KR101422250B1 - 눈개승마 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품 - Google Patents

Abstract

본 발명은 눈개승마 (Aruncus dioicus var. kamtschaticus) 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증 (thrombosis)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는, 눈개승마의 에탄올 추출물, 특히, 눈개승마 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 상기 추출물 또는 분획물을 포함하는 건강 기능 식품에 관한 것이다. 본 발명의 눈개승마 항혈전 활성물질은 눈개승마를 에탄올 등으로 추출하여 추출물을 조제한 후 에틸아세테이트로 분획하여 획득할 수 있으며, 우수한 프로트롬빈 저해활성을 나타내어, 혈전 생성을 효율적으로 억제할 수 있는 효과가 있으며, 혈행개선을 통해 허혈성 뇌졸중 및 출혈성 뇌졸중과 같은 혈전증의 예방 및 치료용으로 사용할 수 있는 뛰어난 효과가 있다. 그 뿐만 아니라, 본 발명의 눈개승마 추출물 및 에틸아세테이트 분획물은 급성경구독성 및 만성독성이 나타나지 않으며, 열 안정성이 우수하고, pH 2의 산성조건 및 혈장내에서도 프로트롬빈 저해 활성의 손실이 나타나지 않아, 추출액, 분말, 환, 정 등의 다양한 형태로 가공되어 상시 복용이 가능한 형태로 조제할 수 있는 뛰어난 효과가 있으므로 식품산업 및 제약산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Description

눈개승마 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품{PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING THE EXTRACT OF ARUNCUS DIOICUS VAR. KAMTSCHATICUS AS AN EFFECTIVE COMPONENT FOR PREVENTION OR TREATMENT OF THROMBOSIS AND HEALTH FUNCTIONAL FOOD COMPRISING THE SAME}

본 발명은 눈개승마 (Aruncus dioicus var. kamtschaticus) 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증 (thrombosis)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는, 눈개승마의 에탄올 추출물, 특히, 눈개승마 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 상기 추출물 또는 분획물을 포함하는 건강 기능 식품에 관한 것이다.

인체 구성성분으로 혈액은 산소, 영양분, 노폐물의 운반 기능과 완충작용, 체온유지, 삼투압 조절 및 이온 평형유지, 수분 일정유지, 액성 조절작용, 혈압의 유지 및 조절, 생체방어 등 다양한 중요 기능들을 가지고 있다. 정상적인 혈액 순환은 체내에서의 혈액 응고 반응계와 혈전 용해 반응계가 상호 보완적으로 조절되면서 혈액 순환을 용이하게 하며, 이들 중 혈액 응고 반응계의 기작은 혈관벽에 혈소판이 점착, 응집하여 혈소판 혈전을 형성한 후, 혈액 응고계가 활성화되어 혈소판 응집괴를 중심으로 피브린 혈전이 형성되는 것으로 보고되어 있다.

한편, 피브린 혈전의 생성은 수많은 혈액응고인자들의 여러 단계 반응을 거쳐 피브린 응고에 관여하는 트롬빈이 활성화되어, 최종적으로 피브리노겐으로부터 피브린 단량체를 생성하게 하며, 피브린 단량체들은 칼슘에 의해 중합되어, 혈소판과 내피세포에 결합하게 되며 XIII 인자에 의해 교차 결합된 피브린 폴리머를 형성하면서 영구적인 혈전을 생성하게 된다. 또한, 트롬빈은 혈소판, V 인자, VII 인자들을 활성화시켜 혈액 응고반응을 촉진시키는 등 혈전 생성에 중추적 역할을 하게 된다. 따라서, 트롬빈의 활성 저해물질은 과다한 혈액응고 이상으로 발생하는 다양한 혈전성 질환에 매우 유용한 예방 및 치료제로 사용될 수 있다. 한편 내인성 혈전생성경로에는 XII 인자, XI 인자, IX 인자, X 인자의 순차적 활성화에 이은 프로트롬빈의 활성화가 최종적으로 트롬빈을 활성화하는 것으로 알려져 혈액응고인자의 특이적 저해 역시 중요한 혈전성 질환 치료제의 개발 타겟이 되고 있다. 현재까지 혈전성 질환의 예방과 치료에 헤파린, 쿠마린, 아스피린, 유로키네이즈 등의 다양한 항응고제, 항혈소판제, 혈전용해제 등이 사용되고 있으나, 이들은 가격이 매우 높을 뿐 아니라 출혈성 부작용과 위장장해 및 과민반응 등으로 그 사용이 한정되고 있는 실정이다.

한편, 눈개승마 (Aruncus dioicus var. kamtschaticus)는 전국 각처의 고산지역에서 발견되는 쌍떡잎식물 장미목 장미과의 여러해살이풀로 눈산승마 또는 삼나물로 불리기도 한다. 잎은 쫄깃하고 고소한 맛으로 쇠고기 맛이 나는 특이한 나물로 비빔밥 부재료 등으로 기호도가 높으며 특히 울릉도에서는 고기나물로 불린다. 중국명으로는 죽토자이고, 영어명은 Goat's Beard이며, 주성분은 Salicyladehyde, Saponin, Spirein이 알려져 있다. 민간에서는 전초를 약용으로 해독, 정력, 편도선염, 지혈에 이용하고 있으며, 100 g당 에너지 254 kcal, 수분 7.5 g, 단백질 22.8 g, 지질 2.2 g, 당질 50.5 g, 섬유소 10.8 g, 회분 6.2 g, Ca 25 mg, P 586 mg, Fe 2.4 mg 및 비타민B2 0.34 mg 등을 포함하여 영양적으로도 매우 우수한 식물이다.

눈개승마와 관련된 학술문헌으로는 눈개승마 용매 추출물의 항산화 및 항균활성 (김 등, 2011. 한국식품영양과학회지, 40: 47-55)에서 우수한 항산화 및 항균 활성이 보고된 바 있으며, 눈개승마의 성분에 관한 연구 (심창민, 대구카톨릭대학 약학과 석사논문, 2009)에서 항산화력을 가지는 cinnamic acid 유도체, quercetin 유도체, kaempferol 유도체 등이 보고된 바 있다. 또한, "차광재배가 눈개승마의 성분 및 항산화 특성에 미치는 영향 (권 등, 2006, 한국자원식물학회, 19: 1-7)의 눈개승마와 재배와 생리활성의 연계보고가 있으며, 최근에는 울릉도 눈개승마의 에틸아세테이트 분획에서는 UV유도 피부세포 노화를 억제하는 활성이 보고되었으며 (Kim 등, 2012, J. Nat. Med. 66: 631-636), 눈개승마에서 다양한 모노털페노이드 (monoterpenoids) 화합물이 분리되었고 (Jeong 등, 2011, Bioorg. Med. Chem. Lett., 21: 3252-3256), 그 중 눈개승마에서 분리된 arunsin B의 강력한 암세포 사멸활성이 보고되어 있다 (Han 등, Bioorg. Med. Chem. Lett., 22: 945-953). 그러나, 현재까지 눈개승마의 지혈활성 (혈액응고 촉진활성)은 알려져 있으나, 반대로 항혈전 활성 (혈액응고 저해활성)이 보고된 바는 없다.

한편, 눈개승마와 관련된 특허로는 대한민국 공개특허 10-2006-0079923 (출원번호 10-2005-0000329, 출원일자 2005년 1월 4일) 눈개승마 추출물을 포함하는 허혈성 질환 및 퇴행성뇌질환의 예방 및 치료를 위한 조성물이 있으며, 이는 저산소 조건에서 허혈성 세포자살을 억제하는 눈개승마 추출물에 관한 내용이다. 따라서, 본 발명과 관련된 인간 트롬빈 및 프로트롬빈 직접 저해, 내인성 인자저해에 따른 내인성 혈전 생성억제 효과를 가진 항혈전 활성의 눈개승마 추출물 및 분획물에 대한 특허는 알려져 있지 않다.

대한민국 공개특허공보 제10-2006-0079923호

본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 식용 및 약용으로 이용되고 있는 눈개승마의 추출물을 유효성분으로 함유하는 인간 트롬빈 직접저해, 프로트롬빈 저해 및 내인성 혈액응고인자 저해에 따른 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 상기 추출물을 포함하는 건강 기능 식품을 제공하고자 하는 것이다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 눈개승마 (Aruncus dioicus var. kamtschaticus) 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 눈개승마 추출물은 눈개승마 에탄올 추출물인 것이 바람직하다.

상기 눈개승마 추출물은 눈개승마 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물인 것이 바람직하다.

상기 눈개승마 추출물은 눈개승마 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물 중 분자량 30 kDa 이상인 고분자 물질인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명의 눈개승마 추출물을 포함하는 건강 기능 식품을 제공한다.

본 발명의 눈개승마 항혈전 활성물질은 눈개승마를 에탄올 등으로 추출하여 추출물을 조제한 후 에틸아세테이트로 분획하여 획득할 수 있으며, 우수한 프로트롬빈 저해활성을 나타내어, 혈전 생성을 효율적으로 억제할 수 있는 효과가 있으며, 혈행개선을 통해 허혈성 뇌졸중 및 출혈성 뇌졸중과 같은 혈전증의 예방 및 치료용으로 사용할 수 있는 뛰어난 효과가 있다. 그 뿐만 아니라, 본 발명의 눈개승마 추출물 및 에틸아세테이트 분획물은 급성경구독성 및 만성독성이 나타나지 않으며, 열 안정성이 우수하고, pH 2의 산성조건 및 혈장내에서도 프로트롬빈 저해 활성의 손실이 나타나지 않아, 추출액, 분말, 환, 정 등의 다양한 형태로 가공되어 상시 복용이 가능한 형태로 조제할 수 있는 뛰어난 효과가 있으므로 식품산업 및 제약산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

도 1은 아스피린과 눈개승마 추출물 및 분획물의 트롬빈 타임 연장 효과를 비교한 그래프이고,
도 2는 아스피린과 눈개승마 추출물 및 분획물의 프로트롬빈 타임 연장 효과를 비교한 그래프이고,
도 3은 아스피린과 눈개승마 추출물 및 분획물의 에이피티 타임 연장 효과를 비교한 그래프이며,
여기에서, -●-는 아스피린, -○-는 에탄올 추출물, -▼-는 헥센 분획물, -▽-는 에틸아세테이트 분획, -■-는 부탄올 분획 및 -□-는 물 잔류물을 각각 나타낸다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명자들은 눈개승마를 이용하여 혈전증 예방 및 치료용 약학 조성물 및 건강 기능 식품을 개발하기 위하여 눈개승마 지상부의 에탄올 추출물을 조제하고 이를 순차적 유기용매 분획하여 헥센 분획, 에틸아세테이트 분획, 부탄올 분획 및 물 잔류물을 수득하고, 이를 각각 인간 혈장과 인간 트롬빈에 대한 트롬빈 직접저해 (Thrombin Time), 프로트롬빈 저해 (Prothrombin Time) 및 혈액응고인자 저해 (activated Partial Thromboplastin Time) 활성을 평가하였다. 그 결과, 눈개승마 에탄올 추출물에서 양호한 혈액응고인자 저해활성을 확인하였으며, 이의 유기용매 분획물 중 에틸아세테이트 분획물에서는 매우 강력한 프로트롬빈 저해 및 혈액응고인자 저해활성에 따른 혈전 생성 억제효과를 확인하였다. 또한, 경구급성독성과 만성독성이 나타나지 않을 뿐만 아니라, 열 안정성과 산 안정성이 우수함도 아울러 확인하였다. 따라서, 눈개승마의 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물은 혈전생성억제에 유용하게 이용할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 눈개승마 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품을 제공하는 것을 특징으로 한다.

바람직한 구체예로서, 상기 눈개승마 추출물은 눈개승마 에탄올 추출물인 것이 바람직하다.

또 다른 바람직한 구체예로서, 상기 눈개승마 추출물은 눈개승마 에탄올 추출물의 유기 용매 분획물 중 에틸아세테이트 분획물인 것이 바람직하다. 상기 에틸아세테이트 분획물은 상기 에탄올 추출물을 헥센으로 분획 후, 에틸아세테이트로 순차 분획하여 얻어질 수 있다.

또 다른 바람직한 구체예로서, 상기 눈개승마 추출물은 눈개승마 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물 중 열 안정성과 산 안정성을 가지며, 분자량이 30 kDa 이상의 고분자 물질인 것이 바람직하다.

이하에서는, 본 발명의 눈개승마 추출물 및 유기용매 분획물의 제조 방법 및 효능 실험 등을 보다 구체적으로 설명한다.

바람직한 구체예에 있어서, 본 발명은 식용 눈개승마 지상부로부터 활성 추출물을 조제하는 단계; 눈개승마 추출물로부터 에틸아세테이드 유기용매 분획의 조정제 단계; 상기 물질의 안정성 조사단계; 및 상기 물질의 급성 독성검사단계에 의하여 항혈전 작용을 갖는 눈개승마 추출물의 제조할 수 있다.

바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 조성물에 포함되는 "눈개승마 추출물"은 눈개승마의 뿌리부분을 제거하고 세척한 후 음건하는 단계, 건조 눈개승마를 유기용매로 추출하는 단계 및 상기 추출액을 0.06 mm 이하의 여과망을 사용하여 여과하고 이를 감압농축하는 단계에 의해 수득될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 유기용매는 물 (냉수, 열수), 주정, 탄소수 1~4의 무수 또는 함수 저급 알코올 (메탄올, 에탄올, 주정, 프로판올, 부탄올 등), 상기 저급알코올과 물과의 혼합용매 등을 이용할 수 있으며, 80-95% 에탄올이 가장 바람직하다.

본 발명에서 눈개승마 에탄올 추출물 5 mg/mL의 농도에서 트롬빈 타임 (thrombin time), 프로트롬빈 타임 (prothrombin time) 및 에이피티 타임을 측정한 결과, 무첨가구보다 각각 1.4 배, 1.7 배 및 2.3 배 이상 연장된 혈전 생성 억제 활성을 나타내었다. 한편, 분획물 중 에틸아세테이트 분획물은 5 mg/ml 농도에서 트롬빈 타임 (thrombin time), 프로트롬빈 타임 (prothrombin time) 및 에이피티 타임을 각각 무첨가구보다 각각 1.7 배, 15 배 이상 및 3.1 배 연장시켰으며, 반면, 부탄올 분획물은 5 mg/ml 농도에서 트롬빈 타임 (thrombin time), 프로트롬빈 타임 (prothrombin time) 및 에이피티 타임을 각각 무첨가구보다 각각 1.3 배, 1.2 배 및 0.7 배 연장시켰다.

이러한 결과는 민간에서 지혈제로 이용되어 온 눈개승마의 추출물에는 혈액 응고활성물질뿐만 아니라, 혈전생성 억제활성물질도 포함되어 있음을 알 수 있으며, 특히 눈개승마의 에틸아세테이트 분획은 우수한 프로트롬빈 저해활성으로 항혈전 활성을 나타내며, 기존의 아스피린과 같은 항응고제를 대치할 수 있음을 제시한다.

본 발명의 눈개승마 추출물 및 이의 에틸아세테이트 분획물은 감압증류 및 동결건조, 또는 분무건조 등과 같은 통상적인 분말화 과정을 거쳐 분말로 제조될 수 있다. 이들은 100 ℃의 열처리와 pH 2의 인체 위내의 산성 조건 하에서도 활성을 유지한다.

본 발명의 눈개승마 추출물은 혈전증과 관련된 다양한 질환들의 예방 또는 치료용으로 사용될 수 있다. 상기 질환들은, 예를 들어, 동맥 혈전증으로서, 급성 심근 경색증, 가슴 통증, 호흡 곤란, 의식 소실, 허혈성 뇌졸중, 출혈성 뇌졸중, 두통, 운동 이상, 감각 이상, 성격 변화, 시력 저하, 간질 발작, 폐 혈전증, 심부정맥 혈전증, 하지 부종, 통증 및 급성 말초 동맥 폐쇄증 등을 들 수 있고, 정맥 혈전증으로서, 심부정맥 혈전증, 간문맥 혈전증, 급성 신장정맥 폐쇄증, 뇌 정맥동 혈전증 및 중심 망막정맥 폐쇄 등을 들 수 있다.

본 발명의 눈개승마 추출물을 포함하는 약학적 조성물은 각각의 사용 목적에 맞게 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구 제형, 멸균 주사용액의 주사제 등 다양한 형태로 제형화하여 사용할 수 있으며, 경구 투여하거나 정맥 내, 복강 내, 피하, 직장, 국소 투여 등을 포함한 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다.

이러한 약학적 조성물에는 추가적으로 담체, 부형제 또는 희석제 등이 더 포함될 수 있으며, 포함될 수 있는 적합한 담체, 부형제 또는 희석제의 예로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리쓰리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 비정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 충전제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 더 포함할 수도 있다.

바람직한 구체예로서, 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 약학적 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 혼합하여 제형화한다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 등과 같은 윤활제가 사용될 수도 있다.

바람직한 구체예로서, 경구용 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 예시될 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

바람직한 구체예로서, 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액제, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제, 좌제 등을 예시할 수 있다. 비수성용제, 현탁제에는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 포함될 수 있다. 주사제에는 용해제, 등장화제, 현탁화제, 유화제, 안정화제, 방부제 등과 같은 종래의 첨가제가 포함될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

바람직한 구체예로서, 본 발명의 약학적 조성물에서 눈개승마 추출물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 ㎏ 당 1 내지 5,000 mg, 바람직하게는 100 내지 3,000 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1 일 1 내지 3 회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 다양한 경로를 통하여 대상에 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명에서 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 약학적 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 일반적인 모든 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 유효성분을 표적 세포로 전달할 수 있는 임의의 장치를 이용해 투여될 수도 있다.

본 발명에서 "대상"은, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 인간, 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함하고, 바람직하게는 포유류, 보다 바람직하게는 인간을 의미한다.

또한, 본 발명의 건강 기능 식품은 혈전증의 예방 또는 개선에 효과적인 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 눈개승마 추출물을 포함하는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.

본 발명의 눈개승마 추출물은 일반적으로 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강음료 조성물은 100 ml를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 기능 식품은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 것 외에 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제, 예컨대, 천연 탄수화물 및 다양한 향미제 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상기 천연 탄수화물의 예로는 포도당, 과당 등의 단당류, 말토오스, 수크로오스 등의 이당류 및 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 다당류와 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등의 당알코올이 있다.

상기 향미제로는 타우마틴; 레바우디오시드 A 또는 글리시르히진과 같은 스테비아 등의 천연 향미제 및 사카린, 아스파르탐 등의 합성 향미제를 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강 기능 식품 100ml당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g을 사용한다. 상기 외에 본 발명의 건강 기능 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물, 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강 기능 식품은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료 등의 제조를 위한 과육을 함유할 수도 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 본 발명의 눈개승마 추출물 100중량부 당 0.01 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 바람직한 하나의 구체예일 뿐이며, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예의 범위로 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1: 눈개승마 추출물 및 에틸아세테이트 용매 분획물의 조제

울릉도산 눈개승마의 지상부를 2011년 5월에 채취하여 정제수로 세정한 다음 음건하였다. 이후 10 배 부피의 에탄올 (95 %, 덕산, 한국)을 가하고 상온에서 8 시간씩 2 회 추출하였다. 추출물은 감압 농축하여 분말로 제조하였으며, 사용 전까지 저온 밀봉 보관하였다. 이후, 추출물을 헥센, 에틸아세테이트, 부탄올로 순차적 분획하였으며, 최종적으로 물 잔류물을 얻었다.

한편, 조제된 눈개승마 추출물 및 분획물의 총 플라보노이드 (total flavonoid) 및 총 폴리페놀 (total polyphenol) 함량, 총당 및 환원당 함량을 측정하였다. 총 플라보노이드 함량 측정은 각각의 시료를 18 시간 메탄올 교반 추출하고 여과한 추출 검액 400 μl에 90 % diethylene glycol 4 mL를 첨가하고 다시 1 N NaOH 40 μl를 넣고 37 ℃에서 1 시간 반응 후 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준시약으로는 rutin을 사용하였다. 총 폴리페놀 함량은 추출 검액 400 μl에 50 μl의 Folin-ciocalteau, 100 μl의 Na₂CO₃ 포화용액을 넣고 실온에서 1 시간 방치한 후 725 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준시약으로는 tannic acid를 사용하였다. 환원당은 DNS법으로, 총당은 phenol-sulfuric acid법을 이용하여 정량하였다.

눈개승마 추출물 및 분획물의 성분 분석결과는 표 1에 나타내었으며, 그 결과 에탄올 추출물의 유기용매 분획수율은 부탄올>헥센>에틸아세테이트>물 분획물의 순서로 나타났으며, 총폴리페놀 함량은 에틸아세테이트>부탄올>헥센>물 분획물의 순서, 총플라보노이드 함량은 에틸아세테이트>헥센>부탄올>물 분획물의 순서, 총당 및 환원당 함량은 부탄올>에틸아세테이트>물>헥센 분획물의 순서로 나타났다.

이러한 결과로 미루어 볼때 에틸아세테이트 분획은 매우 강력한 항산화력과 유용생리활성을 나타낼 것으로 판단되며, 이는 기존에 보고된 눈개승마의 항균, 항산화, 피부노화억제 효과와 상통하는 부분이다.

눈개승마 추출물 및 분획물의 수율 (추출, 분획 효율) 및 이들의 성분 분석

시료	수율 (%)	함량 (mg/g)
		총 폴리페놀	총 플라보노이드	총당	환원당
에탄올 추출물	6.14	53.90±0.06	109.03±0.30	117.69±0.14	92.19±0.5
헥센 분획물	32.11	55.41±4.78	69.99±0.15	55.39±1.58	44.51±0.83
에틸아세테이트 분획물	21.49	499.50±8.58	322.75±0.74	181.02±0.37	127.97±0.67
부탄올 분획물	35.09	104.58±5.15	34.98±1.30	197.20±1.34	129.62±0.33
물 잔류물	9.89	27.41±0.98	13.96±0.12	156.83±2.68	60.45±2.00

실시예 2: 눈개승마 지상부 추출물 및 분획물의 항혈전 활성 평가

실시예 1 의 눈개승마 추출물 및 유기용매 분획물에 대한 항혈전 활성을 조사하였다. 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임, 에이피티티 타임을 측정한 결과는 도 1 내지 도 3에 각각 나타내었다.

먼저, 도 1 내지 도 3에 나타난 바와 같이 무처리 인간 혈장의 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임 및 에이피티 타임은 32 초, 18 초, 55 초이었으나, 항혈전제로 상용되고 있는 아스피린 (상품명: 프로텍트)은 5 mg/mL 농도로 첨가시에는 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임 및 에이피티 타임이 무첨가구에 비해 모두 300 초 이상으로 증가되어 아스피린의 우수한 항혈전능을 확인하였다. 한편, 눈개승마 에탄올 추출물 5 mg/mL 첨가후 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임 및 에이피티 타임을 측정한 결과, 각각 45 초, 31 초 및 127 초를 나타내어, 무첨가구보다 각각 1.4 배, 1.7 배 및 2.3 배 이상 연장된 혈전 생성 억제 활성을 나타내었다. 우수한 항혈전활성은 에틸아세테이트 분획에서 나타났다. 에틸아세테이트 분획물은 5 mg/ml 농도에서 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임및 에이피티 타임을 각각 무첨가구보다 각각 1.7 배 (57 초), 15 배 이상 (300 초 이상) 및 3.1 배 (181 초) 연장시켰다.

이러한 효과는 식용으로 이용되고 있는 눈개승마의 에틸아세테이트 분획이 아스피린에 필적하는 우수한 프로트롬빈 저해활성을 나타내어 부작용이 없는 안전한 항혈전제로 개발 가능함을 제시하고 있다.

항혈전 활성은 기존에 보고된 방법에 준해 평가하였으며 (Sohn et al., 2004. Kor . J. Pharmacogn 35. 52-61; Kwon et al., 2004. J. Life Science, 14. 509-513; 류 등 2010. J. Life Science, 20. 922-928), 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임과 에이피티티 타임을 측정하였다. 혈장은 지원자의 전혈로부터 조제하였으며, 채혈 후 즉시 4 ℃에서 5,000 g로 5 분 동안 원심분리하여 혈장을 분리하고 냉동한 상태로 보관하였으며 (신선동결혈장), 필요시 상온에서 해동하여 사용하였다. 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임과 에이피티티 측정법은 다음과 같이 하였다.

트롬빈 타임( Thrombin Time )

37 ℃에서 0.5 U 트롬빈 (Sigma Co., USA) 50 μl와 20 mM CaCl₂ 50 μl, 다양한 농도의 시료 추출액 10 μl를 Amelung coagulometer KC-1A (Japan)의 튜브에 혼합하여 2 분간 반응시킨 후, 혈장 100 μl를 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였다. 대조로는 아스피린 (Sigma Co., USA)을 사용하였으며, 용매 대조구로는 시료 대신 DMSO를 사용하였다. DMSO의 경우 32.1 초의 응고시간을 나타내었다. 열 안정성 측정의 경우에는 다양한 농도의 시료용액을 100 ℃에서 30 분간 열처리하고, 실온에서 1 시간 방냉한 후, 잔존활성을 측정하였다. 트롬빈 저해 효과는 3 회 이상 반복한 실험의 평균치로 나타내었으며, 시료 첨가시의 응고시간을 용매 대조구의 응고시간으로 나눈 값에 100을 곱하여 %로 나타내었다.

프로트롬빈 타임( prothrombin time )

표준혈장 (MD Pacific Co., China) 70 μl와 다양한 농도의 시료액 10 μl를 Amelung coagulometer KC-1A (Japan)의 튜브에 첨가하여 37 ℃에서 3 분간 가온 후, 130 μl의 PT reagent를 첨가하고 혈장이 응고될 때까지의 시간을 3 회 반복한 실험의 평균치로 나타내었다. 대조로는 아스피린 (Sigma Co., USA)을 사용하였으며, 용매 대조구로는 시료 대신 DMSO를 사용하였다. DMSO의 경우 18.1 초의 응고시간을 나타내었다.

aPTT ( activated Partial Thromboplastin Time )

혈장 100 μl와 다양한 농도의 시료 추출액 10 μl를 Amelung coagulometer KC-1A (Japan)의 튜브에 첨가하여 37 ℃에서 3 분간 가온한 후, 50 μl의 aPTT reagent (Sigma, ALEXIN^TM)를 첨가하고 다시 37 ℃에서 3 분간 배양하였다. 이후 50 μl CaCl₂ (35 mM)을 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였다. 용매 대조구로는 시료 대신 DMSO를 사용하였으며, 이 경우 55.1 초의 응고시간을 나타내었다. aPTT의 결과는 3 회 반복한 실험의 평균치로 나타내었으며, 시료 첨가시의 응고시간을 용매 대조구의 응고시간으로 나눈 값에 100을 곱하여 %로 나타내었다.

실시예 3: 눈개승마 에틸아세테이트 분획의 활성물질의 화학적 특성 및 안정성

상기 실시예 1에서 얻은 에틸아세테이트 분획물을 갑압건조하여 분말 조제한 후, 회수된 활성물질을 대상으로 인간 적혈구 용혈활성, 혈장 안정성, 열 안정성 및 산 안정성을 확인하였다. 조정제된 활성물질은 100 ℃에서 2 시간 처리, pH 2 (0.01 M HCl)에서의 2 시간 처리, 혈장에서 2 시간 처리시에도 활성의 감소가 나타나지 않아 높은 안정성을 나타내었다. 또한, 5 mg/ml 농도까지 인간 적혈구에 대한 용혈활성은 나타나지 않았다 (표 2). 눈개승마의 에탄올 추출물과 분획물 중 유일하게 용혈활성을 나타낸 경우는 헥센 분획물로 5 mg/ml 농도에서 35.76±3.46 %의 용혈활성을 나타내었다.

눈개승마 추출물 및 분획물의 인간 적혈구 용혈활성

시료 (5 mg/ml)	인간 적혈구 용혈활성
에탄올 추출물	3.61±1.54
헥센 분획물	35.76±3.46
에틸아세테이트 분획물	3.14±1.24
부탄올 분획물	1.72±3.70
물 잔류물	4.07±1.88
DMSO (디엠에스오: 용매대조구)	0.00±2.08
Triton X-100 (0.1 %)	100.00±2.28

조제된 에틸아세테이트 분획물의 분말 10 mg에 1 mL의 에탄올을 가하여 녹인 후 이를 대상으로 아미콘 분자체 (Amicon 30, Millipore co.)와 원심분리기를 이용하여 30 kDa 이상과 이하의 물질층을 분리하였다. 이후 각각의 물질층의 활성을 측정한 결과, 항혈전 활성물질은 30 kDa 이상의 물질임을 확인하였다. 회수된 활성물질을 대상으로 다양한 발색반응 및 열 안정성, 산 안정성을 확인하였다. 발색반응은 탄수화물 정성 검색을 위한 안트론 반응, 아미노산 비색정량을 위한 닌하이드린 반응, 폴리페놀 검출을 위한 다이에틸렌글리콜 반응, 플라보노이드 검출반응을 실시하였다. 그 결과 활성물질은 단백질, 아미노산을 포함하지 않은 탄수화물 복합체의 형태로 부분적으로는 폴리페놀 및 플라보노이드 성분을 포함하는 고분자로 확인되었다.

실시예 4: 에틸아세테이트 분획물의 단회경구독성 시험

4 주령의 흰쥐 (Slc, ICR Mouse)를 (주)중앙실험동물로부터 공급받아 온도 23±3 ℃, 상대습도 50±10 %, 150~300 Lux의 조도로 12 시간 간격 (오전 8 시~오후 8 시)으로 조절되는 동물실험실에서 14 일간 순화시킨 후, 5 마리씩 구분하여 각각 실시예 3의 에틸아세테이트 분획물의 단회경구독성을 평가하였다. 먼저 각각의 시료를 DMSO에 녹인 후, 10 마리에게 1,000 mg/kg의 농도로 각각 경구투여 후, 일주일 간 생존여부와 병적 이상증후를 관찰하였으며, 이후 부검하여 각종 장기의 출혈 및 혈청 생화학적 검사를 실시하였다. 대조구로는 DMSO만을 경구투여하였다. 그 결과 생존율은 100 %였으며, 병적 이상 징후나 장기 출혈이 관찰되지 않았으며, GPT, GOT의 혈청 생화학적 검사 역시 대조구와 비교하여 유의점은 확인되지 않았다. 따라서 눈개승마 에틸아세테이트 분획물은 저독성 (예, 에탄올), 무독성 (예, 포도당)으로 구분되며, 이의 낮은 농도의 사용은 부가적인 문제점을 야기하지 않으리라 판단되었다.

Claims (5)

1. 눈개승마(Aruncus dioicus var. kamtschaticus) 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물로서 분자량 30kDa 이상인 물질층을 유효성분으로 함유하는 혈전증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 제 1항에 기재된 눈개승마(Aruncus dioicus var. kamtschaticus) 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물로서 분자량 30kDa 이상인 물질층을 포함하는 혈전증 예방 또는 개선용 건강 기능 식품.

Images