CN108676733A - 裂蹄木层孔菌菌丝体的培养方法及其在保健品上的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种裂蹄木层孔菌的菌丝体培养方法并以此菌丝体制备保健品的流程,所述培养方法的步骤包括裂蹄木层孔菌菌种活化、产孢子培养、种子萌发及菌丝体培养,在产孢子培养阶段应用氨基酸、环腺苷酸及维生素作为生长因子以促进孢子的大量形成,在菌丝体培养阶段使用植物木屑粗粉的混合粉末作为培养基的成分之一,模拟裂蹄木层孔菌的野外生长环境,植物木屑粗粉提供了大量的粗纤维和粗蛋白,提供了适宜菌丝生长的固体基质,并有助于细胞分解利用。经过培养可获得质优、量足的菌丝体,为后续保健营养品的制备创造良好的物质条件。

Description

裂蹄木层孔菌菌丝体的培养方法及其在保健品上的应用
技术领域
本发明涉及真菌培养领域,具体涉及裂蹄木层孔菌的菌丝体培养方法并以此菌丝体制备保健品的流程。
背景技术
裂蹄木层孔菌的生长环境的破坏日益严重,而且由于裂蹄木层孔菌生理状态的特殊性和复杂性,生长周期又很长,需3~4年,并且其生长对外部环境有一定的要求,故野生的成熟子实体很少,而人工培养很困难,条件苛刻,很大程度上限制了裂蹄木层孔菌的利用和开发。
为大量开发裂蹄木层孔菌资源,科学界将研究方向转向裂蹄木层孔菌菌丝体,因此,如何快速繁育裂蹄木层孔菌菌丝体是此领域的一个重要的研究课题。菌丝体含有丰富的多糖、糖蛋白及呋喃衍生物,裂蹄木层孔菌多糖具有降血压、降血脂的功效,在保健制剂的应用较为广泛。同时菌丝体的培育时间相比子实体的培育时间缩短了很多,菌丝体的培育周期短,人工成本耗费低,适用于工业化大生产。而目前要解决的技术问题是如何通过高效快速地繁育从而获得大量裂蹄木层孔菌菌丝体。
发明内容
为解决上述技术问题,本发明提供了通过发酵培养获得裂蹄木层孔菌菌丝体的方法和利用所述菌丝体制备具有降血糖、降血脂功效的保健营养品。
一种通过发酵培养获得裂蹄木层孔菌菌丝体的方法,其技术方案如下。
菌种活化:取新鲜的裂蹄木层孔菌斜面菌种,在无菌条件下挑取少量菌种转接到马铃薯葡萄糖固体培养基上进行活化,于26~38℃下培养4~7天。
产孢子培养:取已活化的菌种,在无菌条件下按2%~15%的接种量接种于已高温灭菌的产孢子培养基,于26~38℃下培养6~9天。所述产孢子培养基的组成为葡萄糖0.06%,玉米淀粉2%~6%,麸皮3%~5%,磷酸二氢钾和硫酸镁各0.03%~0.9%,氨基酸0.01%~0.2%,环腺苷酸0.06%~0.15%,维生素0.08%~0.12%,琼脂1.5%,余量为水。其中,维生素为维生素B1、维生素B12、维生素B6的等量组合物,氨基酸为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、L-异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、L-谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸或组氨酸中的其中一种。经过产孢子培养的步骤,可获得大量分生孢子。取培养终止的孢子培养基,制备孢子悬浮液,用于后续操作。
种子萌发:取上述经过培养后的孢子培养基,在无菌条件下按2%~15%的接种量将孢子悬浮液接种于已高温灭菌的种子培养基,于26~38℃下在恒温摇床中以150~200rpm震荡培养6~9天。所述种子培养基的组成为葡萄糖0.1%~2%,玉米淀粉5%~8%,麸皮6%~9%,硫酸铵0.05%~0.1%,磷酸二氢钾0.4%~0.6%,硫酸镁0.3%,余量为水。分生孢子在种子培养基中萌发、生长,并长成强壮的菌丝。培养终止即得菌丝悬液。
菌丝体培养:在无菌条件下将菌丝悬液按11%~18%的接种量接入已高温灭菌的菌丝体培养基中,于26~38℃下恒温培养,在第12~16天终止培养,收集培养基和菌丝体。所述菌丝体培养基的组成为葡萄糖0.1%~2%,玉米淀粉5%~8%,麸皮6%~9%,硫酸铵0.05%~0.1%,磷酸二氢钾0.4%~0.6%,硫酸镁0.3%,杨树木屑粗粉、栎树木屑粗粉和丁香枝叶粗粉按1~3: 1~2:1~2的重量比混合的粉末22%~34%,桑枝粉、玉米须粉、梧桐叶粉、赤芍粉按2.3~3.5:3.8~5.2:1.6~2.2:1.5~1.9的重量比混合的粉末15%~38%,余量为水。
其中,杨树木屑粗粉、栎树木屑粗粉和丁香枝叶粗粉的制备方法是分别将杨树木屑、栎树木屑或丁香枝叶用烘箱恒温干燥,设置干燥温度为70~95℃,烘干时间为1h~3h,烘干完毕后取出,于粉碎机中粉碎至颗粒均可通过30~80目筛,即颗粒粒径为180微米~550微米。桑枝粉、玉米须粉、梧桐叶粉、赤芍粉的制备方法是分别将桑枝、玉米须、梧桐叶或赤芍用烘箱恒温干燥,设置干燥温度为70~95℃,烘干时间为1h~3h,烘干完毕后取出,于粉碎机中粉碎至颗粒均可通过60~120目筛,即颗粒粒径为120微米~250微米。
经过菌丝体培养阶段得到裂蹄木层孔菌菌丝体和固体培养基的混合培养物。
本发明还提供了含有上述混合培养物的保健营养品,其制备方法是将混合培养物进行高温蒸煮后使用滤袋过滤,滤液即为本保健营养品。其中,蒸煮温度为100℃~121℃,蒸煮时间为20~40min,滤袋过滤精度为25微米~750微米。
本发明提供了裂蹄木层孔菌菌丝体培养的方法和步骤,其有益效果在于,在菌种活化阶段,处于休眠状态的保藏菌种在马铃薯固体培养基中生理活性得到恢复,与此同时恢复其优良的生产性能,为后续扩大培养奠定基础;在产孢子阶段,所提供的培养基营养成分相对较少,此目的在于促使菌体分生出更多的分生孢子,而且添加了维生素、氨基酸和环腺苷酸等生长因子,通过实验数据的分析,生长因子的添加对分生孢子的形成有显著的促进作用,经过此阶段可获得大量的分生孢子,为后续获得大量菌丝提供物质基础;在种子萌发阶段,采用液体种子培养基,并使用摇瓶培养的方式,有利于增大培养基与空气接触的频率,增加溶氧量,同时震荡培养使营养成分均匀分布,使营养成分得到充分的利用,在此阶段,培养基营养丰富,孢子在适宜的环境下萌发,成长为具有旺盛生命力的菌丝;在菌丝体的扩大培养阶段,创造性地将培养基模拟成裂蹄木层孔菌的野外生长环境,使用杨树木屑粗粉、栎树木屑粗粉和丁香枝叶粗粉,以及桑枝粗粉、玉米须粗粉、梧桐叶粗粉、赤芍粗粉的混合粉末,上述植物枝叶的粗粉提供了大量的粗纤维和粗蛋白,提供了适宜菌丝生长的固体基质,而且粉末有助于细胞分解利用,为菌丝生长提供便利。
经过上述的培养步骤和流程,可获得质优、量足的菌丝体,为后续保健营养品的制备创造良好的物质条件。
具体实施方式
为了便于本领域技术人员理解,下面结合具体实施例对本发明作进一步详细的阐述。
实施例1
取新鲜的裂蹄木层孔菌斜面菌种,在无菌条件下挑取少量菌种转接到马铃薯葡萄糖固体培养基上进行活化,于28℃下培养6天。
取上述已活化的菌种,在无菌条件下按13%的接种量接种于已高温灭菌的产孢子培养基,于28℃下培养8天。所述产孢子培养基的组成为葡萄糖0.06%,玉米淀粉5%,麸皮5%,磷酸二氢钾和硫酸镁各0.65%,苯丙氨酸0.15%,环腺苷酸0.09%,维生素B1、维生素B12、维生素B6的等量组合物0.10%,琼脂1.5%,余量为水。经过产孢子培养后即获得大量分生孢子。取培养终止的孢子培养基,制备孢子悬浮液,用于后续操作。
取上述经过培养后的孢子培养基,在无菌条件下按13%的接种量将孢子悬浮液接种于已高温灭菌的种子培养基,于28℃下在恒温摇床中以180rpm震荡培养9天。所述种子培养基的组成为葡萄糖0.75%,玉米淀粉7%,麸皮7%,硫酸铵0.08%,磷酸二氢钾0.55%,硫酸镁0.3%,余量为水。培养终止即得菌丝悬液。
在无菌条件下将菌丝悬液按13%的接种量接入已高温灭菌的菌丝体培养基中,于28℃下恒温培养,在第15天终止培养,收集培养基和菌丝体。所述菌丝体培养基的组成为葡萄糖0.75%,玉米淀粉7%,麸皮7%,硫酸铵0.08%,磷酸二氢钾0.55%,硫酸镁0.3%,杨树木屑粗粉、栎树木屑粗粉和丁香枝叶粗粉按2: 2:1的重量比混合的粉末32%,桑枝粉、玉米须粉、梧桐叶粉、赤芍粉按2.5:4.0:1.8:1.6的重量比混合的粉末28%,余量为水。
其中,分别将杨树木屑、栎树木屑或丁香枝叶用烘箱恒温干燥,设置干燥温度为75℃,烘干时间为2h,烘干完毕后取出,于粉碎机中粉碎至颗粒均可通过60目筛,即得粗粉。分别将桑枝、玉米须、梧桐叶或赤芍用烘箱恒温干燥,设置干燥温度为75℃,烘干时间为2h,烘干完毕后取出,于粉碎机中粉碎至颗粒均可通过100目筛,即得粉末。
菌丝体培养阶段终止后得到裂蹄木层孔菌菌丝体和固体培养基的混合培养物。
将上述混合培养物进行高温蒸煮后使用滤袋过滤,滤液进行灌装、密封即得到本保健营养品。其中,设置蒸煮温度为121℃,蒸煮时间为40min,滤袋过滤精度为100微米。
实施例2
取新鲜的裂蹄木层孔菌斜面菌种,在无菌条件下挑取少量菌种转接到马铃薯葡萄糖固体培养基上进行活化,于32℃下培养7天。
取已活化的菌种,在无菌条件下按14%的接种量接种于已高温灭菌的产孢子培养基,于32℃下培养9天。所述产孢子培养基的组成为葡萄糖0.06%,玉米淀粉4%,麸皮5%,磷酸二氢钾0.45%和硫酸镁0.50%,L-谷氨酰胺0.18%,环腺苷酸0.12%,维生素B1、维生素B12、维生素B6的等量组合物0.09%,琼脂1.5%,余量为水。取培养终止的孢子培养基,制备孢子悬浮液,用于后续操作。
取上述经过培养后的孢子培养基,在无菌条件下按14%的接种量将孢子悬浮液接种于已高温灭菌的种子培养基,于32℃下在恒温摇床中以180rpm震荡培养9天。所述种子培养基的组成为葡萄糖1.5%,玉米淀粉6%,麸皮9%,硫酸铵0.1%,磷酸二氢钾0.6%,硫酸镁0.3%,余量为水。培养终止即得菌丝悬液。
在无菌条件下将菌丝悬液按14%的接种量接入已高温灭菌的菌丝体培养基中,于32℃下恒温培养,在第16天终止培养,收集培养基和菌丝体。所述菌丝体培养基的组成为葡萄糖1.5%,玉米淀粉6%,麸皮9%,硫酸铵0.1%,磷酸二氢钾0.6%,硫酸镁0.3%,杨树木屑粗粉、栎树木屑粗粉和丁香枝叶粗粉按2: 1:1的重量比混合的粉末30%,桑枝粉、玉米须粉、梧桐叶粉、赤芍粉按3.0:4.8:1.6:1.8的重量比混合的粉末25%,余量为水。
其中,分别将杨树木屑、栎树木屑或丁香枝叶用烘箱恒温干燥,设置干燥温度为75℃,烘干时间为2h,烘干完毕后取出,于粉碎机中粉碎至颗粒均可通过60目筛,即得粗粉。分别将桑枝、玉米须、梧桐叶或赤芍用烘箱恒温干燥,设置干燥温度为75℃,烘干时间为2h,烘干完毕后取出,于粉碎机中粉碎至颗粒均可通过100目筛,即得粉末。
菌丝体培养阶段终止后得到裂蹄木层孔菌菌丝体和固体培养基的混合培养物。
将上述混合培养物进行高温蒸煮后使用滤袋过滤,滤液进行灌装、密封即得到本保健营养品。其中,设置蒸煮温度为121℃,蒸煮时间为30min,滤袋过滤精度为250微米。
对照例
在产孢子培养阶段,所使用的培养基不添加任何氨基酸、维生素B1、维生素B12、维生素B6 、环腺苷酸等生长因子,而培养基其他成分及含量不变,培养方式和条件亦保持不变,以此作为对照组,以孢子产量为指标与实施例1和实施例2进行对比,用以说明上述外源生长因子的添加对孢子产量的影响。在对比实验中,取培养终止的产孢子培养基制备孢子悬浮液,计数,并取孢子悬浮液的100倍稀释液于280nm波长下测定吸光度值,其结果如下表所示。其中,接种的已活化的菌种产自同一批,菌种活性均匀一致。
组别 孢子产量/(107个/mL) 吸光度值
实施例1 2.06 1.545
实施例2 1.83 1.133
对照例 0.79 0.652 。
由上述结果看出,氨基酸、维生素和环腺苷酸等生长因子的添加对孢子产量有显著的提高,说明生长因子能促进孢子的形成,这对后续培养中菌丝体的大量获得产生积极的影响。
上述实施例仅供说明本发明之用,而并非是对本发明的限制,有关技术领域的普通技术人员,在不脱离本发明范围的情况下,还可以作出各种变化和变型,因此所有等同的技术方案也应属于本发明的范畴,本发明的专利保护范围应由各权利要求限定。

Claims (6)

1.一种裂蹄木层孔菌菌丝体的培养方法,包括以下步骤:
(1)菌种活化:取新鲜的裂蹄木层孔菌斜面菌种,在无菌条件下挑取少量菌种转接到马铃薯葡萄糖固体培养基上进行活化,于26~38℃下培养4~7天;
(2)产孢子培养:取步骤(1)已活化的菌种,在无菌条件下按2%~15%的接种量接种于已高温灭菌的产孢子培养基,于26~38℃下培养6~9天,取培养终止的孢子培养基,制备孢子悬浮液,用于后续操作;
(3)种子萌发:在无菌条件下按2%~15%的接种量将步骤(2)得到的孢子悬浮液接种于已高温灭菌的种子培养基,于26~38℃下在恒温摇床中以150~200rpm震荡培养6~9天,培养终止即得菌丝悬液;
(4)菌丝体培养:在无菌条件下将步骤(3)得到的菌丝悬液按11%~18%的接种量接入已高温灭菌的菌丝体培养基中,于26~38℃下恒温培养,在第12~16天终止培养,收集培养基和菌丝体;
其特征在于,所述产孢子培养基的组成为葡萄糖0.06%,玉米淀粉2%~6%,麸皮3%~5%,磷酸二氢钾和硫酸镁各0.03%~0.9%,氨基酸0.01%~0.2%,环腺苷酸0.06%~0.15%,维生素0.08%~0.12%,琼脂1.5%,余量为水,其中,维生素为维生素B1、维生素B12、维生素B6的等量组合物,氨基酸为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、L-异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、L-谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸或组氨酸中的其中一种;
所述种子培养基的组成为葡萄糖0.1%~2%,玉米淀粉5%~8%,麸皮6%~9%,硫酸铵0.05%~0.1%,磷酸二氢钾0.4%~0.6%,硫酸镁0.3%,余量为水;
所述菌丝体培养基的组成为葡萄糖0.1%~2%,玉米淀粉5%~8%,麸皮6%~9%,硫酸铵0.05%~0.1%,磷酸二氢钾0.4%~0.6%,硫酸镁0.3%,杨树木屑粗粉、栎树木屑粗粉和丁香枝叶粗粉按1~3: 1~2:1~2的重量比混合的粉末22%~34%,桑枝粗粉、玉米须粗粉、梧桐叶粗粉、赤芍粗粉按2.3~3.5:3.8~5.2:1.6~2.2:1.5~1.9的重量比混合的粉末15%~38%,余量为水。
2.根据权利要求1所述的裂蹄木层孔菌菌丝体的培养方法,其特征在于,所述产孢子培养基的组成为葡萄糖0.06%,玉米淀粉4~5%,麸皮5%,磷酸二氢钾0.45%~0.65%,硫酸镁0.50%~0.65%,苯丙氨酸0.15%,环腺苷酸0.09%~0.12%,维生素B1、维生素B12、维生素B6的等量组合物0.09%~0.10%,琼脂1.5%,余量为水;所述种子培养基的组成为葡萄糖0.75%~1.5%,玉米淀粉6%~7%,麸皮7%~9%,硫酸铵0.08%~0.10%,磷酸二氢钾0.55%~0.60%,硫酸镁0.3%,余量为水;所述菌丝体培养基的组成为葡萄糖0.75%~1.5%,玉米淀粉6%~7%,麸皮7%~9%,硫酸铵0.08%~0.10%,磷酸二氢钾0.55%~0.60%,硫酸镁0.3%,杨树木屑粗粉、栎树木屑粗粉和丁香枝叶粗粉按2:1~2:1的重量比混合的粉末30%~32%,桑枝粉、玉米须粉、梧桐叶粉、赤芍粉按2.5~3.0:4.0~4.8:1.6~1.8:1.6~1.8的重量比混合的粉末25%~28%,余量为水。
3.根据权利要求1所述的裂蹄木层孔菌菌丝体的培养方法,其特征在于,所述杨树木屑粗粉、栎树木屑粗粉和丁香枝叶粗粉的制备方法是分别将杨树木屑、栎树木屑或丁香枝叶用烘箱恒温干燥,设置干燥温度为70~95℃,烘干时间为1h~3h,烘干完毕后取出,于粉碎机中粉碎至颗粒均可通过30~80目筛,即颗粒粒径为180微米~550微米;所述桑枝粉、玉米须粉、梧桐叶粉、赤芍粉的制备方法是分别将桑枝、玉米须、梧桐叶或赤芍用烘箱恒温干燥,设置干燥温度为70~95℃,烘干时间为1h~3h,烘干完毕后取出,于粉碎机中粉碎至颗粒均可通过60~120目筛,即颗粒粒径为120微米~250微米。
4.根据权利要求3所述的裂蹄木层孔菌菌丝体的培养方法,其特征在于,在所述杨树木屑粗粉、栎树木屑粗粉和丁香枝叶粗粉的制备方法中,设置干燥温度为75℃,烘干时间为2h,烘干完毕后取出,于粉碎机中粉碎至颗粒均可通过60~80目筛;在所述桑枝粉、玉米须粉、梧桐叶粉、赤芍粉的制备方法中,设置干燥温度为75℃,烘干时间为2h,烘干完毕后取出,于粉碎机中粉碎至颗粒均可通过100~120目筛。
5.由权利要求1~4任一项所述的裂蹄木层孔菌菌丝体的培养方法中的步骤(4)的菌丝体培养得到的菌丝体培养基和裂蹄木层孔菌菌丝体的混合培养物。
6.一种含有权利要求5所述混合培养物的降血糖、降血脂保健品,其特征在于,其制备方法是将所述混合培养物进行高温蒸煮后使用滤袋过滤,滤液进行灌装、密封即得到所述保健品,其中,蒸煮温度为100℃~121℃,蒸煮时间为20~40min,滤袋过滤精度为25微米~750微米。
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