KR101408088B1 - 효모 복합 발효를 통한 백년초의 기능성 성분 증진방법 - Google Patents

효모 복합 발효를 통한 백년초의 기능성 성분 증진방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 백년초 추출물의 기능성 성분을 증진시키는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 2종 이상의 효모를 복합적으로 발효시키는 방법에 관한 것이다.

Description

효모 복합 발효를 통한 백년초의 기능성 성분 증진방법{METHOD FOR INCREASING FUNTIONAL COMPONENT OF OPUNTIA HUMIFUSA BY COMPLEX FERMENTATION OF YEAST}
본 발명은 백년초 추출물의 기능성 성분을 증진시키는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 2종 이상의 효모를 복합적으로 발효시키는 방법에 관한 것이다.
베타글루칸(β-glucan)은 글루코오즈가 β-1,3 화학 결합을 중심으로 중합된 베타글루칸을 총칭하며, 버섯, 효모 등 미생물의 세포벽의 구성성분으로 존재하거나 세포 외로 분비되는 미생물 유래의 베타글루칸과 보리, 귀리와 같은 맥아류의 식이 섬유에서 추출되는 식물성 베타글루칸이 있다. 이러한 베타글루칸은 수용성 식이 섬유의 형태로 낮은 농도에서 높은 점성을 나타내며, 항암, 항콜레스테롤, 항산화, 면역증강 및 피부재생 효과 등과 같은 여러 가지 생리활성 촉진효과가 밝혀지고 있어 건강식품소재 및 식품첨가물로 이용이 증가되고 있다. 다양한 형태의 베타글루칸 중에서도 면역증강작용은 β-(1,3)-글루칸 구조를 가진 물질에서 많은 것으로 밝혀져 왔다. 그러나 일반적으로 담자균의 자실체나 균사체에 함유되어 있는 베타글루칸은 생육, 재배 조건에 따라 함량이나 분자량 등이 크게 차이가 있고, 불순물을 포함하고 있어 분리 및 정제에 어려움이 따르며, 물에 대한 용해성이 낮아 다양한 용도로의 이용에 많은 제한이 있다.
글루타치온은 효모 및 동물의 간장 등에 넓게 분포되어 있어, 생체 내 산화 환원 반응에 깊게 관여하고 있는 트리펩타이드이며, 생체 내의 주된 환원제로서 그 작용 부위인 SH기에 의해 여러 가지 산화 환원적 대사에 의한 세포방어, 생체 이물질 대사 및 수복과정 등에 작용하여, 더 자세하게는 간기능 회복 작용이나 해독 작용 또 활성 산소의 소거에 의한 세포의 노화를 막는 작용 등이 지극히 유용한 물질이다. 글루타치온에는 그 형태로서 환원형 글루타치온과 2개의 환원형 글루타치온이 시스테인잔기로 다이설파이드 결합한 산화형 글루타치온이 존재한다. 글루타치온의 세포 내 농도 저하에 의해서 야기되는 증상으로는 자외선에 노출됨에 의한 세포 상해, 염증, 흑색화, 주근깨생성, 간질환, 만성신부전, 폐질환, 백내장 등이 일어날 수 있다. 그러므로 미백기능이 중요시 되는 화장품에 있어 글루타치온의 세포 내 공급을 중요하게 생각하고 있으며, 글루타치온의 미백기능성을 강조한 제품이 출시되고 있다. 그러나 글루타치온은 그 생산성이 매우 낮아 고가의 제품으로 출시되고 있다는 문제점이 있다.
본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해, 백년초 추출물을 2종 이상의 효모를 이용하여 발효시키는 경우, 베타글루칸 및 글루타치온을 고수율로 얻을 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
대한민국 등록특허 제10-0763797호
본 발명의 목적은 백년초 추출물의 기능성 성분을 증진시키는 방법 및 기능성 성분인 베타글루칸 및 글루타치온을 고수율로 함유하는 백년초 추출물을 제공하는 데 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 백년초 추출물의 기능성 성분을 증진시키는 방법으로서, 백년초 추출물에 2종 이상의 효모를 접종하여 발효시키는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 발효물 총 중량에 대하여, 베타글루칸을 2중량%이상, 글루타치온을 0.2중량%이상으로 함유하는 백년초 발효물을 제공한다.
본 발명은 종래 낮은 수율로 생산되어 고가로 판매되었던, 미용 또는 건강을 증진시킬 수 있는 유효물질인 베타글루칸 및 글루타치온을 고수율로 함유하면서 생산가격을 낮출 수 있는 제조방법을 제공하여 유용하다. 아울러, 본 발명에 따라 얻어지는 조성물은 화장품, 건강식품 조성물 또는 약학적 조성물에 다양하게 이용될 수 있을 것이다.
도 1은 실시예 1-3에 따른 배양액에 함유되어 있는 베타글루칸을 MiniTab ANOVA으로 분석한 결과이다.
도 2는 실시예 1-3에 따른 배양액에 함유되어 있는 글루타치온을 MiniTab ANOVA분한 결과이다.
도 3은 실시예 3에 따른 배양액의 글루타치온 분석 결과(HPLC)이다.
도 4는 실시예 4 및 비교예 2에 따른 배양액에 함유된 베타글루칸을 분석하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 5는 실시예 4 및 비교예 2에 따른 배양액에 함유된 글루타치온을 분석하여 그래프로 나타낸 것이다.
본 발명은 일 관점에서, 백년초 추출물의 기능성 성분을 증진시키는 방법으로서, 백년초 추출물에 2종 이상의 효모를 접종하여 발효시키는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다.
본 명세서에서 상기 '백년초(Opuntia humifusa)'는 선인장과 중에 오푼티아(Opuntia)속에 속하는 식물로, 손바닥 선인장이라고도 불린다. 제주도의 자생식물로 비교적 척박한 토양에서 잘 자람으로써 개간이 어려운 곳에 널리 재배된다. 백년초 열매는 식이섬유가 매우 풍부한 반면, 열량은 매우 낮으며, 수분 85%, 탄수화물 10-15%, 글루코즈 및 프락토즈 6-8%, 비타민 등이 주성분이다. 본 명세서에서 상기 백년초 추출물은 백년초의 열매, 뿌리, 줄기, 잎 등을 포함하는 식물의 전 부위로부터 제한없이 얻어질 수 있으나, 구체적으로 열매로부터 얻어질 수 있다.
본 명세서에서 상기 '백년초 추출물'은 추출과정에 있어서 예를 들면, 세척하고 건조된 세말화된 백년초를 물 또는 유기용매에 넣고 추출하여 침적시킨 후 여과포 여과와 원심분리를 통해 잔사와 여액을 분리하고, 분리된 여액을 감압 농축하여 얻어질 수 있다. 본 명세서에서 사용가능한 유기용매는 에탄올, 메탄올, 부탄올, 에테르, 에틸아세테이트, 클로로포름 또는 이들 유기용매와 물의 혼합용매에서 선택될 수 있으며, 원료의 안전성을 고려할 때 물 또는 30~70% 농도의 에탄올을 사용하는 것이 바람직하다. 상기와 같이 용매를 이용하여 추출물을 얻은 후 당업계에 알려진 통상적인 방법으로 상온에서 냉침, 가열 및 여과하여 액상물을 얻을 수 있거나, 또는 추가적으로 상기 용매를 증발, 분무 건조 또는 동결 건조할 수 있다. 아울러, 상기 백년초 추출물은 상기 추출물은 유기용매법, 가속용매추출장치(accelerated solvent extracter, ASE) 또는 가압용매추출장치(pressurized liquid extraction, PLE)를 이용하여 추출할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 당업자에게 자명한 추출방법에 의하여 추출할 수 있다.
본 명세서에서 상기 '2종 이상의 효모를 접종하여 백년초 추출물을 발효'시킨다는 것은 2종 이상의 효모를 각각 배양하여 얻어진 배양액을 혼합한 배양액을 이용하여 백년초 추출물을 발효시키거나 또는 2종 이상의 효모를 함께 배양하여 얻어진 배양액을 백년초 추출물의 발효에 이용하는 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 당업자에게 자명한 것이라면 제한이 없다.
본 발명의 일 관점인 방법에 있어서, 상기 효모는 아우레오바시디움 속(Aureobasidium sp.) 및 칸디다 속(Candida sp.)일 수 있다.
본 발명의 일 관점인 방법에 있어서, 상기 효모는 아우레오바시디움 풀루란스 (Aureobasidium pullulans) 및 칸디다 유틸리스 SY8-M2-1(Candida utilis SY8-M2-1)일 수 있다.
본 발명의 일 관점인 방법에 있어서, 상기 효모는 아우레오바시디움 풀루란스 (Aureobasidium pullulans, KCCM 12017) 및 칸디다 유틸리스 SY8-M2-1(Candida utilis SY8-M2-1, KFCC11487P)일 수 있다.
본 명세서에서 아우레오바시디움 풀루란스 (Aureobasidium pullulans, KCCM 12017)는 (사)한국종균협회에서 분양받아 사용하였다. 또한 본 명세서의 칸디다 유틸리스 SY8-M2-1(Candida utilis SY8-M2-1, KFCC11487P)는 대한민국 공개특허 10-2011-0118492에서 이용된 것이며, 2010년 3월 31일 한국미생물보존센터에 미생물 기탁번호 KFCC11487P로 기탁하였다.
본 발명의 일 관점인 방법에 있어서, 상기 기능성 성분은 베타글루칸 및 글루타치온으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 일 관점인 방법에 있어서, 상기 발효시키는 단계는 추출물 총 중량이 100중량부일 때, 아우레오바시디움 풀루란스 및 칸디다 유틸리스 SY8-M2-1의 혼합배양액을 5중량부이상 처리하여, 30℃ 내지 40℃에서 15 시간내지 30시간동안 배양하는 것을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 상기 '혼합 배양액'은 2종 이상의 효모를 각각 배양하여 얻어진 배양액을 혼합한 배양액 또는 2종 이상의 효모를 함께 배양하여 얻어진 배양액을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 당업자에게 자명한 것이라면 제한이 없다.
상기 혼합배양액을 추출물 총 중량이 100중량부일 때, 아우레오바시디움 풀루란스 및 칸디다 유틸리스 SY8-M2-1의 혼합배양액을 5중량부이상 처리하는 경우, 이에 따라 얻어지는 발효물의 베타글루칸 및 글루타치온이 고함량이 될 수 있다. 구체적으로 상기와 같은 관점에서, 혼합배양액은 추출물 총 중량이 100중량부일 때, 5중량부이상 내지 30중량부이하, 7중량부이상 내지 28중량부이하, 9중량부이상 내지 26중량부이하, 11중량부이상 내지 24중량부이하 또는 13중량부이상 내지 22중량부이하로 처리할 수 있다.
상기 발효시키는 단계의 온도가 30℃보다 낮으면 효모의 배양액이 충분히 활성화될 수 없으며, 40℃보다 높으면 효모의 배양액이 변성될 위험이 있다. 상기와 같은 관점에서, 발효시키는 단계의 온도는 31℃ 내지 39℃, 32℃ 내지 38℃ 또는 33℃ 내지 37℃일 수 있다.
상기 발효시키는 단계의 반응시간이 15시간보다 짧으면 효모의 배양액이 충분히 활성화될 수 없으며, 30시간보다 긴 경우, 효모의 배양액이 변성될 위험이 있다. 상기와 같은 관점에서, 발효시키는 단계의 반응시간은 17시간 내지 28시간, 19시간 내지 26시간 또는 21시간 내지 24시간일 수 있다.
본 발명의 일 관점인 방법에 있어서, 상기 방법은 발효시키는 단계 전에, 백년초 추출물에 셀룰라아제(cellulase)를 처리하여 추출물을 얻는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 관점인 방법에 있어서, 상기 추출물을 얻는 단계는 셀룰라아제를 처리하고, 30℃ 내지 70℃에서 3시간 내지 7시간 동안 반응시키는 것을 포함할 수 있다. 상기 방법에서, 30℃미만 또는 3시간 미만 동안 반응시킬 경우, 셀룰라아제에 의한 효소 반응이 충분하지 못하여, 고함량의 베타글루칸 및 글루타치온을 가지는 발효물을 제조하기 어렵다. 아울러, 70℃를 초과하거나 또는 7시간을 초과하여 반응시키는 경우, 셀룰라아제에 의한 효소 반응이 지나쳐서 목적하는 추출물이 얻어질 수 없었다. 상기와 같은 관점에서, 본 발명의 백년초 추출물은 셀룰라아제를 처리하고, 30℃ 내지 70℃, 30℃ 내지 70℃, 30℃ 내지 70℃, 30℃ 내지 70℃ 또는 30℃ 내지 70℃의 온도에서 수행될 수 있고, 3.5시간 내지 6.5시간 동안 또는 4시간 내지 6시간 동안 수행될 수 있다.
본 발명의 일 관점인 방법에 있어서, 상기 추출물은 분말 제형일 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 백년초 발효물로서, 발효물 총 중량에 대하여, 베타글루칸을 2중량%이상, 글루타치온을 0.2중량%이상으로 함유하는 백년초 발효물에 관한 것이다. 구체적으로 상기 발효물은 베타글루칸을 2중량% 내지 50중량%로 포함할 수 있으며, 글루타치온을 0.2중량% 내지 5중량%로 포함할 수 있다. 상기와 같은 관점에서, 본 명세서의 발효물은 베타글루칸을 4중량% 내지 48중량%, 6중량% 내지 46중량%, 8중량% 내지 44중량%, 10중량% 내지 42중량% 또는 12중량% 내지 40중량%로 포함할 수 있고, 글루타치온을 0.4중량% 내지 4.8중량%, 0.6중량% 내지 4.6중량%, 0.8중량% 내지 4.4중량%, 1중량% 내지 4.2중량% 또는 1.2중량% 내지 4중량%로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 관점인 발효물에 있어서, 상기 발효물은 효모 발효물일 수 있고, 상기 효모는 아우레오바시디움 속(Aureobasidium sp.) 및 칸디다 속(Candida sp.)일 수 있다. 또한, 상기 효모는 아우레오바시디움 풀루란스 (Aureobasidium pullulans) 및 칸디다 유틸리스 SY8-M2-1(Candida utilis SY8-M2-1)일 수 있으며, 아우레오바시디움 풀루란스 (Aureobasidium pullulans, KCCM 12017) 및 칸디다 유틸리스 SY8-M2-1(Candida utilis SY8-M2-1, KFCC11487P)를 포함한다.
본 발명의 일 관점인 발효물은 약학적 조성물, 건강식품 조성물 또는 화장료 조성물에 함유되어 사용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
[ 실시예 1] 아우레오바시디움 풀루란스 ( Aureobasidium pullulans )의 배양
본 발명에서 사용된 아우레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pullulans , KCCM 12017) 는 (사)한국종균협회에서 분양받아 사용하였다.
아우레오바시디움 풀루란스는 YM 아가 배지에서 30℃로 24시간동안 계대 배양시킨 후 냉장보관하여 종배양에 사용하였다. 상기 냉장보관한 아우레오바시디움 풀루란스 (Aureobasidium pullulans, KCCM 12017) 슬랜트(slant)에서 1백금이를 종배양 배지 5ml가 담긴 테스트 튜브에 접종하여 종배양 하였다.
본 특허의 기능성 물질인 베타글루칸과 글루타치온의 생산유무를 검증하기 위하여 YM broth를 기본배지로 사용하여 본배양 실험을 실시하였으며 동일한 본 배양 실험을 2회 반복하여 실시하였다. 본 배양은 250ml 플라스크를 사용하였으며, 본 배양액량의 5%(w/w)에 해당하는 종배양액을 접종하여 30℃에서 24시간 동안 배양하여 얻어진 배양액에 포함된 베타글루칸과 글루타치온 함량을 실험예 1 및 실험예 2에서 분석하였고, 그 결과 표 2, 표 3 및 도 1, 도 2가 얻어졌다.
[ 실시예 2] 아우레오바시디움 풀루란스 ( Aureobasidium pullulans ) 및 칸디다 유틸리스 SY8 - M2 -1( Candida utilis SY8 - M2 -1) 복합배양
아우레오바시디움 풀루란스 (Aureobasidium pullulans)의 종배양액은 실시예 1에서 얻어진 것을 사용하였다.
이하, 칸디다 유틸리스 SY8-M2-1(Candida utilis SY8-M2-1)의 종배양액을 제조한다. 칸디다 유틸리스 SY8-M2-1를 YM 아가 배지에서 30℃로 24시간 동안 계대 배양시킨 후 냉장보관하여 종배양에 사용하였다. 상기 냉장보관한 칸디다 유틸리스 SY8-M2-1(Candida utilis SY8-M2-1) 슬랜트(slant)에서 1백금이를 종배양 배지 5ml이 담긴 테스트 튜브에 접종하여 종배양 하였다.
본 특허의 기능성 물질인 베타글루칸과 글루타치온의 생산유무를 검증하기 위하여 YM broth를 기본배지로 사용하여 본배양 실험을 실시하였으며 동일한 본 배양 실험을 2회 반복하여 실시하였다. 본 배양은 250ml 플라스크를 사용하였으며, 본 배양액량의 5%(w/w)에 해당하는 2종(아우레오바시디움 풀루란스, 칸디다 유틸리스 SY8-M2-1)의 종배양액을 혼합접종하고 30℃에서 24시간 동안 배양하여 얻어진 배양액에 포함된 베타글루칸과 글루타치온 함량을 실험예 1 및 실험예 2에서 분석하였고, 그 결과 표 2, 표 3 및 도 1, 도 2가 얻어졌다.
[ 비교예 1] 백년초 추출물(분말)의 제조
파쇄한 백년초 열매(1kg)에 5kg의 정제수를 투입하고 80℃, 1시간 이상 교반하면서 열수 추출한다. 상기 추출물을 필터프레스(동일엔지니어링/대한민국)를 이용하여 여과한 후, 분말건조기(유진테크/대한민국)를 이용하여 분말화하였다. 이렇게 얻어진 분말에 포함된 베타글루칸과 글루타치온 함량을 실험예 1 및 실험예 2에서 분석하였고, 그에 따라 표 1이 얻어졌다.
[ 실시예 3] 백년초 추출물을 아우레오바시디움 풀루란스 ( Aureobasidium pullulans ) 및 칸디다 유틸리스 SY8 - M2 - 1( Candida utilis SY8-M2-1)를 이용하여 복합발효시키는 경우에 있어서, 백년초 추출물의 농도별 첨가에 따른 효과 확인
파쇄한 백년초 열매(1kg)에 5kg의 정제수를 투입하고 80℃, 1시간 이상 교반하면서 열수 추출한다. 상기 추출물을 필터프레스(동일엔지니어링/대한민국)를 이용하여 여과한 후 얻어진 여과액을 40 Brix까지 농축하여, 이하에서 발효 원료로 사용하였다.
아우레오바시디움 풀루란스 (Aureobasidium pullulans) 및 칸디다 유틸리스 SY8-M2-1(Candida utilis SY8-M2-1)의 종배양액은 실시예 2에 의하여 얻어진 것을 사용하였다.
농축한 백년초 추출물을 복합발효시키는 경우, 기능성 물질인 베타글루칸과 글루타치온의 생산유무를 검증하기 위하여 YM broth를 기본배지로 사용하여 본배양 실험을 실시하였으며 동일한 본 배양 실험을 2회 반복하여 실시하였다. 본 배양은 250ml 플라스크를 사용하였으며, 본 배양액량의 5%(w/w)에 해당하는 2종(아우레오바시디움 풀루란스, 칸디다 유틸리스 SY8-M2-1)의 종배양액을 혼합접종하고 30℃에서 24시간 동안 배양하여 얻어진 배양액에 포함된 베타글루칸과 글루타치온 함량을 실험예 1 및 실험예 2에서 분석한 결과, 표 2, 표 3 및 도 1~도 3이 얻어졌다.
[ 실시예 4] 효소 처리하여 얻어진 백년초 추출물을 아우레오바시디움 풀루란스 ( Aureobasidium pullulans ) 및 칸디다 유틸리스 SY8 - M2 -1( Candida utilis SY8 -M2-1)를 이용하여 복합발효
파쇄한 백년초 열매(1kg)에 5kg의 정제수를 투입하고 80℃, 1시간 이상 교반하면서 열수 추출한다. 상기 추출액에 백년초 열매 무게(1kg)의 0.1%(w/w)에 해당하는 셀룰라아제(cellulase)를 투입하여, 50℃에서 5시간동안 효소반응시키고, 100℃에서 효소실활시킨 후, 필터프레스(동일엔지니어링/대한민국)를 이용하여 여과한 후 얻어진 여과액을 40 Brix까지 농축하여, 이하에서 발효 원료로 사용하였다.
아우레오바시디움 풀루란스 (Aureobasidium pullulans) 및 칸디다 유틸리스 SY8-M2-1(Candida utilis SY8-M2-1)의 종배양액은 실시예 2에 의하여 얻어진 것을 사용하였다.
상기 효소처리한 농축 백년초 추출물을 복합발효시키는 경우, 기능성 물질인 베타글루칸과 글루타치온의 생산유무를 검증하기 위하여 YM broth를 기본배지로 사용하여 본배양 실험을 실시하였다. 본 배양은 250ml 플라스크를 사용하였으며, 본 배양액량의 5%(w/w)에 해당하는 2종(아우레오바시디움 풀루란스, 칸디다 유틸리스 SY8-M2-1)의 종배양액을 혼합접종하고 30℃에서 24시간 동안 배양하여 얻어진 배양액에 포함된 베타글루칸과 글루타치온 함량을 실험예 1 및 실험예 2에서 분석하였다.
실험의 통계처리를 위하여 상기와 동일한 방법으로 3회 반복 발효시켜 MiniTab의 ANOVA분석을 실시한 결과, 표 4 및 도 4~도 5가 얻어졌다.
[ 비교예 2] 효소 처리하지 않은 얻어진 백년초 추출물을 아우레오바시디움 풀루란스 ( Aureobasidium pullulans ) 및 칸디다 유틸리스 SY8 - M2 -1( Candida utilis SY8-M2-1)를 이용하여 복합발효
파쇄한 백년초 열매(1kg)에 5kg의 정제수를 투입하고 80℃, 1시간 이상 교반하면서 열수 추출한다. 상기 추출물을 필터프레스(동일엔지니어링/대한민국)를 이용하여 여과한 후 얻어진 여과액을 40 Brix까지 농축하여, 이하에서 발효 원료로 사용하였다.
아우레오바시디움 풀루란스 (Aureobasidium pullulans) 및 칸디다 유틸리스 SY8-M2-1(Candida utilis SY8-M2-1)의 종배양액은 실시예 2에 의하여 얻어진 것을 사용하였다.
상기와 같이 효소처리하지 않은 농축 백년초 추출물을 복합발효시키는 경우, 기능성 물질인 베타글루칸과 글루타치온의 생산유무를 검증하기 위하여 YM broth를 기본배지로 사용하여 본배양 실험을 실시하였다. 본 배양은 250ml 플라스크를 사용하였으며, 본 배양액량의 5%(w/w)에 해당하는 2종(아우레오바시디움 풀루란스, 칸디다 유틸리스 SY8-M2-1)의 종배양액을 혼합접종하고 30℃에서 24시간 동안 배양하여 얻어진 배양액에 포함된 베타글루칸과 글루타치온 함량을 실험예 1 및 실험예 2에서 분석하였다.
실험의 통계처리를 위하여 상기와 동일한 방법으로 3회 반복 발효시켜 MiniTab의 ANOVA분석을 실시한 결과, 표 4 및 도 4~도 5가 얻어졌다.
[ 실시예 5] 실시예 4에 의하여 얻어진 발효액의 분말화
실시예 4에 의하여 얻어진 최종 배양액을 90℃, 30분 동안 살균한 후, 필터프레스 (동일엔지니어링/대한민국)를 사용하여 여과하고 분무건조기 (유진테크/대한민국)를 이용하여 분말화 하였다.
실시예 5에 따른 분말에 포함된 베타글루칸과 글루타치온 함량을 실험예 1 및 실험예 2에서 분석하였고, 이를 표 1에서 나타내었다.
[ 실험예 1] 베타글루칸 (β- glucan ) 분석
실시예 1 내지 5 및 비교예 1 내지 2에 의해 얻어진 각각의 배양액 또는 발효액에 함유되어 있는 베타글루칸의 함량을 분석하였다.
본 분석은 건강기능식품공전 Ⅲ.3.4.3 베타글루칸 시험법을 기본으로 하였으며, 과정은 다음과 같다.
① 시험은 각각의 시료 및 공시험을 동시에 실시한다. 시료 2ml을 취한 뒤 10 ml의 증류수를 가한다.
② 아밀라아제(Amlylase) 200 ㎕와 글루코아밀라아제(glucoamlylase) 100 ㎕를 넣고 60 ℃에서 2시간 동안 진탕하여 효소분해 시킨다.
③ 2시간 후, 80 ㎕ 프로테아제(protease)를 넣고 2시간 동안 진탕하여 효소분해 시킨다.
④ 효소분해물에 95% 에탄올 40 ml을 가하여 4℃에서 12시간 동안 침전시킨다.
⑤ 위의 용액을 원심분리 (6000rpm, 20분) 하여 시료의 침전물을 취한다.
⑥ 침전물에 10ml의 증류수를 가하여 균질화시킨다.
⑦ 위의 용액을 5배 희석한 후, 5%의 페놀용액 1 ml과 황산 5 ml을 가하여 혼합 한 후, 실온에서 20분간 반응시킨 후 파장 470 nm에서 흡광도를 측정한다.
⑧ 베타글루칸 함량 계산법은 아래와 같다.
베타글루칸 함량 (mg/ml) = C * a/S *10 *1/1000 * 0.9
C : 시험용액중의 글루코오즈 농도 (㎍/ml)
a : 시험용액의 전량 (ml)
10 : 희석배수
S : 시료 채취량 (ml)
1/1000 : 단위 환산 계수
0.9 : 베타글루칸 전환계수 (162/180)
[ 실험예 2] 글루타치온 분석
실시예 1 내지 5 및 비교예 1 내지 2에 의해 얻어진 각각의 배양액 또는 발효액에 함유되어 있는 글루타치온의 함량을 분석하였다.
[ 실험예 2-1] HPLC 이용한 글루타치온 분석
실시예 1 내지 5 및 비교예 1 내지 2에 의해 얻어진 각각의 배양액 또는 발효액 20㎕를 0.25 μm 필터를 이용하여 실험에 사용한다. 글루타치온 분석에 사용된 기기는 HPLC system Beckman SYSTEM GOLD® Solvent Module이며, 사용한 컬럼은 SHISEIDO CAPCELL PAK C18 4.6×250 mm column이고 분석조건은 컬럼온도 40℃, 검출기는 215nm, 유속은 1 ml/min이며, 이동상은 0.1mol/L NaClO4, 0.1 vol % H3PO4를 사용하였다. 실시예 3의 배양액을 이용하여 얻어진 결과를 도 3에서 나타내었다.
[ 실험예 2-2] 알록산 시약법( Alloxan reagent method )을 이용한 글루타치온 분석
실시예 1 내지 5 및 비교예 1 내지 2에 의해 얻어진 각각의 배양액 또는 발효액 1ml를 0.25M phosphate buffer(Ph7.6) 3.5mL 에 녹인 후 0.1M 글라이신(glycine) 용액 0.5mL을 가하였다. 시료 혼합액에 0.1% 알록산 시약 (Alloxan reagent)(0.1M HCl에 용해) 1.0mL을 가한 후 알루미늄 호일을 이용하여 빛을 차단하고 실온에서 20분 동안 반응시켰다. 반응액의 흡광도는 305 nm에서 측정하였고, 0-200 μM의 글루타치온 스탠다드 물질을 이용하여 검량선을 구하였다.
이하, 상기 실험예에 따라 얻어진 결과를 보인다.
단백질 NaCl 고형분 조지방 회분 총당 베타
글루칸		 글루
타치온
(%, w/w) (%,w/w) (%, w/w) (%, w/w) (%, w/w) (%, w/w) mg/g mg/g
비교예 1 18.89 1.02 94.98 0.80 12.59 29.98 10.05 0.00
실시예 5 26.54 0.85 94.06 0.74 5.99 5.15 64.30 3.01
백년초를 추출하며 분말화 한 비교예 1의 실험결과, 베타글루칸은 10.05 mg/g이 포함되어 있는 것으로 확인되었다. 반면, 백년초 추출물을 2종의 효모를 이용하여 발효시킴에 따라 얻어진 발효 조성물을 분말화한 실시예 5의 결과, 단백질은 26.54(%, w/w)로 발효를 통하여 기존보다 40% 이상 증가, 베타글루칸 역시 6배 이상 증가하였으며, 기존 백년초 추출분말에는 존재하지 않던 글루타치온이 3.01 mg/g로 존재하는 것으로 확인되었다.
실험군 지표물질 mg/ml
A(실시예 1) 1회 배양시, 베타글루칸 2.146
2회 배양시, 베타글루칸 2.041
B(실시예 2) 1회 배양시, 베타글루칸 3.397
2회 배양시, 베타글루칸 3.257
C[실시예 3(백년초 1%)] 1회 배양시, 베타글루칸 3.854
2회 배양시, 베타글루칸 3.954
D[실시예 3(백년초 10%)] 1회 배양시, 베타글루칸 4.218
2회 배양시, 베타글루칸 4.223
실시예 1보다 아우레오바시디움 풀루란스 (Aureobasidium pullulans) 및 칸디다 유틸리스 SY8-M2-1(Candida utilis SY8-M2-1)을 공동배양한 경우(실시예 3), 베타글루칸 생성량이 증가하는 것을 볼 수 있다. 또한 실시예 3과 실시예 4와 같이 백년초 추출물 첨가량이 증가함에 따라 베타글루칸 생성량이 농도에 비례적으로 증가하는 것을 볼 수 있으며, 이것은 MiniTab ANOVA분석 결과(도 1)처럼 P=0.002로 95% 신뢰구간에서 매우 유의적인 것으로 나타났다.
실험군 지표물질 mg/ml
A(실시예 1) 환원형 글루타치온 0.043
산화형 글루타치온 0.105
B(실시예 2) 환원형 글루타치온 0.070
산화형 글루타치온 0.110
C[실시예 3(백년초 1%)] 환원형 글루타치온 0.075
산화형 글루타치온 0.175
D[실시예 3(백년초 10%)] 환원형 글루타치온 0.144
산화형 글루타치온 0.176
실시예 1보다 아우레오바시디움 풀루란스 (Aureobasidium pullulans) 및 칸디다 유틸리스 SY8-M2-1(Candida utilis SY8-M2-1)을 공동배양한 경우 생성되는 산화형 글루타치온과 환원형 글루타치온의 총합이 증가하는 것을 볼 수 있다. 또한 실시예 3과 실시예 4와 같이 백년초 추출물 첨가량이 증가함에 따라 산화형 글루타치온과 환원형 글루타치온의 총합이 농도에 비례적으로 증가하는 것을 볼 수 있으며, 이것은 MiniTab ANOVA분석 결과(도 2)처럼 P=0.001로 95% 신뢰구간에서 매우 유의적인 것으로 나타났다.
베타글루칸 글루타치온
mg/ml mg/ml
실시예4 6.435 0.275
6.867 0.301
7.01 0.315
비교예2 4.895 0.146
4.213 0.114
4.862 0.129
실시예 4와 비교예 2에서의 베타글루칸과 글루타치온 생산성 결과를 T-검정한 결과 베타글루칸은 P(T<=t)=0.011, 글루타치온은 P(T<=t)=0.006 도출되어 95% 신뢰구간에서 매우 유의적인 것으로 나타났다. 그러므로 효소처리를 한 백년초 추출물을 사용하여 복합발효 시 베타글루칸과 글루타치온의 생산성이 매우 상승됨을 볼 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (14)

  1. 백년초 추출물에 2종 이상의 효모를 접종하여 발효시키는 단계를 포함하는, 백년초 추출물의 기능성 성분을 증진시키는 방법으로,
    상기 효모는 아우레오바시디움 속(Aureobasidium sp.) 및 칸디다 속(Candida sp.)인, 방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 효모는 아우레오바시디움 풀루란스 (Aureobasidium pullulans) 및 칸디다 유틸리스 SY8-M2-1(Candida utilis SY8-M2-1)인, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 효모는 아우레오바시디움 풀루란스 (Aureobasidium pullulans, KCCM 12017) 및 칸디다 유틸리스 SY8-M2-1(Candida utilis SY8-M2-1, KFCC11487P)인, 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 기능성 성분은 베타글루칸 및 글루타치온으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인, 방법.
  6. 제3항 또는 제4항에 있어서,
    상기 발효시키는 단계는 추출물 총 중량이 100중량부일 때, 아우레오바시디움 풀루란스 및 칸디다 유틸리스 SY8-M2-1의 혼합배양액을 5중량부이상 처리하여, 30℃ 내지 40℃에서 15 시간내지 30시간동안 배양하는 것을 포함하는, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 방법은 발효시키는 단계 전에, 백년초 추출물에 셀룰라아제(cellulase)를 처리하여 추출물을 얻는 단계를 더 포함하는, 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 추출물을 얻는 단계는 셀룰라아제를 처리하고, 30℃ 내지 70℃에서 3시간 내지 7시간 동안 반응시키는 것을 포함하는, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 추출물은 분말 제형인, 제조방법.
  10. 발효물 총 중량에 대하여, 베타글루칸을 2중량%이상, 글루타치온을 0.2중량%이상으로 함유하는 백년초 효모 발효물로,
    상기 효모는 아우레오바시디움 속(Aureobasidium sp.) 및 칸디다 속(Candida sp.)인, 백년초 효모 발효물.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 제10항에 있어서, 상기 효모는 아우레오바시디움 풀루란스 (Aureobasidium pullulans) 및 칸디다 유틸리스 SY8-M2-1(Candida utilis SY8-M2-1)인, 백년초 효모 발효물.
  14. 제10항에 있어서, 상기 효모는 아우레오바시디움 풀루란스 (Aureobasidium pullulans, KCCM 12017) 및 칸디다 유틸리스 SY8-M2-1(Candida utilis SY8-M2-1, KFCC11487P)인, 백년초 효모 발효물.







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