KR101479816B1 - 상황버섯 자실체 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품 - Google Patents

상황버섯 자실체 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품 Download PDF

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Abstract

본 발명은 상황버섯 자실체 (Arctium lappa) 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증 (thrombosis)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는, 상황버섯 자실체의 에탄올 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 상기 추출물을 포함하는 건강 기능 식품에 관한 것이다. 본 발명의 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품의 유효성분으로서의 상황버섯 자실체 추출물은, 본 명세서의 실시예를 통해 증명된 바와 같이, 상황버섯 자실체를 에탄올 등으로 추출하여 추출물을 조제한 후, 헥센, 에틸아세테이트 및 부탄올을 이용하여 순차적으로 분획하여 조제되며, 이 중 우수한 트롬빈 직접저해, 프로트롬빈 저해 및 혈액응고인자 저해효과에 의한 항혈전 활성을 나타내는 에틸아세테이트 분획은 혈전 생성을 효율적으로 억제할 수 있는 효과가 있으며, 혈행개선을 통해 허혈성 뇌졸중 및 출혈성 뇌졸중과 같은 혈전증의 예방 및 치료용으로 사용할 수 있는 뛰어난 효과가 있다. 특히, 본 발명의 상황버섯 자실체 추출물은 급성경구독성이 나타나지 않으며, 열 안정성이 우수하고, pH 2의 산성조건 및 혈장 내에서도 항혈전 효과의 손실이 나타나지 않아, 추출액, 분말, 환, 정 등의 다양한 형태로 가공되어 상시 복용이 가능한 형태로 조제할 수 있는 뛰어난 효과가 있으므로 제약산업 및 식품산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Description

상황버섯 자실체 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품{PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING THE EXTRACT OF PHELLINUS LINTEUS AS AN EFFECTIVE COMPONENT FOR PREVENTION OR TREATMENT OF THROMBOSIS AND HEALTH FUNCTIONAL FOOD COMPRISING THE SAME}
본 발명은 상황버섯 (Phellinus linteus) 자실체 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증 (thrombosis)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는, 상황버섯 자실체의 에탄올 추출물, 특히 상황버섯 자실체의 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물, 물 잔류물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 상기 추출물 또는 분획물을 포함하는 건강 기능 식품에 관한 것이다.
인체 구성성분으로 혈액은 산소, 영양분, 노폐물의 운반 기능과 완충작용, 체온유지, 삼투압 조절 및 이온 평형유지, 수분 일정유지, 액성 조절작용, 혈압의 유지 및 조절, 생체방어 등 다양한 중요 기능들을 가지고 있다. 정상적인 혈액 순환은 체내에서의 혈액 응고 반응계와 혈전 용해 반응계가 상호 보완적으로 조절되면서 혈액 순환을 용이하게 하며, 이들 중 혈액 응고 반응계의 기작은 혈관벽에 혈소판이 점착, 응집하여 혈소판 혈전을 형성한 후, 혈액 응고계가 활성화되어 혈소판 응집괴를 중심으로 피브린 혈전이 형성되는 것으로 보고되어 있다.
한편, 피브린 혈전의 생성은 수많은 혈액응고인자들의 여러 단계 반응을 거쳐 피브린 응고에 관여하는 트롬빈이 활성화되어, 최종적으로 피브리노겐으로부터 피브린 단량체를 생성하게 하며, 피브린 단량체들은 칼슘에 의해 중합되어, 혈소판과 내피세포에 결합하게 되며 XIII 인자에 의해 교차 결합된 피브린 폴리머를 형성하면서 영구적인 혈전을 생성하게 된다. 또한, 트롬빈은 혈소판, V 인자, VII 인자들을 활성화시켜 혈액 응고반응을 촉진시키는 등 혈전 생성에 중추적 역할을 하게 된다. 따라서, 트롬빈의 활성 저해물질은 과다한 혈액응고 이상으로 발생하는 다양한 혈전성 질환에 매우 유용한 예방 및 치료제로 사용될 수 있다. 한편 내인성 혈전생성경로에는 XII 인자, XI 인자, IX 인자, X 인자의 순차적 활성화에 이은 프로트롬빈의 활성화가 최종적으로 트롬빈을 활성화하는 것으로 알려져 혈액응고인자의 특이적 저해 역시 중요한 혈전성 질환 치료제의 개발 타겟이 되고 있다. 현재까지 혈전성 질환의 예방과 치료에 헤파린, 쿠마린, 아스피린, 유로키네이즈 등의 다양한 항응고제, 항혈소판제, 혈전용해제 등이 사용되고 있으나, 이들은 가격이 매우 높을 뿐 아니라 출혈성 부작용과 위장장해 및 과민반응 등으로 그 사용이 한정되고 있는 실정이다.
한편 상황버섯 (Phellinus linteus)은 분류학적으로 진흙버섯속에 속하는 백색 부후균으로 한국, 중국, 일본 등에 분포하며, 산뽕나무의 고목 및 뽕나무 줄기 등에 자생하며 갓표면을 제외하고는 모두 황색을 나타내어 상황이라 부른다. 한의서, 신농본초경에는 뽕나무에서 나오는 황색버섯이라는 뜻의 상황 (桑黃) 또는 상이 (桑茸)라고 기록되어 있다. 상황버섯은 전 세계적으로 220 여종이 알려져 있으나, 국내에는 Phellinus linteus, P. baumii , P. gilvus , P. igniarius 등의 7종이 있으며 그 중에서도 국내에서는 P. baumii와 P. linteus가 일반적으로 재배, 유통되고 있다. 상황버섯은 번식이 잘 되지 않는 매우 희귀한 담자균류의 다년생 버섯으로 그 자실체는 경구 투여시 독성이 없음이 이미 확인되어 있어, 대한민국 식품공전상 식품원재료로 식품공전에 등록되어 있으며 (식약청고시 제2003-8호, 2003.10), 제한적으로 사용 가능한 원료의 목록에 등재되어 있다 (식품의약품안전청 식품원재료데이터베이스 http://fse.foodnara.go.kr/). 또한 상황버섯은 다량의 조섬유를 함유하고 있으며, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 비타민 B2 및 비타민 C, 기능성 다당류 (polysaccharide)를 함유하고 있어 영양적으로도 기능적으로도 우수한 식품원재료이다 (표 1).
상황버섯과 기타 버섯의 영양학적 비교
종 류 함량 (%) 에너지
(Kcal/100g)
수분
함량 		조지방 조단백 회분 조섬유 당질
상황버섯 8.8 0.3 5.09 4.6 36.9 44.3 200.4
느타리버섯 7.0 2.0 30.8 7.2 0 53.0 353.2
표고버섯 7.0 2.4 22.8 5.4 0 62.4 362.4
최근까지의 상황버섯 자실체에 대한 연구결과, 상황버섯 자실체는 면역체계를 강화하고, 급성 알러지 반응을 저해하며, 혈압강화, 항혈전, 항돌연변이 활성 및 암, 심장병 등의 성인병 예방과 개선효과를 나타내는 것으로 알려져 있다 (이 등, 한국식품과학회지, 2000, 32: 477-480; 강 등, 한국식품영양과학회지, 2001, 30: 331-337; Kim 등, J. Ethnopharmacology, 2004, 93: 141-146). 또한 식품으로 경구 투여시 독성이 나타나지 않으며 (한 등, J. Appl. Pharmacology, 2001, 9: 46-50) Bifidobacterium 증식에 따른 장내 유해미생물 효소 저해 및 α-glucosidase 저해효과가 보고되어 있다. 현재까지, 상황버섯 자실체로부터 다양한 생리활성물질들의 분리 연구가 지속적으로 진행되고 있으며, 추출방법에 따른 상황버섯 추출물의 효능변화 및 평가가 검토되고 있다. 최근에는, 상황버섯의 자실체 이외에 균사체에서도, 상황버섯 자실체와 유사한 다양한 유용 생리활성이 보고되면서 상황버섯의 균사체 배양에도 연구가 집중되고 있으며, 상황버섯 균사체 배양에서 생성되는 고분자 다당류에 의한 항혈전 활성이 보고 (서호찬, 한국균학회지, 2011. 39: 117-121)되어 있으나, 상황버섯 자실체 및 균사체에서 고분자 다당류가 아닌 저분자 내열성 물질의 항혈전 활성이 보고된 바는 없다.
현재까지 상황버섯 자실체의 생리활성과 관련된 특허문헌으로는 대한민국 공개특허 제10-2001-0000326호 (공개일: 2001.01.05, 특허출원번호 제10-2000-0054319호) "금사상황버섯 추출물을 함유하는 항암용 약제학적 조성물", 대한민국 등록특허 제1003453820000호 "자연산 상황버섯 추출물이 함유된 미백화장료", 대한민국 등록특허 제 10-09080340000호 (등록일자, 2009.07.09) "상황버섯 추출물, 이를 포함하는 조청 및 고추장", 대한민국 등록특허 제 10-05438110000호 (등록일자, 2006.01.10) "에탄올 추출물을 함유하는 염색체 이상 억제용 금사상황버섯 조성물", 대한민국 등록특허 제 10-08872340000호 (등록일자, 2009.02.27) "상황버섯 추출물을 포함하는 당뇨병 합병증 치료 또는 예방용 조성물", 대한민국 등록특허 제 10-09021670000호 (등록일자, 2009.06.03) "상황버섯 추출물을 이용하여 뼈 강화 성분을 함유하는 가공제품 및 그의 제조방법" 등의 항암활성, 미백활성, 당뇨 활성, 발암억제활성 및 뼈 강화활성 등이 보고되어 있으나, 항혈전 활성을 가지는 상황버섯 자실체 유래의 저분자성 유기용매 분획물에 대한 보고는 없다.
또한 상황버섯 균사체와 관련된 특허문헌으로는 대한민국 등록특허 제10-09040800000호 (등록일: 2009.06.15) "상황버섯 균사체 함유 티백차의 제조방법 및 그로부터 제조된 상황버섯 균사체 함유 티백차"등이 있으나, 역시 상황버섯 균사체 유래의 저분자 유기용매 추출물에 의한 항혈전 활성 관련 특허도 보고된 바 없다.
대한민국 공개특허공보 제10-2001-0000326호
본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 식용 및 약용으로 이용되고 있는 상황버섯 자실체의 추출물을 유효성분으로 함유하는 인간 트롬빈 직접저해, 프로트롬빈 저해 및 내인성 혈액응고인자 저해에 따른 혈전성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 상기 추출물을 포함하는 건강 기능 식품을 제공하고자 하는 것이다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 상황버섯 자실체의 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 상황버섯 자실체의 추출물은 상황버섯 자실체의 에탄올 추출물인 것이 바람직하다.
또한, 상기 상황버섯 자실체의 추출물은 상황버섯 자실체 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물인 것이 바람직하다.
상기 에틸아세테이트 분획물은 상기 에탄올 추출물을 헥센으로 분획 후, 에틸아세테이트로 순차 분획하여 얻어지는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명의 상황버섯 자실체 추출물을 포함하는 건강 기능 식품을 제공한다.
본 발명의 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품의 유효성분으로서의 상황버섯 자실체 추출물은, 본 명세서의 실시예를 통해 증명된 바와 같이, 상황버섯 자실체를 에탄올 등으로 추출하여 추출물을 조제한 후, 헥센, 에틸아세테이트 및 부탄올을 이용하여 순차적으로 분획하여 조제되며, 이 중 강력한 프로트롬빈 저해 및 혈액응고인자 저해효과를 가지고 있으면서 지용성의 저분자 활성물질을 포함하는 에틸아세테이트 분획은 혈전 생성을 효율적으로 억제할 수 있는 효과가 있으며, 혈행개선을 통해 허혈성 뇌졸중 및 출혈성 뇌졸중과 같은 혈전증의 예방 및 치료용으로 사용할 수 있는 뛰어난 효과가 있다. 특히, 본 발명의 상황버섯 자실체 추출물은 급성경구독성이 나타나지 않으며, 열 안정성이 우수하고, pH 2의 산성조건 및 혈장 내에서도 인간트롬빈 직접저해, 프로트롬빈 저해, 혈액응고인자 저해 효과의 손실이 나타나지 않아, 추출액, 분말, 환, 정 등의 다양한 형태로 가공되어 상시 복용이 가능한 형태로 조제할 수 있는 뛰어난 효과가 있으므로 제약 산업 및 식품 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 상황버섯 자실체 추출물을 함유하는 인간 트롬빈 직접저해, 프로트롬빈 저해 및 내인성 혈액응고인자 저해 활성을 갖는 혈전증 예방 또는 치료용 약학적 조성물과 건강 기능 식품에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명의 발명자들은 일정 방법으로 수득한 상황버섯 자실체 추출물로부터 항혈전 활성 성분을 회수하였고, 이러한 성분은 경구급성독성이 나타나지 않으면서, 열 안정성과 산 안정성이 우수한 특징을 가짐을 확인함으로써 상기 추출물을 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품으로 활용하고자 하였다.
구체적으로, 본 발명자들은 상황버섯 자실체를 이용하여 혈전증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품을 개발하기 위하여 상황버섯 자실체의 에탄올 추출물을 조제하고, 이를 순차적 유기용매 분획하여 헥센 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물 및 물 잔류물 등을 수득하고, 이의 총폴리페놀, 총플라보노이드 등의 유용성분을 분석하고, 이를 각각 인간 혈장과 인간 트롬빈에 대한 트롬빈 직접저해 (Thrombin Time), 프로트롬빈 저해 (Prothrombin Time) 및 활성부분 트롬보플라스틴 타임 (activated Partial Thromboplastin Time: aPTT), 혈소판 응집저해능을 평가하였다. 그 결과, 상황버섯 자실체 에탄올 추출물에서 현재 사용되고 있는 의약품인 아스피린 (시판 항혈전제)보다 우수한 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임 및 활성부분 트롬보플라스틴 타임 연장활성을 확인하였다. 또한 기존에 알려진 수용성의 고분자 다당류가 아닌, 지용성의 저분자 활성물질을 가진 에틸아세테이트 분획에서는 아스피린보다 강력한 트롬빈 타임 연장효과, 프로트롬빈 타임 및 활성부분 트롬보플라스틴 타임 연장효과, 혈소판 응집저해효과를 확인하였다. 한편, 상황버섯 자실체의 에탄올 추출물 및 각 유기용매 분획물들은 인간 적혈구 용혈활성이 나타나지 않았으며, 열 및 산 안정성이 우수하였을 뿐만 아니라, 흰쥐에 경구투여하여 급성독성검사를 실시함으로써 상기 추출물이 인체 독성이 없음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 상황버섯 자실체 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈전증 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 건강 기능 식품을 제공한다.
바람직한 구체예로서, 상기 상황버섯 자실체 추출물은 상황버섯 자실체 에탄올 추출물인 것이 바람직하다.
또 다른 바람직한 구체예로서, 상기 상황버섯 자실체 추출물은 상황버섯 자실체 에탄올 추출물의 유기 용매 분획물 중 에틸아세테이트 분획물인 것이 바람직하다. 상기 에틸아세테이트 분획물은 상기 에탄올 추출물을 헥센으로 분획 후, 에틸아세테이트로 순차 분획하여 얻어질 수 있다.
이하에서는, 본 발명의 상황버섯 자실체 추출물의 제조 방법 및 효능 실험 등을 보다 구체적으로 설명한다.
본 발명은 상황버섯 자실체로부터 활성 추출물을 조제하는 단계; 상황버섯 자실체 추출물로부터 헥센, 에틸아세테이트, 부탄올 등의 유기용매 분획물 및 물 잔류물로 조정제하는 단계; 상기 추출물 및 분획물의 효능 및 안정성 조사단계; 활성 분획물의 분자량 측정단계; 및 상기 분획물의 급성 독성검사단계를 포함한다.
본 발명의 조성물에 포함되는 "상황버섯 자실체 추출물"은 상황버섯 자실체를 수세후 음건하는 단계, 건조 자실체를 유기용매로 추출하는 단계 및 상기 추출액을 0.06 mm 이하의 여과망을 사용하여 여과하고, 이를 감압농축하는 단계에 의해 수득될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 유기용매는 물 (냉수, 열수), 주정, 탄소수 1~4의 무수 또는 함수 저급 알코올 (메탄올, 에탄올, 주정, 프로판올, 부탄올 등), 상기 저급알코올과 물과의 혼합용매 등을 이용할 수 있으며, 80~95 % 에탄올이 가장 바람직하다.
본 발명에서는, 상황버섯 자실체 에탄올 추출물을 5 mg/ml의 농도로 조제하여 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임 및 에이피티 타임을 측정한 결과, 상황버섯 자실체 에탄올 추출물은 무첨가구보다 각각 15 배 이상 연장된 매우 강력한 혈전생성 억제 활성을 나타내었다. 이러한 강력한 혈전생성 억제활성은 1.25 mg/ml농도까지 희석한 경우에도 동일하게 15 배 이상 연장된 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임 및 에이피티 타임을 나타내어 아스피린보다 강력한 활성을 확인하였다. 반면, 헥센 분획은 1.25 mg/ml 농도에서 각각 2.7 배, 1.3 배, 1.95 배 연장된, 상대적으로 미약한 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임 및 에이피티 타임을 나타내었다. 에틸아세테이트 분획은 1.25 mg/ml 농도에서 각각 3.54 배, 15 배, 15 배 연장된 강력한 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임 및 에이피티 타임을 유지하였다. 한편 부탄올 분획 및 물 잔류물에서는, 에탄올 추출물 및 에틸아세테이트 분획보다 강력한 활성을 나타내었으며, 특히 물 잔류물의 경우 0.25 mg/ml 농도에서도 각각 15 배 이상 연장된 강력한 프로트롬빈 타임 및 에이피티 타임을 나타내었다. 이러한 결과는 상황버섯 자실체의 에탄올 추출물 및 이의 유기용매 분획물은 트롬빈, 프로트롬빈, 혈액응고인자에 작용하여 혈전생성을 억제하는 효과를 가짐을 의미하며, 위장장해와 같은 부작용이 보고된 아스피린과 같은 항응고제를 대치할 수 있음을 제시한다.
본 발명의 상황버섯 자실체 추출물 및 이의 에틸아세테이트 분획물은 감압증류 및 동결건조, 또는 분무건조 등과 같은 통상적인 분말화 과정을 거쳐 분말로 제조될 수 있다. 이들은 100 ℃의 열처리와 pH 2의 인체 위 내의 pH에서도 활성을 유지한다.
본 발명의 상황버섯 자실체 추출물은 혈전증과 관련된 다양한 질환들의 예방 또는 치료용으로 사용될 수 있다. 상기 질환들은, 예를 들어, 동맥 혈전증으로서, 급성 심근 경색증, 가슴 통증, 호흡 곤란, 의식 소실, 허혈성 뇌졸중, 출혈성 뇌졸중, 두통, 운동 이상, 감각 이상, 성격 변화, 시력 저하, 간질 발작, 폐 혈전증, 심부정맥 혈전증, 하지 부종, 통증 및 급성 말초 동맥 폐쇄증 등을 들 수 있고, 정맥 혈전증으로서, 심부정맥 혈전증, 간문맥 혈전증, 급성 신장정맥 폐쇄증, 뇌 정맥동 혈전증 및 중심 망막정맥 폐쇄 등을 들 수 있다.
본 발명의 상황버섯 자실체 추출물을 포함하는 약학적 조성물은 각각의 사용 목적에 맞게 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구 제형, 멸균 주사용액의 주사제 등 다양한 형태로 제형화하여 사용할 수 있으며, 경구 투여하거나 정맥 내, 복강 내, 피하, 직장, 국소 투여 등을 포함한 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다.
이러한 약학적 조성물에는 추가적으로 담체, 부형제 또는 희석제 등이 더 포함될 수 있으며, 포함될 수 있는 적합한 담체, 부형제 또는 희석제의 예로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리쓰리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 비정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 충전제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 더 포함할 수도 있다.
바람직한 구체예로서, 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 약학적 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 혼합하여 제형화한다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 등과 같은 윤활제가 사용될 수도 있다.
바람직한 구체예로서, 경구용 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 예시될 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
바람직한 구체예로서, 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액제, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제, 좌제 등을 예시할 수 있다. 비수성용제, 현탁제에는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 포함될 수 있다. 주사제에는 용해제, 등장화제, 현탁화제, 유화제, 안정화제, 방부제 등과 같은 종래의 첨가제가 포함될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
바람직한 구체예로서, 본 발명의 약학적 조성물에서 상황버섯 자실체 추출물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 ㎏ 당 1 내지 5,000 mg, 바람직하게는 100 내지 3,000 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 다양한 경로를 통하여 대상에 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에서 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 본 발명의 약학적 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 일반적인 모든 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 유효성분을 표적 세포로 전달할 수 있는 임의의 장치를 이용해 투여될 수도 있다.
본 발명에서 "대상"은, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 인간, 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함하고, 바람직하게는 포유류, 보다 바람직하게는 인간을 의미한다.
또한, 본 발명의 건강 기능 식품은 혈전증의 예방 또는 개선에 효과적인 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 상황버섯 자실체 추출물을 포함하는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.
본 발명의 상황버섯 자실체 추출물은 일반적으로 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강음료 조성물은 100 ml를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.
본 발명의 건강 기능 식품은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 것 외에 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제, 예컨대, 천연 탄수화물 및 다양한 향미제 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상기 천연 탄수화물의 예로는 포도당, 과당 등의 단당류, 말토오스, 수크로오스 등의 이당류 및 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 다당류와 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등의 당알코올이 있다.
상기 향미제로는 타우마틴; 레바우디오시드 A 또는 글리시르히진과 같은 스테비아 등의 천연 향미제 및 사카린, 아스파르탐 등의 합성 향미제를 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강 기능 식품 100 ml당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g을 사용한다. 상기 외에 본 발명의 건강 기능 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물, 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강 기능 식품은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료 등의 제조를 위한 과육을 함유할 수도 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 본 발명의 상황버섯 자실체 추출물 100 중량부 당 0.01 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 바람직한 하나의 구체예일 뿐이며, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예의 범위로 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
실시예 1: 상황버섯 자실체 추출물 및 유기용매 분획물의 조제
경북 영천에서 재배된 상황버섯 자실체를 채취하여 이를 수세 음건후 분쇄하여 분말화한 후, 상황버섯 자실체 분말에 대해 10 배 부피의 에탄올 (95 %, 덕산, 한국)을 가하고 상온에서 8 시간씩 2 회 추출하였다. 에탄올 추출물은 감압 농축하여 분말로 제조하고 사용 전까지 저온 밀봉 보관하였다. 분획물 조제를 위해서는, 에탄올 추출물을 증류수에 현탁한 후, 헥센, 에틸아세테이트, 부탄올로 순차적 분획하였으며, 최종적으로 물 잔류물을 얻었다.
이때 에탄올 추출물의 수득율은 12.19±0.32 % 였으며, 상황버섯 자실체 에탄올 추출물의 헥센 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물 및 물 잔류물의 수득율은 각각 2.16 %, 38.33 %, 43.02 % 및 13.41 %였다. 기존의 버섯류들과는 달리 에틸아세테이트 분획물의 양이 매우 많이 나타났으며, 이는 목질부가 많은 상황버섯의 특징으로 이해되며, 상황버섯 자실체 100 g에 대해 에틸아세테이트 분획물은 약 4.67 g을 얻게 됨을 의미하며, 에틸아세테이트 분획은 상당히 정제된 것으로 판단된다.
조제된 상황버섯 자실체 추출물 및 분획물들의 총 플라보노이드 (total flavonoid), 총 폴리페놀 (total polyphenol), 총 당 및 환원당 함량을 측정하였다. 총 플라보노이드 함량 측정은 각각의 시료를 18 시간 메탄올 교반 추출하고, 여과한 추출 검액 400 μl에 90 % diethylene glycol 4 ml를 첨가하고 다시 1 N NaOH 40 μl를 넣고 37 ℃에서 1 시간 반응 후 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준시약으로는 rutin을 사용하였다. 총 폴리페놀 함량은 추출 검액 400 μl에 50 μl의 Folin-ciocalteau, 100 μl의 Na2CO3 포화용액을 넣고 실온에서 1 시간 방치한 후 725 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준시약으로는 tannic acid를 사용하였다. 환원당은 DNS법으로, 총당은 phenol-sulfuric acid법을 이용하여 정량하였다. 그 결과는 다음 표 2에 나타내었다.
상황버섯 자실체의 에탄올 추출물 및 분획물의 수율 및 이들의 성분 분석 (단위: mg/g)
추출물/
분획물		 추출 및
분획효율 (%)		 함량 (mg/g)
총 폴리페놀 총 플라보노이드 총 당 환원당
에탄올
추출물		 12.19±0.32 212.89±0.63 69.5±5.51 367.08±8.0 236.69±15.54
헥센
분획		 2.16±0.03 42.07±0.31 69.50±3.94 109.15±11.43 82.65±1.49
에틸
아세테이트
분획		 38.33±1.67 200.96±7.5 137.44±2.36 157.66±4.57 95.52±5.37
부탄올
분획		 43.02±2.45 336.51±3.75 204.83±6..30 287.03±9.15 222.90±6.56
물
잔류물		 13.41±1.32 345.35±11.25 142.45±3.15 288.65±4.57 222.48±7.16
그 결과 에탄올 추출물의 유기용매 분획수율은 부탄올> 에틸아세테이트>물>헥센 분획물의 순서로 나타났으며, 총 폴리페놀 함량 및 총 플라보노이드 함량은 부탄올>물>에틸아세테이트>헥센 분획물의 순서, 총 당 및 환원당 함량은 물=부탄올>에틸아세테이트>헥센 분획물의 순서로 나타났다. 따라서 상황버섯 자실체 추출물은 매우 높은 양의 폴리페놀과 플라보노이드를 함유하고 있음을 알 수 있었으며, 부탄올 분획물이 상당량의 폴리페놀 및 플라보노이드를 함유함을 알 수 있다. 이는 일반 식용과일에 비해 10~100 배 이상 높은 함량을 나타내고 있으며, 상황버섯 자실체의 강력한 항산화 활성과 관련된다(결과 미제시).
실시예 2: 상황버섯 자실체 추출물 및 분획물의 항혈전 활성 평가
실시예 1 의 상황버섯 추출물 및 유기용매 분획물에 대한 항혈전 활성을 조사하였다. 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임, 에이피티티 타임을 측정하였으며, 분석방법은 다음과 같다.
항혈전 활성은 기존에 보고된 방법에 준해 평가하였으며 (Sohn et al., 2004. Kor . J. Pharmacogn 35. 52-61; Kwon et al., 2004. J. Life Science, 14. 509-513; 류 등 2010. J. Life Science, 20. 922-928), 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임과 에이피티티 타임을 측정하였다. 혈장은 지원자의 전혈로부터 조제하였으며, 채혈 후 즉시 4 ℃에서 5,000 g로 5 분 동안 원심분리하여 혈장을 분리하고 냉동한 상태로 보관하였으며 (신선동결혈장), 필요시 상온에서 해동하여 사용하였다. 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임과 에이피티티 측정법은 다음과 같은 과정으로 수행되었다.
트롬빈 타임( Thrombin Time )
37 ℃에서 0.5 U 트롬빈 (Sigma Co., USA) 50 μl와 20 mM CaCl2 50 μl, 다양한 농도의 시료 추출액 10 μl를 Amelung coagulometer KC-1A (Japan)의 튜브에 혼합하여 2 분간 반응시킨 후, 혈장 100 μl를 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였다. 대조로는 아스피린 (Sigma Co., USA)을 사용하였으며, 용매 대조구로는 시료 대신 DMSO를 사용하였다. DMSO의 경우 32.1 초의 응고시간을 나타내었다. 열 안정성 측정의 경우에는 다양한 농도의 시료용액을 100 ℃에서 30 분간 열처리하고, 실온에서 1 시간 방냉한 후, 잔존활성을 측정하였다. 트롬빈 저해 효과는 3 회 이상 반복한 실험의 평균치로 나타내었으며, 시료 첨가시의 응고시간을 용매 대조구의 응고시간으로 나눈 값에 100을 곱하여 %로 나타내었다.
프로트롬빈 타임( prothrombin time )
표준혈장 (MD Pacific Co., China) 70 μl와 다양한 농도의 시료액 10 μl를 Amelung coagulometer KC-1A (Japan)의 튜브에 첨가하여 37 ℃에서 3 분간 가온 후, 130 μl의 PT reagent를 첨가하고 혈장이 응고될 때까지의 시간을 3 회 반복한 실험의 평균치로 나타내었다. 대조로는 아스피린 (Sigma Co., USA)을 사용하였으며, 용매 대조구로는 시료 대신 DMSO를 사용하였다. DMSO의 경우 18.1 초의 응고시간을 나타내었다.
aPTT ( activated Partial Thromboplastin Time )
혈장 100 μl와 다양한 농도의 시료 추출액 10 μl를 Amelung coagulometer KC-1A (Japan)의 튜브에 첨가하여 37 ℃에서 3 분간 가온한 후, 50 μl의 aPTT reagent (Sigma, ALEXINTM)를 첨가하고 다시 37 ℃에서 3 분간 배양하였다. 이후 50 μl CaCl2(35 mM)을 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였다. 용매 대조구로는 시료 대신 DMSO를 사용하였으며, 이 경우 55.1 초의 응고시간을 나타내었다. aPTT의 결과는 3 회 반복한 실험의 평균치로 나타내었으며, 시료 첨가시의 응고시간을 용매 대조구의 응고시간으로 나눈 값에 100을 곱하여 %로 나타내었다.
상기 설명된 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임과 에이피티 타임 측정법에 따른 항혈전 측정 결과는 다음 표 3에 나타내었다. 대조구로 사용된 아스피린(상품명: 프로텍트)은 5 mg/ml 농도에서 무첨가구에 비해 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임과 에이피티 타임 모두 280 초 이상으로 증가되어 우수한 항혈전 효과를 나타내었으며, 상황버섯 자실체의 에탄올 추출물은 1.25~5 mg/ml 농도에서는 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임, 에이피 타임을 각각 15배 이상 연장시키는 강력한 항혈전 활성을 나타내어 아스피린보다 더욱 우수함을 확인하였다.
한편, 우수한 항혈전 활성은 에틸아세테이트 분획, 부탄올 분획 및 물 잔류물에서 각각 확인되었으며, 에틸아세테이트 분획물은 2. 5 mg/ml 농도에서 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임 및 에이피티 타임을 각각 무첨가구보다 15 배 이상 연장시켰으며, 1.25 mg/ml 농도에서는 프로트롬빈 타임 및 이에피티 타임은 각각 15 배 이상 연장시켰으며, 트롬빈 타임은 3.54 배 연장시켰다. 부탄올 분획 및 물 잔류물의 경우 더욱 강력한 항혈전 활성을 나타낸 바, 0.5 mg/ml 농도에서도 15 배 이상 연장된 트롬빈 타임, 프로트롬빈 타임및 에이피티 타임을 나타내었다.
이러한 효과는 식용으로 이용되고 있는 상황버섯의 에틸아세테이트 분획이 아스피린보다 우수한 트롬빈 저해, 프로트롬빈 저해, 혈액응고인자 저해활성을 나타내어 부작용이 없는 안전한 항혈전제로 개발 가능함을 제시하고 있다.
상황버섯 자실체 유기용매 분획물 및 물 잔류물의 항혈전 활성
시료 농도 (mg/ml) 혈전생성 시간 (초)
트롬빈 타임 프로트롬빈 타임 에이피티 타임
디엠에스오(용매) - 32.1±0.5 18.1±0.3 55.1±1.4
아스피린 5.0 >480 >280 >800
1.5 86.3±6.6 28.1±2.4 75.5±5.1
에탄올 추출물 5.0 >480 >280 >800
2.5 >480 >280 >800
1.25 >480 >280 >800
0.5 73.5±3.2 26.9±1.2 88.1±7.4
0.25 66.1±4.5 20.4±2.6 64.8±2.2
0.125 43.9±2.9 16.9±3.6 59.5±3.0
헥센분획 5.0 >480 >280 >800
2.5 114.5±9.5 29.6±3.8 180.7±7.9
1.25 86.6±5.4 　23.5±0.9 107.4±7.3　
0.5 43.4±3.1 　18.2±0.8 71.2±5.2　
에틸아세테이트
분획		 5.0 >480 >280 >800
2.5 >480 >280 >800
1.25 113.6±9.6 >280 >800
0.5 60.0±6.2 21.4±2.5　 100.3±11.5
0.25 35.7±1.7 18.1±1.4　 62.8±3.4
부탄올 분획 5.0 >480 >280 >800
2.5 >480 >280 >800
1.25 >480 >280 >800
0.5 90.2±8.9 >280 >800
0.25 36.4±3.1 26.9±3.8　 92.5±8.4
물 잔류물
 5.0 >480 >280 >800
2.5 >480 >280 >800
1.25 >480 >280 >800
0.5 >480 >280 >800
0.25 189.4±15.7 >280 >800
0.125 102.0.2±7.8 23.8±2.4 73.8±7.5
실시예 3: 상황버섯 자실체 추출물, 순차적 유기용매 분획물의 인간 혈소판 응집 저해활성
상황버섯 자실체 추출물 및 분획물의 항혈전 활성 평가의 일환으로 인간 혈소판에 대한 응집저해활성을 평가하였으며, 그 결과는 표 4에 나타내었다. 먼저 아스피린은 우수한 인간 혈소판 응집저해 활성을 나타내었으며, 농도의존적인 응집저해 활성을 확인하였다. 상황버섯 자실체 에탄올 추출물 및 유기용매 분획물은 0.25 mg/ml 농도에서 전반적으로 혈소판 응집저해 활성이 우수한 바, 아스피린 0.25 mg/ml 농도가 나타내는 응집저해 활성과 비교할 만하였으며, 물 잔류물>부탄올 분획물> 에틸아세테이트 분획물의 순서로 강력한 활성을 나타내었다. 따라서 상황버섯 자실체 추출물 및 분획물은 항혈전제로 아스피린을 대치할 수 있음을 확인하였다. 혈소판 응집저해 활성은 다음의 방법에 준해 평가하였다.
혈소판 응집저해 활성( Platelet aggregation inhibition activity )
혈소판은 건강한 인간의 전혈로부터 3.2 % sodium citrate 용액과 1:9의 비율로 혼합한 후, 1,100 rpm에서 10분간 원심분리하여 상층의 PRP (platelet rich plasma)를 취하고, 이를 washing buffer (138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 12 mM NaHCO3, 0.36 mM NaH2PO4, 5.5 mM Glucose, 1 mM EDTA, pH 6.5)로 1회 세척하였다. 이후, suspending buffer (138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 12 mM NaHCO3, 0.36 mM NaH2PO4, 5.5 mM Glucose, 0.49 mM MgCl2, 025% gelatin, pH 7.4)에 재 현탁한 후, 3,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후 다시 suspending buffer에 재현탁하였으며, 이때 혈소판 수는 4x109/ml 되도록 조정하였다. 이후 1 ml 현탁액에 2.5 ul collagen을 가해 5분간 반응시키고, whole-blood aggregometer (Chrono-log, USA)를 사용하여 37 ℃에서 혈소판 응집을 측정하였다.
상황버섯 자실체 에탄올 추출물 및 분획물의 인간 혈소판 응집저해 활성
시료/대조구 강도
(Amplitude:ohm)		 기울기
(Slope)		 연장시간
(Lag time:초)		 하강면적
(Area under)
디엠에스오 (용매:DMSO) 14 2 84 148.5
아스피린 (0.50 mg/mL) 5 1 184 21.7
아스피린 (0.25 mg/mL) 8 2 94 56.4
에탄올 추출물 (0.25 mg/mL) 14 2 25 75.6
헥센 분획물 (0.25 mg/mL) 14 2 61 84.5
에틸아세테이트 분획물 (0.25 mg/mL) 10 1 65 71.8
부탄올 분획물 (0.25 mg/mL) 7 1 56 55.4
물 잔류물 (0.25 mg/mL) 6 1 46 47.2
*하강면적이 작을수록 혈소판 응집이 나타나지 않음을 의미
실시예 4: 상황버섯 자실체 에틸아세테이트 분획물의 활성물질의 화학적 특성 및 안정성
먼저 상기 실시예 1에서 얻은 상황버섯 자실체의 분획물의 분말 10 mg에 1 mL의 에탄올을 가하여 녹인 후 이를 대상으로 아미콘 분자체 (Amicon 30, Millipore co.)와 원심분리기를 이용하여 30 kDa 이상과 30 kDa이하의 물질층을 분리하였다. 이후 각각의 물질층의 활성을 측정한 결과, 에틸아세테이트 분획물에서는 분자량 30 kDa 이하에서 활성이 나타났으며, 부탄올 분획물 및 물 잔류물에서는 30 kDa 이상의 물질층에서 활성이 나타났다. 따라서 수용성 고분자 다당류가 아닌, 신규의 지용성 저분자 활성물질을 포함하는 에틸아세테이트 분획물을 대상으로 인간 적혈구 용혈활성, 혈장 안정성, 열 안정성 및 산 안정성을 확인하였다. 조정제된 활성물질은 100 ℃에서 2 시간 처리, pH 2(0.01 M HCl)에서의 2 시간 처리, 혈장에서 2 시간 처리시에도 에틸아세테이트 분획이 트롬빈 저해 및 혈소판 응집저해활성의 감소가 나타나지 않아 높은 안정성을 나타내었다. 또한, 5 mg/ml 농도까지 인간 적혈구에 대한 용혈 활성은 나타나지 않았다 (표 5).
상황버섯 자실체 추출물 및 분획물의 인간 적혈구 용혈활성
시료 (5 mg/ml) 인간 적혈구 용혈활성 (%)
에탄올 추출물 1.93±0.82
헥센 분획물 29.43±1.18
에틸아세테이트 분획물 0.29±0.77
부탄올 분획물 1.12±1.24
물 잔류물 3.75±0.52
트리톤 X-100 (triton X-100) 0.1% 100.00±0.00
엠포테리신 B (amphotericin B) 125 μg/ml 75.30±8.50
실시예 5: 상황버섯 자실체 에틸아세테이트 분획물의 단회경구독성 시험
4 주령의 흰쥐(Slc, ICR Mouse)를 (주)중앙실험동물로부터 공급받아 온도 23±3 ℃, 상대습도 50±10 %, 150~300 Lux의 조도로 12 시간 간격(오전 8 시~오후 8 시)으로 조절되는 동물실험실에서 14 일간 순화시킨 후, 실시예 1로부터 얻은 에틸아세테이트 분획물의 단회경구독성을 평가하였다. 먼저, 시료를 DMSO 및 물에 녹인 후, 400, 800, 1500, 2000 mg/kg 농도로 각각 3마리씩 경구투여 후, 일주일 간 생존 여부와 병적 이상 증후를 관찰하였다. 대조구로는 DMSO만을 경구투여하였다. 그 결과 생존율은 100 %였으며, 병적 이상 징후는 나타나지 않았다. 따라서, 약용으로 사용되어 온 상황버섯 자실체의 에틸아세테이트 분획물은 저독성 또는 무독성으로 구분되며, 이의 낮은 농도의 사용은 부가적인 문제점을 야기하지 않으리라 판단되었다.

Claims (5)

  1. 상황버섯(Phellinus linteus) 자실체 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 혈전증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 상황버섯 자실체 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물은 분자량 30kDa 이하의 물질층인 것을 특징으로 하는 혈전증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 삭제
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 상황버섯 자실체 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물은 상기 에탄올 추출물을 헥센 분획 후, 에틸아세테이트로 순차 분획하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 혈전증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 제 1항, 제 2항 또는 제 4항 중 어느 한 항에 기재된 상황버섯 자실체 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 포함하는 혈전증 예방 또는 개선용 건강 기능 식품.
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S.M.Kamruzzaman. Anti-platelet activities of natural products from mushroom and plant origin. 경북대학교 대학원 수의과대학. 박사학위논문. 2010. 6. *
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