CN108901611A - 一种牛樟芝培养基及其制备方法和应用 - Google Patents

一种牛樟芝培养基及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种牛樟芝培养基及其制备方法和应用，所述培养基按重量份数包括如下组分：碳源180‑250份、氮源10‑20份、无机盐0.5‑2份、诱导因子0.1‑0.6份、维生素B0.05‑0.15份、琼脂10‑30份和水650‑850份。本发明提供一种培养基及其制备方法和应用，本发明的培养基配方合理，碳源氮源选择利于牛樟芝整个生长阶段的快速增值，同时加入诱导因子，与碳源氮源协同增效，实现牛樟芝的快速人工繁育。

Description

一种牛樟芝培养基及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物领域，具体涉及一种牛樟芝培养基及其制备方法和应用。
背景技术
牛樟芝(Antrodia Camphorate)为非褶菌目多孔菌科薄孔菌属多年生蕈菌类，又名牛樟菇、红樟芝、血灵芝，是我国台湾特有的一种道地药用真菌。牛樟芝具有十分广泛的生物活性，如解醉保肝、抗肿瘤、抗氧化、免疫调节、解毒等，是一种极具开发潜力和应用前景的药用真菌，近年来引起了国内外研究者的关注。但由于其生长缓慢、寄主专一性强等因素，天然产量严重不足已无法满足市场需求，因此通过人工快繁的技术获得牛樟芝成为研究的热点。目前，牛樟芝人工快繁主要集中在对菌体生长和增加活性成分研究两个方面，即传统培养基成分的优选，主要包括碳源、氮源、微量元素；培养条件的优选，如度、湿度、光照、溶氧量和pH值等。目前市场上的人工快繁技术，多采用皿式固体培养。
CN102283019A公开了一种人工快速繁育牛樟芝方法，采用改良马铃薯培养基，包括葡萄糖2～5％(g/ml)；蛋白胨0.2～0.8％g/ml；MgSO40.02～0.05％g/ml；KH2PO41.0～1.5％g/ml；2～5％g/ml麸皮浸出液20ml；2～5％g/ml的红曲浸出液20ml；发酵小麦10～30g/l；琼脂粉2～3％g/ml；以上混均后进行煮沸过滤，取100～120ml加入500ml三角培养瓶中，加盖灭菌，冷却凝固后人工接种牛樟芝种，于23～26℃培养50～70天后可收获子实体。该发明工艺具有营养条件好，生长速度快，少污染，投资小，质量高，但三角培养瓶限制该工艺的工业化生产，产量少，无法满足市场需要，且马铃薯配方的培养基在后期培养中抑制牛樟芝生长速度。
CN106212044A公开一种一种牛樟芝皿式培养方法，所述培养方法包括：(1)培养基制备步骤：按照与水的质量体积比称取5～40g/L的麸皮、5～40g/L的玉米淀粉、5～40g/L的琼脂、1～3g/L的蛋白胨、0.5～4.0g/L的硫酸镁以及0.5～10ml/L的橄榄油，制备牛樟芝种的皿式培养基；(2)接种步骤：在无菌环境下，将牛樟芝种接种于所述培养基上；(3)培养步骤：将接种后的培养基置于恒温恒湿环境中培养3～12个月。该培养基碳源和氮源不利于后期培养的营养摄取，培养周期长，产量低，所得牛樟芝质量不稳定。
因此，提供一种生长快速，适合大规模生产的牛樟芝培养基配方，具有重要的意义和广阔的市场前景。
发明内容
针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种培养基及其制备方法和应用，本发明的培养基配方合理，碳源氮源选择利于牛樟芝整个生长阶段的快速增值，同时加入诱导因子，与碳源氮源协同增效，具有广阔的应用前景和市场价值。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种培养基，所述培养基按重量份数包括如下组分：
本发明中，组合配比碳源和氮源，提高牛樟芝的吸收利用，协同诱导因子，加快牛樟芝的生长速度，促进牛樟芝的成熟，适合工业化生产，满足市场对牛樟芝的需求。常用的马铃薯配方培养基在生长后期会抑制牛樟的快速生长，因此本发明发现谷物碳源有利于牛樟芝的后期生长成熟。
优选地，所述碳源的重量份数为180-250份，例如可以是180份、185份、190份、195份、200份、205份、210份、215份、220份、225份、230份、235份、240份、245份、250份、255份、260份、265份、270份、275份或280份。
优选地，所述氮源的重量份数为10-20份，例如可以是10份、11份、12份、13份、14份、15份、16份、17份、18份、19份或20份。
优选地，所述无机盐的重量份数为0.5-2份，例如可以是0.5份、0.6份、0.7份、0.8份、0.9份、1.0份、1.1份、1.2份、1.3份、1.4份或1.5份。
优选地，所述诱导因子的重量份数为0.1-0.6份，例如可以是0.1份、0.2份、0.3份、0.4份、0.5份或0.6份。
优选地，所述维生素B的重量份数为0.05-0.15份，例如可以是0.05份、0.06份、0.07份、0.08份、0.09份、0.1份、0.11份、0.12份、0.13份、0.14份或0.15份。
优选地，所述琼脂的重量份数为10-30份，例如可以是10份、12份、15份、18份、20份、22份、25份、26份、28份或30份。
优选地，所述水的重量份数为650-850份，例如可以是650份、655份、660份、665份、670份、675份、680份、685份、690份、695份、700份、710份、720份、730份、740份、750份、760份、770份、780份、790份、800份、810份、820份、830份、840份或850份。
优选地，所述碳源包括葡萄糖、牛肉膏、蔗糖、乳糖、大米煮沸滤液或玉米煮沸滤液中的任一种或至少两种的组合，例如可以是葡萄糖和牛肉膏的组合，蔗糖和玉米煮沸滤液的组合，葡萄糖和大米煮沸滤液的组合，葡萄糖、牛肉膏和大米煮沸滤液的组合，优选为葡萄糖和大米煮沸滤液的组合。
本发明发现，牛樟芝培养基中添加所述重量份的谷物碳源可以更好的促进牛樟芝吸收利用，同时促进后期牛樟芝的成熟，加快生长周期。
优选地，所述葡萄糖和大米煮沸滤液的重量比为1:(6-12)，例如可以是1:6、1:7、1:8、1:9或1:10，优选为1:10。
优选地，其特征在于，所述氮源包括黄豆饼粉、酵母膏、蛋白胨、胰蛋白胨或麸皮中的任一种或至少两种的组合，例如可以是黄豆饼粉和酵母膏的组合，酵母膏和胰蛋白胨的组合，蛋白胨和麸皮的组合，优选为胰蛋白胨。
本发明发现，胰蛋白胨作为氮源可显著促进牛樟芝的生长，与其他组分协同增效，加快牛樟芝的生长。
优选地，所述诱导因子包括谷氨酸和/或甘氨酸。
本发明发现，在牛樟芝培养基中添加所述重量份的谷氨酸和甘氨酸作为诱导因子可促进牛樟芝的生长繁育，所得牛樟芝的成分与野生牛樟芝相似度99％以上。
优选地，所述谷氨酸和甘氨酸的重量比为1:(1-3)，例如可以是1:1、1:2或1:3，优选为1:2。
优选地，所述维生素B包括维生素B1和/或维生素B6，优选为维生素B6。
优选地，本发明中最优技术方案为：
第二方面，本发明提供一种制备如第一方面所述的培养基的方法，包括如下步骤：将原料按重量份数混合均匀后，调节培养基pH，灭菌，放至室温备用。
本发明中，所述灭菌为本领域的常规技术手段进行灭菌即可，在此不作特殊限定，本发明采用121℃高压灭菌20min。
优选地，所述pH值为7.2-7.5，例如可以是7.2、7.3、7.4或7.5。
第三方面，本发明提供一种培养牛樟芝的方法，采用如第一方面所述的牛樟芝培养基进行培养。
优选地，所述培养温度为26-30℃，例如可以是26℃、27℃、28℃、29℃或30℃，优选为27-29℃。
优选地，所述培养在黑暗环境下进行。
优选地，所述培养时间为5-15天，例如可以是5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天或15天，优选为7天。
第四方面，本发明提供一种如第三方面所述的方法培养得到的牛樟芝。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明提供一种培养基及其制备方法和应用，本发明的培养基配方合理，碳源氮源选择利于牛樟芝整个生长阶段的快速增值，同时加入诱导因子，与碳源氮源协同增效，实现牛樟芝的快速人工繁育；
(2)本发明中，大米煮熟滤液作为优选谷物碳源可明显促进牛樟芝的成熟，生产过程不需要自然树木原料，生产设备投资低，原料易得，利于实现工业化生产，满足市场需要。
附图说明
图1为本发明实施例1中牛樟芝生长情况；
图2为本发明实施例2中牛樟芝生长情况；
图3为本发明实施例3中牛樟芝生长情况；
图4为本发明实施例4中牛樟芝生长情况；
图5为本发明实施例5中牛樟芝生长情况；
图6为本发明实施例6中牛樟芝生长情况；
图7为本发明实施例7中牛樟芝生长情况；
图8为本发明实施例8中牛樟芝生长情况；
图9为本发明实施例9中牛樟芝生长情况；
图10为本发明对比例1中牛樟芝生长情况；
图11为本发明对比例2中牛樟芝生长情况；
图12为本发明对比例3中牛樟芝生长情况。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例1
一种牛樟芝培养基，按重量份数包括如下组分：
培养方法：
(1)将培养基各组分混合均匀，调节pH至7.2，于121℃高压灭菌20min，放至室温备用；
(2)采用固体皿式培养法，将牛樟芝菌落接种于培养基上，28℃黑暗恒温箱中活化牛樟芝5天，至白色菌丝体；
(3)取已经活化的牛樟芝1cm2，接种于培养基中间位置，设置三个重复组，置于28℃恒温霉菌培养箱，黑暗条件下培养7天。
实施例2
一种牛樟芝培养基，按重量份数包括如下组分：
培养方法：
(1)将培养基各组分混合均匀，调节pH至7.3，于121℃高压灭菌20min，放至室温备用；
(2)采用固体皿式培养法，将牛樟芝菌落接种于培养基上，28℃黑暗恒温箱中活化牛樟芝5天，至白色菌丝体；
(3)取已经活化的牛樟芝1cm2，接种于培养基中间位置，设置三个重复组，置于26℃恒温霉菌培养箱，黑暗条件下培养10天。
实施例3
一种牛樟芝培养基，按重量份数包括如下组分：
培养方法：
(1)将培养基各组分混合均匀，调节pH至7.4，于121℃高压灭菌20min，放至室温备用；
(2)采用固体皿式培养法，将牛樟芝菌落接种于培养基上，28℃黑暗恒温箱中活化牛樟芝5天，至白色菌丝体；
(3)取已经活化的牛樟芝1cm2，接种于培养基中间位置，设置三个重复组，置于30℃恒温霉菌培养箱，黑暗条件下培养15天。
实施例4
一种牛樟芝培养基，按重量份数包括如下组分：
培养方法：
(1)将培养基各组分混合均匀，调节pH至7.5，于121℃高压灭菌20min，放至室温备用；
(2)采用固体皿式培养法，将牛樟芝菌落接种于培养基上，29℃黑暗恒温箱中活化牛樟芝5天，至白色菌丝体；
(3)取已经活化的牛樟芝1cm2，接种于培养基中间位置，设置三个重复组，置于27℃恒温霉菌培养箱，黑暗条件下培养8天。
实施例5
一种牛樟芝培养基，按重量份数包括如下组分：
培养方法：
(1)将培养基各组分混合均匀，调节pH至7.2，于121℃高压灭菌20min，放至室温备用；
(2)采用固体皿式培养法，将牛樟芝菌落接种于培养基上，27℃黑暗恒温箱中活化牛樟芝5天，至白色菌丝体；
(3)取已经活化的牛樟芝1cm2，接种于培养基中间位置，设置三个重复组，置于29℃恒温霉菌培养箱，黑暗条件下培养12天。
实施例6
与实施例1相比，除了不添大米煮沸滤液之外，其他条件与实施例1相同。
实施例7
实施例1相比，除了只添加甘氨酸之外，其他条件与实施例1相同。
实施例8
实施例1相比，除了只添加谷氨酸之外，其他条件与实施例1相同。
实施例9
实施例1相比，除了维生素B的重量份数为0.2g之外，其他条件与实施例1相同。
对比例1
实施例1相比，除了不添加诱导因子之外，其他条件与实施例1相同。
对比例2
实施例1相比，除了不维生素B之外，其他条件与实施例1相同。
对比例3
实施例1相比，除了用土豆煮沸滤液代替大米煮沸滤液之外，其他条件与实施例1相同。
牛樟芝生长情况
将实施例1-9和对比例1-3的牛樟芝培养至第5天测量菌落直径，培养至第7天记录菌落浓密度，++++表示非常密集，+++表示极密集，++表示较密集，+表示密集，-表示稀疏；同时记录菌落前端平整度，+++表示非常平整，++表示较平整，+表示平整，-表示没铺满培养皿，叉状。培养至相应的天数(5-15天)记录菌落颜色，结果见表1和图1-12。
表1牛樟芝生长情况
直径/cm 浓密度 平整度 颜色
实施例1 8.68±0.0035 ++++ +++ 微红色
实施例2 8.49±0.023 +++ +++ 微红色
实施例3 8.55±0.011 +++ ++ 微红色
实施例4 8.52±0.014 +++ +++ 微红色
实施例5 8.53±0.0083 +++ +++ 微红色
实施例6 8.39±0.019 ++ + 白色
实施例7 8.41±0.021 ++++ ++ 微红色
实施例8 8.43±0.033 +++ ++ 微红色
实施例9 8.29±0.046 +++ ++ 微红色
对比例1 7.98±0.015 ++ + 白色
对比例2 7.68±0.011 ++ + 白色
对比例3 5.78±0.050 ++ - 白色
由表1和图1-12可知，比较实施例1与实施例6-9和对比例1-3，碳源、氮源、诱导因子和维生素B协同增效，缺一不可，促进牛樟芝的快速生长繁育，增加菌落浓密度和平整度，谷物碳源尤其是大米煮沸滤液对牛樟芝的生长成熟至关重要，在本发明所述大米煮沸滤液的用量范围内，培养相应的天数时牛樟芝均呈微红色，说明适量的大米煮沸滤液有助于牛樟芝成熟；胰蛋白胨做为氮源可显著增加牛樟芝生长速度，培养至第5天直径即可达到8.68±0.0035，说明胰蛋白胨在其他组分的配合下可促进牛樟芝生长。
综上，本发明组合配比碳源、氮源、诱导因子、维生素B、无机盐等成分，提供一种适用于牛樟芝快速人工繁育的培养基及其方法与应用，本发明的培养基配方合理，碳源氮源选择利于牛樟芝整个生长阶段的快速增值，同时加入诱导因子，与碳源氮源协同增效，实现牛樟芝的快速人工繁育。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加份份、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种牛樟芝培养基，其特征在于，所述培养基按重量份数包括如下组分：
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述碳源包括葡萄糖、牛肉膏、蔗糖、乳糖、大米煮沸滤液或玉米煮沸滤液中的任一种或至少两种的组合，优选为葡萄糖和大米煮沸滤液的组合。
3.根据权利要求1或2所述的培养基，其特征在于，所述葡萄糖和大米煮沸滤液的重量比为1:(6-12)，优选为1:10。
4.根据权利要求1-3任一项所述的培养基，其特征在于，所述氮源包括黄豆饼粉、酵母膏、蛋白胨、胰蛋白胨或麸皮中的任一种或至少两种的组合，优选为胰蛋白胨。
5.根据权利要求1-4任一项所述的培养基，其特征在于，所述诱导因子包括谷氨酸和/或甘氨酸。
6.根据权利要求1-5任一项所述的培养基，其特征在于，所述谷氨酸和甘氨酸的重量比为1:(1-3)，优选为1:2。
7.根据权利要求1-6任一项所述的培养基，其特征在于，所述维生素B包括维生素B1和/或维生素B6，优选为维生素B6。
8.一种制备如权利要求1-7中任一项所述的培养基的方法，其特征在于，包括如下步骤：将原料按重量份数混合均匀后，调节培养基pH，灭菌，放至室温备用；
优选地，所述pH值为7.2-7.5。
9.一种培养牛樟芝的方法，其特征在于，采用如权利要求1-7中任一项所述的培养基进行培养；
优选地，所述培养温度为26-30℃，优选为27-29℃；
优选地，所述培养在黑暗环境下进行；
优选地，所述培养时间为5-15天，优选为7天。
10.一种如权利要求9所述的方法培养得到的牛樟芝。
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