KR101366498B1 - 자극완화 및 미백능이 있는 인삼꽃 발효물의 제조방법 - Google Patents

자극완화 및 미백능이 있는 인삼꽃 발효물의 제조방법 Download PDF

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조이슬
박진수
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Abstract

본 발명은 인삼꽃 발효물의 제조방법에 관한 것으로, 탄닌과 조사포닌의 함량이 한층 증진된 인삼꽃 발효물을 제조할 수 있는데, 항염 및 미백능이 우수하여 자극완화용 화장품 또는 미백용 화장품의 소재로 활용될 수 있다.

Description

자극완화 및 미백능이 있는 인삼꽃 발효물의 제조방법{Method for production of ginseng flower fermentation product with abirritation and whitening effect}
본 발명은 인삼꽃 발효물의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 자극완화 및 미백능이 있는 인삼꽃 발효물의 제조방법에 관한 것이다.
한국은 가장 빠른 고령사회 진입 예정국으로서 노령 인구의 비중이 증가함에 따른 노화 관련 시장 및 다양한 산업의 증대가 예상되며, 노화 관련 시장이 20~30대의 젊은 세대부터 중·장년층까지 관심이 확대되고 있다.
인삼꽃은 개화 전·후, 열매 생성 전에 제거하여 버리는 농업폐기물로 인식되어 있다. 하지만, 인삼꽃에는 진세노사이드(ginsenoside)가 다량 함유되어 있어, 이를 재가공할 수 있는 방법을 개발한다면, 폐기물의 처리 및 농가의 소득 증대에 일조할 수 있을 것으로 판단된다.
발효는 미생물을 이용하여 소재를 재가공할 수 있는 효율적인 방법인데, 소재를 선택적으로 변환하여 유용한 산물을 대량 생산할 수 있게 한다. 258조원의 바이오 시장에서 발효 제품은 약 73조원으로 전체 바이오 시장의 약 28%를 차지하고 있을 정도로 발효는 대단히 중요한 식품 가공 기술이다.
최근 전통 발효식품 외에 화장품 분야에서도 발효기술이 활발히 이용되고 있고, 발효 한방 화장품이라는 별도의 제품군을 형성할 정도로 선풍적인 인기를 끌고 있다.
2010년 국내 발효화장품 시장규모는 약 5,000억원인데, 발효 화장품의 시장규모는 발효 기술 개발 및 항노화 시장의 성장에 따라서 증대될 것으로 사료된다.
인삼꽃을 이용한 특허로서, 대한민국 특허공개번호 제10-2010-0059347호 (공개일자 2010. 06. 04)에는, "인삼꽃 정유(精油, essential oil)를 유효성분으로 함유하는 피부 외용제에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 주름 개선, 탄력 개선, 보습 개선의 효과가 있으며, 자외선에 의한 피부의 미세염증 상태를 조절하고 환경 유해요소와 산화적 스트레스에 의한 손상을 줄여주어 피부를 보호하고, 색소 침착을 줄여 주고, 피지를 조절하고, 피부 트러블과 여드름을 개선하고, 혈색을 개선하며, 부작용이 없는 인삼꽃의 고유 향취를 유지하면서 뛰어난 피부 효능을 갖는 인삼꽃 정유(精油, essential oil)를 함유하는 피부 외용제 조성물"이 기재되어 있다.
본 발명에서는 농업 폐기물인 인삼꽃을 재가공하여 유용한 소재로 전환시킬 수 있는 새로운 기술을 개발하여 제공하고자 한다.
본 발명은 인삼꽃을 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 생육용 배지에 적셔 인삼꽃 배지를 준비하는 단계; 및 상기 인삼꽃 배지에 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 접종하여 배양하는 단계;를 포함하는 과정으로 부터 제조되는 것을 특징으로 하는 인삼꽃 발효물의 제조방법을 제공한다.
이하, 본 발명의 인삼꽃 발효물의 제조방법을 각 단계별로 세분하여 설명하고자 한다.
<인삼꽃 배지 준비 단계>
본 단계는 인삼꽃을 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 생육용 배지에 적셔 인삼꽃 배지를 준비하는 단계이다.
본 발명은 인삼꽃을 배지로 사용하는데, 인삼꽃은 바람직하게 분쇄하여 사용하는 것이 좋다. 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)는 생육이 까다롭지 않아, 탄소원, 질소원 및 수분이 갖춰지는 조건에서는 배양이 가능하나, 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 생육용 배지를 사용하는 것이 좋다. 인삼꽃에 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 직접 접종할 경우, 발효가 왕성히 일어나지는 않으므로, 인삼꽃을 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 생육용 배지에 적셔 준비하는 것이 좋은 것이다. 이와 같은 과정을 통해 인삼꽃에 적절한 함량의 수분이 제공되고, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)의 생육에 필요한 각종 영양인자가 공급될 수 있다. 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 생육용 배지의 예로는 YM 배지가 있다.
<배양 단계>
본 단계는 상기 인삼꽃 배지에 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 접종하여 배양하는 단계이다. 본 단계에서는 발효 균주인 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 상기 단계에서 제조한 인삼꽃 배지에 접종하여 발효를 수행한다. 이때, 상기 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)는 바람직하게 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) KCTC 7913인 것이 좋다. 이 균주를 사용할 경우, 조사포닌의 함량이 증가하고, 특히 진세노사이드의 함량이 다른 균주를 사용하는 것보다 많이 증가하기 때문이다.
발효는 바람직하게 5~7일 정도 수행하는 것이 좋은데, 이 정도의 기간 동안 발효를 수행할 경우, 탄닌 및 조사포닌의 함량이 많이 증가하기 때문이다.
한편, 본 발명은 상기 본 발명의 방법에 의해 제조된 인삼꽃 발효물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 자극완화용 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명의 방법에 의해 제조된 인삼꽃 발효물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 미백용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 발명에 의할 경우, 탄닌 및 조사포닌의 함량이 한층 증가된 인삼꽃 발효물을 제조할 수 있고, 더욱이 진세노사이드의 함량이 한층 증가된 발효물을 제조할 수 있다.
또한, 본 발명에 의해 제조된 인삼꽃 발효물은 항염 작용이 우수하여 자극완화용 화장품의 유효 성분으로 활용될 수 있고, 미백능이 우수하여 미백용 화장품의 유효 성분으로 활용될 수 있다.
도 1은 탄닌산의 표준품 정량 곡선을 나타낸 그래프이다.
도 2는 발효 인삼꽃의 항염 효과를 RT-PCR로 실험한 결과이다.
도 3은 발효 인삼꽃의 항염 효과를 웨스턴 블럿(Western Blot)으로 실험한 결과이다.
도 4는 발효 인삼꽃의 미백 효과를 RT-PCR로 실험한 결과이다.
도 5는 발효 인삼꽃의 미백 효과를 웨스턴 블럿(Western Blot)으로 실험한 결과이다.
도 6은 인공피부실험을 통하여 발효 인삼꽃의 티로시나아제 억제율을 실험한 결과이다. 도 6에서 '***'은 유의차가 p<0.001 수준에서 있음을, '#'은 '***'에 해당하는 p<0.001 만큼의 유의성은 아니지만, p<0.1 수준으로 유의차가 있음을 의미한다.
도 7은 진세노사이드의 표준 곡선이다.
도 8은 KCTC 7108 발효 균주로 발효시킨 발효 인삼꽃의 HPLC 분석 결과이다.
도 9는 KCTC 7913 발효 균주로 발효시킨 발효 인삼꽃의 HPLC 분석 결과이다.
도 10은 비발효 인삼꽃의 HPLC 분석 결과이다.
도 11은 비발효 인삼꽃 대비 발효 인삼꽃의 진세노사이드 함량 차이를 비교하여 보여주는 그래프이다. 도 11에서 '인삼꽃'은 비발효 인삼꽃 샘플이고, KCTC 7108, KCTC 7913은 이들 균주로 각각 발효한 발효 인삼꽃 샘플이다.
도 12은 조사포닌 증가율 대비 진세노사이드 증가율을 보여주는 그래프이다. 도 12에서 KCTC 7108, KCTC 7913은 이들 균주로 각각 발효한 발효 인삼꽃 샘플이다.
이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
[ 실시예 1: 발효 인삼꽃 추출분말의 제조]
YM 배지에 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) KCTC 7913을 계대 배양하여 30℃ 인큐베이터(incubator)에서 2일간 배양하였다. 백금이를 이용하여 1 콜로니(colony)를 취해 YM 배지 2000 ㎖에 접종한 후, 진탕 배양기(shaking incubator)에서 1일간 액체 배양하였다.
한편, 인삼꽃 1 kg을 분쇄하여 준비하고 YM 배지를 2000 ㎖ 분주하여, 충분히 적셔지도록(함습) 2시간 동안 정치하였다. 상기 준비된 인삼꽃에 균 배양액 500 ㎖(약 1×108 CFU/㎖)를 고르게 접종하고, 30℃ 인큐베이터(incubator)에서 5일간 배양하였다. 5일 후, 배양이 완료된 발효물을 회수하였다. 상기 발효물을 800 rpm, 상온에서 3시간 동안 메탄올로 추출하여 발효 인삼꽃 추출물을 수득하였다. 그 후, 상기 발효 인삼꽃 추출물을 농축 및 분말화하여 발효 인삼꽃 추출분말을 제조하였다.
한편, 상기와 같은 방법으로 KCTC 7108 균주를 이용하여 발효 인삼꽃 추출분말을 제조한 후, 하기 실험예에서 사용하였다.
[ 실험예 1-1: 발효 인삼꽃 추출분말의 지표성분 확인 - 탄닌 함량 측정]
본 실험에서는 발효 균주 및 발효 일수에 따른 발효 인삼꽃 추출분말의 탄닌 함량을 확인하고자 하였다. 발효 인삼꽃 추출분말의 탄닌 성분을 확인하기 위하여 Folin-ciocalteu의 방법에 따라 Folin-ciocalteu 시약이 샘플의 폴리페놀화합물에 의해 환원되어 몰리브덴 청색으로 발색하는 것을 원리로 이용하여 측정하였다.
먼저, 표준액을 제조하고자 탄닌산(Tannic acid, 92.7%, sigma) 0.017 g을 증류수 10 ㎖에 녹인 후, 단계희석하여 65.6625, 131.325, 262.65 ppm의 표준품을 각각 제조하였다. 제조된 표준품 0.1 ㎖에 증류수 0.9 ㎖를 가하고 Folin-ciocalteu 시약(sigma) 0.5 ㎖를 가하여 반응시켰다. 여기에 20% 탄산나트륨 1.5 ㎖를 첨가한 후, 1시간 동안 실온에서 방치한 다음 765 nm에서 흡광도를 측정하여 표준곡선을 작성하였다(도 1).
한편, 검액(실험군)을 제조하고자, 상기 실시예 1에서 제조한 각각의 발효 인삼꽃 추출분말 약 0.02 g을 취하여 증류수 1 ㎖에 용해하여 검액을 제조하였다. 상기 검액 0.1 ㎖에 증류수 0.9 ㎖를 가하고 Folin-ciocalteu 시약(sigma) 0.5 ㎖를 가하여 반응시켰다. 여기에 15% 탄산나트륨 1.5 ㎖를 첨가한 후, 1시간 동안 실온에서 방치한 다음 765 nm에서 흡광도를 측정하였다. 또한, 발효하지 않은 인삼꽃 추출분말을 대조군으로 하였다.
No. 균주명 발효일수(day) 탄닌 함량(%)
1
KCTC 7108

 1 1.30
2 3 1.49
3 5 1.57
4 7 1.71
5
KCTC 7913		 1 1.10
6 3 1.76
7 5 1.55
8 7 2.17
9 대조군 0 1.37
측정결과, 발효시간의 경과에 따라 비발효 인삼꽃 대비 발효 인삼꽃의 탄닌 함량이 월등히 높음을 확인하였으며, 특히, 인삼꽃에 KCTC 7913 발효 균주를 접종하고, 7일간 발효시킨 발효 인삼꽃 추출분말의 탄닌 함량이 가장 높게 측정되었다.
[ 실험예 1-2: 발효 인삼꽃 추출분말의 지표성분 확인 - 조사포닌 함량 측정]
본 실험에서는 발효 균주 및 발효 일수에 따른 발효 인삼꽃 추출분말의 조사포닌 함량을 확인하고자 하였다.
상기 실시예 1에서 제조된 각각 발효 인삼꽃 추출분말 약 3 g을 취하여 증류수 50 ㎖에 용해하여 제조된 용해물을 분액 깔때기에 넣고 에테르 50 ㎖를 넣어 지방질을 제거하였다. 그 다음 물포화 부탄올 50 ㎖를 넣어 분획한 후, 부탄올 층을 모으는 단계를 3회 반복하였다. 그 후, 감압 농축기를 이용하여 농축 후 무게를 확인하였다. 이때, 발효하지 않은 인삼꽃 추출분말을 대조군으로 하였다.
NO. 균주명 발효일수(day) 조사포닌 함량(%)
1
KCTC 7108

 1 55.67
2 3 68.26
3 5 75.08
4 7 64.16
5
KCTC 7913

 1 68.85
6 3 66.18
7 5 74.27
8 7 64.32
9 대조군 0 50.84
측정결과, 발효시간의 경과에 따라 비발효 인삼꽃 대비 발효 인삼꽃의 조사포닌 함량이 월등히 높음을 확인하였다. 특히, 인삼꽃에 KCTC 7913 발효 균주를 접종하고, 5일간 발효시킨 발효 인삼꽃 추출분말의 조사포닌 함량이 가장 높게 측정되었다.
[ 실험예 2-1: 발효 인삼꽃 추출분말의 항염( 자극완화) 효과 측정 - RT - PCR 측정]
본 실험예에서는 RT-PCR을 이용하여 발효 인삼꽃 추출분말의 항염 효과를 측정하고자 하였다. 발효 인삼꽃 추출분말이 염증 인자의 대표적인 사이토카인(cytokine)인 IL-6에 미치는 영향을 알아보기 위하여 mRNA에서의 발현을 평가하였다. 대조군은 인삼꽃 추출분말로 하였고, HaCat 세포에 자외선 처리를 하여 IL-6를 증가시킨 후, 함량 변화를 관찰하였다. 실험방법은 하기와 같았다.
① RNA 분리
HaCat 세포를 배양한 후, 배지를 버리고 PBS로 세척(washing)한 후, 플레이트(plate)에 RNAiso를 넣고 5분간 배양하였다. 세포를 스크래퍼(scraper)로 긁고 피펫질(pipetting)한 후, 마이크로튜브(microtube)로 옮겼다. 실온에서 5분간 배양(incubation)하고, 핵산으로부터 핵단백질을 유리시켰다. 그 다음 RNAiso 용량의 0.2배의 클로로폼(chloroform)을 넣은 후, 실온에서 5분간 두었다. 5분 후, 4℃, 12,000×g로 15분간 원심분리(ntrifuge)한 후, RNA가 포함된 상층의 액상층 만을 새로운 마이크로튜브(microtube)로 옮겼다. 그 다음, RNAiso 용량의 0.5배 이소프로판올(isopropanol)을 첨가한 후, 잘 혼합하여 실온에서 10분간 배양(incubation)하였다. 4℃, 12,000×g로 10분간 원심분리한 후, RNA가 침전된 액상층에 RNAiso과 동일 양의 75% 에탄올(4℃)을 첨가하여 RNA를 세정하였다. 그 다음, 4℃, 8,000×g 이상으로 5분간 원심분리한 후 상층만 버리고, 실온에서 몇 분간 건조한 후, RNase-free water로 용해함으로써 RNA를 분리하였다.
② RNA 정량
RNA 2 ㎕과 중수(dH2O) 998 ㎕를 혼합한 후, 260 nm에서 흡광도를 측정하였다.
③ cDNA 제작
올리고(Oligo) d(T)는 고정적으로 1 ㎕, RNA와 DEPC는 총 RNA 양을 2 ㎍으로 계산하여 4 ㎕, DEPC는 6.5 ㎕(Total 10.5 ㎕)을 넣고 PCR 기계를 이용하여 70℃에서 10분 동안 반응시킨 후, 아이스(Ice)에 넣고, 배양(incubation)하였다. 상기 혼합물(Mixture) 11.5 ㎕, 5X incubation BF 4 ㎕, dNTP(2.5 mM) 4 ㎕, 역전사효소 0.5 ㎕(Total 20 ㎕)를 혼합한 후, PCR 기계를 이용하여 42℃에서 60분 동안, 70℃에서 15분 동안, 4℃에서 8분 동안 반응시켰다.
④ PCR
PCR premix가 동결건조된 튜브에 중수(dH2O) 17 ㎕, cDNA 1 ㎕, 5'-프라이머(primer) 1 ㎕, 3'-프라이머(primer) 1 ㎕ (total 20 ㎕)를 혼합 후 PCR 기계에 넣어 DNA를 증폭시켰다.
⑤ 아가로스(Agarose) 전기영동
1% 아가로스 젤(Agarose gel)을 제조한 후, 상온에서 30분 동안 굳혔다. 상기 굳어진 아가로스 젤을 전기영동 기계에 넣고 PCR 산물을 로딩(loading)하였다. 젤(Gel)에 자외선(UV light)를 쪼여서 결과를 확인하였다.
실험결과, 발효 인삼꽃 추출분말 샘플(실험군)에서 대조군 인삼꽃 대비 자외선 자극에 의해 증가한 IL-6이 현저하게 감소함을 확인할 수 있었다(도 2).
[ 실험예 2-2: 발효 인삼꽃 추출분말의 항염(자극완화) 효과 측정 - Western blotting ]
본 실험예에서는 웨스턴 블럿(Western Bolt)을 이용하여 발효 인삼꽃 추출분말의 항염 효과를 측정하고자 하였다.
본 실험에서는 발효 인삼꽃 추출분말이 염증 인자의 대표적인 사이토카인(cytokine)인 COX-2에 미치는 영향을 알아보기 위하여 단백질 수준에서의 발현을 평가하였다. 대조군은 비발효 인삼꽃 추출분말로 하였고, HaCat 세포에 자외선 처리를 하여 COX-2를 증가시킨 후, 실험하였다. 실험방법은 하기와 같았다.
① 실험 샘플의 준비
HaCat 세포를 배양 접시의 바닥에 접종한 후, 37℃, 5% 이산화탄소를 포함하는 배양기 내에서 배양하였다. 배양 후, 세포를 96 웰 플레이트(well plate)에 5× 105 cells/㎖의 농도로 희석하여 1 ㎖씩 접종한 후, 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 배지를 모두 제거하고, 혈청이 포함되지 않은 배지를 이용하여 시료를 적당한 농도로 희석하여 각 시료를 웰(well) 당 1 ㎖씩 처리한 후, 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 세포를 PBS로 세척하고 트립신-EDTA(trypsin-EDTA) 0.5 ㎖를 처리하여 세포를 떼어내고 PBS 0.5 ㎖를 첨가하여 마이크로 튜브(micro-tube)에 세포를 회수하였다. 상기 회수된 세포는 4℃, 12,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 제거하고, 펠릿(pellet)에 라이시스 버퍼(lysis buffer)를 100 ㎕씩 넣고 튜브를 얼음에 넣고 1시간 동안 반응시켰다. 그 다음 4℃, 12,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후, 상층액 70 ㎕를 새 튜브에 옮긴 후, BCA법을 이용하여 단백질을 정량하였다. 그 후, 단백질, 증류수 및 5×샘플 버퍼(sample buffer)를 총 부피가 40 ㎕가 되도록 혼합한 후, 끓는 물에 5분 동안 단백질을 변성시켰다.
② 웨스턴 블럿(Western blot)
SDS 젤을 제조한 후, 젤에 샘플을 로딩(loading)하였다. 100 V로 스태킹 젤(stacking gel)까지 전기영동 한 후, 러닝 젤(Running gel)에서부터 120 V로 전기영동을 하였다. 전기영동이 끝난 후, 젤을 유리판에서 떼어내고, 트랜스퍼 카세트(Transfer cassette)에 '스폰지-3M페이퍼-젤-액티베이션멤브레인(Activation Membrane)-3M페이퍼-스폰지' 순으로 넣어 주었다. 상기 트랜스퍼 카세트를 트랜스퍼 기계에 장착하고 100 V로 4℃에서 1시간 동안 러닝(running) 하였다. 러닝(running)이 끝난 멤브레인(membrane)은 5% 무지방 우유(non-fat milk)로 상온에서 1시간 동안 블로킹(blocking) 하였다. 그 다음 멤브레인(membrane)에 1차 항체(antibody)를 4℃에서 16시간 동안 반응시킨 후, TBS-T로 5분간 3번 세척(washing)하였다. 그 후, 2차 항체(antibody)를 상온에서 1시간 반응시킨 후, TBS-T로 20분간 3번 세척(washing)하였다. 그 후, 멤브레인(Membrane)을 ECL(Enhanced chemiluminescence) 반응을 시키고, 카세트(Cassette)에 멤브레인(membrane)을 넣고 필름을 이용하여 검출(detection) 하였다. 이후, 크기를 확인하여 밴드(band)를 확인하였다. 이때, 멤브레인(Membrane)에 0.2N 수산화나트륨(NaOH)을 넣고 20분간 흔들어 항체(antibody)를 제거한 후, 위와 동일한 방법으로 액틴 항체(Actin antibody)를 반응시켜 밴드를 확인하였다.
실험결과, 발효 인삼꽃 추출분말에서 대조군 비발효 인삼꽃 대비 자외선 자극에 의해 증가한 COX-2가 현저하게 감소함을 확인할 수 있었다(도 3).
[ 실험예 3-1: 발효 인삼꽃 추출분말의 미백 효과 측정 - RT - PCR 측정]
본 실험예에서는 RT-PCR을 이용하여 발효 인삼꽃 추출분말의 미백 효과를 측정하고자 하였다. 미백 관련 단백질인 티로시나제(Tyrosinase) 및 TRP-1에 발효 인삼꽃 추출분말이 미치는 영향을 알아보기 위하여 mRNA에서의 발현 수준을 평가하였다. B16F10 세포에 α-MSH 처리를 하여 티로시나제(Tyrosinase) 및 TRP-1의 활성 증가시켰고, 그 외 실험방법은 상기 실험예 2-1과 같았다.
실험결과, 발효 인삼꽃 추출분말에 의하여 티로시나제(Tyrosinase) 및 TRP-1의 활성이 감소하였음을 확인하였다(도 4).
[ 실험예 3-2: 발효 인삼꽃 추출분말의 미백 효과 측정 - Western blotting ]
본 실험예에서는 Western Bolt을 이용하여 발효 인삼꽃 추출분말의 미백 효과를 측정하고자 하였다. 미백 관련 단백질인 티로시나제(Tyrosinase) 및 TRP-1에 발효 인삼꽃 추출분말이 미치는 영향을 알아보기 위하여 단백질 수준에서의 발현 여부를 평가하였다. B16F10 세포에 α-MSH 처리를 하여 티로시나제(Tyrosinase) 및 TRP-1의 활성을 증가시켰고, 나머지 실험방법은 상기 실험예 2-2와 같았다.
실험결과, 발효 인삼꽃 추출분말에 의하여 티로시나제(Tyrosinase) 및 TRP-1의 활성이 감소함을 확인할 수 있었다(도 5).
[ 실험예 4: 티로시나아제 활성 저해 어세이( Tyrosinase inhibition assay )]
본 실험예에서는 인공피부실험을 통하여 발효 인삼꽃 추출분말의 티로시나아제(Tyrosinase) 억제율을 평가하고자 하였다.
멜라닌형성세포가 함유된 NeoDerm-ME를 PBS로 세척한 후, 1% 트리톤(triton) X-100 300 ㎕에 넣어 추출(extraction)하였다. 그 다음 초음파처리(Sonication)를 3회 하여 세포를 용해시키고, 13,000 rpm, 4℃에서 20분 동안 원심분리를 하였다. 원심분리 후, 상층액을 모아 단백질 정량(BCA assay)를 실시하였다. 그 다음 상층액 50 ㎕(총 단백질 50 ㎍ + PBS)에 0.1M 인산완충액(phosphate buffer, pH 6.8) 50 ㎕를 섞은 후, 0.1% L-DOPA를 100 ㎕ 넣어 37℃에서 배양(incubation)하였다. 배양 후, 1시간 동안 더 배양(incubation)한 후, 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 알부틴(albutin)을 양성 대조군으로 하고, 비발효 인삼꽃 추출분말을 대조군으로 하였다.
실험결과, 알부틴(albutin)을 처리한 양성대조군이, 비발효 인삼꽃을 처리한 대조군보다 높은 티로시나아제(Tyrosinase) 억제율을 보였고, 발효 인삼꽃 처리 군은 알부틴(albutin)보다 높은 티로시나아제(Tyrosinase) 억제율을 보일 뿐만 아니라 비발효 인삼꽃 처리 군에 비하여 좀더 높은 억제율을 나타내었다 (도 6).
[ 실험예 5: 발효균주 종류별 진세노사이드 ( Ginsenoside ) 함량 차이 분석]
본 실험예에서는 발효균주 종류별 비발효 인삼꽃과 발효 인삼꽃의 진세노사이드 함량을 비교하고자 하였다.
Rg2, Rg3 및 Rh1 표준품을 메탄올에 녹인 후, 최종농도가 Rg2는 2146.7, Rg3는 2217.7, Rh1는 1523.3 ppm이 되는 혼합물을 제조한 후, 시린지 필터(syringe filter)로 거른 후, 표준액으로 사용하고, 표준곡선을 작성하였다 (도 7).
이후, 상기 실시예 1에서 제조한 발효 인삼꽃 추출 분말 각 약 0.1 g을 취하여 메탄올 10 ㎖에 용해한 후, 시린지 필터(syringe filter)하여 검액(실험군)으로 사용하였다. 이때, 비발효 인삼꽃 처리군을 대조군으로 하였다.
실험결과, 발효 인삼꽃의 Rg2, Rg3 및 Rh1의 함량이 비발효 인삼꽃 대비 월등함을 확인할 수 있었다(표 3, 도 8 내지 11).
NO. 균주명 발효일수(day) Rg2(ppm) Rg3(ppm) Rh1(ppm)
1 KCTC 7108 5 12890.48 938.89 15090.00
2 KCTC 7913 5 14477.76 1775.39 20110.58
3 대조군 0 11007.20 1141.27 17698.46
한편, 조사포닌의 증가율 대비 진세노사이드 증가율을 계산한 결과, KCTC 7913 균주를 이용하여 발효할 경우 진세노사이드 함량이 더욱 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 12).

Claims (4)

  1. 삭제
  2. 인삼꽃을 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 생육용 배지에 적셔 인삼꽃 배지를 준비하는 단계; 및
    상기 인삼꽃 배지에 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) KCTC 7913를 접종하여 배양하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 인삼꽃 발효물의 제조방법.
  3. 인삼꽃을 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 생육용 배지에 적셔 인삼꽃 배지를 준비하는 단계; 및 상기 인삼꽃 배지에 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 접종하여 배양하는 단계;를 포함하는 인삼꽃 발효물의 제조방법에 의해 제조된 인삼꽃 발효물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 자극완화용 화장료 조성물.
  4. 인삼꽃을 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 생육용 배지에 적셔 인삼꽃 배지를 준비하는 단계; 및 상기 인삼꽃 배지에 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 접종하여 배양하는 단계;를 포함하는 인삼꽃 발효물의 제조방법에 의해 제조된 인삼꽃 발효물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 미백용 화장료 조성물.
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