JP2023097375A - ２菌株の共発酵によるシゾフィランとエルゴチオネインの調製方法 - Google Patents
２菌株の共発酵によるシゾフィランとエルゴチオネインの調製方法 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】２菌株の共発酵によるシゾフィランとエルゴチオネインの調製方法を提供する。【解決手段】方法は、下記のステップを含む：スエヒロタケの種子発酵液とキノコの種子発酵液を共発酵培地に接種して共発酵培養を行い、シゾフィランとエルゴチオネイン含有の発酵液を得る。【効果】スエヒロタケとエルゴチオネインを調製する菌株を共発酵させたことで、２菌株共発酵が相乗効果を発揮し、エルゴチオネインの収量を有意に改善し、得られる共発酵液が顕著な抗酸化作用とフリーラジカルの除去能力を有する。【選択図】なし
Description
本発明は、微生物発酵の技術分野に属し、具体的には、２菌株の共発酵によるシゾフィランとエルゴチオネインの調製方法である。
エルゴチオネイン（ＥＧＴ）の化学名称は２－メルカプトヒスチジントリメチル分子内塩であり、希少な天然キラルアミノ酸である。エルゴチオネインは、抗酸化、フリーラジカルの除去、金属イオンのキレート化、紫外線による損傷の防止、がんの抑制などにおいて、独自の生理機能を有し、ある面ではグルタチオンなどの天然の抗酸化物質よりも優れた生理機能を持っており、食品添加物、健康製品、化粧品等の分野において広く使用されている。現在、エルゴチオネインの生産方法は主に単一の食用菌液体発酵方法を採用しており、発酵産物を後処理して最終的にエルゴチオネインを取得している。しかし、既存の製造方法で得られるエルゴチオネインの収率は一般的に高くなく、増大する市場の需要を満たすことができない。
シゾフィラン（ＳＰＧ）は、スエヒロタケの発酵により得られる水溶性多糖類であり、腫瘍の抑制、抗菌消炎、抗輻射、有機体免疫力の向上などの様々な生理活性を有する。近年、シゾフィランの生産方法主に単一の食用菌液体発酵方法を採用しており、発酵産物を後処理して最終的にシゾフィランを取得している。しかし、発酵により得られるシゾフィランは、再溶解しにくい、生体吸収に不利などの特性があり、その用途が大きく限定されている。
ＣＮ１０９９３９０２７Ａは、ヤマブシタケの発酵によるエルゴチオネイン含有の化粧品原液の調製方法を開示しており、下記のステップを含む：（１）ヤマブシタケの菌糸を液体種子培地に接種して培養して種子液を得る；（２）種子液を発酵培地に接種して発酵させ、エルゴチオネインの前駆物質を添加して最後まで発酵させて発酵液を得る；（３）菌糸体含有の発酵液を処理し、エルゴチオネイン含有の発酵原液を得て、エルゴチオネイン含有の化粧品原液とする。当該方法は、現在広く用いられているエルゴチオネインの生産方法であり、単一の食用菌液体発酵方法を採用し、発酵製品の後処理を行うため、当該原液製品は、３００ｍｇ／Ｌぐらいのエルゴチオネインを含有する。
ＣＮ１１２１９５２１５Ａは、タモギタケとマツタケの菌糸体を複合発酵させてエルゴチオネインを調製する方法を開示しており、下記のステップを含む：マツタケの菌糸体を培養により得たタモギタケ種子液に接種し、一定量の種子培地を追加し、２～３日間継続培養する。培養により得たタモギタケとマツタケの種子液を、発酵培地体積の５～２０％の接種量で発酵培地に接種した後前駆物質を添加して２～４日間発酵させた後、少量の前駆物質を追加して３～４日間継続発酵させる。発酵後の発酵液に対して処理を行い、エルゴチオネイン含有の溶液を得た。当該発明は、タモギタケとマツタケをエルゴチオネインの生産株として選択し、複合発酵方式によりエルゴチオネインの収率を増加させる目的を達成し、最終発酵液におけるエルゴチオネイン含有量が８８０ｍｇ／Ｌぐらいまで達したが、エルゴチオネインの収率はまだ改善の余地がある。
ＣＮ１０７５５７４０７Ａは、スエヒロタケの発酵産物であるシゾフィランの分子量の調節方法を開示しており、当該方法では、スエヒロタケの傾斜株を採取し、ＰＤＡ培地試験管の傾斜面上で培養して種子発酵液を得る。種子培養液を発酵タンクの中で発酵させ、発酵条件をそれぞれ制御し、発酵終了後に材料を排出し、菌糸体を除去する。後処理して精製シゾフィランを得る。当該発明方法は、単一の食用菌液体発酵方法を採用しているため、スエヒロタケの発酵において、発酵条件を個別に制御する必要があり、調製プロセスが複雑である。
ＣＮ１１３３３７５４５Ａは、スエヒロタケの発酵産物及びその調製方法、スキンケア製品、スエヒロタケ培地を開示している。当該スエヒロタケの発酵産物の調製方法は、下記のステップを含む：スエヒロタケ培地においてスエヒロタケを培養し、発酵産物を収集する。そこで、前記スエヒロタケ培地は、プエラリアを含む。培地にプエラリア粉末を添加してスエヒロタケを培養し、発酵産物を収集する。当該発明はスエヒロタケ培地がプエラリアを含有する方法により、提高スエヒロタケの発酵産物の抗酸化レベルを高めた。
そのため、２菌株の共発酵によるシゾフィランとエルゴチオネインの調製方法を開発する必要がある。
従来技術の欠点を考慮して、本発明は、２菌株の共発酵によるシゾフィランとエルゴチオネインの調製方法を提供する。前記方法によりスエヒロタケとエルゴチオネインを調製する菌株を共発酵させた結果、２菌株共発酵が相乗効果を発揮し、エルゴチオネインの収量を有意に改善し、得られる共発酵液が顕著な抗酸化作用とフリーラジカルの除去能力を有することを見つけた。
上記の目的を達成するために、本発明は以下の実施形態を採用する。
一実施形態において、本発明は２菌株の共発酵によるシゾフィランとエルゴチオネインの調製方法を提供し、前記方法は、下記のステップを含む：スエヒロタケの種子発酵液とキノコの種子発酵液を共発酵培地に接種して共発酵培養を行い、シゾフィランとエルゴチオネイン含有の発酵液を得る。
本発明において、スエヒロタケとエルゴチオネインを調製する菌株を共発酵させた結果、２菌株共発酵に競争がないだけでなく、相乗効果を発揮することで、菌糸体からエルゴチオネインを大量に調整することが可能になり、エルゴチオネイン製品の品質を保証し、エルゴチオネインの収量を顕著に改善した。また、調製プロセスが簡単であり、特にエルゴチオネインの大規模生産に適している。
特に、最終的に得られる発酵液がシゾフィランとエルゴチオネインを含有するため、前記シゾフィランとエルゴチオネインが互いに協力し合い、相乗効果を発揮し、前記組成物がＤＰＰＨフリーラジカル、ヒドロキシラジカル及びスーパーオキシドアニオンフリーラジカルに対する除去効果を改善し、皮膚組織の抗酸化効果を高め、皮膚組織のフリーラジカルの含有量を減らし、皮膚の光老化を遅らせる役割を果たす。
好ましくは、前記共発酵培地は、質量百分率でグルコース０．５～５％、トリプトン０．５～３％、酵母エキス０．１～３％、酵母エキス０．１～０．５％、硫酸マグネシウム０．０１～０．１５％及びリン酸二水素カリウム０．０５～０．２％、残りは水から構成される。
本発明において、適切な培地を選択することで、スエヒロタケとキノコの共発酵培養が可能になるが、これは２菌株の相乗効果に有益であり、エルゴチオネインの収率をさらに向上させる。
前記共発酵培地の質量を１００％とすると、グルコースの含有量は０．５～５％であり、例えば０．５％、０．６％、０．８％、１％、１．２％、１．４％、１．６％、１．８％、２％、２．２％、２．４％、２．６％、２．８％、３％、３．２％、３．４％、３．６％、３．８％、４％、４．２％、４．４％、４．６％、４．８％、５％等でもよく、好ましくは３～５％である。
前記共発酵培地の質量を１００％とすると、トリプトンの含有量は０．５～３％であり、例えば０．５％、０．６％、０．８％、１％、１．２％、１．４％、１．６％、１．８％、２％、２．２％、２．４％、２．６％、２．８％、３％等でもよく、好ましくは２～３％である。
前記共発酵培地の質量を１００％とすると、酵母エキスの含有量は０．１～３％であり、例えば０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．８％、１％、１．２％、１．４％、１．６％、１．８％、２％、２．２％、２．４％、２．６％、２．８％、３％等でもよく、好ましくは２～３％である。
前記共発酵培地の質量を１００％とすると、酵母エキスの含有量は０．１～０．５％であり、例えば０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％等でもよい。
前記共発酵培地の質量を１００％とすると，硫酸マグネシウムの含有量は０．０１～０．１５％であり、例えば０．０１％、０．０２％、０．０４％、０．０６％、０．０８％、０．１％、０．１２％、０．１５％等でもよい。
前記共発酵培地の質量を１００％とすると、リン酸二水素カリウムの含有量は０．０５～０．２％であり、例えば０．０５％、０．０６％、０．０８％、０．１％、０．１２％、０．１５％、０．１８％、０．２％等でもよい。
好ましくは、前記共発酵培地のｐＨは５．５～７．０であり、例えば５．５、５．６、５．８、６．０、６．２、６．５、６．７、６．９、７．０等でもよい。
好ましくは、前記スエヒロタケの種子発酵液中菌体の質量百分率は５～３０％であり、例えば５％、６％、８％、１０％、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％、２２％、２４％、２６％、２８％、３０％等でもよい。
好ましくは、前記キノコの種子発酵液中菌体の質量百分率は５～３０％であり、例えば５％、６％、８％、１０％、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％、２２％、２４％、２６％、２８％、３０％等でもよい。
好ましくは、前記共発酵培地において、スエヒロタケの種子発酵液の接種量は２～２０ｗｔ％であり、例えば２ｗｔ％、３ｗｔ％、４ｗｔ％、５ｗｔ％、６ｗｔ％、７ｗｔ％、８ｗｔ％、９ｗｔ％、１０ｗｔ％、１１ｗｔ％、１２ｗｔ％、１３ｗｔ％、１４ｗｔ％、１５ｗｔ％、１６ｗｔ％、１７ｗｔ％、１８ｗｔ％、１９ｗｔ％、２０ｗｔ％等でもよい。
好ましくは、前記共発酵培地において、キノコの種子発酵液の接種量は５～２０ｗｔ％であり、例えば５ｗｔ％、６ｗｔ％、７ｗｔ％、８ｗｔ％、９ｗｔ％、１０ｗｔ％、１１ｗｔ％、１２ｗｔ％、１３ｗｔ％、１４ｗｔ％、１５ｗｔ％、１６ｗｔ％、１７ｗｔ％、１８ｗｔ％、１９ｗｔ％、２０ｗｔ％等でもよい。
好ましくは、前記共発酵培養の具体的なステップは、スエヒロタケの種子発酵液とキノコの種子発酵液を、共発酵培地を含むフラスコに接種し、インキュベーターシェーカーに置いて振盪培養を行うことである。
好ましくは、前記振盪培養の温度は２８～３０℃であり、例えば２８℃、２８．５℃、２９℃、２９．５℃、３０℃等でもよく、振盪培養の回転速度は１００～１５０ｒ／ｍｉｎであり、例えば１００ｒ／ｍｉｎ、１１０ｒ／ｍｉｎ、１２０ｒ／ｍｉｎ、１４０ｒ／ｍｉｎ、１５０ｒ／ｍｉｎ等でもよく、振盪培養の時間は３～５日であり、例えば３日、３．５日、４日、４．５日、５日等でもよい。
好ましくは、前記共発酵培養後、超音波処理及び／又は遠心分離を更に含む。
好ましくは、前記超音波処理の仕事率は４００～１０００Ｗであり、例えば４００Ｗ、５００Ｗ、６００Ｗ、７００Ｗ、８００Ｗ、９００Ｗ、１０００Ｗ等でもよく、超音波処理の時間は５～２０ｍｉｎであり、例えば５ｍｉｎ、６ｍｉｎ、８ｍｉｎ、１０ｍｉｎ、１２ｍｉｎ、１４ｍｉｎ、１６ｍｉｎ、１８ｍｉｎ、２０ｍｉｎ等でもよい。
好ましくは、前記遠心分離の回転速度は８０００～１００００ｒ／ｍｉｎであり、例えば８０００ｒ／ｍｉｎ、８５００ｒ／ｍｉｎ、９０００ｒ／ｍｉｎ、９５００ｒ／ｍｉｎ等でもよく、遠心分離の時間は５～１０ｍｉｎであり、例えば５ｍｉｎ、６ｍｉｎ、７ｍｉｎ、８ｍｉｎ、９ｍｉｎ、１０ｍｉｎ等でもよい。
好ましくは、前記スエヒロタケの種子発酵液は以下の調製方法により調製される。
ステップ（ａ）：スエヒロタケをＰＤＡ培地に接種し、活性化培養を行うことで活性化種子を得る。
ステップ（ｂ）：ステップ（ａ）から得られた活性化種子を液体培地に接種し、種子培養を行うことでスエヒロタケの種子発酵液を得る。
好ましくは、ステップ（ａ）において、前記活性化培養の温度は２４～２６℃であり、例えば２４℃、２５．５℃、２５℃、２５．５℃、２６℃等でもよく、活性化培養の時間は２～５日であり、例えば２日、２．５日、３日、３．５日、４日、５日等でもよい。
好ましくは、ステップ（ｂ）において、前記液体培地は、質量百分率でグルコース０．５～２％、酵母エキス０．１～２％、硫酸マグネシウム０．０１～０．１５％及びリン酸二水素カリウム０．０５～０．２％、残りは水から構成される。
前記液体培地の質量を１００％とすると、前記グルコースの含有量は０．５～２％であり、例えば０．５％、０．６％、０．８％、１％、１．２％、１．４％、１．６％、１．８％、２％等でもよい。
前記液体培地の質量を１００％とすると、前記酵母エキスの含有量は０．１～２％であり、例えば０．１％、０．２％、０．５％、０．６％、０．８％、１％、１．２％、１．４％、１．６％、１．８％、２％等でもよい。
前記液体培地の質量を１００％とすると、前記硫酸マグネシウムの含有量は０．０１～０．１５％であり、例えば０．０１％、０．０２％、０．０４％、０．０６％、０．０８％、０．１％、０．１２％、０．１５％等でもよい。
前記液体培地の質量を１００％とすると、リン酸二水素カリウムの含有量は０．０５～０．２％であり、例えば０．０５％、０．０６％、０．０８％、０．１％、０．１２％、０．１５％、０．１８％、０．２％等でもよい。
好ましくは、ステップ（ｂ）において、前記種子培養はインキュベーターシェーカーの中で行われ、培養温度は２４～２６℃であり、例えば２４℃、２５．５℃、２５℃、２５．５℃、２６℃等でもよく、培養回転速度は１５０～２００ｒ／ｍｉｎであり、例えば１５０ｒ／ｍｉｎ、１６０ｒ／ｍｉｎ、１７０ｒ／ｍｉｎ、１８０ｒ／ｍｉｎ、１９０ｒ／ｍｉｎ、２００ｒ／ｍｉｎ等でもよく、培養時間は３～５日であり、例えば３日、３．５日、４日、４．５日、５日等でもよい。
好ましくは、前記キノコの種子発酵液は、以下の調製方法により調製される：キノコの菌糸体を種子培地に接種し、種子培養を行うことでキノコの種子発酵液を得る。
好ましくは、前記キノコは、ヤマブシタケ、ヒラタケ、霊芝、キングヒラタケ、ホウビタケ、タモギタケ、マツタケ、ヒラタケまたはキクラゲ中のいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせを含む。
好ましくは、前記種子培地は、質量百分率でスクロース１～１０％、豆粉３５％、とうもろこし粉１～３％、ビタミンＢ１ ０．１～０．３％、硫酸マグネシウム０．０１～０．１５％及びリン酸二水素カリウム０．０５～０．２％、残りは水から構成される。
前記種子培地の質量を１００％とすると、前記スクロース含有量は１～１０％であり、例えば１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％等でもよい。
前記種子培地の質量を１００％とすると、前記豆粉含有量は３～５％であり、例えば３％、３．５％、４％、４．５％、５％等でもよい。
前記種子培地の質量を１００％とすると、前記とうもろこし粉含有量は１～３％であり、例えば１％、１．５％、２％、２．５％、３％等でもよい。
前記種子培地の質量を１００％とすると、前記ビタミンＢ１の含有量は０．１～０．３％であり、例えば０．１％、０．１５％、０．２％、０．２５％、０．３％等でもよい。
前記種子培地の質量を１００％とすると、前記硫酸マグネシウムの含有量は０．０１～０．１５％であり、例えば０．０１％、０．０２％、０．０４％、０．０６％、０．０８％、０．１％、０．１２％、０．１５％等でもよい。
前記種子培地の質量を１００％とすると、リン酸二水素カリウムの含有量は０．０５～０．２％であり、例えば０．０５％、０．０６％、０．０８％、０．１％、０．１２％、０．１５％、０．１８％、０．２％等でもよい。
好ましくは、前記種子培養は、インキュベーターシェーカーの中で行われ、培養温度は２３～２５℃であり、例えば２３℃、２３．５℃、２４℃、２４．５℃、２５℃等でもよく、培養回転速度は１６０～１８０ｒ／ｍｉｎであり、例えば１６０ｒ／ｍｉｎ、１６５ｒ／ｍｉｎ、１７０ｒ／ｍｉｎ、１７５ｒ／ｍｉｎ、１８０ｒ／ｍｉｎ等でもよく、培養時間は１～３日であり、例えば１日、１．５日、２日、２．５日、３日等でもよい。
好ましくは、前記シゾフィランとエルゴチオネイン含有の発酵液において、エルゴチオネインの含有量は９００ｍｇ／Ｌ以上であり、例えば９００ｍｇ／Ｌ、９２０ｍｇ／Ｌ、９４０ｍｇ／Ｌ、９６０ｍｇ／Ｌ、９８０ｍｇ／Ｌ、１０００ｍｇ／Ｌ、１１００ｍｇ／Ｌ、１２００ｍｇ／Ｌ、１４００ｍｇ／Ｌ、１６００ｍｇ／Ｌ、２０００ｍｇ／Ｌ等でもよく、好ましくは９５０～１０５０ｍｇ／Ｌである。
好ましくは、前記シゾフィランとエルゴチオネイン含有の発酵液において、シゾフィランの含有量は９ｇ／Ｌ以上であり、例えば９ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１１ｇ／Ｌ、１２ｇ／Ｌ、１３ｇ／Ｌ、１４ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、１６ｇ／Ｌ、１８ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ等でもよく、好ましくは９～１２ｇ／Ｌである。
従来技術に比べて、本発明は以下のような有利な効果を有する。
（１）本発明において、スエヒロタケとエルゴチオネインを調製する菌株を共発酵させた結果、２菌株共発酵に競争がないだけでなく、相乗効果を発揮することで、菌糸体からエルゴチオネインを大量に調整することが可能になり、エルゴチオネイン製品の品質を保証し、エルゴチオネインの収量を顕著に改善した。また、調製プロセスが簡単であり、特にエルゴチオネインの大規模生産に適している。
（２）本発明は、最終的に得られる発酵液がシゾフィランとエルゴチオネインを含有するため、前記シゾフィランとエルゴチオネインが互いに協力し合い、相乗効果を発揮し、前記組成物がＤＰＰＨフリーラジカル、ヒドロキシラジカル及びスーパーオキシドアニオンフリーラジカルに対する除去効果を改善し、皮膚組織の抗酸化効果を高め、皮膚組織のフリーラジカルの含有量を減らし、皮膚の光老化を遅らせる役割を果たす。
以下、具体的な実施形態を通じて本発明の技術的解決策をさらに説明する。前記実施形態は、本発明の理解を高めるためのものであり、本発明を限定するものではないことを理解されたい。
以下の実施例および比較例において、技術または条件が記載されていないものは、この分野の文献に記載された技術、条件、または製品仕様に従って実施することができる。使用される試薬または機器は、メーカーが記載されていないが、通常の経路で入手できる市販品、従来技術によって調製できるものである。
調製例１
本調製例はスエヒロタケの種子発酵液を提供し、前記スエヒロタケの種子発酵液は以下の調製方法により調製される。
（ａ） スエヒロタケをＰＤＡ培地に接種し、２４℃で３日間活性化培養を行うことで活性化種子を得、それを４℃で保存して種子の保存処理を行う。
そこで、前記ＰＤＡ培地は、質量百分率でジャガイモ２０％、グルコース２％及び寒天２％、残りは水から構成される。ＰＤＡ培地を配合後、１２１℃で２０ｍｉｎ間滅菌処理を行う。
（ｂ）ステップ（ａ）から得られた活性化種子を液体培地のフラスコに接種し、インキュベーターシェーカーに置いて振盪培養を行う。培養温度は２４℃であり、培養回転速度は１５０ｒ／ｍｉｎであり、培養時間は３日であり、菌体含有量が１０質量％のスエヒロタケの種子発酵液が得られる。
そこで、前記液体培地は、質量百分率でグルコース１％、酵母エキス１％、硫酸マグネシウム０．０５％及びリン酸二水素カリウム０．１％、残りは水から構成される。液体培地を配合後、１２１℃で２０ｍｉｎ間滅菌処理を行う。
調製例２
本調製例はスエヒロタケの種子発酵液を提供し、前記スエヒロタケの種子発酵液は以下の調製方法により調製される。
（ａ） スエヒロタケをＰＤＡ培地に接種し、２５℃で４日間活性化培養を行うことで活性化種子を得、それを４℃で保存して種子の保存処理を行う。
そこで、前記ＰＤＡ培地は、質量百分率でジャガイモ２０％、グルコース２％及び寒天２％、残りは水から構成される。ＰＤＡ培地を配合後、１２１℃で２０ｍｉｎ間滅菌処理を行う。
（ｂ）ステップ（ａ）から得られた活性化種子を液体培地のフラスコに接種し、インキュベーターシェーカーに置いて振盪培養を行う。培養温度は２５℃であり、培養回転速度は１８０ｒ／ｍｉｎであり、培養時間は４日であり、菌体含有量が１８質量％のスエヒロタケの種子発酵液が得られる。
そこで、前記液体培地は、質量百分率でグルコース１％、酵母エキス１％、硫酸マグネシウム０．０５％及びリン酸二水素カリウム０．１％、残りは水から構成される。液体培地を配合後、１２１℃で２０ｍｉｎ間滅菌処理を行う。
調製例３
本調製例はスエヒロタケの種子発酵液を提供し、前記スエヒロタケの種子発酵液は以下の調製方法により調製される。
（ａ） スエヒロタケをＰＤＡ培地に接種し、２６℃で５日間活性化培養を行うことで活性化種子を得、それを４℃で保存して種子の保存処理を行う。
そこで、前記ＰＤＡ培地は、質量百分率でジャガイモ２０％、グルコース２％及び寒天２％、残りは水から構成される。ＰＤＡ培地を配合後、１２１℃で２０ｍｉｎ間滅菌処理を行う。
（ｂ）ステップ（ａ）から得られた活性化種子を液体培地のフラスコに接種し、インキュベーターシェーカーに置いて振盪培養を行う。培養温度は２６℃であり、培養回転速度は２００ｒ／ｍｉｎであり、培養時間は５日であり、菌体含有量が２５質量％のスエヒロタケの種子発酵液が得られる。
そこで、前記液体培地は、質量百分率でグルコース１％、酵母エキス１％、硫酸マグネシウム０．０５％及びリン酸二水素カリウム０．１％、残りは水から構成される。液体培地を配合後、１２１℃で２０ｍｉｎ間滅菌処理を行う。
調製例４
本調製例はキノコの種子発酵液を提供し、前記キノコの種子発酵液は以下の調製方法により調製される。ヤマブシタケの菌糸体を液体培地のフラスコに接種し、インキュベーターシェーカーに置いて振盪培養を行う。培養温度は２３℃であり、培養回転速度は１６０ｒ／ｍｉｎであり、培養時間は１日であり、菌体含有量が１２質量％のヤマブシタケの種子発酵液が得られる。
そこで、前記種子培地は、質量百分率でスクロース５％、豆粉４％、とうもろこし粉２％、ビタミンＢ１ ０．２％、硫酸マグネシウム０．１％及びリン酸二水素カリウム０．０５％、残りは水から構成される。種子培地を配合後、１２１℃で２０ｍｉｎ間滅菌処理を行う。
調製例５
本調製例はキノコの種子発酵液を提供し、前記キノコの種子発酵液は以下の調製方法により調製される。ヒラタケの菌糸体を液体培地のフラスコに接種し、インキュベーターシェーカーに置いて振盪培養を行う。培養温度は２４℃であり、培養回転速度は１７０ｒ／ｍｉｎであり、培養時間は２日であり、菌体含有量が２３質量％のヒラタケの種子発酵液が得られる。
そこで、前記種子培地は、質量百分率でスクロース６％、豆粉３％、とうもろこし粉１％、ビタミンＢ１ ０．３％、硫酸マグネシウム０．１％及びリン酸二水素カリウム０．０５％、残りは水から構成される。種子培地を配合後、１２１℃で２０ｍｉｎ間滅菌処理を行う。
調製例６
本調製例はキノコの種子発酵液を提供し、前記キノコの種子発酵液は以下の調製方法により調製される。マツタケの菌糸体を液体培地のフラスコに接種し、インキュベーターシェーカーに置いて振盪培養を行う。培養温度は２３℃であり、培養回転速度は１８０ｒ／ｍｉｎであり、培養時間は３日であり、菌体含有量が３０質量％のマツタケの種子発酵液が得られる。
そこで、前記種子培地は、質量百分率スクロース６％、豆粉３％、とうもろこし粉１％、ビタミンＢ１ ０．３％、硫酸マグネシウム０．１％及びリン酸二水素カリウム０．０５％、残りは水から構成される。種子培地を配合後、１２１℃で２０ｍｉｎ間滅菌処理を行う。
実施例１
本実施例は２菌株の共発酵によるシゾフィランとエルゴチオネインの調製方法を提供し、前記方法は具体的に下記のステップを含む。
（１）調製例１が提供するスエヒロタケの種子発酵液と調製例４が提供するキノコの種子発酵液を、共発酵培地を含むフラスコに接種し、インキュベーターシェーカーに置いて振盪培養を行うことで、発酵液を得る。
そこで、前記共発酵培地は、質量百分率でグルコース３％、トリプトン３％、酵母エキス３％、酵母エキス０．３％、硫酸マグネシウム０．１％及びリン酸二水素カリウム０．０５％、残りは水から構成され、ｐＨは６．０である。
そこで、スエヒロタケの種子発酵液の接種量は１０ｗｔ％であり、キノコの種子発酵液の接種量は１０ｗｔ％である。前記振盪培養の温度は２８℃であり、振盪培養の回転速度は１２０ｒ／ｍｉｎであり、振盪培養の時間は４日である。
（２）ステップ（１）から得られた発酵液を、まず８００Ｗの仕事率で１５ｍｉｎ間超音波処理を行い、その後、９０００ｒ／ｍｉｎの回転速度で８ｍｉｎ間遠心分離して菌糸体をろ過することで、シゾフィランとエルゴチオネイン含有の発酵液を得る。
実施例２
本実施例は２菌株の共発酵によるシゾフィランとエルゴチオネインの調製方法を提供し、前記方法は具体的に下記のステップを含む。
（１）調製例２が提供するスエヒロタケの種子発酵液と調製例５が提供するキノコの種子発酵液を、共発酵培地を含むフラスコに接種し、インキュベーターシェーカーに置いて振盪培養を行うことで、発酵液を得る。
そこで、前記共発酵培地は、質量百分率でグルコース５％、トリプトン２％、酵母エキス２％、酵母エキス０．２％、硫酸マグネシウム０．１％及びリン酸二水素カリウム０．０６％、残りは水から構成され、ｐＨは６．５である。
そこで、スエヒロタケの種子発酵液の接種量は１２ｗｔ％であり、キノコの種子発酵液の接種量は８ｗｔ％である。前記振盪培養の温度は２８℃であり、振盪培養の回転速度は１１０ｒ／ｍｉｎであり、振盪培養の時間は４日である。
（２）ステップ（１）から得られた発酵液を、まず１０００Ｗの仕事率で５ｍｉｎ間超音波処理を行い、その後、８０００ｒ／ｍｉｎの回転速度で１０ｍｉｎ間遠心分離して菌糸体をろ過することで、シゾフィランとエルゴチオネイン含有の発酵液を得る。
実施例３
本実施例は２菌株の共発酵によるシゾフィランとエルゴチオネインの調製方法を提供し、前記方法は具体的に下記のステップを含む。
（１）調製例３が提供するスエヒロタケの種子発酵液と調製例６が提供するキノコの種子発酵液を、共発酵培地を含むフラスコに接種し、インキュベーターシェーカーに置いて振盪培養を行うことで、発酵液を得る。
そこで、前記共発酵培地は、質量百分率でグルコース４％、トリプトン２．５％、酵母エキス ２．５％、酵母エキス０．１％、硫酸マグネシウム０．０８％及びリン酸二水素カリウム０．０６％、残りは水から構成され、ｐＨは５．８である。
そこで、スエヒロタケの種子発酵液の接種量は８ｗｔ％であり、キノコの種子発酵液の接種量は１２ｗｔ％である。前記振盪培養の温度は３０℃であり、振盪培養の回転速度は１００ｒ／ｍｉｎであり、振盪培養の時間は３日である。
（２）ステップ（１）から得られた発酵液を、まず４００Ｗの仕事率で２０ｍｉｎ間超音波処理を行い、その後、１００００ｒ／ｍｉｎの回転速度で５ｍｉｎ間遠心分離して菌糸体をろ過することで、シゾフィランとエルゴチオネイン含有の発酵液を得る。
実施例４
本実施例は２菌株の共発酵によるシゾフィランとエルゴチオネインの調製方法を提供し、実施例との相違点は、前記スエヒロタケの種子発酵液の接種量は１５ｗｔ％であり、キノコの種子発酵液の接種量は５ｗｔ％であり、それ以外のステップは実施例１と同様である。
実施例５
本実施例は２菌株の共発酵によるシゾフィランとエルゴチオネインの調製方法を提供し、実施例１との相違点は、前記スエヒロタケの種子発酵液の接種量は５ｗｔ％であり、キノコの種子発酵液の接種量は１５ｗｔ％であり、それ以外のステップは実施例１と同様である。
実施例６
本実施例は２菌株の共発酵によるシゾフィランとエルゴチオネインの調製方法を提供し、実施例１との相違点は、前記共発酵培地は、質量百分率でグルコース３％、ペプトン３％、酵母エキス４％、硫酸マグネシウム０．１％及びリン酸二水素カリウム０．０５％、残りは水から構成され、それ以外のステップは実施例１と同様である。
実施例７
本実施例は２菌株の共発酵によるシゾフィランとエルゴチオネインの調製方法を提供し、実施例１との相違点は、前記共発酵培地は、質量百分率でグルコース３％、ペプトン３％、酵母エキス４％、硫酸マグネシウム０．１％及びリン酸二水素カリウム０．０５％、残りは水から構成され、それ以外のステップは実施例１と同様である。
実施例８
本実施例は２菌株の共発酵によるシゾフィランとエルゴチオネインの調製方法を提供し、実施例１との相違点は、振盪培養の温度は２６℃であり、振盪培養の回転速度は１８０ｒ／ｍｉｎであることである。
実施例９
本実施例は２菌株の共発酵によるシゾフィランとエルゴチオネインの調製方法を提供し、実施例１との相違点は、振盪培養の温度は３２℃であり、振盪培養の回転速度は８０ｒ／ｍｉｎであり、振盪培養の時間は２日であることである。
比較例１
本比較例は単一菌株の発酵によるシゾフィランの調製方法を提供し、前記方法は具体的に下記のステップを含む。
（１）調製例１が提供するスエヒロタケの種子発酵液を、発酵培地を含むフラスコに接種し、インキュベーターシェーカーに置いて振盪培養を行うことで、発酵液を得る。
そこで、前記発酵培地は、質量百分率でグルコース３％、トリプトン３％、酵母エキス３％、酵母エキス０．３％、硫酸マグネシウム０．１％及びリン酸二水素カリウム０．０５％、残りは水から構成され、ｐＨは６．０である。
そこで、スエヒロタケの種子発酵液の接種量は１５ｗｔ％であり、前記振盪培養の温度は２８℃であり、振盪培養の回転速度は１２０ｒ／ｍｉｎであり、振盪培養の時間は７日である。
（２）ステップ（１）から得られた発酵液を、１００００ｒ／ｍｉｎの回転速度で５ｍｉｎ間遠心分離して菌糸体をろ過することで、シゾフィランの発酵液を得る。
比較例２
本比較例は単一菌株の発酵によるシゾフィランの調製方法を提供し、前記方法は具体的に下記のステップを含む。
（１）調製例４が提供するキノコの種子発酵液を、発酵培地を含むフラスコに接種し、インキュベーターシェーカーに置いて振盪培養を行うことで、発酵液を得る。
そこで、前記発酵培地は、質量百分率でグルコース３％、トリプトン３％、酵母エキス３％、酵母エキス０．３％、硫酸マグネシウム０．１％及びリン酸二水素カリウム０．０５％、残りは水から構成され、ｐＨは６．０である。
そこで、キノコの種子発酵液の接種量は１５ｗｔ％であり、前記振盪培養の温度は２８℃であり、振盪培養の回転速度は１２０ｒ／ｍｉｎであり、振盪培養の時間は５日である。
（２）ステップ（１）から得られた発酵液を、まず３００Ｗの仕事率で３ｍｉｎ間超音波処理を行い、その後、９０００ｒ／ｍｉｎの回転速度で８ｍｉｎ間遠心分離して菌糸体をろ過することで、エルゴチオネインの発酵液を得る。
試験例１
エルゴチオネインとシゾフィランの含有量測定
サンプル：実施例１～９が提供するシゾフィランとエルゴチオネイン含有の発酵液、比較例１が提供するシゾフィラン含有発酵液、比較例２が提供するエルゴチオネイン含有発酵液
測定方法：シゾフィランの標準品、エルゴチオネインの標準品、被検サンプルに対してＨＰＬＣ測定を行い、サンプルクロマトグラフと標準溶液クロマトグラフを比較し、保持時間によりサンプルにおけるエルゴチオネインピークを決める。標準品エルゴチオネインの濃度及び対応するピーク面積により検量線を描き、標準品とサンプルの投入量が同じの場合、外部標準法に基づいて定量し、サンプル中のエルゴチオネインとシゾフィランの含有量を算出する。
具体的な測定結果は、表１に示す。
表１の測定データに示すように、本発明の調製方法により得られたシゾフィランとエルゴチオネイン含有の発酵液において、エルゴチオネインの含有量は９００ｍｇ／Ｌ以上であり、シゾフィランの含有量は９ｇ／Ｌ以上である。これは、本発明において、スエヒロタケとエルゴチオネインを調製する菌株を共発酵させた結果、２菌株共発酵に競争がないだけでなく、相乗効果を発揮することで、菌糸体からエルゴチオネインを大量に調整することが可能になり、エルゴチオネイン製品の品質を保証し、エルゴチオネインの収量を顕著に改善し、調製プロセスが簡単であり、特にエルゴチオネインの大規模生産に適していることを示唆する。
試験例２
シゾフィランの分子量及び粘度の測定
サンプル：実施例１～９が提供するシゾフィランとエルゴチオネイン含有の発酵液、比較例１が提供するシゾフィラン含有の発酵液
測定方法：上記の発酵液を１／４に濃縮し、５倍量の８５ｖｏｌ％エタノールを加えて沈殿させ、１００００ｒｐｍで遠心分離して上清を捨て、沈殿物を回収し、蒸留水に再溶解し、分子量５ｋＤａのスーパーろ過膜でエルゴチオネイン、タンパク質及びその他低分子生成物をろ過し、濡れたシゾフィランを得る。得られた濡れたシゾフィランを－２０℃で２４時間凍結乾燥し、得られたシゾフィランの分子量を高性能のゲル浸透クロマトグラフィーにより測定した。
測定条件：
クロマトカラム：７．８×３００ｍｍ（Ｕｌｔｒａｈｙｄｒｏｇｅｌ ＴＭ １２０，２５０，１０００，Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）；
カラム温度：３５℃
移動相：高純水
流動速度：０．６ｍＬ／ｍｉｎ
注入量：５０μＬ
クロマトカラム：７．８×３００ｍｍ（Ｕｌｔｒａｈｙｄｒｏｇｅｌ ＴＭ １２０，２５０，１０００，Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）；
カラム温度：３５℃
移動相：高純水
流動速度：０．６ｍＬ／ｍｉｎ
注入量：５０μＬ
具体的な測定結果は、表２に示す。
表１の測定データに示すように、本発明の前記シゾフィランとエルゴチオネイン含有の発酵液において、シゾフィランの分子量は１２００ｋＤａ以下である。これは、本発明において、スエヒロタケとエルゴチオネインを調製する菌株を共発酵させた結果、菌糸体からエルゴチオネインを大量に調製するだけでなく、分子量が比較的低くて水溶性に優れたシゾフィランも得られ、生体内に吸収されて生物活性を発揮することに有利であり、シゾフィランの用途を大幅に拡大したことを示唆する。
試験例３
抗酸化活性の測定
サンプル：実施例１～９が提供するシゾフィランとエルゴチオネイン含有の発酵液、比較例１が提供するシゾフィラン含有の発酵液、比較例２が提供するエルゴチオネイン含有の発酵液
測定方法：
１、ＤＰＰＨフリーラジカルの除去能力の評価
ＤＰＰＨは１，１－ジフェニル－２－トリニトロフェニルヒドラジンといい、安定した窒素中心のフリーラジカルであり、その安定性は主に、共振安定効果を有する３つのベンゼン環の立体障害に由来するため、中央に挟まれた窒素原子の不対電子は、その電子対の効果を発揮できなくなる。その無水エタノール溶液は紫色となっており、５１７ｎｍの波長に最大吸収があり、吸光度は濃度に線形関係を表す。フリーラジカル除去剤を添加すると、ＤＰＰＨと結合またはＤＰＰＨを置き換えることができるため、フリーラジカルの数が減少し、吸光度が小さくなり、溶液の色が薄くなることから、フリーラジカルを除去する能力が向上したと評価できる。
具体的な実験ステップは、以下のようである。陽性対照としてＴｒｏｌｏｘ溶液を用い、異なる濃度のＤＰＰＨフリーラジカルに対するＴｒｏｌｏｘの除去効果を測定する。実験結果はＴＥＡＣ値で表され、その単位はμｍｏｌ Ｔｒｏｌｏｘ当量／１００ｍＬ、即ち、１００ｍＬのサンプルに相当するＴｒｏｌｏｘの抗酸化能力が何μｍｏｌであるかとなる。共栓試験管にサンプル溶液（または無水エタノール）２ｍＬ、ＤＰＰＨ・溶液２ｍＬをそれぞれピペットで取り、よく混ぜ合わせる。暗所で３０ｍｉｎ間反応させ、５１７ｎｍの波長での吸光度を測定した。
ＤＰＰＨフリーラジカル除去率（％）＝［１―（Ａ１―Ａ２）／Ａ０］×１００％；
式において、
Ａ０：サンプル無添加、ＤＰＰＨ添加；
Ａ１：サンプルまたは無水エタノール添加、ＤＰＰＨ添加；
Ａ２ ：サンプルまたは無水エタノール添加、ＤＰＰＨ無添加。
Ａ０：サンプル無添加、ＤＰＰＨ添加；
Ａ１：サンプルまたは無水エタノール添加、ＤＰＰＨ添加；
Ａ２ ：サンプルまたは無水エタノール添加、ＤＰＰＨ無添加。
２、ＡＢＴＳ＋フリーラジカルの除去能力の評価
ＡＢＴＳは適切な酸化剤の作用下で緑色のＡＢＴＳ＋に酸化される。反応に抗酸化物質を添加すると、ＡＢＴＳ＋の生成が抑制され、７３４ｎｍでの吸光度を測定することによって、サンプルの総抗酸化能力を測定および計算できる。
具体的な実験ステップは、以下のようである。陽性対照としてＴｒｏｌｏｘ溶液を用い、異なる濃度のＡＢＴＳ＋フリーラジカルに対するＴｒｏｌｏｘの除去効果を測定する。実験結果はＴＥＡＣ値で表され、その単位はμｍｏｌ Ｔｒｏｌｏｘ当量／１００ｍＬ、即ち、１００ｍＬのサンプルに相当するＴｒｏｌｏｘの抗酸化能力が何μｍｏｌであるかとなる。７ｍｍｏｌ／ＬのＡＢＴＳ溶液を１０ｍｍｏｌ／ＬのＰＢＳ（ｐＨ ７．４）で６０倍に希釈し、ＡＢＴＳ作業溶液を得る。１９０μＬのＡＢＴＳ作業溶液（またはＰＢＳ）をピペットで取り、１０μＬのサンプル溶液（またはＰＢＳ）を加え、１０秒間振とう、３０℃で６分間静置した状態で、７３４ｎｍにおける吸光度Ａ値を測定する。
ＡＢＴＳ＋フリーラジカル除去率（％）＝［１―（Ａ１―Ａ２）／Ａ０］×１００％；
式において、
Ａ０：サンプル無添加、ＡＢＴＳ添加；
Ａ１：サンプルまたはＰＢＳ添加、ＡＢＴＳ添加；
Ａ２ ：サンプルまたはＰＢＳ添加、ＡＢＴＳ無添加。
Ａ０：サンプル無添加、ＡＢＴＳ添加；
Ａ１：サンプルまたはＰＢＳ添加、ＡＢＴＳ添加；
Ａ２ ：サンプルまたはＰＢＳ添加、ＡＢＴＳ無添加。
具体的な測定結果は、表３に示す。
表３の測定データに示すように、本発明により調製された発酵液の原液のＤＰＰＨフリーラジカル除去率が９０％以上であり、１０ｖｏｌ％の濃度まで希釈した後も、ＤＰＰＨフリーラジカル除去率が６７％以上であった。発酵液の原液のＡＢＴＳ＋フリーラジカル除去率が９０％以上であり、１０ｖｏｌ％の濃度まで希釈した後も、ＡＢＴＳ＋フリーラジカル除去率が６７％以上であった。
これは、最終的に得られる発酵液がシゾフィランとエルゴチオネインを含有するため、前記シゾフィランとエルゴチオネインが互いに協力し合い、相乗効果を発揮し、前記組成物がＤＰＰＨフリーラジカル、ヒドロキシラジカル及びスーパーオキシドアニオンフリーラジカルに対する除去効果を改善し、皮膚組織の抗酸化効果を高め、皮膚組織のフリーラジカルの含有量を減らすことを示唆する。
これは、最終的に得られる発酵液がシゾフィランとエルゴチオネインを含有するため、前記シゾフィランとエルゴチオネインが互いに協力し合い、相乗効果を発揮し、前記組成物がＤＰＰＨフリーラジカル、ヒドロキシラジカル及びスーパーオキシドアニオンフリーラジカルに対する除去効果を改善し、皮膚組織の抗酸化効果を高め、皮膚組織のフリーラジカルの含有量を減らすことを示唆する。
出願人は、本発明が上記の実施例を通じて、本発明による前記２菌株の共発酵によるシゾフィランとエルゴチオネインの調製方法を説明することを宣言するが、本発明は上記の実施例に限定されるとはいえなく、本発明を実施するために上記の実施例に依存しなければならないことを意味するものではない。当業者は、本発明のいかなる改良、本発明の製品の各原材料の同等の置換、補助成分の追加、特定の方法の選択なども、本発明の保護の範囲内にあることを理解されたい。
Claims (10)
- ２菌株の共発酵によるシゾフィランとエルゴチオネインの調製方法であって、前記方法は、下記のステップを含む：
スエヒロタケの種子発酵液とキノコの種子発酵液を共発酵培地に接種して共発酵培養を行い、シゾフィランとエルゴチオネイン含有の発酵液を得る。 - 前記共発酵培地は、質量百分率でグルコース０．５～５％、トリプトン０．５～３％、酵母エキス０．１～３％、酵母エキス０．１～０．５％、硫酸マグネシウム０．０１～０．１５％及びリン酸二水素カリウム０．０５～０．２％、残りは水から構成され、
前記共発酵培地のｐＨは５．５～７．０であることを特徴とする、請求項１に記載の２菌株の共発酵によるシゾフィランとエルゴチオネインの調製方法。 - 前記スエヒロタケの種子発酵液中菌体の質量百分率は５～３０％であり、
前記キノコの種子発酵液中菌体の質量百分率は５～３０％であり、
前記共発酵培地において、スエヒロタケの種子発酵液の接種量は２～２０ｗｔ％であり、
前記共発酵培地において、キノコの種子発酵液の接種量は５～２０ｗｔ％であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の２菌株の共発酵によるシゾフィランとエルゴチオネインの調製方法。 - 前記共発酵培養の具体的なステップは、スエヒロタケの種子発酵液とキノコの種子発酵液を、共発酵培地を含むフラスコに接種し、インキュベーターシェーカーに置いて振盪培養を行うことであり、
前記振盪培養の温度は２８～３０℃であり、振盪培養の回転速度は１００～１５０ｒ／ｍｉｎであり、振盪培養の時間は３～５日であることを特徴とする、請求項１～３のうちいずれか一項に記載の２菌株の共発酵によるシゾフィランとエルゴチオネインの調製方法。 - 前記共発酵培養後、超音波処理及び／又は遠心分離を更に含み、
前記超音波処理の仕事率は４００～１０００Ｗであり、超音波処理の時間は５～２０ｍｉｎであり、
前記遠心分離の回転速度は８０００～１００００ｒ／ｍｉｎであり、遠心分離の時間は５～１０ｍｉｎであることを特徴とする、請求項１～４のうちいずれか一項に記載の２菌株の共発酵によるシゾフィランとエルゴチオネインの調製方法。 - 前記スエヒロタケの種子発酵液は、以下の調製方法により調製されることを特徴とする、請求項１～５のうちいずれか一項に記載の２菌株の共発酵によるシゾフィランとエルゴチオネインの調製方法：
ステップ（ａ）：スエヒロタケをＰＤＡ培地に接種し、活性化培養を行うことで活性化種子を得る；
ステップ（ｂ）：ステップ（ａ）から得られた活性化種子を液体培地に接種し、種子培養を行うことでスエヒロタケの種子発酵液を得る。 - ステップ（ａ）において、前記活性化培養の温度は２４～２６℃であり、活性化培養の時間は２～５日であり、
ステップ（ｂ）において、前記液体培地は、質量百分率でグルコース０．５～２％、酵母エキス０．１～２％、硫酸マグネシウム０．０１～０．１５％及びリン酸二水素カリウム０．０５～０．２％、残りは水から構成され、
ステップ（ｂ）において、前記種子培養はインキュベーターシェーカーの中で行われ、培養温度は２４～２６℃であり、培養回転速度は１５０～２００ｒ／ｍｉｎであり、培養時間は３～５日であることを特徴とする、請求項６に記載の２菌株の共発酵によるシゾフィランとエルゴチオネインの調製方法。 - 前記キノコの種子発酵液は、以下の調製方法により調製されることを特徴とする、請求項１～７のうちいずれか一項に記載の２菌株の共発酵によるシゾフィランとエルゴチオネインの調製方法：
キノコの菌糸体を種子培地に接種し、種子培養を行うことでキノコの種子発酵液を得る。 - 前記キノコは、ヤマブシタケ、ヒラタケ、霊芝、キングヒラタケ、ホウビタケ、タモギタケ、マツタケ、ヒラタケまたはキクラゲ中のいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせを含み、
前記種子培地は、質量百分率でスクロース１～１０％、豆粉３５％、とうもろこし粉１～３％、ビタミンＢ１ ０．１～０．３％、硫酸マグネシウム０．０１～０．１５％及びリン酸二水素カリウム０．０５～０．２％、残りは水から構成され、
前記種子培養は、インキュベーターシェーカーの中で行われ、培養温度は２３～２５℃であり、培養回転速度は１６０～１８０ｒ／ｍｉｎであり、培養時間は１～３日であることを特徴とする、請求項８に記載の２菌株の共発酵によるシゾフィランとエルゴチオネインの調製方法。 - 前記シゾフィランとエルゴチオネイン含有の発酵液において、エルゴチオネインの含有量は９００ｍｇ／Ｌ以上であり、好ましくは９５０～１０５０ｍｇ／Ｌであり、
前記シゾフィランとエルゴチオネイン含有の発酵液において、シゾフィランの含有量は９ｇ／Ｌ以上であり、好ましくは９～１２ｇ／Ｌであることを特徴とする、請求項１～９のうちいずれか一項に記載の２菌株の共発酵によるシゾフィランとエルゴチオネインの調製方法。
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