TWI654298B - 刺槐木層孔菌子實體的培養方法及其萃取物 - Google Patents

Abstract

本發明係關於一種刺槐木層孔菌(Phellinus robiniae )子實體的培養方法及其萃取物，培養方法係包含：製備一刺槐木層孔菌菌絲液，將刺槐木層孔菌菌絲液以一定比例接種於一包含有大麥、薏仁及紅高粱的五穀雜糧固體培養基，每日以LED光源照射8-12小時，並培養6-9個月，以獲得一刺槐木層孔菌子實體。將刺槐木層孔菌子實體以乙醇溶液萃取，以製得一刺槐木層孔菌子實體萃取物，係包含多酚與類黃酮，且具有調節免疫系統之活性。

Description

刺槐木層孔菌子實體的培養方法及其萃取物

本發明係關於一種刺槐木層孔菌(Phellinus robiniae )子實體的培養方法及其萃取物，尤指一種以特定培養條件培育刺槐木層孔菌子實體的方法，以及刺槐木層孔菌子實體萃取後所得之產物。

利用真菌以及其衍生產物作為保健食品已具有長久歷史，例如冬蟲夏草、樟芝、蟬花、桑黃等；根據目前研究，這些真菌或其衍生物具有多種類的多醣體、生物鹼、萜類、皂苷等對人體有益的成分。以往這些真菌係從自然界採集，除了數量稀少之外，經驗不足之採集者亦可能採集到具有毒性的其他真菌，因此往昔具有保健功效的真菌價格都十分昂貴。此外，由於無法控制真菌的生長環境，故也無法保證每一批採集之真菌都能達到相同的功效。因此研發具保健功效真菌的培養方法，以提供大量且生長狀況穩定的真菌，為本領域研究者相當重視的議題。

分類學上屬於銹革孔菌科(Hymenochaetaceae )木層孔菌屬(Phellinus )之刺槐木層孔菌(Phellinus robiniae )為一種多年生真菌，外觀呈現黃褐色至黑色，大多寄生於刺槐屬(Robiniae )樹木的心材(heartwood)上，亦可生長於已死亡之刺槐屬樹木之木材。然而，目前仍然缺少刺槐木層孔菌子實體的人工培育方法，因此目前仍亟需開發較佳的人工培養方法，以增加刺槐木層孔菌於產業上的應用。

目前針對真菌類的培養已有不少相關研發，例如中華民國專利第TW 201249987 (A)號公開案為關於一種桑黃類子實體、培養方法及其固態發酵培養基，係將桑黃(又名裂蹄木層孔菌，Phellinus igniarius )菌種接種於液態培養基一預定時間，再將含桑黃之液態培養基接種於固態發酵培養基，並先於恆溫恆濕之避光環境下培養一預定時間後，再繼續照光培養一預定時間，便可獲得固態培養基上的桑黃類子實體，且所獲得之子實體還有高量多醣與黃酮；中國專利第 CN 103695322 (B)號專利，係關於富含生物活性成分的桑黃菌絲體產品及其生產方法，是在以桑黃為原料的培養基中，接種桑黃菌種後，整合溫度與光照時間，誘導菌絲轉色，並省略子實體成形階段，然後再分離出富含包含多醣、黃酮、三萜類等成分的菌絲產品；中華民國專利第TW 200513174 (A)號公開案為一種蕈類的培養方法、蕈類的栽培系統、培育用架子、靈芝的培養方法、培育系統，係關於以靈芝(Ganoderma lucidum )為主的蕈類的培養方法，包含並以特定波長之光照進行培養，以增加子實體的總表面積等等；此外，中華民國專利TW I543706(B)為一種牛樟芝的培養方法，係使用含有特定比例水分與五穀雜糧的固態培養基，搭配藍光或綠光照射以提高牛樟芝的總多酚、胞內多醣以及粗三萜之含量。根據上述前案，由於不同真菌類其特性不同，因此若要從不同種的真菌中製備具有特定功效的萃取物，必須藉由特定的培養方法或製備方法才可能得到。

再者，相較於菌絲體，子實體的培養較為困難，且不同種類的真菌子實體培養方式大多無法通用，目前亦無有關刺槐木層孔菌(Phellinus robiniae )之人工培養方法。爰此，如何藉由人工培養方式培養具有更多元養分的刺槐木層孔菌子實體，仍為相關領域發明人所思及之方向。

今，發明人有鑑於現有刺槐木層孔菌(Phellinus robiniae )之培養方法仍有不足，於是乃一本孜孜不倦之精神，並藉由其豐富專業知識及多年之實務經驗所輔佐，而加以改善，並據此研創出本發明。

本發明係一種刺槐木層孔菌(Phellinus robiniae )子實體的培養方法，包含步驟一：培養一刺槐木層孔菌菌絲液，再將50 mL-100 mL之刺槐木層孔菌菌絲液接種於1公斤之五穀雜糧固體培養基；步驟二：將該接種有刺槐木層孔菌菌絲之五穀雜糧固體培養基培養於26-33℃之環境，再以一波長為800-1100 nm之LED光源每日照射，每日照射8-12小時，照射30-60日；步驟三：將該接種有刺槐木層孔菌菌絲之五穀雜糧固體培養基培養於26-33℃之環境，再以一波長為500-600 nm之LED光源每日照射，每日照射8-12小時，照射90-120日；步驟四：將該接種有刺槐木層孔菌菌絲之五穀雜糧固體培養基培養於26-33℃之環境，再以一波長為410-500 nm之LED光源每日照射，每日照射8-12小時，照射60-90日，以獲得一刺槐木層孔菌子實體；其中五穀雜糧固體培養基包含40-50wt%小麥、10-20 wt%薏仁、20-30 wt%紅高粱。

本發明亦包含一種刺槐木層孔菌子實體的萃取物，係將以上述培養方法所獲得之刺槐木層孔菌子實體，以一乙醇溶液萃取以獲得一乙醇粗萃物，再將乙醇粗萃物上載至填充苯乙烯系樹脂之管柱，並依序以20%乙醇溶液、50%乙醇溶液、75%乙醇溶液與95%乙醇溶液沖提以獲得20%乙醇沖提液、50%乙醇沖提液、75%乙醇沖提液與95%乙醇沖提液；以及將20%乙醇沖提液、50%乙醇沖提液、75%乙醇沖提液與95%乙醇沖提液濃縮乾燥後，分別獲得萃取物A、萃取物B、萃取物C以及萃取物D，該些萃取物具有調節免疫系統之生物活性。

於本發明之一實施例中五穀雜糧固體培養基係包含50 wt%小麥、20 wt%薏仁與30 wt%紅高粱。

於本案之一實施例中，每1 mL之刺槐木層孔菌菌絲液係含有2.50-3.50 mg菌絲體。

於本案之一實施例中，刺槐木層孔菌子實體萃取物具有免疫調節之功效。

於本案之一實施例中，刺槐木層孔菌子實體萃取物包含有60~180 μg /g總多酚與60-290 μg /g總類黃酮。

藉此，本案一種刺槐木層孔菌子實體之培養方法，以特定的培養條件與特定成分之五穀雜糧固體基培養，能成功培育出刺槐木層孔菌子實體，且萃取該刺槐木層孔菌子實體所獲得之萃取物具有調節免疫系統之生物活性。

本發明之目的及其功能上的優點，將依據以下圖面所示之結果，配合具體實施例予以說明，俾使審查委員能對本發明有更深入且具體之瞭解。

本發明為一種刺槐木層孔菌(Phellinus robiniae )子實體的培養方法，包含步驟一：培養一刺槐木層孔菌菌絲液，再將50 mL-100 mL之刺槐木層孔菌菌絲液接種於1公斤之五穀雜糧固體培養基；步驟二：將該接種有刺槐木層孔菌菌絲之五穀雜糧固體培養基培養於26-33℃，再以一波長為800-1100 nm之LED光源每日照射，每日照射8-12小時，照射30-60日，此步驟係使菌絲體能充足培育成子實體；步驟三：將該接種有刺槐木層孔菌菌絲之五穀雜糧固體培養基培養於26-33℃之環境，再以一波長為500-600 nm之LED光源每日照射，每日照射8-12小時，照射90-120日，此步驟係使子實體能穩定成長，並進行二次代謝以使單醣產生；以及步驟四：將該接種有刺槐木層孔菌菌絲之五穀雜糧固體培養基培養於26-33℃之環境，再以一波長為410-500 nm之LED光源每日照射，每日照射8-12小時，照射60-90日，此步驟係利用近紫外光波長之光線促進子實體產生二次代謝物，以獲得一刺槐木層孔菌子實體。其中五穀雜糧固體培養基係包含40-50 wt%小麥、10-20 wt%薏仁、20-30 wt%紅高粱，較佳之培養基成分為包含50 wt%小麥、20 wt%薏仁與30 wt%紅高粱；每1 mL之刺槐木層孔菌菌絲液含有2.50-3.5 mg 菌絲體。再者，本案之刺槐木層孔菌子實體進一步以不同濃度之乙醇溶液分餾後，獲得之萃取物具有免疫調節之功效。

此外，藉由下述具體實施例，可進一步證明本發明可實際應用之範圍，但不意欲以任何形式限制本發明之範圍。

一、五穀雜糧固體培養基之製備

將50 wt%之小麥、20 wt%之薏仁與30 wt%之紅高粱均勻混合後以獲得第一混合物，再添加第一混合物總重量8%之純水，以使培養基充分潤濕，水分補足就可適合菌絲體成長，均勻混合後，再以121℃-132℃之高溫，壓力15磅/平方英吋之條件，滅菌30-60分鐘，以獲得本案培養方法使用之五穀雜糧固體培養基。

二、刺槐木層孔菌子實體之培養

本試驗中使用之刺槐木層孔菌菌種之ATCC編號為ATCC 26139。將菌種先接種於馬鈴薯葡萄糖液態培養基(potato dextrose broth，PDB)中，以30℃、100 rpm震盪培養7-10 日，當液態培養基中的菌絲量達到2.50-3.5 mg菌絲/mL時，再將75 mL之刺槐木層孔菌菌絲液接種於1公斤之固體培養基進行培養。將接種有刺槐木層孔菌菌絲液之固體培養基培育於26-33℃的環境中，先以波長為800-1100 nm之LED光源照射，每日照射8小時，照射30日，此階段中較佳的LED波長為950 nm；接著再以波長為500-600 nm之LED光源照射接種有刺槐木層孔菌菌絲液之固體培養基，每日照射12小時，照射90日，此階段中較佳的LED波長為550 nm；再以波長為410-500 nm之LED光源照射接種有刺槐木層孔菌菌絲液之固體培養基，每日照射8小時，培養60日，以獲得刺槐木層孔菌之子實體，此階段中較佳的LED波長為410 nm；請參見第一圖，為刺槐木層孔菌之子實體經乾燥後所獲得之樣本。上述之LED光照條件中，800 nm-1100 nm之波長光照係用以促進菌絲體成長並充足培育成子實體，500 nm-600 nm波長之LED光照係用於穩定子實體成長，且，而410 nm-500 nm波長之LED光照則可促進子實體產生較多活性成分；此外，若總培養時間不足6個月，則子實體質量過小；若培養時間超過9個月，則子實體不僅無法繼續生長，且會因為養分不足而有萎縮之現象。

三、刺槐木層孔菌子實體萃取物製備

請參閱第二圖，將獲得之刺槐木層孔菌子實體，先進行低溫乾燥後再磨成粉末，再將其以95%乙醇溶液浸泡一週，以獲得一乙醇粗萃物(5.28 g/乾重)；將乙醇粗萃物上載至填充苯乙烯系大孔樹脂之管柱，再依序以20%、50%、75%與95%乙醇進行沖提，並收集不同濃度乙醇溶液沖提後所得之沖提液；將各沖提液濃縮乾燥後以獲得各沖提部分之樣品，20%乙醇沖提液濃縮乾燥後獲得萃取物A，50%乙醇沖提液獲得萃取物B，75%乙醇沖提液獲得萃取物C，以及95%乙醇沖提液獲得萃取物D。將各萃取物將樣品保存於4℃以進行後續分析。

經過檢測，四種萃取物皆含有多酚(polyphenol)與類黃酮(flavonoid)。總多酚係以Folin-Ciocalteu比色法進行檢測，檢測步驟簡述如下：將待測物與2%碳酸鈉(Na₂ CO₃ )溶液混合後，再加入Folin-Ciocalteu試劑並反應30分鐘，測定波長730 nm之吸光值，並與由不同濃度所建立之標準沒食子酸(gallic acid)檢量線進行比對後，計算萃取物之總多酚含量。

此外，總類黃酮含量之檢測步驟簡述如下：將各萃取物之凍乾粉末以甲醇溶解後，取待測溶液100 μL，加入30 μL之5%亞硝酸鈉(NaNO₂ )溶液，反應6分鐘後，再加入30 μL 10% 硝酸鋁反應6分鐘，隨後加入100 μL 之1 M氫氧化鈉(NaOH)溶液，10分鐘後測定於波長515 nm之吸光值；以芸香苷(rutin)做為測定的標準曲線，表示成1克待測物相當於多少量之芸香苷(μg rutin/g-待測物乾粉)(參考文獻：陳如茵，蔡美珠，2011，酸桔(Citrus sunki Hort)及扁實檸檬(Citrus depressa Hayata)果實萃取物對發炎生化指標的影響，臺灣農業化學與食品科學，Vol.49 (3)，pp. 22-34)。

分析之結果請參見表一；其中萃取物B之總多酚與總類黃酮含量最多。

表一

四、刺槐木層孔菌子實體萃取物之功效

( 一 ) 、小鼠初代脾臟細胞懸浮液製備

自樂斯科生物科技股份有限公司購買四週齡之BALB/c雌鼠，並飼養於SPF(specific pathogen free)等級的動物房，飼養溫度控制於23 ± 2℃、濕度維持於60 ± 10% RH，每日光照與黑暗時間各12小時；以德國Altromin公司之1324N真空包裝SPF等級粒狀飼料餵食，且飲水無限制供應。當小鼠成長至8週齡時，取其脾臟，並將脾臟浸泡於5 mL RPMI-1640培養液，以針筒推進器之平尾端輕輕壓住脾臟、磨動，使結締組織之間的脾臟細胞盡量游離出來，直到整顆脾臟變成白色為止。將含有細胞之培養液吸取至15 mL離心管，靜置5-10分鐘；待結締組織沉澱，以轉速1500 rpm離心5分鐘，移除上清液後輕拍離心管管壁，以使貼附於管壁之細胞均勻散開；將前述細胞加入5 mL之冰涼的紅血球裂解溶液(ACK RBC lysis buffer) 使其混合均勻，作用1分鐘後立即加入回溫之含血清細胞培養液，再以轉速1500 rpm離心5分鐘；移除上清液，以10 mL之 HBSS緩衝液清洗細胞兩次後，打散細胞使其均勻懸浮於10 mL細胞培養液中；最後以Trypan blue染劑染色以計算活細胞數量。

( 二)、細胞激素分泌測試

於96孔(96-well) 培養盤中加入100 μL/well 培養液，或100 μL/well含有2.5 μg/mL 刀豆蛋白A(concanacalin A，簡稱ConA)或10 μg/mL 脂多醣(lipopolysaccharide，簡稱LPS)之培養液，或100 μL/well 含ConA或LPS，以及不同濃度之刺槐木層孔菌子實體萃取物的培養液後，再加入100 μL/well 之小鼠初代脾臟細胞懸浮液，每孔加入的細胞數為2 X 10⁵ cells/well。將細胞培養於37℃、5% CO₂ 之培養箱中培養48小時；48小時之後收集細胞上清液，測量上清液中介白素-2(Interleukin-2，IL-2)、介白素-4(Interleukin-4，IL-4)、介白素-6 (Interleukin-6，IL-6)與腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)之含量。本試驗使用DuoSet® ELISA Development Systems細胞激素檢測套組(Bio-Techne, Minneapolis, MN, U.S.A.)，以三明治型酵素連結免疫分析法(sandwich enzyme-linked immunosorbent assay，sandwich-ELISA)進行試驗。

請參見第三圖，小鼠初代脾臟細胞在僅使用ConA的刺激下(對照組)，會分泌高量的IL-2，而同時以ConA以及萃取物A處理之細胞，亦會分泌高量IL-2，且分泌量高於對照組。對於同時以ConA與萃取物B處理之細胞，當添加濃度介於500 μg/mL~1000 μg/mL時，會顯著抑制細胞分泌IL-2；但添加濃度若介於7.8125 μg/mL~250 μg/mL，則會明顯增加細胞分泌IL-2。此外，同時以ConA與萃取物C或是萃取物D處理之組別，當萃取物添加濃度介於125 μg/mL ~1000 μg/mL 時，會減少IL-2之分泌。

請參閱第四圖，小鼠初代脾臟細胞在ConA的刺激下亦會分泌IL-4 (對照組)；在當添加萃取物A(500μg/mL~1000μg/mL)於以ConA處理之小鼠初代脾臟細胞時，IL-4之分泌量有減少之現象，但若添加濃度介於7.8125μg/mL~250μg/mL，則會使IL-4之分泌量增加。另，將125μg/mL~1000μg/mL之萃取物B添加於小鼠初代脾臟細胞時下，IL-4分泌量會有減少的趨勢。此外，添加萃取物C(7.8125μg/mL~31.25 μg/mL)會促進IL-4之分泌量有增加的趨勢；相對地，添加62.5μg/mL ~1000μg/mL之萃取物C，則會降低細胞分泌之IL-4。萃取物D(7.8125μg/mL~62.5 μg/mL)與以ConA處理之小鼠初代脾臟細胞反應後，IL-4之分泌量有提升之作用；而添加濃度介於125 μg/mL~1000 μg/mL時，反而會造成細胞之IL-4之分泌量減少。

請參閱第五圖，在LPS單獨處理下(對照組)，小鼠初代脾臟細胞會分泌IL-6，若添加利用五穀雜糧固體培養所獲得之刺槐木層孔菌子實體萃取物(萃取物A、B、C或D)於以LPS處理之小鼠初代脾臟細胞，除了添加7.8125 μg/mL與15.625 μg/mL萃取物A之組別以外，其餘組別之細胞IL-6分泌量皆會減少。

請參閱第六圖，在LPS單獨處理下(對照組)，小鼠初代脾臟細胞會分泌TNF-α，若將刺槐木層孔菌子實體萃取物(萃取物A、B、C或D)與以LPS處理之小鼠初代脾臟細胞進行培養，除了添加7.8125 μg/mL萃取物A及7.8125 μg/mL~31.25 μg/mL之萃取物B的組別以外，其他處理條件下細胞分泌TNF-α的分泌量皆會減少。

由上述之實施說明可知，本發明與現有技術相較之下，本發明具有以下優點：

1. 本發明之刺槐木層孔菌子實體的培養方法，使用含有小麥、薏仁及紅高粱的五穀雜糧固體培養基，在特定的培養條件下可利用人工培養出刺槐木層孔菌子實體。

2. 本發明之刺槐木層孔菌子實體的培養方法，五穀雜糧固體培養基中可再添加燕麥，以提供刺槐木層孔菌更多元之養分。

3. 本發明之刺槐木層孔菌子實體的培養方法，獲得之刺槐木層孔菌子實體進一步以乙醇萃取濃縮後，所獲得之萃取物具有免疫調控的功效。

綜上所述，本發明刺槐木層孔菌子實體的培養方法及其萃取物，的確能藉由上述所揭露之實施例，達到所預期之使用功效，且本發明亦未曾公開於申請前，誠已完全符合專利法之規定與要求。爰依法提出發明專利之申請，懇請惠予審查，並賜准專利，則實感德便。

惟，上述所揭之說明，僅為本發明之較佳實施例，非為限定本發明之保護範圍；其；大凡熟悉該項技藝之人士，其所依本發明之特徵範疇，所作之其它等效變化或修飾，皆應視為不脫離本發明之設計範疇。

第一圖：以本案方法培養之刺槐木層孔菌子實體外觀照片。

第二圖：刺槐木層孔菌子實體萃取步驟流程圖。

第三圖：刺槐木層孔菌萃取物影響IL-2分泌分析圖。

第四圖：刺槐木層孔菌萃取物影響IL-4分泌分析圖。

第五圖：刺槐木層孔菌萃取物影響IL-6分泌分析圖。

第六圖：刺槐木層孔菌萃取物影響TNF-α分泌分析圖。

Claims (6)

1. 一種提高刺槐木層孔菌(Phellinus robiniae)子實體活性成分的培養方法，係包含：步驟一：培養一液態培養刺槐木層孔菌菌絲，並將50mL-100mL之該液態培養刺槐木層孔菌菌絲接種於1公斤之一五穀雜糧固體培養基；步驟二：將該接種有刺槐木層孔菌菌絲之該五穀雜糧固體培養基培養於26-33℃，並以一波長為800-1100nm之LED光源照射，每日照射8-12小時，共照射30-60日以促進菌絲體成長並充足培育成子實體；步驟三：將該接種有刺槐木層孔菌菌絲之該五穀雜糧固體培養基培養於26-33℃，並以一波長為500-600nm之LED光源照射，每日照射8-12小時，共照射90-120日以使子實體穩定成長；以及步驟四：將該接種有刺槐木層孔菌菌絲之該五穀雜糧固體培養基培養於26-33℃，並以一波長為410-500nm之LED光源照射，每日照射8-12小時，共照射60-90日以促進子實體產生較多活性成分，以獲得一具有多活性成分之刺槐木層孔菌子實體；其中該五穀雜糧固體培養基係包含40-50wt%小麥、10-20wt%薏仁及20-30wt%紅高粱。
2. 如申請專利範圍第1項所述之培養方法，其中該五穀雜糧固體培養基係包含50wt%小麥、20wt%薏仁與30wt%紅高粱。
3. 如申請專利範圍第1項所述之培養方法，其中每1mL之該液態培養刺槐木層孔菌菌絲係含有2.50-3.50mg菌絲體。
4. 一種刺槐木層孔菌子實體萃取物，係將請求項1所述之培養方法所獲得之一具有多活性成分之刺槐木層孔菌子實體，以一萃取步驟製備而得，其中該萃取步驟包含：以一乙醇溶液萃取該刺槐木層孔菌子實體以獲得一乙醇粗萃物；將該乙醇粗萃物上載至一填充苯乙烯系樹脂之管柱，並依序以20%乙醇溶液、50%乙醇溶液、75%乙醇溶液與95%乙醇溶液沖提以獲得一20%乙醇沖提液、一50%乙醇沖提液、一75%乙醇沖提液與一95%乙醇沖提液；以及將該20%乙醇沖提液、該50%乙醇沖提液、該75%乙醇沖提液與該95%乙醇沖提液濃縮乾燥後，分別獲得萃取物A、萃取物B、萃取物C以及萃取物D；其中，該刺槐木層孔菌子實體萃取物係為萃取物B。
5. 如申請專利範圍第4項所述之刺槐木層孔菌子實體萃取物，係具有免疫調節之功效。
6. 如申請專利範圍第4項所述之刺槐木層孔菌子實體萃取物，其中該萃取物係包含60~180μg/g總多酚與60-290μg/g總類黃酮。