KR101750619B1 - 여주와 어성초를 이용한 삼투압 효소 발효물의 제조방법, 이로부터 제조된 발효물 및 이를 포함하는 화장료, 식품 또는 약학 조성물 - Google Patents
여주와 어성초를 이용한 삼투압 효소 발효물의 제조방법, 이로부터 제조된 발효물 및 이를 포함하는 화장료, 식품 또는 약학 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 여주와 어성초를 이용한 삼투압 효소 발효물의 제조방법, 이로부터 제조된 발효물 및 이를 포함하는 화장료, 식품 또는 약학 조성물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 여주와 어성초를 이용한 삼투압 효소 발효물의 제조방법, 이로부터 제조된 발효물 및 이를 포함하는 화장료, 식품 또는 약학 조성물에 관한 것이다.
여주(Momordica charantia)는 열대 아시아 전역에서 재배되는 박과 덩굴식물로서, 주요 영양 물질이 열매에 포함되어 있다. 상기 영양 물질로는 글루코사이드, 펙틴 등의 당류; 글루탐산, 페닐알라닌 등의 아미노산; 비타민 C, 비타민 A로 전환되는 베타카로틴 등의 비타민; 칼슘, 엽산, 철, 칼륨 등의 무기염류; 식이섬유 등이 함유되어 있다. 이러한 영양 물질을 함유하는 여주는 갈증 해소, 식욕 증진, 기관지 보호, 혈당 개선, 면역 증강, 항염증, 항암 등의 효능을 나타낸다.
어성초(Houttuynia cordata)는 다년생 초본으로, 잎과 줄기에서 특이한 냄새가 나는 약용식물이다. 상기 어성초는 데카노일아세트알데히드, 메틸렌노닐케톤, 미로세네, 로우릴알데히드, 케프리알데히드, 캐프릭액시드, 코오다리에, 쿠에르시트린, 이소쿠에르시트린, 레이노트린, 하이퍼린 등 다양한 성분을 함유하고 있다. 이러한 성분에 의해 어성초는 이뇨 작용, 해독 작용, 항염증 등의 효능이 있는 것으로 알려져 있다.
이러한 다양한 효능을 나타내는 여주 및 어성초는 자연 그대로 섭취하거나 가공하여 식품, 음료수, 주류 등으로 이용할 수 있고, 여주 및 어성초에 의한 효능을 향상시키기 위해 유효성분만을 추출하여 이용할 수도 있다. 이때, 유효성분을 추출하는 방법으로는 열수 추출, 가압 추출, 용매 추출 등의 추출법이나 알코올 발효, 젖산 발효, 메탄 발효 등의 발효법을 이용할 수 있으며, 이를 통해 기질(여주 및 어성초)의 유효성분을 포함하는 추출물을 제조할 수 있다.
예를 들면, 대한민국 공개특허 제2012-0096344호에는 열수 추출 또는 용매 추출법을 사용하여 추출한 생약제 추출물을 유효성분으로 하는 항균 활성 조성물 및 그 제조방법이 개시되어 있다.
그러나, 열수 추출이나 가압 추출을 이용할 경우에는 높은 열과 압력에 의해 기질의 유효성분이 파괴될 뿐만 아니라 변성되어 원하는 효능을 발휘하기 어려울 수 있고, 용매 추출을 이용할 경우에는 유효성분의 손실은 막을 수 있으나, 추출물에 잔존하는 비극성 용매, 유기 용매 등이 인체에 해로울 수 있다는 문제점이 있다.
또한, 미생물을 이용하여 발효할 경우에는 접종 미생물이 생장하기 적합한 온도, 습도, 산소 농도 등의 조건을 일정하게 유지하는 것이 어려우며, 접종하지 않은 다른 미생물의 오염으로 인해 원하는 발효가 일어나지 않을 수 있다.
이러한 추출법 및 발효법의 단점을 개선하기 위한 방법으로, 당장법을 이용할 수 있다. 당장법은 고농도의 당을 첨가하여 삼투압 현상에 의해 기질 내 수분과 함께 유효성분을 용출하는 방법이다. 당장법에 의하여 열 또는 압력에 의한 유효성분의 손실을 줄이면서 유효성분을 용이하게 얻을 수 있지만, 당장법은 추출법과 발효법에 비해 추출물을 얻는데 장시간이 소요될 뿐만 아니라 기질에 존재하는 미생물의 상태, 종류에 따라 반복적으로 균일한 추출물을 얻기 어려울 수 있다.
이러한 문제점을 해결하기 위해, 당장법으로 추출된 추출물에 미생물을 접종하여 발효하는 방법도 알려져 있다. 그러나, 기질에서 유효성분을 포함하는 추출물을 빠르고 균일하게 얻을 수 있는 방법이 여전히 요구되고 있는 실정이다.
Abdel-Rahman et al., 2011; John et al., 2009
상기한 문제점을 해결하기 위해, 본 발명은 여주와 어성초의 유효성분을 열에 의한 손실 없이 균일하게 추출할 수 있는 삼투압 효소 발효물의 제조방법, 이로부터 제조된 발효물 및 이를 포함하는 화장료, 식품 또는 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 (a) (i)기질로서 여주와 어성초, (ii)당 및 (iii)효모로서 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)와 유산균으로서 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)을 혼합한 혼합물을 20 내지 50 ℃에서 1차 발효하여 1차 발효물을 제조하는 단계; (b) 상기 1차 발효물에서 고형분을 제거한 후 20 내지 50 ℃에서 2차 발효하여 2차 발효물을 제조하는 단계; 및 (c) 상기 2차 발효물에서 고형분을 제거한 후 0 내지 10 ℃에서 숙성하는 단계를 포함하는 여주와 어성초를 이용한 삼투압 효소 발효물의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) (i)기질로서 여주와 어성초, (ii)당 및 (iii)효모로서 사카로마이세스 세레비지아(Saccharomyces cerevisiae)와 유산균으로서 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)을 혼합한 혼합물을 20 내지 50 ℃에서 1차 발효하여 1차 발효물을 제조하는 단계; (b-1) 상기 1차 발효물에서 고형분을 제거한 후 100 내지 140 ℃에서 멸균하는 단계; (b-2) 상기 멸균된 1차 발효물에 (iv)당 및 (v)효모로서 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)와 유산균으로서 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)을 첨가한 후 20 내지 50 ℃에서 2차 발효하여 2차 발효물을 제조하는 단계; 및 (c) 상기 2차 발효물에서 고형분을 제거한 후 0 내지 10 ℃에서 숙성하는 단계를 포함하는 여주와 어성초를 이용한 삼투압 효소 발효물의 제조방법을 제공한다.
또한, 상기 제조방법으로 제조된 삼투압 효소 발효물을 제공한다.
또한, 상기 삼투압 효소 발효물을 유효성분으로 포함하는 화장료, 식품 또는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 제조방법에 따르면, 열에 의한 유효성분의 손실 없이 여주와 어성초의 유효성분을 추출함으로써, 여주와 어성초의 유효성분을 균일하게 함유하는 삼투압 효소 발효물을 제조할 수 있다. 이러한 삼투압 효소 발효물은 항염증, 항알러지, 피부 재생, 모발 보호 등 효과가 우수하여 화장료, 식품 또는 약학 조성물로 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 예에 따른 삼투압 효소 발효물의 제조방법의 모식도이다.
도 2는 본 발명의 다른 일 예에 따른 삼투압 효소 발효물의 제조방법의 모식도이다.
도 3은 본 발명의 실험예 1에 따른 세포 안정성을 확인한 그래프이다.
도 4 및 도 5는 본 발명의 실험예 2에 따른 항염증 효과를 확인한 그래프이다.
도 6은 본 발명의 실험예 3에 따른 항알러지 효과를 확인한 그래프이다.
도 7은 본 발명의 실험예 4에 따른 피부 재생 효과를 확인한 그래프이다.
도 8은 본 발명의 실험예 5에 따른 모발 보호 효과를 확인한 그래프이다.
도 2는 본 발명의 다른 일 예에 따른 삼투압 효소 발효물의 제조방법의 모식도이다.
도 3은 본 발명의 실험예 1에 따른 세포 안정성을 확인한 그래프이다.
도 4 및 도 5는 본 발명의 실험예 2에 따른 항염증 효과를 확인한 그래프이다.
도 6은 본 발명의 실험예 3에 따른 항알러지 효과를 확인한 그래프이다.
도 7은 본 발명의 실험예 4에 따른 피부 재생 효과를 확인한 그래프이다.
도 8은 본 발명의 실험예 5에 따른 모발 보호 효과를 확인한 그래프이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 여주와 어성초를 이용한 삼투압 효소 발효물의 제조방법, 이로부터 제조된 발효물 및 이를 포함하는 화장료, 식품 또는 약학 조성물을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이러한 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시적으로 제시된 것일 뿐 본 발명의 범위가 이러한 예시적인 설명에 의하여 제한되는 것은 아니다.
<삼투압 효소
발효물의
제조방법>
본 발명의 일 예에 따른 삼투압 효소 발효물의 제조방법은 도 1에 도시된 바와 같이, (a) (i)기질로서 여주와 어성초, (ii)당 및 (iii)효모로서 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)와 유산균으로서 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)을 혼합한 혼합물을 20 내지 50 ℃에서 1차 발효하여 1차 발효물을 제조하는 단계; (b) 상기 1차 발효물에서 고형분을 제거한 후 20 내지 50 ℃에서 2차 발효하여 2차 발효물을 제조하는 단계; 및 (c) 상기 2차 발효물에서 고형분을 제거한 후 0 내지 10 ℃에서 숙성하는 단계를 포함할 수 있다.
이하, 상기 제조방법을 각 공정 단계별로 나누어 설명하면 다음과 같다.
(a) 1차 발효 단계
(a) 단계는 기질(여주, 어성초), 당 및 미생물(효모, 유산균)을 혼합한 혼합물을 20 내지 50 ℃에서 1차 발효하여 1차 발효물을 제조하는 단계이다.
기질로는 여주(Momordica charantia)와 어성초(약모밀, Houttuynia cordata)를 사용하며, 이들의 종류, 원산지 및 형태는 특별히 한정되지 않는다. 여주는 열매를 사용할 수 있으며, 어성초는 잎, 꽃, 줄기, 뿌리 등을 포함하는 전초를 사용할 수 있다. 이때, 기질은 유효성분을 용이하게 추출하기 위해, 일정한 크기로 분쇄하거나 압착기를 이용한 착즙 형태일 수 있다. 기질은 중량비를 기준으로 여주 : 어성초 = 1 : 0.5 내지 2로 혼합될 수 있고, 여주 : 어성초 = 1 : 1로 혼합되는 것이 바람직하다.
당으로는 당업계에 공지된 통상적인 당류를 제한 없이 사용할 수 있으며, 백설탕, 황설탕 및 원당(비정제당)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이 사용될 수 있다. 당으로는 황설탕 또는 원당을 사용하는 것이 바람직하고, 원당을 사용하는 것이 더욱 바람직하다.
접종하는 미생물로는 효모로서 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)와 유산균으로서 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)을 모두 사용하며, 효모 발효와 유산균 발효가 동시에 진행될 수 있다. 상기 효모로는 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) MAB Y1(수탁번호: KCTC 11386BP), 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)(KCTC 7904)를 사용할 수 있으며, 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) MAB Y1(KCTC 11386BP)를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 유산균으로는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) Miev L1106(수탁번호: KCTC 12082BP), 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)(KCTC 3112)을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) Miev L1106(KCTC 12082BP)을 사용할 수 있다. 상기 미생물은 중량비를 기준으로 효모 : 유산균 = 1 : 0.5 내지 2로 혼합될 수 있으며, 효모 : 유산균 = 1 : 1로 혼합되는 것이 바람직하다.
상기 기질, 당 및 미생물을 혼합할 경우에는 이들의 혼합비율 또는 사용량을 조절하여 기질의 유효물질을 최대한으로 추출할 수 있다. 상기 기질과 당의 혼합비율은 중량비를 기준으로 기질 : 당 = 1 : 0.5 내지 2이고, 바람직하게는 기질 : 당 = 1 : 1일 수 있다. 상기 미생물의 사용량은 상기 기질과 당을 혼합한 전체 중량을 기준으로 1 내지 10 중량%이고, 바람직하게는 3 내지 5 중량%일 수 있다.
이러한 기질, 당 및 미생물을 혼합한 혼합물은 적절한 온도 및 호기 조건을 갖는 인큐베이터(incubator)에서 1차 발효함으로써, 기질의 수분과 함께 유효성분이 용출된 1차 발효물로 제조된다.
1차 발효 온도는 특별히 한정되지 않으나, 20 내지 50 ℃이고, 바람직하게는 25 내지 45 ℃일 수 있다.
이때, 상기 혼합물이 산소가 차단된 혐기 조건에서 발효할 경우에는 효모에 의한 당 분해시 알코올이 생성되어 미생물의 효소 활성을 저해할 수 있으므로, 산소가 공급되는 호기 조건에서 발효를 진행한다.
상기 1차 발효하는 동안에는 일정한 간격으로 1차 발효물의 pH를 측정하여 오염 유무를 확인하고, 액상의 상층에 쌓이는 기포들을 제거한다. 또한, BCA assay, Bradford assay 등의 단백질 정량법을 이용하여 생성된 효소량을 추정한다. 구체적으로, 접종한 미생물, 균체를 포함하지 않은 상등액에서 단백질량을 정량한다. 미생물의 단백질 함량을 배제하기 위하여 상등액에서의 단백질량을 정량하였고, 단백질량으로 효소량을 추정한다.
상기 1차 발효물의 pH는 3 내지 6인 것이 바람직하며, 상기 범위를 벗어나는 경우, 효모에 의한 혐기 발효가 일어나거나 접종한 미생물이 아닌 외부 미생물에 의해 오염된 것으로 볼 수 있다. 상기 1차 발효물의 단백질량이 400 내지 1000 ug/ml일 경우에는 효소가 충분히 생성된 것으로, 1차 발효를 종료한다. 이때, 1차 발효 기간은 특별히 한정되지 않으나, 4일 내지 10일 동안 발효할 수 있다.
(b) 2차 발효 단계
(b) 단계는 1차 발효물에서 고형분을 제거한 후 20 내지 50 ℃에서 2차 발효하여 2차 발효물을 제조하는 단계이다.
2차 발효를 위해 상기 (a) 단계에서 제조된 1차 발효물로부터 고형분을 제거한다. 이때, 상기 1차 발효물은 미세망(mesh)을 이용하여 고형분을 제거하고, 고형분이 제거된 1차 발효액을 2차 발효에 사용한다.
이러한 1차 발효액은 상기 (a) 단계의 1차 발효와 동일한 온도 및 호기 조건으로 2차 발효함으로써, 1차 발효액에 함유된 기질의 유효성분과 미생물의 효소가 반응하여 2차 발효물로 제조된다.
상기 2차 발효하는 동안에는 일정한 간격으로 2차 발효물의 pH를 측정하여 오염 유무를 확인하고, 미생물의 당 분해효소인 인버테이스(invertase)를 통해 전환된 환원당량을 측정한다. 상기 1차 발효물의 pH는 3 내지 6인 것이 바람직하며, 상기 범위를 벗어나는 경우, 효모에 의한 혐기 발효가 일어나거나 접종한 미생물이 아닌 외부 미생물에 의해 오염된 것으로 볼 수 있다.
상기 2차 발효물의 환원당량이 3.0 내지 10.0 mg/ml일 경우에는 효소의 활성이 활발한 것으로, 2차 발효를 종료한다. 이때, 2차 발효 기간은 특별히 한정되지 않으나, 4일 내지 23일 동안 발효할 수 있다.
(c) 숙성 단계
(c) 단계는 2차 발효물에서 고형분을 제거한 후 0 내지 10 ℃에서 숙성하는 단계이다.
숙성을 위하여 상기 (b) 단계에서 제조된 2차 발효물은 고형분을 제거한다. 이때, 상기 2차 발효물은 미세망(mesh)을 이용하여 고형분을 제거하고, 고형분이 제거된 2차 발효액을 숙성한다.
이러한 2차 발효액은 1차 발효와 동일한 온도에서 배양하면서 삼투압 발효를 통한 추출액을 기질로 하여 2차 미생물 발효가 이루어지며, 이를 통해 2차 발효액에 함유된 성분들이 상호작용할 수 있도록 저온 숙성 및 보관하여 최종 삼투압 효소 발효물로 제조된다. 상기 숙성하는 온도는 0 내지 10 ℃인 것이 바람직하다.
한편, 본 발명의 다른 일 예에 따른 삼투압 효소 발효물의 제조방법은 도 2에 도시된 바와 같이, (a) (i)기질로서 여주와 어성초, (ii)당 및 (iii)효모로서 사카로마이세스 세레비지아(Saccharomyces cerevisiae)와 유산균으로서 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)을 혼합한 혼합물을 20 내지 50 ℃에서 1차 발효하여 1차 발효물을 제조하는 단계; (b-1) 상기 1차 발효물에서 고형분을 제거한 후 100 내지 140 ℃에서 멸균하는 단계; (b-2) 상기 멸균된 1차 발효물에 (iv)당 및 (v)효모로서 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)와 유산균으로서 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)을 첨가한 후 20 내지 50 ℃에서 2차 발효하여 2차 발효물을 제조하는 단계; 및 (c) 상기 2차 발효물에서 고형분을 제거한 후 0 내지 10 ℃에서 숙성하는 단계를 포함할 수 있다.
이하, 상기 제조방법을 각 공정 단계별로 나누어 설명하면 다음과 같다.
(a) 1차 발효 단계
(a) 단계는 기질(여주, 어성초), 당 및 미생물(효모, 유산균)을 혼합한 혼합물을 20 내지 50 ℃에서 1차 발효하여 1차 발효물을 제조하는 단계이다.
(a) 단계는 상기 본 발명의 일 예에 따른 삼투압 효소 발효물의 제조방법의 (a) 단계와 동일한 것으로, 기질의 유효성분 및 미생물의 효소를 함유하는 1차 발효물을 제조한다.
(b-1) 멸균 단계
(b-1) 단계는 1차 발효물에서 고형분을 제거한 후 100 내지 140 ℃에서 멸균하는 단계이다.
상기 (a) 단계에서 제조된 1차 발효물은 미세망(mesh)을 이용하여 고형분을 제거한 후 남은 1차 발효액을 멸균한다. 상기 멸균하는 조건은 특별히 한정되지 않으나, 온도가 100 내지 140 ℃이고, 시간이 5 내지 30 분일 수 있다. 이로 인해, 1차 발효물 20 내지 50 %를 기질로 하여 미생물을 재접종한 후 2차 발효를 진행할 수 있다. 이때, 함유되는 죽은 미생물은 2차 발효시에 단백질원이 공급될 수 있다.
(b-2) 2차 발효 단계
(b-2) 단계는 멸균된 1차 발효물에 당 및 미생물(효모, 유산균)을 첨가한 후 20 내지 50 ℃에서 2차 발효하여 2차 발효물을 제조하는 단계이다.
상기 (b-1) 단계에서 멸균된 1차 발효물은 2차 발효하기 위해 당 및 미생물을 첨가한다.
상기 당 및 미생물은 상기 (a) 단계에서 사용된 당 및 미생물과 동일하다.
상기 1차 발효물, 당 및 미생물을 혼합할 경우에는 이들의 혼합비율 또는 사용량을 조절하여 1차 발효물에 함유된 유효성분과 미생물에서 생성되는 효소의 반응을 향상시킬 수 있다. 상기 1차 발효물과 당의 혼합비율은 중량비를 기준으로 1차 발효물 : 당 = 1 : 0.5 내지 2이고, 바람직하게는 1차 발효물 : 당 = 1 : 1일 수 있다. 상기 미생물의 사용량은 상기 1차 발효물과 당을 혼합한 전체 중량을 기준으로 1 내지 10 중량%이고, 바람직하게는 3 내지 5 중량%일 수 있다.
이러한 멸균된 1차 발효물, 당 및 미생물을 혼합한 혼합물은 상기 (a) 단계의 1차 발효와 동일한 온도 및 호기 조건으로 2차 발효함으로써, 첨가된 미생물이 1차 발효물에 함유된 유효성분뿐만 아니라 죽은 미생물을 단백질원으로 이용하여 효소 반응에 의해 2차 발효물로 제조된다.
(c) 숙성 단계
(c) 단계는 2차 발효물에서 고형분을 제거한 후 0 내지 10 ℃에서 숙성하는 단계이다.
(c) 단계는 상기 본 발명의 일 예에 따른 삼투압 효소 발효물의 제조방법의 (c) 단계와 동일한 것으로, 최종 삼투압 효소 발효물을 제조한다.
이와 같이, 본 발명의 삼투압 효소 발효물의 제조방법은 여주와 어성초의 유효성분을 손실 없이 빠르고 균일하게 추출할 수 있다.
<삼투압 효소
발효물
>
본 발명의 제조방법으로 제조된 삼투압 효소 발효물은 여주와 어성초의 유효성분을 모두 함유하는 것으로, 여주에 의한 효과와 어성초에 의한 효과가 동시에 나타날 뿐만 아니라 이들의 상승 효과(synergy effect) 또한 기대할 수 있다.
<삼투압 효소
발효물을
포함하는
화장료
, 식품, 약학 조성물>
본 발명에 의한 삼투압 효소 발효물은 생물에서 유래하여 인체에 안전한 물질로서, 여주와 어성초의 삼투압 효소 발효물을 유효성분으로 함유하는 화장료, 식품, 약학 조성물로 이용될 수 있다. 이때, 상기 조성물들은 면역 및 재생 기능을 증대시켜 항염증, 항알러지, 피부 재생, 모발 보호 등에 효과적일 수 있다.
구체적으로, 상기 삼투압 효소 발효물을 포함하는 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 젤, 크림, 로션, 파우더, 오일, 파우더, 에어졸, 연고 등의 형태로 이용될 수 있으며, 화장료 제조시 통상적으로 첨가되는 첨가제가 추가될 수 있다. 이때, 상기 화장료 조성물은 샴푸, 린스, 토닉, 헤어컨디셔너, 헤어에센스 등 모발용 화장료 조성물로 사용되거나 바디샤워, 바디로션, 바디오일, 바디미스트, 파운데이션, 세안제, 미스트 등 안면 또는 전신용 화장료 조성물로 사용될 수 있다.
또한, 상기 삼투압 효소 발효물을 포함하는 식품 조성물은 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 기능성 음료, 건강보조 및 건강기능식품 등의 형태로 이용될 수 있으며, 식품 제조시 통상적으로 첨가되는 첨가제가 추가될 수 있다.
또한, 상기 삼투압 효소 발효물을 포함하는 약학 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구제, 외용제, 좌제, 주사용제 등의 형태로 이용될 수 있으며, 약품 제조시 통상적으로 첨가되는 첨가제가 추가될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통해 구체적으로 설명하나, 하기 실시예는 본 발명의 한 형태를 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
[
실시예
1] 여주와 어성초 삼투압 효소
발효물
기질로서 여주와 어성초를 흐르는 물로 세척한 후 물기를 완전히 제거한 후 가로, 세로, 높이 모두 2 cm로 일정하게 절단하여 준비하였다. 준비된 기질과 당을 1:1의 중량비로 혼합하였다. 효모, 유산균을 기질과 당은 혼합물 전체 중량을 기준으로 각각 5 중량%의 양으로 상기 혼합물에 접종하였다. 하기 표 1에는 사용된 원료 및 함량이 기재되어 있다.
| 혼합물 | 함량 | |
| 기질 |
여주 (열매) | 31.25 중량% |
| 어성초 (전초) | 18.75 중량% | |
| 당 | 천연당 (원당) | 50.00 중량% |
| 효모 | 사카로마이세스 세레비지아에 MABY1 (KCTC 11386BP) |
기질과 당의 혼합물 기준 5 중량% |
| 유산균 | 락토바실러스 퍼멘텀 MieVL1106 (KCTC 12082BP) |
기질과 당의 혼합물 기준 5 중량% |
상기 혼합물을 발효용기에 담고, 산소만 겨우 통과하도록 부직포로 발효용기의 입구를 막은 후 30 ℃ 인큐베이터에서 1차 발효하였다. 1차 발효를 시작한 시점을 0일째 샘플로 간주하고, 24시간 간격으로 1차 발효물을 채취하여 pH를 측정하고, 단백질 정량법(BCA assay)으로 효소량을 측정하였다. 1차 발효하는 동안 1차 발효물의 표면에 생성되는 기포를 제거하였다. 약 7일째, 1차 발효물의 효소량이 800 ug/ml인 것을 확인한 후 미세망(300 mesh)을 이용하여 1차 발효물의 고형분을 제거하였다.
고형분이 제거된 1차 발효액을 소독한 새로운 발효용기에 담고, 산소만 통과하도록 부직포로 발효용기의 입구를 막은 후 30 ℃ 인큐베이터에서 2차 발효하였다. 2차 발효를 시작한 시점을 0일째 샘플로 간주하고, 24시간 간격으로 2차 발효물을 채취하여 pH를 측정하고, 인버테이스(invertase, 당 분해 효소) 활성을 환원당량으로 측정하였다. 2차 발효하는 동안 2차 발효물의 표면에 생성되는 기포를 제거하였다. 약 7일째, 2차 발효물의 환원당량이 4 mg/ml인 것을 확인한 후 미세망(300 mesh)을 이용하여 2차 발효물의 고형분을 제거하였다.
고형분이 제거된 2차 발효액을 소독한 새로운 용기에 담고, 4 ℃에서 숙성함으로써, 여주와 어성초 삼투압 효소 발효물을 제조하였다.
[
비교예
1] 여주
열수
추출물
여주를 흐르는 물로 세척한 후 물기를 완전히 제거한 후 가로, 세로, 높이 모두 2 cm로 일정하게 절단하여 준비하였다. 준비된 여주와 물을 1 : 1 비율로 혼합하여 121℃에서 15분 동안 가열하였다. 이후 미세망(300 mesh)으로 고형분을 제거하여 여주 열수 추출물을 제조하였다.
[
비교예
2] 어성초
열수
추출물
여주 대신 어성초를 사용한 것을 제외하고는, 상기 비교예 1과 동일한 방법으로 어성초 열수 추출물을 제조하였다.
[
비교예
3] 여주와 어성초
열수
추출물
여주 대신 여주와 어성초를 상기 실시예 1과 동일하게 사용한 것을 제외하고는, 상기 비교예 1과 동일한 방법으로 여주와 어성초 열수 추출물을 제조하였다.
[
비교예
4] 여주와 어성초
열수
추출
발효물
상기 비교예 3에서 제조된 여주와 어성초 열추 추출물에 상기 실시예 1과 동일한 효모 5 중량%와 유산균 5 중량%를 접종한 후 30 ℃ 인큐베이터에서 72시간 발효하였다. 이후 미세망(300 mesh)으로 고형분을 제거하여 여주와 어성초 열수 추출 발효물을 제조하였다.
[
실험예
1] 세포 안정성
대식세포인 RAW 264.7 세포(1×105 cells/ml)를 18시간 전 배양하고, LPS 1 ug/ml와 함께 실시예 1의 삼투압 효소 발효물을 농도별로 동시에 처리하여 48시간 동안 배양하였다. 이후 3-(4,5-디메틸티아졸)-2,5-디페닐테트라졸리윰 브로마이드(MTT, Sigma)를 1 mg/ml의 농도가 되도록 첨가하고 4시간 동안 더 배양하였다. 배양액을 모두 제거한 후 디메틸설폭사이드 (Dimethylsulfoxide; DMSO, Sigma) 또는 0.04N HCl/이소프로판올 100 ul를 가하여 MTT의 환원에 의해 생성된 포르마잔(formazan) 침전물을 용해하여 흡광도 측정기를 사용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.
실시예 1의 삼투압 효소 발효물과 항염증제인 인도메타신(indomethacin)을 각 농도별로 처리한 경우의 흡광도 값을 이들을 처리하지 않은 경우(대조군)의 흡광도 값과 비교하여 세포 생존율을 백분율로 나타내었고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 도시된 바와 같이, 삼투압 효소 발효물(실시예 1)을 0.25 내지 1%로 처리한 경우에는 대식세포의 생존율이 90% 이상으로 유지되는 것으로 나타났다. 반면, 삼투압 효소 발효물(실시예 1)을 5 내지 50%로 처리한 경우에는 대식세포에 독성을 나타내어 세포 생존율이 40% 미만으로 감소하는 것으로 나타났다. 또한, 삼투압 효소 발효물(실시예 1)을 농도별로 처리한 경우에는 인도메타신을 농도별로 처리한 경우에 비해 세포 생존율이 높은 것으로 나타났다.
[
실험예
2] 항염증 효과
(1) 농도에 따른 NO 생성 억제 효과
마이크로플레이트(96 well)에 RAW 264.7 세포를 1×104 cell/well로 24시간 동안 배양하였다. 배양은 1% 페니실린-스트렙토마이신과 10% 소태아혈정(FBS)이 함유된 고농도 글루코오스 배지(high glucose DMEM; Lonza, USA)를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건 하에서 진행되었다.
상기 배양액에 실시예 1의 삼투압 효소 발효물 또는 인도메타신(indomethacin)을 농도별로 처리하여 1시간 동안 배양한 후 LPS 1 ug/ml을 처리하여 18시간 더 배양하였다.
세포 배양액 50 ul에 1% 술파닐아미드(sulfanilamide), 5% 인산과 0.1% 나프틸에틸에틸렌 디아민(naphthylethylethylene diamine)이 포함된 그리스 시약(Griess reagent)(Sigma chemical Co., USA) 50 ul를 첨가하였다. 10분 간 반응시킨 후 흡광도 측정기(TECAN/infinite M200, Switzerland)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 실시예 1의 삼투압 효소 발효물 또는 인도메타신을 각 농도별로 처리한 경우의 흡광도 값을 LPS만을 처리한 경우의 흡광도 값과 비교하여 NO 생성 정도를 백분율로 나타내었고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 도시된 바와 같이, 실시예 1의 삼투압 효소 발효물을 처리한 경우에는 고농도로 처리할수록 LPS만을 처리한 경우에 비해 NO 생성이 억제되는 것으로 나타났다. 또한, 실시예 1의 삼투압 효소 발효물을 농도별로 처리한 경우에는 인도메타신을 농도별로 처리한 경우에 비해 NO 생성이 억제되는 것으로 나타났다.
(2) 추출물에 따른 NO 생성 억제 효과
실시예 1의 삼투압 효소 발효물 또는 인도메타신을 농도별로 처리하는 대신 인도메타신 0.1%, 실시예 1의 삼투압 효소 발효물 1%, 비교예 1의 여주 열수 추출물 1%, 비교예 2의 어성초 열수 추출물 1%, 비교예 3의 여주와 어성초 열수 추출물 1%, 비교예 4의 여주와 어성초 열수 추출 발효물 1%로 처리하는 것을 제외하고는, 상기 실험예 2의 (1)과 동일한 방법으로 흡광도를 측정하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 도시된 바와 같이, 실시예 1의 삼투압 효소 발효물을 처리한 경우에는 LPS만을 처리한 경우에 비해 NO 생성이 억제되는 것으로 나타났다.
또한, 실시예 1의 삼투압 효소 발효물을 처리한 경우에는 인도메타신, 여주 열수 추출물(비교예 1), 어성초 열수 추출물(비교예 2), 여주와 어성초 열수 추출물(비교예 3), 여주와 어성초 열수 추출 발효물(비교예 4)을 처리한 경우에 비해 NO 생성 억제 효과가 우수한 것으로 나타났다.
[
실험예
3]
항알러지
효과
초기 알러지 반응을 일으키는 비만세포의 탈과립 현상을 확인하기 위해, 탈과립시 분비되는 헥소사미니다아제(β-hexosaminidase)를 측정하였다.
마이크로플레이트(48 well)에 RBL-2H3 세포를 5×105 cell/well로 1% 페니실린-스트렙토마이신과 10% FBS가 포함된 배지(DMEM)를 사용하여 37 ℃, 5% CO2 조건 하에서 24시간 배양하였다. 이후 anti-DNP IgE (0.5 ug/ml)로 감작하고 12시간 배양하였다. 상기 세포를 시라가니안 버퍼(Siraganian buffer; 119 mM NaCl, 5mM KCl, 0.4mM MgCl2, 25mM PIPES, 40mM NaOH, pH 7.2)로 2번 세척하고 5.6mM 글루코오스, 1mM CaCl2와 0.1% BSA가 포함된 시라가니안 버퍼를 첨가한 후 실시예 1의 삼투압 효소 발효물을 농도별로 처리하여 1시간 동안 배양하였다. 이후 DNP-BSA (20 ug/ml)를 처리하여 1시간 동안 반응시키고, 얼음물에서 10분 동안 정치하여 반응을 종료하였다. 상층액 20 ul를 마이크로플레이트(96 well)로 옮기고 기질 버퍼(substrate buffer, 1mM 4-p-니트로페닐-N-아세틸-b-D-글루코사미니드, 0.05M 소듐 시트레이트, pH 4.5) 20 ul를 넣고 37 ℃에서 30분 배양하였다. 이후 반응 정지액(stop solution, 0.1M Na2CO3/NaHCO3) 200 ul를 첨가하여 반응을 종료한 후 흡광도 측정기(TECAN/infinite M200, Switzerland)를 사용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 실시예 1의 삼투압 효소 발효물을 각 농도별로 처리한 경우의 흡광도 값을 anti-DNP IgE와 DNP-BSA만을 처리한 경우의 흡광도 값과 비교하여 헥소사미니다아제 분비 정도를 백분율로 나타내었고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 도시된 바와 같이, 실시예 1의 삼투압 효소 발효물을 농도별로 처리한 경우에는 처리 농도가 증가할수록 헥소사미니다아제의 분비가 억제되는 것으로 나타났다.
[
실험예
4] 피부 재생 효과 확인
마이크로플레이트(24 well)에 인간 진피세포(NHDF)를 5×104 cell/well로 1% 페니실린-스트렙토마이신과 10% FBS가 포함된 저농도 글루코오스 배지(low glucose DMEM)를 사용하여 37 ℃, 5% CO2 조건 하에서 24시간 배양하였다. 실시예 1의 삼투압 효소 발효물 1%를 처리하여 4시간 배양하고, PBS로 2번 세척한 후 100 mJ/cm2 UV-B를 조사하였다. 실시예 1의 삼투압 효소 발효물 1%를 처리하여 48시간 배양하였다. 이후 3-(4,5-디메틸티아졸)-2,5-디페닐테트라졸리윰 브로마이드(MTT, Sigma)를 1 mg/ml의 농도가 되도록 첨가하고, 4시간 동안 더 배양하였다. 배양액을 모두 제거한 후 이소프로판올 100 ul를 가하여 MTT의 환원에 의해 생성된 포르마잔(formazan) 침전물을 용해하여 흡광도 측정기를 사용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 실시예 1의 삼투압 효소 발효물을 처리한 경우의 흡광도 값을 UV를 조사하지 않은 경우(control)의 흡광도 값과 비교하여 세포 생존율을 백분율로 나타내었고, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 도시된 바와 같이, UV를 조사한 후 실시예 1의 삼투압 효소 발효물을 처리한 경우에는 삼투압 효소 발효물을 처리하지 않은 경우에 비해 세포 생존율이 증가한 것으로 나타났다.
[
실험예
5] 모발 보호 효과 확인
6% 과산화수소와 1.68% 암모니아의 1:1 혼합 용액 10 ml에 모발 3 g을 넣고 실시예 1의 삼투압 효소 발효물을 농도별로 30분 동안 처리하였다. 상기 처리액 0.5 ml을 Rapid-Con 단백질 농축 키트(Elpis Biotech.)를 사용하여 농축시키고, 그 농축액을 10% SDS-폴리아크릴아미드 젤에 램리(Laemmli)법에 따라 전기영동하였다. 이후 젤에 있는 케라틴 단백질을 0.1% 쿠마시 블루(Coomassie brilliant blue R 250), 10% 빙초산 및 40% 에탄올이 혼합된 용액에서 1시간 동안 염색하고, 10% 빙초산 및 40% 에탄올이 혼합된 용액에서 탈색시켜 케라틴 단백질 띠를 확인하였다. 실시예 1의 삼투압 효소 발효물을 각 농도별로 처리한 경우의 케라틴 단백질 띠를 정상 모발의 케라틴 단백질 띠(control)와 비교하여 모발 내 케라틴 단백질량을 백분율로 나타내었고, 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에 도시된 바와 같이, 과산화수소와 암모니아 처리한 후 실시예 1의 삼투압 효소 발효물을 처리한 경우에는 삼투압 효소 발효물을 처리하지 않은 손상 모발에 비해 케라틴 단백질 함량이 증가한 것으로 나타났다.
Claims (16)
- (a) (i)기질로서 여주와 어성초와,
(ii)당 및 (iii)효모로서 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)와 유산균으로서 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)을 혼합한 혼합물을 20 내지 50 ℃에서 한꺼번에 1차 발효하여 1차 발효물을 제조하는 단계;
(b) 상기 1차 발효물에서 고형분을 제거한 후 20 내지 50 ℃에서 2차 발효하여 2차 발효물을 제조하는 단계; 및
(c) 상기 2차 발효물에서 고형분을 제거한 후 0 내지 10 ℃에서 숙성하는 단계
를 포함하는 여주와 어성초를 이용한 삼투압 효소 발효물의 제조방법으로,
상기 1차 발효시 상기 효모와 상기 유산균은 1:0.5 내지 2의 중량비로 혼합되며,
상기 1차 발효는 상기 1차 발효물의 단백질량이 400 내지 1000 ug/ml일 때 종료되는, 여주와 어성초를 이용한 삼투압 효소 발효물의 제조방법. - (a) (i)기질로서 여주와 어성초와,
(ii)당 및 (iii)효모로서 사카로마이세스 세레비지아(Saccharomyces cerevisiae)와 유산균으로서 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)을 혼합한 혼합물을 20 내지 50 ℃에서 한꺼번에 1차 발효하여 1차 발효물을 제조하는 단계;
(b-1) 상기 1차 발효물에서 고형분을 제거한 후 100 내지 140 ℃에서 멸균하는 단계;
(b-2) 상기 멸균된 1차 발효물에 (iv)당 및 (v)효모로서 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)와 유산균으로서 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)을 첨가한 후 20 내지 50 ℃에서 2차 발효하여 2차 발효물을 제조하는 단계; 및
(c) 상기 2차 발효물에서 고형분을 제거한 후 0 내지 10 ℃에서 숙성하는 단계
를 포함하는 여주와 어성초를 이용한 삼투압 효소 발효물의 제조방법으로,
상기 1차 발효시 상기 효모와 상기 유산균은 1:0.5 내지 2의 중량비로 혼합되며,
상기 1차 발효는 상기 1차 발효물의 단백질량이 400 내지 1000 ug/ml일 때 종료되는, 여주와 어성초를 이용한 삼투압 효소 발효물의 제조방법. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 기질은 중량비를 기준으로 여주 : 어성초 = 1 : 0.5 내지 2로 혼합되는 것인 여주와 어성초를 이용한 삼투압 효소 발효물의 제조방법. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 당은 백설탕, 황설탕, 원당으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 여주와 어성초를 이용한 삼투압 효소 발효물의 제조방법. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 효모는 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) MAB Y1(KCTC 11386BP)인 여주와 어성초를 이용한 삼투압 효소 발효물의 제조방법. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 유산균은 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum ) Miev L1106(KCTC 12082BP)인 여주와 어성초를 이용한 삼투압 효소 발효물의 제조방법. - 삭제
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 (a) 단계에서 기질과 당의 혼합비율은 중량비를 기준으로 기질 : 당 = 1 : 0.5 내지 2인 여주와 어성초를 이용한 삼투압 효소 발효물의 제조방법. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 (a) 단계에서 효모 및 유산균의 사용량은 기질과 당을 혼합한 전체 중량을 기준으로, 각각 1 내지 10 중량%인 여주와 어성초를 이용한 삼투압 효소 발효물의 제조방법. - 제2항에 있어서,
상기 (b-2) 단계에서 1차 발효물과 당의 혼합비율은 중량비를 기준으로 1차 발효물 : 당 = 1 : 0.5 내지 2인 여주와 어성초를 이용한 삼투압 효소 발효물의 제조방법. - 제2항에 있어서,
상기 (b-2) 단계에서 효모 및 유산균의 사용량은 1차 발효물과 당을 혼합한 전체 중량을 기준으로, 각각 1 내지 10 중량%인 여주와 어성초를 이용한 삼투압 효소 발효물의 제조방법. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 1차 발효 및 2차 발효는 호기 조건에서 진행되는 것인 여주와 어성초를 이용한 삼투압 효소 발효물의 제조방법. - 제1항 또는 제2항의 제조방법으로 제조된 여주와 어성초를 이용한 삼투압 효소 발효물.
- 제13항의 발효물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물.
- 제13항의 발효물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물.
- 삭제
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