CN114010548B - 层孔菌深层发酵浓缩液与菌体提取物组合物及其制备方法、应用 - Google Patents
层孔菌深层发酵浓缩液与菌体提取物组合物及其制备方法、应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提出层孔菌深层发酵浓缩液与菌体提取物组合物及其制备方法、应用，属于生物护肤品技术领域。该方法包括如下步骤：1)制备一级液体发酵种子；2)制备二级液体发酵种子；3)二级液体发酵种子分散后，接种到新的液体培养基中第三发酵培养，发酵结束后，对三级液体发酵产物进行离心，分别收集菌体、菌体的发酵液；4)向上述菌体中加入无菌超纯水混悬后，加入保护剂，匀浆，热裂解，过滤，收集菌体提取液；真空旋转蒸发浓缩，得菌体提取物；5)将菌体的发酵液过滤除菌后，真空旋转蒸发浓缩，得深层发酵浓缩液；6)将菌体提取物、上述深层发酵浓缩液混合，得组合物。所得组合物具有抗氧化，抗炎症，促胶原蛋白生成，延缓皮肤衰老的作用。
Description
技术领域
本发明属于生物护肤品技术领域，具体涉及层孔菌深层发酵浓缩液与菌体提取物组合物及其制备方法、应用。
背景技术
真菌是一类广泛分布于陆地和水体，依靠分解现有的有机物或活的动植物吸收营养物质的真核生物。自然界中的绝大多数真菌有机体是由菌丝体组成的，它们通过产生大量孢子进行有性或无性繁殖，并在适宜的条件下生长为菌丝体。随后，这些菌丝体分化成不同形状的子实体，成为自然界中可观察到的真菌类生物。
真菌具有极高的营养价值，在我国具有悠久的食用和药用价值。这是因为菌中含有大量蛋白质，并含有多种维生素、多糖和一些微量元素，对人体具有良好的药理作用。随着人们对健康和天然成分的追求，一些植物来源的具有不同药理功效的真菌逐渐被发现并被加工成产品，例如，猴头菌制成的“猴菇片”具有的抗炎功效使其可以被用来治疗慢性胃炎、胃溃疡等疾病。除此之外，研究表明真菌产生的次生代谢产物中的活性成分还具有抗肿瘤，抗氧化的药理作用，为真菌的应用开阔了前景。
药用拟层孔菌是一类多生长于树干表面，子实体木栓质至木质的植物真菌，具有祛风除湿，消肿止痛的疗效，可以用来治疗哮喘、风湿性关节炎、牙周炎和水肿等疾病，同时还具有抗肿瘤的功效。发酵工程是充分利用真菌次生代谢产物的一种生产手段，目前多种层孔菌次生代谢产物在护肤品行业中的应用价值尚未被充分发掘。
发明内容
本发明提供的高温诱导的层孔菌深层发酵浓缩液与菌体提取物组合物及其制备方法、应用，使护肤品具有抗氧化，抗炎症，促进胶原蛋白生成，延缓皮肤衰老的护肤功效。
本发明提出一种层孔菌深层发酵浓缩液与菌体提取物组合物的制备方法，包括如下步骤：
1)活化后的层孔菌菌株接种到液体培养基中，28℃第一发酵培养，得一级液体发酵种子；
2)上述一级液体发酵种子分散后，接种到新的液体培养基中第二发酵培养，第二发酵培养的温度由28℃升至30℃，得二级液体发酵种子；
3)上述二级液体发酵种子分散后，接种到新的液体培养基中第三发酵培养，第三发酵培养的温度由30℃升至32℃，发酵结束后，对三级液体发酵产物进行离心，分别收集菌体、菌体的发酵液；
4)向上述菌体中加入无菌超纯水混悬后，加入保护剂，匀浆，热裂解，过滤，收集菌体提取液；真空旋转蒸发浓缩，得菌体提取物；
5)将上述菌体的发酵液过滤除菌后，真空旋转蒸发浓缩，得深层发酵浓缩液；
6)将上述菌体提取物、上述深层发酵浓缩液混合，得组合物。
进一步地，所述层孔菌包括裂蹄层孔菌、松针层孔菌中至少一种。
进一步地，步骤1)中，第一发酵培养的时间为7d；第一发酵培养的转速为150r/min；
步骤2)中，第二发酵培养的时间为7d；第二发酵培养的转速为150r/min；
步骤3)中，第三发酵培养的时间为7d；第三发酵培养的转速为150r/min。
进一步地，步骤1)、步骤2)、步骤3)中所述液体培养基，由包括如下原料制备而得：麦芽糖15g/L、蔗糖15g/L、酵母浸粉15g/L、蛋白胨15g/L、磷酸二氢钾1g/L、七水硫酸镁0.5g/L、氯化钙0.5g/L、维生素B1 10mg/L、桦木皮发酵浸提物10mL/L、栎树皮发酵浸提物10mL/L，松树皮发酵物浸提物20mL/L。
进一步地，步骤4)中，所述保护剂为海藻糖；
步骤4)中，无菌超纯水的加入质量为菌体的2-20倍。
进一步地，步骤4)、步骤5)中，真空旋转蒸发浓缩的真空度为0.094-0.096Mpa。
进一步地，步骤6)中，深层发酵浓缩液、菌体提取物的体积比为10％～90％：10％～90％；
优选的，步骤6)中，深层发酵浓缩液和菌体提取物的体积比为30％：70％。
本发明还提出上述任一所述的制备方法制备得到的深层发酵浓缩液与菌体提取物的组合物。
本发明还提出上述任一所述的深层发酵浓缩液与菌体提取物的组合物在护肤品中的应用。
进一步地，所述护肤品具有抗氧化，抗炎症，促进胶原蛋白生成，延缓皮肤衰老功能。
本发明具有以下优势：
本发明提出的层孔菌深层发酵浓缩液与菌体提取物组合物及其制备方法，通过高温诱导方法制备得到层孔菌的深层发酵浓缩液与菌体提取物组合物，将其用于护肤品制备中，不仅具有抗氧化，抗炎症，促胶原蛋白生成，延缓皮肤衰老或护肤等功效，而且使用起来更加安全，更加天然。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为本发明实施例高温诱导层孔菌发酵浓缩液或菌体提取物对超氧化物歧化酶活力的影响(P*<0.05；**P<0.01。①：空白对照组；②：UV模型组；③：高温诱导层孔菌深层发酵浓缩液组；④：高温诱导层孔菌菌体提取物组；⑤：未经诱导层孔菌深层发酵浓缩液组；⑥：未经诱导层孔菌菌体提取物组)。
图2为本发明实施例高温诱导层孔菌发酵浓缩液或菌体提取物对抗脂质氧化水平的影响(P*<0.05；**P<0.01。①：空白对照组；②：UV模型组；③：高温诱导层孔菌深层发酵浓缩液组；④：高温诱导层孔菌菌体提取物组；⑤：未经诱导层孔菌深层发酵浓缩液组；⑥：未经诱导层孔菌菌体提取物组)。
图3为本发明实施例不同处理方式中超氧化物歧化酶活力检测(**P<0.01。①：空白对照组；②：UV模型组；③：组合物1处理组；④：组合物2处理组；⑤：组合物3处理组；⑥：组合物4处理组；⑦：组合物5处理组)。
图4为本发明实施例高温诱导层孔菌深层发酵浓缩液及菌体提取物组合物对细胞抗脂质氧化的影响(*P<0.05；**P<0.01。①：空白对照组；②：UV模型组；③：组合物1处理组；④：组合物2处理组；⑤：组合物3处理组；⑥：组合物4处理组；⑦：组合物5处理组)。
图5为本发明实施例高温诱导层孔菌深层发酵浓缩液及菌体提取物组合物对MMPsmRNA表达的影响(**P<0.01)。
图6为本发明实施例高温诱导层孔菌深层发酵浓缩液及菌体提取物组合物对IL-1β、IL-6表达的影响(**P<0.01)。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
现有技术中，层孔菌的发酵培养及如何获得高活性或者独特活性的层孔菌提取物研究较少。生物体在抗逆环境中，如高温、高盐碱环境，会产生高药理活性的次生代谢产物，如多糖，黄酮类或三萜类化合物。本发明从改变菌种生长的温度条件入手，找到高温诱导获得具有活性更强的层孔菌次生代谢产物的工艺，并探究其作为护肤品原料的应用。
本发明一实施例提出一种高温诱导层孔菌深层发酵浓缩液与菌体提取物组合物的制备方法，包括如下步骤：
1)活化后的层孔菌菌株接种到液体培养基中，28℃第一发酵培养，得一级液体发酵种子；
2)上述一级液体发酵种子分散后，接种到新的液体培养基中第二发酵培养，第二发酵培养的温度由28℃升至30℃，得二级液体发酵种子；
3)上述二级液体发酵种子分散后，接种到新的液体培养基中第三发酵培养，第三发酵培养的温度由30℃升至32℃，发酵结束后，对三级液体发酵产物进行离心，分别收集菌体、菌体的发酵液；
4)向上述菌体中加入无菌超纯水混悬后，加入保护剂，匀浆，热裂解，过滤，收集菌体提取液；真空旋转蒸发浓缩，得菌体提取物；
5)将上述菌体的发酵液过滤除菌后，真空旋转蒸发浓缩，得深层发酵浓缩液；
6)将上述菌体提取物、上述深层发酵浓缩液混合，得组合物。
本发明实施例提出的层孔菌发酵方法，在分级发酵过程中，采用逐级高温诱导方式，可有效提高层孔菌发酵产物的抗氧化活性等生物活性。该方法操作简单，便于控制，具有极高的应用价值。
本发明一实施例中，所述层孔菌包括裂蹄层孔菌、松针层孔菌中至少一种。裂蹄层孔菌的菌种编号为BNCC118832，松针层孔菌的菌种编号为BNCC114700。本发明所选用的层孔菌均购自北纳生物公司。
本发明一实施例中，步骤1)和步骤2)中所使用的液体培养基，包括：麦芽糖15g/L、蔗糖15g/L、酵母浸粉15g/L、蛋白胨15g/L、磷酸二氢钾1g/L、七水硫酸镁0.5g/L、氯化钙0.5g/L、维生素B1 10mg/L、桦木皮发酵浸提物10mL/L、栎树皮发酵浸提物10mL/L，松树皮发酵物浸提物20mL/L。液体培养基中特别添加桦木皮发酵浸提物、栎树皮发酵浸提物，松树皮发酵物浸提物等，更有利于层孔菌的培养并且增加次级代谢产物的种类，提高发酵产物的活性。
本发明一实施例中，步骤1)中，第一发酵培养的时间为7d；第一发酵培养的转速为150r/min。
本发明一实施例中，步骤2)中，第二发酵培养的时间为7d；第二发酵培养的转速为150r/min。接种量为10％，以体积计算。
本发明一实施例中，步骤3)中，第三发酵培养的时间为7d；第三发酵培养的转速为150r/min。接种量为10％，以体积计算。
本发明一实施例中，步骤4)中，所述保护剂为海藻糖。保护剂在体系中的质量浓度为5％-20％。
本发明一实施例中，步骤4)中，无菌超纯水的加入质量为菌体的2-20倍。
本发明一实施例中，步骤4)、步骤5)中，真空旋转蒸发浓缩的真空度为0.094-0.096Mpa。
本发明一实施例中，步骤6)中，深层发酵浓缩液、菌体提取物的体积比为10％～90％：10％～90％。具体而言，步骤6)中，深层发酵浓缩液和菌体提取物可以以不同的体积比配制成不同的组合物。如组合物1:10％深层发酵浓缩液+90％菌体提取物。组合物2：30％深层发酵浓缩液+70％菌体提取物。组合物3：50％深层发酵浓缩液+50％菌体提取物。组合物4：70％深层发酵浓缩液+30％菌体提取物。组合物5：90％深层发酵浓缩液+10％菌体提取物。
优选的，步骤6)中，深层发酵浓缩液和菌体提取物的体积比为30％：70％。将高温诱导后的层孔菌深层发酵液和菌体提取物以不同比例配制成组合物，抗氧化活性检测证明，当组合物为30％深层发酵浓缩液+70％菌体提取物时，抗氧化活性最好。
本发明一实施例还提出上述任一所述制备方法制备得到的深层发酵浓缩液与菌体提取物的组合物。高温诱导层孔菌深层发酵浓缩液及菌体提取物组合物是一种安全性高，且具有防止UV辐射引起的胶原蛋白降解，发挥抗氧化、抗衰老等作用的护肤品新原料。
本发明一实施例还提出上述任一所述深层发酵浓缩液与菌体提取物的组合物在护肤品中的应用。
进一步地，所述组合物具有抗氧化，抗炎症，促进胶原蛋白生成，延缓皮肤衰老功能。包含上述组合物的护肤品也可具有抗氧化，抗炎症，促进胶原蛋白生成，延缓皮肤衰老功能。
进一步地，所述护肤品以水、精华液、凝胶、乳液、护肤液、霜、溶液、悬浮液、无水生成物、面膜、粉末或明胶中至少一种形式存在。
进一步地，所述护肤品还可以包括其他辅料。如防腐剂(苯甲醇、苯甲酸、水杨酸、等硼酸、山梨酸)，保湿剂(甘油、丙二醇、聚乙二醇等)等。
下面将结合实施详细阐述本发明。如无特殊说明，所用试剂都来源于市售商品。
实施例1高温诱导层孔菌深层发酵浓缩液、菌体提取物、及二者组合物的制备方法(以蹄裂层孔菌为例)，包括如下步骤：
步骤1：活化后的层孔菌(蹄裂层孔菌)菌株接种到含麦芽糖，酵母浸粉，蛋白胨，KH2PO4和CaCl2的液体培养基中，28℃，150r/min培养7d，得到一级液体发酵种子。
步骤2：一级液体发酵种子分散后，按10％接种量接到新的液体种子培养基中，发酵温度由28℃缓慢升至30℃，150r/min培养7d，得二级液体发酵种子。
步骤3：二级液体发酵种子分散后按10％接种量接到新的供试培养基中，发酵温度由30℃缓慢升至32℃，150r/min培养7d，得三级液体发酵产物；达到发酵终点后，发酵液进行离心收集菌体、菌体的发酵液。
制备菌体提取物：
步骤4：将步骤3离心所得菌体加入5倍体积的无菌超纯水混悬，加入质量浓度15％的海藻糖作为保护剂，将所得的温度诱变的层孔菌进行菌体破碎匀浆，并在90℃进行热裂解，过滤，收集菌体提取液。菌体提取液在真空度为0.096MPa的条件下进行真空旋转蒸发，得层孔菌深层发酵的菌体提取物(菌体提取物发酵浓缩液)。
制备层孔菌深层发酵浓缩液：
步骤5：将步骤3所得的菌体的发酵液在真空度为0.096MPa的条件下进行真空旋转蒸发，得到高温诱导层孔菌深层发酵浓缩液。
制备组合物：
步骤6：将步骤5所得的发酵浓缩液和菌体提取物以不同的体积比配制成组合物1:10％发酵浓缩液+90％菌体提取物；组合物2：30％发酵浓缩液+70％菌体提取物；组合物3：50％发酵浓缩液+50％菌体提取物；组合物4：70％发酵浓缩液+30％菌体提取物；组合物5：90％发酵浓缩液+10％菌体提取物。
对比例1未经高温诱导层孔菌深层发酵浓缩液、菌体提取物、及二者组合物的制备方法
同实施例1，不同之处在于，步骤1、步骤2、步骤3中发酵培养的温度均为28℃。
试验例1考察高温诱导对实施例1所得层孔菌深层发酵浓缩液、实施例1所得菌体提取物抗氧化活力影响
检测方法：
本部分实验选用人永生化角质形成细胞(HaCaT)进行实验，将角质形成细胞接种于6孔板，铺板密度为1×105cells/孔，过夜待细胞贴壁后，将细胞孔分为对照组、UV模型组和实验组。
对照组正常换液；UV模型组的HaCaT细胞在没有塑料盖的PBS(磷酸盐缓冲液)中以10J/cm2剂量的UV照射，随后，细胞在补充有10％FBS(胎牛血清)的新鲜DMEM(Dulbecco改良的Eagle培养基)培养液中；实验组的细胞在UV照射后换分别含有实施例1所得高温诱导的层孔菌深层发酵浓缩液，实施例1所得高温诱导的层孔菌菌体提取物，对比例1所得未经诱导的层孔菌深层发酵浓缩液、对比例1所得未经诱导的层孔菌菌体提取物的完全培养基，上述细胞在37℃、5％CO2恒温恒湿培养箱继续培养24h后，去除细胞培养液，加入SOD(超氧化物歧化酶)样品制备液，充分裂解细胞，4℃约12,000g离心3-5分钟，取上清作为待测样品。按照SOD检测试剂盒要求，配制反应工作液，向96孔板中依次加入待测样品和其它各种溶液。37℃孵育30分钟。用多功能酶标仪检测样品在450nm处的吸光度。根据公式①、公式②，计算待测样品中SOD酶活力。
①抑制百分率＝[(A空白对照1－A空白对照2)－(A样品－A空白对照3)]/(A空白对照1－A空白对照2)×100％；
②待测样品中SOD酶活力单位＝抑制百分率/(1－抑制百分率)units。
结果：
如图1所示，UV诱导对HaCaT细胞中超氧化物歧化酶活性具有抑制作用，而层孔菌深层发酵浓缩液或菌体提取物能够不同程度地提高超氧化物歧化酶活性水平，并且高温诱导后的层孔菌深层发酵浓缩液或菌体提取物的抗氧化水平优于未经诱导的发酵产物。
试验例2考察高温诱导对层孔菌深层发酵浓缩液、菌体提取物抗脂质氧化水平的影响
检测方法：
本部分实验选用人永生化角质形成细胞(HaCaT)开展实验，将角质形成细胞接种于6孔板，铺板密度为1×105cells/孔，过夜待细胞贴壁后，将细胞孔分为对照组、UV模型组和实验组。对照组正常换液；UV模型组的HaCaT细胞在没有塑料盖的磷酸盐缓冲液(PBS)中以10J/cm2剂量的UV照射，随后，细胞在补充有10％FBS(胎牛血清)的新鲜DMEM(Dulbecco改良的Eagle培养基)培养液中；实验组的细胞在UV照射后换分别含有实施例1所得高温诱导的层孔菌深层发酵浓缩液，实施例1所得高温诱导的层孔菌菌体提取物，对比例1所得未经诱导的层孔菌深层发酵浓缩液、对比例1所得未经诱导的层孔菌菌体提取物的完全培养基，上述细胞在37℃、5％CO2恒温恒湿培养箱继续培养24h后，使用细胞裂解液裂解细胞，并利用Bradford法测定样品蛋白浓度。配制MDA(丙二醛)检测工作液，并按一定的比例稀释蛋白样品。向容器内加入样品的反应工作液，100℃或沸水浴加热15分钟后水浴冷却至室温，1000g室温离心10分钟，取200μL上清液至96孔板中，用多功能酶标仪检测样品在532nm处的吸光度。
结果：
UV诱导引起细胞中MDA(丙二醛)水平升高，层孔菌深层发酵浓缩液或菌体提取物能够降低该脂质氧化反应，并且经高温诱导的菌体发酵产物对MDA(丙二醛)的抑制作用更强。
试验例1和试验例2的结果证明，高温诱导的层孔菌深层发酵产物的抗氧化活性优于未经诱导的发酵产物。
下面仅对高温诱导后的层孔菌深层发酵浓缩液及菌体提取物组合物进行抗炎症，抗氧化水平的检测。
试验例3考察高温诱导层孔菌深层发酵浓缩液及菌体提取物组合物对SOD(超氧化物歧化酶)活力影响
检测方法：
本部分实验选用人永生化角质形成细胞(HaCaT)进行实验，将角质形成细胞接种于6孔板，铺板密度为1×105cells/孔，过夜待细胞贴壁后，将细胞孔分为对照组、UV模型组和实验组。对照组正常换液；UV模型组的HaCaT细胞在没有塑料盖的磷酸盐缓冲液(PBS)中以10J/cm2剂量的UV照射，随后，细胞在补充有10％FBS的新鲜DMEM(Dulbecco改良的Eagle培养基)培养液中；实验组的细胞在UV照射后分别换分别含有实施例1所得的组合物1-5的高温诱导层孔菌深层发酵浓缩液及菌体提取物组合物的完全培养基，上述细胞在37℃、5％CO2恒温恒湿培养箱继续培养24h后，去除细胞培养液，加入SOD(超氧化物歧化酶)样品制备液，充分裂解细胞，4℃约12,000g离心3-5分钟，取上清作为待测样品。按照SOD检测试剂盒要求配制反应工作液，向96孔板中依次加入待测样品和其它各种溶液。37℃孵育30分钟。用多功能酶标仪检测样品在450nm处的吸光度。根据公式①、公式②，计算待测样品中SOD酶活力。
③抑制百分率＝[(A空白对照1－A空白对照2)－(A样品－A空白对照3)]/(A空白对照1－A空白对照2)×100％；
④待测样品中SOD酶活力单位＝抑制百分率/(1－抑制百分率)units。
结果：
如图3所示，模型组SOD酶活力明显低于对照组，而在经高温诱导层孔菌深层发酵浓缩液及菌体提取物组合物处理后，SOD酶活性增强。以上结果证明：高温诱导层孔菌深层发酵浓缩液及菌体提取物组合物能够维持细胞内SOD酶活力，具有良好的抗氧化活性，且当组合物的成分为30％发酵浓缩液+70％菌体提取物时，抗氧化活性最好。
试验例4高温诱导层孔菌深层发酵浓缩液及菌体提取物组合物对脂质氧化影响的测定
检测方法：
本部分实验选用人永生化角质形成细胞(HaCaT)开展实验，将角质形成细胞接种于6孔板，铺板密度为1×105cells/孔，过夜待细胞贴壁后，将细胞孔分为对照组、UV模型组和实验组。对照组正常换液；UV模型组的HaCaT细胞在没有塑料盖的磷酸盐缓冲液(PBS)中以10J/cm2剂量的UV照射，随后，细胞在补充有10％FBS(胎牛血清)的新鲜DMEM(Dulbecco改良的Eagle培养基)培养液中；实验组的细胞在UV照射后分别换分别含有实施例1所得组合物1-5的高温诱导层孔菌深层发酵浓缩液及菌体提取物组合物的完全培养基，上述细胞在37℃、5％CO2恒温恒湿培养箱继续培养24h后，使用细胞裂解液裂解细胞，并利用Bradford法测定样品蛋白浓度。配制MDA检测工作液，并按一定的比例稀释蛋白样品。向容器内加入样品的反应工作液，100℃或沸水浴加热15分钟后水浴冷却至室温，1000g室温离心10分钟，取200μL上清液至96孔板中，用多功能酶标仪检测样品在532nm处的吸光度。
结果：
在人永生化角质形成细胞中，高温诱导层孔菌深层发酵浓缩液及菌体提取物组合物能够降低UV诱导引起的脂质氧化反应，其中当用组合物2(30％发酵浓缩液+70％菌体提取物)处理时，抗脂质氧化的效果最显著。证明该体积比的组合物对抗UV照射引起的脂质氧化具有积极作用。
试验例5高温诱导层孔菌深层发酵浓缩液及菌体提取物组合物对基质金属蛋白酶(MMPs)mRNA表达的影响
检测方法：
本部分使用人皮肤成纤维细胞(HSF)开展实验。将HSF细胞以3×106cells/孔的密度接种于10cm细胞培养皿内，过夜待细胞贴壁后，将细胞孔分为对照组、UV模型组和实验组。对照组正常换液；UV模型组的HaCaT细胞在没有塑料盖的磷酸盐缓冲液(PBS)中以10J/cm2剂量的UV照射，随后，细胞在补充有10％FBS(胎牛血清)的新鲜DMEM(Dulbecco改良的Eagle培养基)培养液中；实验组的细胞在UV照射后换含有实施例1所得组合物2的高温诱导层孔菌深层发酵浓缩液及菌体提取物组合物的完全培养基，上述细胞在37℃、5％CO2恒温恒湿培养箱继续培养24h后，使用Trizol法提取细胞总RNA，逆转录合成cDNA，在Eppendorf荧光定量PCR仪上采用SYBR Green法进行基因表达分析。使用2^-ΔΔCT方法进行相对定量分析。所有数据均以GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)作为内部对照计算相对基因表达。
结果：
高温诱导层孔菌深层发酵浓缩液及菌体提取物组合物对MMPs mRNA表达的影响如图5所示，其可以显著降低基质金属蛋白酶MMP-1、MMP-3、MMP-9的mRNA的表达，表明30％发酵浓缩液+70％菌体提取物的组合物(组合物2)可以通过抑制基质金属蛋白酶的表达，抑制胶原纤维降解，发挥抗衰老作用。
试验例6高温诱导层孔菌深层发酵浓缩液及菌体提取物组合物对炎症因子的影响
检测方法：
本部分实验选用HSF细胞，将HSF细胞以3×106cells/孔的密度接种于10cm细胞培养皿内，过夜待细胞贴壁后，将细胞孔分为对照组、UV模型组和实验组。对照组正常换液；UV模型组的HaCaT细胞在没有塑料盖的磷酸盐缓冲液(PBS)中以10J/cm2剂量的UV照射，随后，细胞在补充有10％FBS(胎牛血清)的新鲜DMEM(Dulbecco改良的Eagle培养基)培养液中；实验组的细胞在UV照射后换含有实施例1所得组合物2的高温诱导层孔菌深层发酵浓缩液及菌体提取物组合物的完全培养基，上述细胞在37℃、5％CO2恒温恒湿培养箱继续培养24h后，收集细胞并提取蛋白，然后利用ELISA试剂盒检测细胞中IL-1β、IL-6含量。
结果：
高温诱导层孔菌深层发酵浓缩液及菌体提取物组合物对炎症因子IL-1β、IL-6释放的影响如图6所示，高温诱导层孔菌深层发酵浓缩液及菌体提取物组合物能够有效抑制HSF中UV引起的IL-1β、IL-6释放，表明30％发酵浓缩液+70％菌体提取物的组合物(组合物2)可以抑制炎症因子释放，发挥抗炎作用。
结论：
综上，高温诱导层孔菌深层发酵浓缩液及菌体提取物组合物具有显著的抗氧化，抗炎症因子释放的作用，有望成为一种优秀的抗炎、抗衰老护肤品原料。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种深层发酵浓缩液与菌体提取物的组合物在制备护肤品中的应用，其特征在于，
所述层孔菌深层发酵浓缩液与菌体提取物组合物的制备方法，包括如下步骤：
1)活化后的层孔菌菌株接种到液体培养基中，28 ℃第一发酵培养，得一级液体发酵种子；第一发酵培养的时间为7 d；第一发酵培养的转速为150 r/min；
2)上述一级液体发酵种子分散后，接种到新的液体培养基中第二发酵培养，第二发酵培养的温度由28 ℃升至30 ℃，得二级液体发酵种子；第二发酵培养的时间为7 d；第二发酵培养的转速为150 r/min；
3)上述二级液体发酵种子分散后，接种到新的液体培养基中第三发酵培养，第三发酵培养的温度由30 ℃升至32 ℃，发酵结束后，对三级液体发酵产物进行离心，分别收集菌体、菌体的发酵液；第三发酵培养的时间为7 d；第三发酵培养的转速为150 r/min；
4)向上述菌体中加入无菌超纯水混悬后，加入保护剂，匀浆，热裂解，过滤，收集菌体提取液；真空旋转蒸发浓缩，得菌体提取物；
5)将上述菌体的发酵液过滤除菌后，真空旋转蒸发浓缩，得深层发酵浓缩液；
6)将上述菌体提取物、上述深层发酵浓缩液混合，得组合物，其中，深层发酵浓缩液和菌体提取物的体积比为30%：70%；
其中，步骤1)、步骤2)、步骤3)中所述液体培养基，由包括如下原料制备而得：麦芽糖15g/L、蔗糖 15 g/L、酵母浸粉15 g/L、蛋白胨15 g/L、磷酸二氢钾 1 g/L、七水硫酸镁 0.5g/L、氯化钙 0.5 g/L、维生素B1 10 mg/L、桦木皮发酵浸提物 10mL/L、栎树皮发酵浸提物10mL/L，松树皮发酵物浸提物20 mL/L；
所述层孔菌包括裂蹄层孔菌、松针层孔菌中至少一种。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，
步骤4）中，所述保护剂为海藻糖；
步骤4）中，无菌超纯水的加入质量为菌体的2-20倍。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，
步骤4）、步骤5）中，真空旋转蒸发浓缩的真空度为0.094 - 0.096Mpa。
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