CN116999362A

CN116999362A - 一种灵芝五味子双向发酵液的后处理工艺和应用

Info

Publication number: CN116999362A
Application number: CN202311068290.9A
Authority: CN
Inventors: 魏长浩; 邹乐; 巫群; 颜少慰; 张廷志
Original assignee: Syoung Cosmetics Manufacturing Co Ltd
Current assignee: Syoung Cosmetics Manufacturing Co Ltd
Priority date: 2023-08-23
Filing date: 2023-08-23
Publication date: 2023-11-07

Abstract

本发明提供了一种发酵液的后处理工艺，包括：A)将发酵液进行板框固液分离，微滤、纳滤，得到过滤后发酵液；B)将过滤后发酵液经组合膜过滤除菌即得。本发明提供的后处理工艺不仅尽可能的保留了多糖，同时也没有损失太多的酪氨酸酶抑制率；还能有效解决透过率的问题，同时制备的产品可以直接用于护肤品。

Description

一种灵芝五味子双向发酵液的后处理工艺和应用

技术领域

本发明涉及化妆品技术领域，尤其是涉及一种灵芝五味子双向发酵液的后处理工艺和应用。

背景技术

灵芝(Ganoderma lucidum)被称为“扶正固本，滋补强壮”的珍贵中药材，属多孔菌科药用真菌，一直被用作治疗肝病、高胆固醇、高血脂等疾病。灵芝中主要抗氧化活性成分被认为是灵芝三萜与灵芝多糖。灵芝多糖还能显著促进细胞核内DNA合成功能，并可促进细胞的分裂，从而起到延缓衰老的作用，并具有增强免疫力的作用。灵芝分为三个生长阶段：孢子、菌丝、子实体，灵芝菌作为第二生长阶段，近年来灵芝菌丝体与发酵液的充分利用为灵芝开发了一条新的应用途径。

五味子为多年生落叶木质藤本植物的干燥成熟果实，分为南五味子(SchisandraSphenanthera)和北五味子(Schisandra Chinensis)，且普遍认为北五味子的品质比南五味子优良。五味子的种子含有丰富的脂肪酸和挥发油，果实则富含有机酸和木脂素类化合物。五味子果实中含有17种氨基酸，其中人体所必需的氨基酸占17.7％，并且含有多种微量元素。不仅如此，它还含有丰富的抗氧化活性成分，能降低血清胆固醇含量，增加脑和肝中蛋白质含量。目前五味子的研究与应用主要在医学领域，研究其药理作用及其在中药配方中的作用，五味子也可泡茶饮用，但在精加工食品、化妆品等方向应用还有待开拓。

双向发酵通过采用中药材作为药性基质来替代传统发酵菌微生物营养基质，微生物改变中药材的药性，中药材中的活性与营养成分为微生物提供碳源、氮源、微量元素等，在此过程中微生物的活性物质也会受中药材影响而改变，它们之间相互作用相互影响，从而产生新的成分和新的药效，因此称为双向发酵。双向发酵的用途主要体现在增效和解毒方面。

近年来，灵芝菌丝体液体发酵技术的开发与应用取得了较大进展。液体发酵是一种将菌丝体生长所必需的营养制成液体培养基，再进行摇瓶发酵或发酵罐发酵以达到扩大化培养菌丝球的技术。摇瓶发酵和发酵罐发酵的区别在于其发酵规模与用途，前者主要用于菌种选育与工艺分析研究，后者则主要用于工业化生产。灵芝真菌液体发酵可产生大量的菌丝体，其产生的生物活性物质的含量和种类与天然采集的灵芝子实体的基本一致，甚至某些重要活性物质的含量还高于子实体。相较于传统栽培，液体发酵技术具有生产周期短、成本低、产量大、产品质量稳定且能自动化工业生产等特点，正在成为灵芝培养的新模式，同时也成为关于灵芝属真菌生产利用研究的热点。。

目前适用于发酵液后处理的膜分离技术有微滤、超滤、纳滤和反渗透等。微滤膜截留0.01～10μm以上的粒子，如菌体、细胞、不溶物等，常用作超滤的预处理过程；超滤膜截留分子量5000～500000，膜孔径1～20nm，可以截留病毒、蛋白质、酶、多糖等大分子物质；反渗透膜只允许溶剂分子通过，盐、氨基酸等小分子物质也被截留；纳滤膜平均孔径2nm，截留组分可小到抗生素、合成药、染料、二糖等，允许水、无机盐、有机物等小分子物质通过，截留性能介于超滤和反渗透之间。目前发酵液一般使用陶瓷膜后处理工艺，但是真菌发酵液由于其富含多糖，因此原料表现为高粘度，一般的后处理方式容易产生浓差极化现象，使溶液凝胶强度提高，凝胶附着于膜表面，大大降低功效物透过率。

因此，提供一种经济效益优越，功效物透过率高的发酵液后处理工艺就显得尤为迫切。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种灵芝五味子双向发酵液的后处理工艺，本发明提供的一种灵芝五味子双向发酵液的后处理工艺得到的灵芝双向发酵液具有酪氨酸酶抑制、抗氧化、舒缓、补水保湿和抗炎的功效。

本申请中，术语“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示:单独存在A，同时存在A和B，单独存在B的情况。其中A,B可以是单数或者复数。

应理解，在本申请的各种实施例中，上述各过程的序号的大小并不意味着执行顺序的先后，部分或全部步骤可以并行执行或先后执行，各过程的执行顺序应以其功能和内在逻辑确定，而不应对本申请实施例的实施过程构成任何限定。

本发明提供了一种发酵液的后处理工艺，包括：

A)将发酵液进行板框固液分离，微滤、纳滤，得到过滤后发酵液；

B)将过滤后发酵液经三级组合膜过滤除菌即得。

本发明提供的灵芝五味子双向发酵液的后处理工艺首先将灵芝五味子双向发酵液进行板框固液分离；本发明对于上述操作不进行限定，本领域技术人员熟知的即可。

按照本发明，所述板框固液分离的压力为0.2～0.3Mpa。

固液分离后，采用微滤截留部分杂质；本发明所述述微滤的孔径为1～5μm；优选为1～3μm；更优选为1μm。

微滤后采用纳滤处理上述发酵液从而降电导，得到过滤后的发酵液；本发明所述纳滤的纳滤膜为150Da。

将过滤后发酵液经组合膜过滤除菌即得。

本发明第一级的PP膜造价便宜，起到初步除菌除杂，保护后续PES膜的作用；第二级的0.65PES膜目的是除去0.2pp膜透过的杂质(由于PP膜的膜结构特性可能存在大分子杂质透过的情况)，保护后续的0.2PES膜；最后再过一遍0.2PES膜完成除菌。

按照本发明，所述组合膜具体包括0.2μmPP、0.65μmPES和0.2μmPES。

本发明将上述三组膜依次通过，具体的：PP是聚丙烯材质的膜；PES聚醚砜材质的膜。

本发明还提供了一种灵芝五味子双向发酵工艺，包括：

A)制备灵芝种子液；

将双向发酵培养基灭菌后，待用；

B)将灵芝种子液接种入双向发酵培养基中，发酵，得到灵芝五味子双向发酵液；

C)采用上述任意一项所述的后处理工艺对步骤B)所述的灵芝五味子双向发酵液进行后处理，即得。

本发明提供的灵芝五味子双向发酵工艺首先制备灵芝种子液。

在本发明其中一些实施方式中，所述制备灵芝种子液具体为：

将灵芝菌丝体接种于种子培养基中，培养，即得灵芝种子液；

取灵芝菌丝体接种于已灭菌的种子培养基中，在30℃、180rpm得条件下培养2～6天，得灵芝种子液。

本发明所述种子培养基包括葡萄糖、蛋白胨、酵母粉和麦芽浸粉；

在一些实施例中，葡萄糖20g/L；蛋白胨1g/L；酵母粉1g/L；麦芽浸粉20g/L。

本发明所述灵芝种子液的接种量优选为10％。

将双向发酵培养基灭菌后，待用。

在本发明其中一些实施方式中，所述双向发酵培养基包括：

五味子粉末10g/L、豆粕粉0～30g/L、麦芽浸粉20g/L、酵母粉1g/L、蛋白胨1g/L；

其中，首先制备五味子粉末和豆粕粉。

在本发明其中一些实施方式中，所述五味子粉末及豆粕粉末由以下方法制得：中药粉碎机粉碎五味子及干豆粕，过20～150目筛处理。

在本发明其中一些实施方式中，所述双向发酵培养基包括：

五味子粉末10g/L、豆粕粉2～28g/L、麦芽浸粉20g/L、酵母粉1g/L、蛋白胨1g/L；

在本发明其中一些实施方式中，所述双向发酵培养基包括：

五味子粉末10g/L、豆粕粉5～25g/L、麦芽浸粉20g/L、酵母粉1g/L、蛋白胨1g/L；

在本发明其中一些实施方式中，所述双向发酵培养基包括：

五味子粉末10g/L、豆粕粉15～25g/L、麦芽浸粉20g/L、酵母粉1g/L、蛋白胨1g/L；

在本发明其中一个实施方式中，所述双向发酵培养基包括：

麦芽浸粉了20g/L、豆粕粉20g/L、酵母粉1g/L、蛋白胨1g/L、五味子10g/L。

上述培养的pH值为4.5～4.6。

按照本发明，所述灭菌为在121℃，压力0.11Mpa下灭菌20min。

将灵芝种子液接种入双向发酵培养基中，发酵，得到灵芝五味子双向发酵液。

本发明所述发酵参数具体为：30℃、通气量2VVM、罐压0.01～0.015MPa、搅拌转速150rpm、装液量为60％罐体积、发酵周期4天。

本发明提供了一种灵芝双向发酵液，由上述技术方案任意一项所述的制备方法制备得到。

本发明对于上述制备方法已经有了清楚的描述，在此不再赘述。

本发明还提供了所述的灵芝双向发酵液在制备抑制酪氨酸酶的产品、抗氧化产品、舒缓产品、保湿产品或抗炎产品中的应用。

本发明人发现，通过灵芝双向发酵类原料生产工艺(包含发酵工艺及后处理工艺)所得到的双向发酵液(灵芝-五味子双向发酵液)经研究发现：具备较好的酪氨酸酶抑制(美白功效)效果，此外，还新发现其具有出色的抗氧化功效(ROS图)、舒缓功效(斑马鱼舒缓功效图)、补水保湿功效(保湿率图)及抗炎功效(IL-6)。

本发明还提供了一种化妆品，包括上述所述的灵芝双向发酵液。

本发明所述化妆品还可以包括化妆品领域常规辅料，本发明对此不进行限定。

本申请重心在于做出了可应用于化妆品中的成品原料(通过膜工艺处理，降低原料电导，除去微生物等且最大程度的保留功效成分多糖及产品功效，实施例中也有陶瓷膜工艺及电渗析工艺的对比阐述)的发酵工艺条件，同时还证明了经过后处理之后的成品原料具备补水保湿、抗炎、舒缓、美白等护肤功效(在先申请仅有酪氨酸酶，即美白功效)。

若使用陶瓷膜除菌，多糖截留率很高，而使用电渗析处理美白功效显著降低，相比之下目前本发明的后处理工艺不仅尽可能的保留了多糖，同时也没有损失太多的酪氨酸酶抑制率；并且不经过后处理的发酵液无法被护肤品所使用；本发明人做出了全套的成品工艺，并且通过成品的功效证明了本发明的工艺的出色性，同步表达了灵芝-五味子双向发酵这款原料具备出色的多维度功效。

目前发酵液一般使用陶瓷膜后处理工艺，但是容易产生浓差极化现象，使溶液凝胶强度提高，凝胶附着于膜表面，大大降低功效物透过率，本技术方案提供的工艺方法能有效解决透过率的问题，相比于陶瓷膜工艺40％，本发明的工艺有80％+。

附图说明

图1不同浓度灵芝-五味子双向发酵液添加量对细胞活性的影响；

图2灵芝-五味子双向发酵液、灵芝发酵液对脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞中的IL-6含量的影响；

图3灵芝-五味子双向发酵液对双氧水诱导的人永生化角质细胞ROS的影响；

图4灵芝-五味子双相发酵液对斑马鱼刺激模型的缓解作用；

图5灵芝发酵液、双向发酵液保湿效果。

具体实施方式

本发明提供了一种灵芝五味子双向发酵液的后处理工艺和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都属于本发明保护的范围。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的原料皆为普通市售品，皆可于市场购得。

为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种灵芝五味子双向发酵液的后处理工艺和应用进行详细描述。本发明实施例中提及的自然pH指的是pH4.5-4.6。

本发明所述灵芝-五味子双向发酵液对酪氨酸酶抑制率测定

1试剂配制

(1)配制pH6.8的PBS缓冲溶液，称取6.8g磷酸二氢钾，称取0.94g氢氧化钠，加入蒸馏水溶解并定容于1000mL容量瓶中。

(2)L-酪氨酸溶液(现配现用)，精确称取0.0272gL-酪氨酸，加入pH6.8的PBS溶液溶解并定容于100mL容量瓶中。

(3)200U酶活力酪氨酸酶溶液(现配现用)，25KU的索莱宝酪氨酸酶，加入12.5mLpH6.8的PBS溶液充分溶解得到2KU的酪氨酸酶溶液，-20℃保存；使用时取出适量2KU酪氨酸酶溶液，使用pH6.8的PBS溶液稀释10倍使用。

2实验过程

(1)用移液枪分别按表1及表2剂量准确A、B、C溶液，加入至96孔板中，最后加入D溶液，充分混合均匀，37℃温育反应10min，测定反应液在475nm处的吸光度A，并计算其对酪氨酸酶的抑制率。

3.计算公式：

抑制率＝[1-(A样-A空白)/(A0-A1)]×100％

表3反应液组成

本发明所述灵芝-五味子双向发酵液对ABTS测定

1试剂配制

(1)配制pH7.4的PBS缓冲溶液，称取8g氯化钠，称取0.2g氯化钾，称取0.2g磷酸二氢钾，称取3.63g磷酸氢二钠，加入蒸馏水溶解并定容于1000mL容量瓶中，调整pH至7.4。

(2)ABTS储备液：称取0.096g ABTS粉末，使用蒸馏水溶解后定容至25mL。

(3)K2S2O8储备液：称取0.066g过硫酸钾粉末，使用蒸馏水溶解后定容至100mL。

(4)ABTS工作液：ABTS储备液与K2S2O8储备液1：1混合，静置12-16h；使用前将静置的样液使用PBS稀释至A734为0.7±0.02

2实验过程

A1：200ul ABTS工作液+10ul样品

A2：200ul PBS+10ul样品

A3：200ul ABTS工作液+10ul蒸馏水

反应液添加完毕后避光反应6min，于A734测定样品吸光值

3.计算公式：

抑制率＝[1-(A1-A2)/A3]×100％

本发明所述灵芝-五味子双向发酵液对多糖含量测定

1试剂配制

(1)5％苯酚：称取5g苯酚，使用蒸馏水定容至100mL。

(2)0.1mg/mL葡萄糖：称取烘干葡萄糖50mg，使用蒸馏水定容至500mL。

(3)浓硫酸：沪试AR。

2实验过程

(1)、取100ul样液加入300ul无水乙醇，混合均匀于4℃，放置24h。

(2)、放置24h后的样品于4℃，10000rpm离心10min，离心完成后倒去上清。

(3)、沉淀置于70℃烘干，烘干后加入1.5mL蒸馏水，超声20min。

(4)、吸取200ul清夜，加入200ul 5％苯酚溶液，混匀后加入1mL浓硫酸，再次混匀，室温反应30min。

(5)、吸取200ul反应液加入96孔板中，酶标仪490nm测定吸光值

3.标曲绘制

标准曲线样品测定从上述过程④开始，测定完毕后利用EXCEL绘制标准曲线图，拟合线性公式，确定R2达到0.99以上；本次使用标曲为Y＝5.0263X+0.0791(R2为0.9979)。

4.计算公式：

多糖含量＝A*15(式中：A为标准曲线计算值)

本发明所述灵芝-五味子双向发酵液补水保湿功效测定

1试剂配制

(1)饱和碳酸钾溶液：不断往纯水中添加碳酸钾粉末，底部出现固体粉末无法溶解。

(2)甘油溶液：根据实验需求配置成不同百分含量的甘油溶液。

2实验过程

用分析天平称取一定量的待测试保湿剂，用去离子水配制成对应质量分数的样品溶液；温度为20℃时，在玻璃干燥器的底部放入碳酸钾的饱和盐溶液从而控制玻璃干燥器中的相对湿度(relative humidity，RH)为43％～47％，移液枪量取200ul配制好的样品涂敷在贴有医用3M胶带的玻片上(胶带宽度1.2cm，长度2.5cm；玻片规格7.5*2.5cm)，精确记录贴有3M胶带的玻璃板质量m和涂抹样品后的质量m0，放入盛有碳酸钾饱和溶液的干燥器中(RH为43％～47％)，放置2、4、6、8时称量记录数据mt，计算此时的保湿率。重复3次，计算均值及相对标准偏差(RSD)。

3计算公式

(1)保湿率：

式中：m为贴有3M胶带的玻璃板质量，g；

m0为玻璃板涂抹样品后的质量，g；

mt为玻璃板涂抹样品放置t小时后的质量，g。

实施例1

一种灵芝-五味子双向发酵液，所述双向发酵液由灵芝菌液与五味子复配培养基通过双向发酵及膜分离工艺后处理制得。

所述培养基包括下述原料：五味子粉末10g/L、豆粕粉5g/L、麦芽浸粉20g/L、酵母粉1g/L、蛋白胨1g/L、自然pH。

所述灵芝菌液在所述培养基中的接种量为10％；

所述灵芝-五味子双向发酵液工艺，包括以下步骤：

(1)制备五味子粉末及豆粕粉末：中药粉碎机粉碎五味子及豆粕，过60目筛处理；

(2)制备灵芝菌液：取灵芝菌丝体接种于已灭菌的种子培养基中，在30℃、180rpm的条件下培养4天，得灵芝菌液；

(3)配制双向发酵培养基：将五味子粉末及各类营养成分混合搅拌均匀，灭菌备用；

(4)双向发酵：将灵芝菌液接种入上述双向发酵培养基以150rpm得搅拌速度，在发酵温度为30℃、自然pH得条件下进行发酵，待发酵完毕，采用20℃，8500rpm离心收集上清发酵液。

实施例2

一种灵芝-五味子双向发酵液，所述培养基中豆粕粉末添加量为10g/L，其余均与实施例1所述发酵液的制备原料及制备工艺相同。

实施例3

一种灵芝-五味子双向发酵液，所述培养基中豆粕粉末添加量为15g/L，其余均与实施例1所述发酵液的制备原料及制备工艺相同。

实施例4

一种灵芝-五味子双向发酵液，所述培养基中豆粕粉末添加量为20g/L，其余均与实施例1所述发酵液的制备原料及制备工艺相同。

表1不同豆粕粉末添加量对灵芝-五味子双向发酵液的影响

实验结果

表2不同豆粕粉添加量酪氨酸酶抑制率对比研究表

豆粕粉添加量(g/L)	5	10	15	20
					酪氨酸酶抑制率(％)	ND	33.57	71.13	94.86

注：ND表示酪氨酸酶抑制率未检出(计算后酪氨酸酶抑制率为负数百分比)。

由上表可知，灵芝五味子双向发酵液其最佳效果体现在豆粕粉添加量为20g/L时，酪氨酸酶抑制率可达94.86，因此最佳培养基成分配比固定为五味子粉末10g/L、豆粕粉20g/L、麦芽浸粉20g/L、酵母粉1g/L、蛋白胨1g/L、自然pH

实施例5

所述培养基包括下述原料：五味子粉末10g/L、豆粕粉20g/L、麦芽浸粉20g/L、酵母粉1g/L、蛋白胨1g/L、自然pH

所述灵芝菌液在所述培养基中的接种量为10％；

所述灵芝-五味子双向发酵液工艺，包括以下步骤：

(4)双向发酵：将灵芝菌液接种入上述双向发酵培养基，在发酵温度为25℃，通气量2VVM、罐压0.01-0.015MPa、搅拌转速150rpm、装液量为60％罐体积、接种量为装液量10％、发酵周期4天，待发酵完毕，采用20℃，8500rpm离心收集上清发酵液。

实施例6

一种灵芝-五味子双向发酵液，所述培养温度为30℃，其余均与实施例5所述发酵液的制备原料及制备工艺相同。

实施例7

一种灵芝-五味子双向发酵液，所述培养温度为35℃，其余均与实施例5所述发酵液的制备原料及制备工艺相同。

实验结果

表3不同温度灵芝-五味子双向发酵液对比研究表

	25℃	30℃	35℃
				酪氨酸酶抑制率(％)	91.70	98.71	97.85
样品稀释两倍酪氨酸酶抑制率(％)	62.41	98.09	98.03
				多糖(g/L)	1.36	1.46	1.38
样品稀释五倍ABTS(％)	58.28	71.37	59.28

由上表可知，灵芝五味子双向发酵液其最佳效果体现在温度为30℃时，酪氨酸酶抑制率稀释两倍后可达98.09％，且多糖水平、抗氧化水平菌表现出色。

实施例8

所述灵芝菌液在所述培养基中的接种量为10％；

所述灵芝-五味子双向发酵液工艺，包括以下步骤：

(4)双向发酵：将灵芝菌液接种入上述双向发酵培养基，在发酵温度为30℃，通气量0.5VVM、罐压0.01-0.015MPa、搅拌转速150rpm、装液量为60％罐体积、接种量为装液量10％、发酵周期4天，待发酵完毕，采用20℃，8500rpm离心收集上清发酵液。

实施例9

一种灵芝-五味子双向发酵液，所述通气量为1VVM，其余均与实施例8所述发酵液的制备原料及制备工艺相同。

实施例10

一种灵芝-五味子双向发酵液，所述通气量为2VVM，其余均与实施例8所述发酵液的制备原料及制备工艺相同。

实验结果

表3不同温度灵芝-五味子双向发酵液对比研究表

由上表可知，灵芝五味子双向发酵液其最佳效果体现在通气量为2VVM时，酪氨酸酶抑制率稀释可达97.73％，且多糖水平、抗氧化水平菌表现出色。因此最佳发酵工艺为：温度30℃、搅拌转速150rpm、罐压0.01-0.015Mpa、通气量2VVM、装液量为60％罐体积、接种量为装液量10％、发酵周期4天；

实施例11

所述灵芝菌液在所述培养基中的接种量为10％；

所述灵芝-五味子双向发酵液工艺，包括以下步骤：

(4)双向发酵：将灵芝菌液接种入上述双向发酵培养基，在发酵温度为30℃，通气量2VVM、罐压0.01-0.015MPa、搅拌转速150rpm、装液量为60％罐体积、接种量为装液量10％、发酵周期4天.

(5)发酵液后处理：板框进行固液分离(板框压力0.2-0.3MPa)、陶瓷膜除去大分子杂质(陶瓷膜孔径200nm)、电渗析除盐、纳滤浓缩(纳滤膜150Da)。

实验结果

表4双向发酵液陶瓷膜、电渗析、纳滤后处理对比研究表

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由上表可知，使用陶瓷膜、电渗析后处理工艺处理双向发酵液，多糖含量、抗氧化能力，酪氨酸酶抑制率均有较大损失，考虑到陶瓷膜设备构造及过滤特性，多糖大部分被其截留(得率仅为40.86％)，而电渗析处理则造成了酪氨酸酶抑制率水平的下调，说明陶瓷膜、电渗析工艺不适合本双向发酵液的后处理。

实施例12

所述灵芝菌液在所述培养基中的接种量为10％；

所述灵芝-五味子双向发酵液工艺，包括以下步骤：

(1)制备五味子粉末：中药粉碎机粉碎五味子，过60目筛处理；

(5)发酵液后处理：板框进行固液分离(板框压力0.2-0.3MPa)、微滤截留部分杂质(微孔滤芯孔径1um)、纳滤处理降电导(纳滤膜150Da)、组合过滤除菌(0.2umPP+0.65umPES+0.2umPES)，完成无菌灌装。

实验结果

表5双向发酵液微滤、纳滤、在线过滤器后处理对比研究表

	下罐滤液	后处理成品
			样液体积(L)	8	8
多糖(g/L)	1.53	1.26
			样品稀释五倍ABTS(％)	57.61	46.57
酪氨酸酶抑制率(％)	97.09	96.28

由上表可知，使用微滤、纳滤、在线过滤器后处理工艺处理双向发酵液较为合适，多糖得率提升为82.35％，成品酪氨酸酶抑制率依旧可达96.28％；因此最佳后处理工艺为板框进行固液分离(板框压力0.2-0.3MPa)、微滤截留部分杂质(微孔滤芯孔径1um)、纳滤处理降电导(纳滤膜150Da)、组合过滤除菌(0.2umPP+0.65umPES+0.2umPES)，完成无菌灌装。

实施例13

一种灵芝-五味子双向发酵液，所述双向发酵液由灵芝菌液与五味子复配培养基通过双向发酵及膜分离工艺后处理制得；使用成品灵芝五味子双向发酵液进行细胞及斑马鱼实验验证功效。结果表明灵芝-五味子双向发酵液具备较好的酪氨酸酶抑制效果、出色的抗氧化功效、舒缓功效、补水保湿功效及抗炎功效；

验证例1实验结果

实验结果如图1～图5所述。其中，图1为不同浓度灵芝-五味子双向发酵液添加量对细胞活性的影响；阴性组为正常细胞(细胞活性100％)，培养基中未作任何添加；双向发酵液-1000组为培养基中双向发酵液添加量为0.1％；双向发酵液-4000组为培养基中双向发酵液添加量为0.4％；双向发酵液-1％组为培养基中双向发酵液添加浓度为1％；双向发酵液-5％组为培养基中双向发酵液添加量为5％。

图2为灵芝-五味子双向发酵液、灵芝发酵液对脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞中的IL-6含量的影响；阴性组是正常细胞；阳性组是培养基中加入2ug/mL LPS(脂多糖，作用是促进IL-6的表达)诱导的炎症模型组；双向发酵液-1000组为阳性组培养基中双向发酵液添加量为0.1％；双向发酵液-4000组为阳性组培养基中双向发酵液添加量为0.4％；双向发酵液-1％组为阳性组培养基中双向发酵液添加量为1％；灵芝发酵液-1000组为阳性组培养基中双向发酵液添加量为0.1％；灵芝发酵液-4000组为阳性组培养基中双向发酵液添加量为0.4％；灵芝发酵液-1％组为阳性组培养基中双向发酵液添加量为1％。

图3灵芝-五味子双向发酵液对双氧水诱导的人永生化角质细胞ROS的影响；阴性组为正常细胞、阳性组为500uM双氧水诱导的高活性氧自由基模型组；双向发酵液-5％为阳性组培养基中双向发酵液添加量为5％；双向发酵液-1％为阳性组培养基中双向发酵液添加量为1％；双向发酵液-4000为阳性组培养基中双向发酵液添加量为0.4％。

图4灵芝-五味子双相发酵液对斑马鱼刺激模型的缓解作用；空白对照组为正常斑马鱼；模型组为添加了250umol/L十二烷基硫酸钠的刺激模型组；阳性对照组为在刺激模型组基础上添加量1000umol/L甘草酸二钾，用来对比受试物对斑马鱼刺激的缓解效果；双向发酵液-0.5％为刺激模型组中加入双向发酵液添加量为0.5％.

图5灵芝发酵液、双向发酵液保湿效果；3％甘油为3mL甘油定容到100mL；4％甘油为4mL甘油定容到100mL；5％灵芝发酵液为5g灵芝发酵液冻干粉溶解后定容至100mL；5％双向发酵液为5g灵芝-五味子双向发酵液冻干粉溶解后定容至100mL。

上述图添加量百分比均为体积百分比。

从图1可以看出灵芝五味子双向发酵液≤1％添加量时对细胞无毒性，且通过与阳性对照对比，证明了灵芝五味子双向发酵液具备抗炎、抗氧化、舒缓保湿等功效，均与阳性对照组存在显著性差异，且保湿水平显著高于同浓度灵芝发酵液，保湿效果处于3％-4％甘油之间；综上该款双向发酵液原料具备较好的酪氨酸酶抑制效果、出色的抗氧化功效、舒缓功效、补水保湿功效及抗炎功效。

从图1可以看出，相较于正常hacat细胞活力而言，当灵芝添加量从0.1％增加到1％过程中，对细胞活力均无显著性影响；当添加量为5％时，细胞活性出现显著降低，说明灵芝五味子双向发酵液≤1％添加量时对细胞无影响，当添加量来到5％时细胞活性受抑制。

从图2可以看出，相较于阳性炎症模型组，灵芝发酵液0.1％、0.4％均无抑制验证因子IL-6表达的效果，说明在该添加量下灵芝发酵液无抗炎功效，当灵芝发酵液添加量为1％时才有略微的抗炎功效；灵芝双向发酵液三个浓度下对IL-6炎症因子均有显著的抑制效果，且抗炎效果与浓度呈现正相关，并且抗炎症效果均显著强于同浓度的灵芝发酵液。

从图3可知，相较于阳性模型组高活性氧自由基模型，灵芝-五味子双向发酵液添加量为0.4％与1％均有显著的清除活性氧自由基的效果，且0.4％的添加量抗氧化效果优于1％的组别；添加量为5％时无抗氧化效果，原因可能是添加量为5％时细胞活性下降所导致的结果。

从图4可以看出，相较于模型组刺激模型，灵芝-五味子双向发酵液添加量为0.5％时具备显著的舒缓效果，能有效降低斑马鱼的受刺激强度；但是相较于1000umol/L甘草酸二钾的阳性组作用效果略差，可以考虑适当提高添加量进一步评估。

从图5可以看出，灵芝发酵液与灵芝-五味子双向发酵液均具备一定的保湿效果，且在相同的时间点，灵芝-五味子双向发酵液的保湿效果优于灵芝发酵液，且通过与甘油的对比可以判断，灵芝-五味子双向发酵液的保湿效果处于3％-4％甘油之间。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种发酵液的后处理工艺，包括：

B)将过滤后发酵液经三级组合膜过滤除菌即得。

2.根据权利要求1所述的后处理工艺，其特征在于，步骤A)所述板框固液分离的压力为0.2～0.3Mpa；所述微滤的孔径为1～5μm；所述纳滤的纳滤膜为150Da。

3.根据权利要求1所述的后处理工艺，其特征在于，步骤B)所述三级组合膜具体包括0.2μmPP、0.65μmPES和0.2μmPES。

4.根据权利要求1所述的后处理工艺，其特征在于，所述发酵液为灵芝五味子双向发酵液。

5.一种灵芝五味子双向发酵工艺，其特征在于，包括：

A)制备灵芝种子液；

将双向发酵培养基灭菌后，待用；

C)采用权利要求1～4任意一项所述的后处理工艺对步骤B)所述的灵芝五味子双向发酵液进行后处理，即得。

6.根据权利要5所述的工艺，其特征在于，步骤A)所述制备灵芝种子液具体为：

所述种子培养基包括葡萄糖、蛋白胨、酵母粉和麦芽浸粉；

所述培养的条件为30℃，180rpm，培养2～6天；

所述灵芝种子液的接种量为10％。

7.根据权利要求4所述的工艺，其特征在于，步骤A)所述双向发酵培养基包括：

所述灭菌为在121℃，压力0.11Mpa下灭菌20min；

步骤B)所述发酵参数具体为：30℃、通气量2VVM、罐压0.01～0.015MPa、搅拌转速150rpm、装液量为60％罐体积、发酵周期4天。

8.一种灵芝五味子双向发酵液，其特征在于，由权利要求4～7任意一项所述的制备方法制备得到。

9.权利要求8所述的灵芝五味子双向发酵液在制备抑制酪氨酸酶的产品、抗氧化产品、舒缓产品、保湿产品或抗炎产品中的应用。

10.一种化妆品，其特征在于，包括权利要求8所述的灵芝五味子双向发酵液。