KR20160131585A - 유산균 발효 삼채 추출물 및 이의 제조방법 - Google Patents
유산균 발효 삼채 추출물 및 이의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 발효균 또는 발효균의 배양액으로 발효시킨, 항산화 활성을 갖는 삼채 추출물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 삼채 추출물은 DPPH 유리기 소거 활성, ABTS 유리기 소거 활성 및 총 페놀성 화합물 함량 등이 높아 항산화 활성이 우수한 유리한 효과가 있다. 또한 본 발명의 제조방법에 따르면 열수 추출을 이용하므로 종래 알코올 추출로 인한 인체 유해 성분 섭취 우려를 감소시킬 수 있다.
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Description
본 발명은 삼채 추출물에 관한 것으로서, 더 상세하게는 유산균을 이용하여 발효시킨 삼채로부터 추출된 삼채 추출물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
삼채(三菜, Allium hookeri)는 파 속 식물로 히말라야 산맥 해발 1,400~4,200미터 이상의 초원지대에서 자생하며, 중국, 인도, 부탄, 스리랑카 및 미얀마 등에 분포한다. 삼채는 뿌리, 잎, 순 모두가 식용으로 가능하고 식이유황성분이 마늘보다 6배 많다고 알려져 있다. 또한 단백질, 당, 섬유소, 아스코르브 산, 식물성 스테롤, 총 페놀 함량 등이 양파보다 많이 함유되어 있어 양파 대체물로 널리 사용되고 있다.
특허문헌 1은 삼채 성분을 포함한 막걸리의 제조방법에 관한 것이고, 특허문헌 2는 삼채액을 첨가한 김치의 제조방법에 관한 것으로 삼채를 첨가물로 한 다양한 식품의 제조방법을 소개하고 있으나 삼채 자체의 기능성을 향상시키는 방법 등에 관하여는 소개하고 있지 않다.
비특허문헌 1에서는 메탄올을 이용한 삼채 뿌리 추출물이 LPS(내독소)가 유도된 RAW264.7 세포에 대해 항염증 효과가 있다는 내용이 개시되어 있으나 항산화 활성을 증가시키기 위한 내용은 기재되어 있지 않으며, 메탄올을 이용한 삼채 추출물은 유해성분인 메탄올이 함께 섭취될 우려가 있다.
김창현 외. 삼채 뿌리 메탄올 추출물이 LPS가 유도된 RAW264.7 세포에 대한 항염증 효과. 한국식품영양과학회지 제41권 제11호 (2012년 11월) 1645-1648 쪽
본 발명은 항산화 활성이 향상되고 섭취 시에도 안정한 삼채 추출물 및 이의 제조방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 유산균 또는 유산균의 배양물로 발효시킨, 항산화 활성을 갖는 삼채 추출물을 제공한다.
상기 유산균은 락토바실러스 아시도필루스, 비피도박테리움 롱검, 엔테로코커스 페시움 및 스트렙토코커스 서머필러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 균인 것을 특징으로 한다.
상기 배양물은 천연효소를 더 포함할 수 있다. 천연효소로는 미숙성 과일을 발효시킨 것으로 미숙성 과일은 일 예로서 감일 수 있다.
또한 본 발명은 삼채 추출물의 제조방법으로서, 건조 삼채에 유산균이 포함된 발효액을 접종하여 발효시켜 유산균 발효 삼채를 수득하고, 추출하는 것을 특징으로 한다.
상기 발효액은 1×108 내지 1×1010 cfu/g의 유산균을 포함할 수 있다.
상기 추출은 열수 추출일 수 있다.
또한 본 발명은 상기 삼채 추출물을 포함하는 항산화용 조성물을 제공한다.
상기 항산화용 조성물은 약학 조성물, 식품 조성물, 화장료 조성물 또는 사료 첨가용 조성물에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명에 따른 유산균 발효 삼채 추출물은 DPPH 유리기 소거 활성, ABTS 유리기 소거 활성 및 총 페놀성 화합물 함량 등이 높아 항산화 활성이 우수한 유리한 효과가 있다.
또한 본 발명의 제조방법에 따르면 열수 추출을 이용하므로 종래 알코올 추출로 인한 인체 유해 성분 섭취 우려를 감소시킬 수 있다.
도 1은 대조군 및 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 각 삼채 추출물의 DPPH 유리기 소거 활성을 나타낸 그래프이다.
도 2는 대조군 및 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 각 삼채 추출물의 ABTS 유리기 소거 활성을 나타낸 그래프이다.
도 3은 대조군 및 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 각 삼채 추출물의 총 페놀성 화합물 함량을 나타낸 그래프이다.
도 4는 대조군 및 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 각 삼채 추출물의 총 항산화 활성을 나타낸 그래프이다.
도 2는 대조군 및 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 각 삼채 추출물의 ABTS 유리기 소거 활성을 나타낸 그래프이다.
도 3은 대조군 및 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 각 삼채 추출물의 총 페놀성 화합물 함량을 나타낸 그래프이다.
도 4는 대조군 및 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 각 삼채 추출물의 총 항산화 활성을 나타낸 그래프이다.
본 발명에서 사용된 모든 기술 및 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.
이하에서는 본 발명을 상세하게 설명한다. 다만, 본 발명의 권리는 하기에서 설명된 구현예에 한정되지 않고 청구범위에 기재된 바에 의해 정의되며, 본 발명의 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 청구범위에 기재된 권리범위 내에서 다양한 변형과 개작을 할 수 있다는 것은 자명하다.
<실시예>
건조 삼채 뿌리로부터 미숙성 삼채 뿌리 (이하, S-0), 락토바실러스 아시도필루스 (Lactobacillus acidophilus) MG501 발효숙성 삼채 뿌리 (이하 F-1), 비피도박테리윰 롱검 (Bifidobacterium longum) MG723 발효숙성 삼채 뿌리 (이하, F-2), 엔테로코커스 페시움 (Enterococcus faecium) MG89 발효숙성 삼채 뿌리 (이하, F-3), 스트렙토코커스 서머필러스 (Streptococcus thermophilus) MG510 발효숙성 삼채 뿌리 (이하, F-4), 사카로마이세스 세레비시아 (Saccharomyces cerecisae) MG111 발효숙성 삼채 뿌리 (이하, F-5)의 열수추출물을 제조하여 건조 삼채 뿌리를 이들로 발효시켜 제조하였다.
1. 발효균 준비
먼저 발효균을 배양하여 농축분말을 제조하기 위해 유산균류인 Lactobacillus acidophilus MG501와 Bifidobacterium longum MG723, Enterococcus faecium MG89 및 Streptococcus thermophilus MG510를 액체배지(뉴트리언트 브로스; Nutrients broth medium)에 접종하여 계대배양 후 고체배지(브이온 아가배지; Bouillon agar medium)에 분산시키고 25~30 ℃에서 24~48시간 건조시켜 분말로 만들었다. 또한 효모인 Saccharomyses cerevisiae MG111을 액체배지(포도당 배지; Glucose medium)에 접종하여 계대배양 후 고체배지(사브로드 아가배지; Sabouraud agar medium)에 분산시키고 25~30 ℃에서 24~48시간 건조시켜 분말로 만들었다.
2. 천연효소액 준비
천연효소 발효액 제조를 위해 무농약 재배된 완숙 직전의 미숙성 과일(성숙되기 전 녹색의 띈 상태의 감)을 월하 시에 세척 및 건조하고 발효용기에 담아 무정제 설탕을 가하여 밀봉한 후, 직사광선이 닿지 않으며 서늘하고 통풍이 원활한 장소에서 6개월 이상 발효시킨 다음, 상층액을 취하고 무명으로 여과시켰다.
3. 발효 및 추출
각각 제조된 발효균 농축 분말 및 천연효소 발효액을 이용하여 복합발효액을 제조하였다. 발효균 분말을 1×109 cfu/g로 2g을 취하여 정제수 50 ㎖에 넣고 실온에서 교반하여 균질하게 혼합하였고, 천연효소 농축액 1 g을 취하여 정제수 50 ㎖에 넣고 실온에서 교반하여 균질 혼합하였다. 발효균 발효액 50 ㎖과 천연효소 배양액 50 ㎖에 정제수를 900 ㎖ 넣어 전량을 1,000 ㎖로 하여 제조하였다. 건조 삼채 뿌리 200 g을 발효용 트레이에 넣고 준비된 복합발효액 400 ㎖에 침지하여 실온에서 24시간 방치시킨 후, 발효조 내부 선반에 올려놓고 40~50 ℃를 유지하면서 3일 동안 1차 발효시켰으며, 1차 발효 후 삼채 뿌리에 복합발효액 300 ㎖을 스프레이로 고르게 분사한 후 실온에서 24시간 동안 방치하고 다시 발효조 내부 선반에 올려놓고 40~50 ℃를 유지하면서 3일 동안 2차 발효시킨 후, 동일 과정을 한 번 더 반복하여 3차 발효를 시켜 발효숙성 삼채 뿌리를 제조하였다.
제조된 발효숙성 삼채 뿌리를 -80 ℃에서 72시간 동안 동결건조 시킨 후, 각각 100 g을 플라스크에 넣고 열수를 각각 500 ㎖씩 넣어 95~100 ℃ 조건 하의 추출항온 수조에서 4시간 동안 가열 및 추출한 후, 필터링하는 과정을 3회 반복하였다. 3회 반복하여 얻은 용액을 감압농축 후 동결건조하였다.
<항산화 활성 측정>
각 실험은 3회 이상의 반복 실험을 통하여 결과를 얻어 각각의 시료 농도에 대한 평균±표준편차로 나타내었다. 각 시료 농도군에 대한 유의 검정은 GraphPad Prism 5 프로그램을 이용하여 검정하였으며, One-way ANOVA의 Bonferroni post hoc test를 이용하여 그룹간의 차이를 통계 처리한 후, p<0.05 수준에서 유의성을 검정하였다.
1. DPPH에 의한 유리기 소거 효과 측정
상기 실시예에 따라 제조된 삼채 뿌리 열수추출물의 유리기 소거 효과는 Blois에 따라 DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl)에 대한 전자공여능 (electron donating ability)으로 분석시료에 대한 환원력을 측정하였으며, 발효균에 따른 삼채 뿌리 열수추출물이 DPPH 유리기를 50% 소거하는데 필요로 하는 농도 (IC50, Inhibition concentration)를 측정하였다. 즉, 실시예에 따라 제조된 삼체 추출물의 열수 추출물과 동량의 증류수를 혼합하여 여과지로 여과한 후 이 여과액 100 ㎕를 96 well plate에 넣은 후, 메탄올에 용해시킨 DPPH (α,α'-diphenyl-β-picryl-hydrayl) 용액 600 μM을 100 ㎕ 넣어 반응시켰다. 이를 실온에서 10분간 반응시킨 후 ELISA reader (Tecan Group Ltd., Mannedorf, Swizerland)로 540 nm 파장에서 흡광도의 변화를 측정하였다.
DPPH 라디칼 소거능은 자유 라디칼인 DPPH 시약을 이용하여 시료의 항산화 능력을 측정하는 실험으로 시료 내의 항산화물질과 반응 시 라디칼이 소거되면서 자색에서 노란색으로 탈색되는 원리를 이용하여, 유산균에 따른 삼채 뿌리 열수추출물의 DPPH 유리기 소거 활성을 비교하여 분석하였다. 그 결과 도 1과 같이 IC50 값으로 비교해본 결과, 발효시키지 않은 미숙성 삼채 뿌리인 S-0의 경우, 2,552.0 μg/㎖로 가장 높게 나타났으며, F-2는 1,993.2 μg/㎖, F-1은 1,916.0 μg/㎖, F-4는 1,573.2 μg/㎖, F-3은 1,332.7 μg/㎖으로, F-3 및 F-4가 S-0에 대해 유의적인 차이를 보였으며, F-3의 DPPH 유리기 소거 활성에 대한 IC50 값이 가장 낮게 나타났다.
2. ABTS에 의한 유리기 소거 효과 측정
상기 실시예에 따라 제조된 삼채 뿌리 열수추출물의 ABTS 유리기 소거 활성은 Re 등의 방법에 의하여 측정하였다. ABTS (2,2'-Azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)와 과황화칼륨(potassium persulfate)를 7.4 : 2.6의 비율로 혼합한 후, 37 ℃의 암소에서 24시간 방치하였다. 암소반응을 시킨 ABTS radical solution과 1X PBS를 3:12의 비율로 혼합하여 사용하였다. 표준액과 삼채 뿌리 열수추출물과 동량의 증류수를 혼합하여 여과지로 여과한 후 이 여과액 50 ㎕를 96 웰 플레이트(well plate)에 넣은 후, ABTS radical solution을 150 ㎕ 넣어 실온의 암소에서 30분간 반응시켰다. 이를 734 nm에서 흡광도의 변화를 측정하였다.
ABTS 라디칼 소거능은 과황화칼륨(potassium persulfate)과 ABTS 시약의 반응에 의해 생성된 ABTS 자유 라디칼이 시료 내의 항산화 성분에 의해 소거되면서 청록색이 탈색되는 원리를 이용하여, 발효균에 따른 삼채 뿌리 열수추출물의 ABTS 유리기 소거 활성을 비교하여 분석하였다. 그 결과, 도 2와 같이 IC50 값(value)으로 비교해본 결과, 발효시키지 않은 미숙성 삼채 뿌리인 S-0의 경우, 2,157.8 μg/㎖로 가장 높게 나타났으며, F-2는 1,513.4 μg/㎖, F-1은 1,361.0 μg/㎖, F-4는 1,246.6 μg/㎖, F-3은 1,188.2 μg/㎖ 순으로, F-1, F-2, F-3 및 F-4 모두가 S-0에 대해 유의적인 차이를 보였으며, 특히 F-3의 ABTS유리기 소거 활성에 대한 IC50 값이 가장 낮게 나타났다.
3. 총 페놀성 화합물 함량 측정
총 페놀성 화합물 함량은 폴린-데니스(Folin-Denis)법에 의하여 측정하였다. 상기 실시예에 따라 제조된 삼채 추출물 0.2 ㎖를 시험관에 취하고 증류수를 가하여 2 ㎖로 만든 후, 여기에 0.2 ㎖ 폴린-치오칼토 페놀 시약(Folin-Ciocalteus phenol reagent)을 첨가하여 혼합한 후 3분간 실온에 방치하였다. 3분 후 Na2CO3 포화 용액 0.4 ㎖를 가하여 혼합하고 증류수를 첨가하여 4 ㎖로 만든 후 실온에서 1시간 방치하여 상등액을 750 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도는 tannic acid를 이용한 표준곡선으로부터 g 중의 mg tannic acid equivalent (TAE, dry basis)로 환산하여 나타내었다.
페놀성 화합물은 방향족화합물에 하이드록실기(-OH)가 결합한 화합물을 일컫는 것으로 활성산소에 노출 시 DNA, 세포구성 단백질 및 효소의 손상을 보호하는 항산화, 항암작용 등을 가지는 것으로 알려져 있다. 또한 총 페놀함량이 증가할수록 항산화 활성과 같은 생리활성이 증가된다고 보고되고 있다. 발효균에 따른 삼채 뿌리 열수추출물의 총 페놀성 화합물 함량을 도 3에 나타내었다. 발효를 하지 않은 삼채 뿌리 열수추출물의 경우(S-0) 219.9 mg TAE/g의 총 페놀성 화합물 함량을 나타낸 반면, Lactobacillus acidophilus MG501로 발효시킨 삼채 뿌리 열수추출물인 F-1에서 611.4 mg TAE/g로 가장 높게 나타났으며, 다음으로 F-3는 589.1 mg TAE/g, F-2는 528.0 mg TAE/g, F-4는 524.2 mg TAE/g의 순으로 나타났다. 발효시킨 균주에 상관없이 발효시킨 삼채 뿌리 열수추출물 모두에서 발효시키지 않은 삼채 뿌리 열수추출물에 비해 유의적으로 증가하는 것을 알 수 있었으며(p<0.05), 특히 Lactobacillus acidophilus MG501로 발효시킨 삼채 뿌리 열수추출(F-4)물의 총 페놀성 화합물 함량은 대조군인 S-0에 비해 2.8배 높게 나타났다. 이와 같은 결과는 단백질과 결합된 고분자의 페놀성 화합물이 균주를 달리하여 발효함에 따라 결합이 파괴 또는 새로운 페놀성 화합물이 생성된 것으로 유추된다.
4. 총 항산화력 측정
총 항산화력 측정은 OxiSelectTM Total Antioxidant Capacity (TAC) Assay Kit (Cell BioLabs, Inc., San Diego, CA, USA)를 이용하여 측정하였으며, 제시된 방법에 따라 처리한 다음, 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 요산(uric acid)의 반응을 표준 곡선(standard curve)으로 하여 각각 시료 g당의 총 항산화력을 uric acid의 반응과 비교하여 나타내었다.
발효 균주에 따른 삼채 뿌리 열수추출물의 총 항산화능을 측정하여 도 4에 나타내었다. 발효를 하지 않은 삼채 뿌리 열수추출물인 S-0의 경우, 0.014 mM Uric acid/mg으로 나타났으며, F-1에서 0.039 mM Uric acid/mg으로 가장 높게 나타났으며, 다음으로 F-3는 0.034 mM Uric acid/mg, F-4는 0.031 mM Uric acid/mg, F-2는 0.029 mM Uric acid/mg의 순으로 나타났다. 총 항산화능 측정 결과 역시, 앞서 언급된 총 페놀성 함량 측정과 동일한 결과로, S-0에 비해 2.8배 높게 나타나 우수한 항산화능을 나타내었다.
Claims (14)
- 유산균 또는 유산균의 배양물로 발효시킨, 항산화 활성을 갖는 삼채 추출물.
- 제1항에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스 아시도필루스, 비피도박테리움 롱검, 엔테로코커스 페시움 및 스트렙토코커스 서머필러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 균인 것을 특징으로 하는 삼채 추출물.
- 제1항에 있어서, 상기 배양물은 천연효소를 포함하는 것을 특징으로 하는 삼채 추출물.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 삼채 추출물은 삼채 뿌리로부터 추출한 것인 삼채 추출물.
- 건조 삼채에 유산균을 접종하여 발효시켜 발효 삼채를 수득하고, 추출하는 것을 특징으로 하는 삼채 추출물의 제조방법.
- 제5항에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스 아시도필루스, 비피도박테리움 롱검, 엔테로코커스 페시움 및 스트렙토코커스 서머필러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 균인 것을 특징으로 하는 삼채 추출물의 제조방법.
- 제5항에 있어서, 상기 건조 삼채는 건조된 삼채 뿌리인 것을 특징으로 하는 삼채 추출물의 제조방법.
- 제5항에 있어서, 상기 접종은 유산균이 포함된 발효액에 건조 삼채를 침지시키는 것을 특징으로 하는 삼채 추출물의 제조방법.
- 제8항에 있어서, 상기 발효액은 1×108 내지 1×1010 cfu/g의 유산균을 포함하는 것을 특징으로 하는 삼채 추출물의 제조방법.
- 제8항에 있어서, 상기 발효액은 천연효소를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 삼채 추출물의 제조방법.
- 제5항에 있어서, 상기 추출은 열수 추출인 것을 특징으로 하는 삼채 추출물의 제조방법.
- 제11항에 있어서, 상기 열수 추출은 상기 발효 삼채를 90 내지 100 ℃의 열수에서 3 내지 5시간 동안 가열하여 추출물을 추출하는 것을 특징으로 하는 삼채 추출물의 제조방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 삼채 추출물 또는 제5항 내지 제12항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 삼채 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화용 조성물.
- 제13항에 있어서, 상기 조성물은 약학 조성물, 식품 조성물, 화장료 조성물 또는 사료 첨가용 조성물에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 항산화용 조성물.
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