 추출물 및 에탄올 추출물의 항혈전 활성
최종
농도
(mg/ml)		 트롬빈 타임(초) 프로트롬빈 타임(초) 에이피티 타임 (초)
열수 에탄올 아스피린 열수 에탄올 아스피린 열수 에탄올 아스피린
0 32.1 32.1 32.1 18.1 18.1 18.1 55.1 55.1 55.1
1.5 ND ND 79.9 ND ND 22.6 ND ND 65.0
2.5 35.1±1.2 35.6±3.6 282.4 18.0±1.3 18.5±1.0 28.3 56.8±2.7 43.8±4.1 85.4
5.0 38.5±3.2 54.6±3.2 > 480 16.3±0.4 16.3±0.9 > 270 55.1±10.5 71.6±5.1 > 800
ND: Not Determined (비측정)
실시예 2: 참당귀 추출물의 순차적 유기용매 분획물의 성분 분석 및 항혈전 활성 평가
항혈전 활성이 확인된 실시예 1의 참당귀 에탄올 추출물을 용매 분획한 후, 분획물의 성분 및 항혈전 활성을 조사하였다. 분획물의 총 플라보노이드, 총 폴리페놀, 총당 및 환원당 함량을 측정한 결과는 표 3과 같다.
참당귀 추출물의 유기용매 분획물의 분획효율 및 이들의 성분 분석
추출물 분획효율
(%)		 함량 (mg/g)
총 폴리페놀 총 플라보노이드 총 당 환원당
헥센 분획 23.99 11.19±0.49 8.07±0.80 13.01±6.09 4.96±0.23
에틸아세테이트 분획 38.27 44.23±1.23 29.33±1.28 35.38±3.65 5.51±0.30
부탄올 분획 5.97 100.42±3.43 32.54±2.39 245.38±2.43 66.55±7.95
물 잔류물 25.77 31.13±0.37 8.50±1.52 643.44±14.00 20.37±3.75
참당귀 에탄올 추출물의 유기용매 분획수율은 에틸아세테이트>물>헥센>부탄올 분획물의 순서로 나타났으며, 총폴리페놀 함량 및 총폴리페놀 함량은 부탄올>에틸아세테이트>물>헥센 분획물의 순서, 총당 함량은 물>부탄올>에틸아세테이트>헥센 분획물의 순서, 환원당 함량은 부탄올>물>에틸아세테이트>헥센 분획물의 순서로 나타났다. 이러한 결과로 미루어 볼때 부탄올 및 에틸아세테이트 분획은 강력한 항산화력과 유용생리활성을 나타낼 것으로 예상되었으며, 실제 강력한 항산화력을 나타내었다(결과 미제시).
분획물의 항혈전 활성을 평가한 결과, 다음 표 4에 나타낸 바와 같이 헥센 분획은 5 mg/ml 농도에서 2.2 배 증가된 트롬빈 타임을 나타내었으나, 0.5 배로 감소된 에이피티 타임을 나타내었으며, 물 잔류물은 선택적으로 에이피티 타임을 0.6 배 감소시켰다. 에틸아세테이트 분획은 5 mg/ml 농도에서 에이피티 타임을 2 배 정도 증가시켰으나, 부탄올 분획은 15 배 이상 증가된 혈액응고시간을 나타내어 강력한 항혈전 활성을 나타내었다. 따라서, 부탄올 분획물은 혈전생성 억제 조성물로 개발될 수 있음을 나타낸다.
참당귀 유기용매 분획물 및 물 잔류물의 항혈전 활성
시료 농도(mg/ml) 혈전생성 시간 (초)
트롬빈 타임 프로트롬빈 타임 에이피티 타임
물 - 32.1 18.1 55.1
아스피린 1.5 79.9 22.6 65.0
헥센
분획		 5.0 70.6±3.2 16.3±1.0 27.5±0.5
2.5 41.7±1.5 18.3±1.5 32.3±2.1
1.0 36.1±2.2 18.6±1.1 49.7±3.6
에틸
아세테이트
분획		 5.0 35.3±2.3 18.1±0.0 110.2±5.4
2.5 32.3±1.7 18.6±1.7 78.4±3.9
1.0 31.3±2.5 18.2±1.1 58.6±2.2
부탄올
분획		 5.0 35.4±2.2 18.8±0.7 > 820
2.5 33.2±2.2 19.1±1.3 93.7±2.5
1.0 31.9±0.9 18.4±1.1 56.6±2.2
물
잔류물 		5.0 32.1±0.6 14.4±0.2 33.6±1.6
2.5 32.2±1.2 18.1±0.5 41.1±1.1
1.0 31.1±0.8 18.2±0.8 53.2±0.6
실시예 3: 참당귀 부탄올 분획물의 활성물질의 화학적 특성 및 안정성
상기 실시예 1에서 얻은 부탄올 분획물을 갑압건조하여 분말 조제한 후, 회수된 활성물질을 대상으로 인간 적혈구 용혈활성, 혈장 안정성, 열 안정성 및 산 안정성을 확인하였다. 조정제된 활성물질은 100 ℃에서 2 시간 처리, pH 2(0.01 M HCl)에서의 2 시간 처리, 혈장에서 2 시간 처리시에도 부탄올 분획이 혈전 생성저해활성의 감소가 나타나지 않아 높은 안정성을 나타내었다. 또한, 5 mg/ml 농도까지 인간 적혈구에 대한 용혈 활성은 나타나지 않았다(표 5).
참당귀 추출물 및 분획물의 인간 적혈구 용혈활성
시료 (5 mg/ml) 인간 적혈구 용혈활성 (%)
에탄올 추출물 3.5±2.4
헥센 분획물 4.5±1.8
에틸아세테이트 분획물 2.1±1.4
부탄올 분획물 1.7±3.7
물 잔류물 5.1±1.7
트리톤 X-100 (triton X-100) 0.1% 100±0.0
엠포테리신 B (amphotericin B) 125 μg/ml 75.3±8.5
실시예 4: 참당귀 부탄올 분획물의 단회경구독성 시험
4 주령의 흰쥐(Slc, ICR Mouse)를 (주)중앙실험동물로부터 공급받아 온도 23±3 ℃, 상대습도 50±10 %, 150~300 Lux의 조도로 12 시간 간격(오전 8 시~오후 8 시)으로 조절되는 동물실험실에서 14 일간 순화시킨 후, 실시예 1로부터 얻은 부탄올 분획물의 단회경구독성을 평가하였다. 먼저, 시료를 DMSO 및 물에 녹인 후, 400, 800, 1500, 2000 mg/kg 농도로 각각 3마리씩 경구투여 후, 일주일 간 생존 여부와 병적 이상 증후를 관찰하였다. 대조구로는 DMSO만을 경구투여하였다. 그 결과 생존율은 100 %였으며, 병적 이상 징후는 나타나지 않았다. 따라서, 약용으로 사용되어 온 참당귀의 부탄올 분획물은 저독성 또는 무독성으로 구분되며, 이의 낮은 농도의 사용은 부가적인 문제점을 야기하지 않으리라 판단되었다.

Claims (5)

  1. 참당귀(Angelica gigas Nakai) 에탄올 추출물의 부탄올 분획물을 유효성분으로 함유하는 혈전증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 부탄올 분획물은 상기 에탄올 추출물을 헥센, 에틸아세테이트 및 부탄올로 순차 분획하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 혈전증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 제 1항 또는 제 4항에 기재된 참당귀(Angelica gigas Nakai) 에탄올 추출물의 부탄올 분획물을 포함하는 혈전증 개선용 건강 기능 식품.
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