KR102207995B1 - 여주 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 항균, 항염증, 및 피부 보습용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 락토바실러스 사케이(기탁번호: KCTC 14130BP) 균주로 발효된 여주 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 항균, 항염증, 및 피부 보습용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 조성물은 세포 독성이 없고, 피부 보습에 우수한 효과가 있으며, 여드름 원인균에 대한 우수한 항균 활성이 있고, 대표적인 염증 관련 유전자인 iNOS 및 COX-2 유전자를 효과적으로 억제하여 우수한 항염증 효과가 있으므로, 화장품, 식품, 및 의약외품 분야에서 피부 보습과 여드름 및 염증성 질환의 치료 및 예방 목적으로 유용하게 이용 가능하다.
본 발명의 조성물은 세포 독성이 없고, 피부 보습에 우수한 효과가 있으며, 여드름 원인균에 대한 우수한 항균 활성이 있고, 대표적인 염증 관련 유전자인 iNOS 및 COX-2 유전자를 효과적으로 억제하여 우수한 항염증 효과가 있으므로, 화장품, 식품, 및 의약외품 분야에서 피부 보습과 여드름 및 염증성 질환의 치료 및 예방 목적으로 유용하게 이용 가능하다.
Description
본 발명은 항균, 항염증, 및 피부 보습용 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 락토바실러스 사케이 균주로 발효한 여주 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 항균, 항염증, 및 피부 보습용 조성물에 관한 것이다.
여드름의 치료는 국소제제 도포 요법 및 경구 약물 복용 요법과 최근 시행되고 있는 레이저 시술, 박피술 등 수술 요법이 있다. 국소 도포 요법은 여드름의 원인균으로 알려진 프로피오니박테리움 아크네스에 대한 항균 작용 목적으로 아젤라익산(azelaic acid), 살리실산 등의 항균제를 사용하거나 면포 용해 작용을 위해 벤조일퍼옥사이드(benzoyl peroxide) 등을 외용 연고 타입으로 사용하는 방법이나, 이는 제형화에 어려움이 있고, 관련 법규제 등으로 제품화에 어려운 점이 있었다. 또한, 경구약물 복용요법은 피지선의 기능 억제와 모낭벽 파괴의 억제 목적으로 레티노이드, 부신피질 호르몬 등을 이용하는 방법인데, 이들 경구제제의 과량 복용시 피부 발적, 피부 과민반응, 피부 건조증 등의 부작용이 발생하는 문제점이 있었다.
또한, 염증 반응은 세포 또는 조직의 손상이나 박테리아, 곰팡이, 바이러스, 다양한 종류의 알레르기 유발물질 등의 외부감염원에 감염되었을 때 국소 혈관과 체액 중 각종 염증 매개인자 및 면역세포가 관련되어, 효소 활성화, 염증 매개물질 분비, 체액 침윤, 세포 이동, 조직 파괴 등 일련의 복합적인 생리적 반응과 홍반, 부종, 발열, 통증 등 외적 증상을 나타낸다. 평상시의 염증 반응은 외부감염원을 제거하고 손상된 조직을 재생하여 생명체 기능회복작용을 하지만, 항원이 제거되지 않거나 내부물질이 원인이 되어 염증 반응이 과도하거나 지속해서 일어나면 오히려 점막 손상을 촉진하고, 그 결과 일부에서는 암 발생 등의 질환을 이끈다.
염증의 발생 원인으로서는 다양한 생화학적인 현상이 관여하고 있는 것으로 알려져 있는데, 특히 일산화질소(Nitric Oxide; NO)를 발생시키는 효소인 산화질소 합성 효소(Nitric Oxide Synthase; NOS)와 프로스타글란딘의 생합성과 관련된 효소들이 염증 반응을 매개하는 데 있어서 가장 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 따라서 L-아르기닌으로부터 NO를 생성시키는 효소인 산화질소 합성효소(NOS)나, 아라키돈산으로부터 프로스타글란딘 등을 합성하는데 관련된 효소인 사이클로옥시게나아제(COX)의 활성 저해를 통해 염증을 차단하는 것이 염증 치료제 개발에 목표가 되고 있다.
또한, 대표적인 피부 염증 질환의 하나인 여드름은 호르몬의 작용, 과도한 피지 분비, 세균의 감염 등에 의한 모피지선, 모낭 및 주변 조직의 염증성 질환을 말한다. 여드름의 원인은 여러 가지가 있으나, 피지 분비의 증가, 피지선을 자극하는 호르몬(예를 들어, 안드로젠)과 모피지선에서 번식하면서 피지를 분해하여 유리 지방산을 형성하는 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)에 의한 염증 진전, 모낭 내 이상 각화, 유전적 소질 등의 주요 인자가 복합적으로 작용하여 발생하는 것으로 알려져 있다. 또한, 호기성 피부 상재균은 염증의 일차적 원인은 아니지만, 염증 발생 부위를 더욱 확장시켜 여드름이 악화되는데 영향을 주는 것으로 밝혀져 있다.
지금까지 단일 식물추출물 또는 복합 식물추출물을 여드름 원인균의 치료 용도로 사용하고자 하는 시도가 있었으나, 아직 산업 현장에서 활용되기에 충분할 만큼의 항균 효과를 나타내는 식물추출물은 거의 없었으며, 여드름 원인균에 대하여 강력한 항균 효과를 나타내는 식물 복합 추출물의 조합에 연구 성과는 미미한 상태이다. 또한, 항균제로서의 고유 기능 이외에 피부 보습 또는 항염증 활성 등의 다양한 부가 효능에 관한 연구는 미진한 상태이다.
이러한 배경 아래에서, 본 발명자들은 여드름 원인균에 대한 우수한 항균 활성을 갖는 동시에 자체적으로 항염 활성, 피부 보습 활성 등의 다양한 기능성을 보유한 식물 추출물을 찾기 위한 연구를 수행하였고, 특히 유용 미생물을 활용하여 식물 추출물의 기능성을 더욱 개선시키고자 예의 연구노력한 결과, 여주 추출물을 락토바실러스 사케이 균주로 발효한 여주 발효 추출물이 갖는 우수한 피부상태 개선 효과를 규명하여, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 주된 목적은 항염증, 항균, 및 피부 보습 등 피부 상태 개선에 뛰어난 효과가 있는 여주 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 락토바실러스 사케이(기탁번호: KCTC 14130BP) 균주로 발효된 여주 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 항균, 항염증, 및 피부 보습용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 여드름 원인균에 대한 우수한 항균 활성을 갖는 동시에 자체적으로 피부 보습 및 항염 활성 등의 다양한 기능성을 보유한 식물 추출물을 찾기 위한 연구를 수행하였으며, 특히 유용 미생물을 활용하여 식물 추출물의 기능성을 더욱 개선시키고자 예의 연구노력한 결과, 여주 추출물을 락토바실러스 사케이 균주로 발효한 여주 발효 추출물이 우수한 항염증, 항균, 및 피부 보습 활성을 갖는 것을 확인하였고, 발견하였고, 또한 피부에 적용시에도 안전성에 문제가 없음을 확인하였다.
본 발명의 "여주(Momordica charantia)"는 쌍떡잎식물 박목 박과의 덩굴성 한해살이풀을 의미한다.
본 발명의 항균, 항염증, 및 피부 보습용 조성물에서, 상기 여주 발효 추출물은 락토바실러스 사케이(기탁번호: KCTC 14130BP) 균주로 발효된 복합 발효 추출물이다.
본 발명자들은 상기 여주 추출물의 항균, 항염증, 및 피부 보습 효과를 더욱 개선시키기 위해 발효 추출물에 대한 연구를 심층적으로 진행하는 과정에서 발효에 최적화된 균주의 특성을 종합하여 조사한 결과, 여주 추출물을 대상으로 한 발효에 가장 최적화된 효율을 내는 균주가 락토바실러스 사케이 균주임을 확인하였고, 이를 “락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei subsp. sakei) pfbio005”로 명명하고, 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2020년 02월 07일자로 기탁하여 기탁번호 KCTC 14130BP를 부여받았다. 상기 본 발명의 락토바실러스 사케이 pfbio005(기탁번호: KCTC 14130BP) 균주는 락토바실러스 사케이(기탁번호: KCTC 14130BP)와 동일한 의미로 사용된다.
본 발명에서 사용되는 용어 '발효 추출물'이란, 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei subsp. sakei) 균주가 성장할 수 있는 배지에 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei subsp. sakei) 균주를 접종하고 배양한 배양물로부터 수득한 배양결과물을 의미한다. 본 발명에서는 여주 추출물에 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei subsp. sakei) 균주를 접종하여 배양한 배양물로부터 수득한 배양 상등액 또는 배양 상등액의 건조물을 의미한다.
또한, 본 명세서에서 "유효성분"이란 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나, 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "추출물"은 여주 발효물의 추출 처리로 얻어지는 추출액, 상기 추출액의 희석액이나 농축액, 상기 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다. 본 발명의 상기 추출물은 바람직하게 추출 후 건조 분말 형태로 제조되어 사용될 수 있다.
본 발명의 상기 여주 발효 추출물의 추출에 있어서, 상기 추출물을 추출하는 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 추출할 수 있다. 상기 추출방법의 비제한적인 예로는, 열수 추출법, 초음파 추출법, 여과법, 환류 추출법 등을 들 수 있으며, 이들은 단독으로 수행되거나 2종 이상의 추출방법을 병용하여 수행될 수 있다.
본 발명에서 상기 여주 발효 추출물을 추출하는데 사용되는 추출 용매의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 상기 추출 용매의 비제한적인 예로는 물; 메탄올, 에탄올, 프로필알코올, 부틸알코올 등의 C1 내지 C4의 저급 알코올; 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 등의 다가 알코올; 및 메틸아세테이트, 에틸아세테이트, 아세톤, 벤젠, 헥산, 디에틸에테르, 디클로로메탄 등의 탄화수소계 용매; 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있으며, 바람직하게, 물, 저급알코올, 1,3-부틸렌글리콜, 에틸아세테이트를 단독으로 사용하거나 2종 이상 혼합하여 사용할 수 있다.
본 발명에서 열수 추출 또는 냉침 추출한 추출물은 부유하는 고체 입자를 제거하기 위해 여과, 예를 들어 나일론 등을 이용해 입자를 걸러내거나 냉동여과법 등을 이용해 여과한 후, 그대로 사용하거나 이를 동결건조, 열풍건조, 분무건조 등을 이용해 건조하여 사용할 수 있다.
또한, 상기 용어 "피부 보습"은 피부에 수분감을 증가시켜주고, 촉촉한 상태를 유지하는 것을 의미한다.
본 발명의 항균, 항염증, 및 피부 보습용 화장료 조성물은 히알루론산(Hyaluronic acid) 및 필라그린(Filaggrin)의 합성을 촉진하여 피부 보습 활성을 갖는 것을 특징으로 한다(도 2 및 도 3 참조).
본 발명의 항균, 항염증, 및 피부 보습용 화장료 조성물은 여드름 원인균에 대하여 매우 강력한 항균 활성을 나타내는데, 구체적으로 여드름 유발에 가장 큰 원인균으로 지목되고 있는 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes) 균주, 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis) 균주, 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 균주에 대하여 매우 강력한 항균 활성이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 항균, 항염증, 및 피부 보습용 화장료 조성물은 염증 유발 인자인 iNOS 및 COX-2 유전자 발현을 억제하여 항염증 활성을 갖는 것을 특징으로 한다(도 5 참조).
본 발명의 항균, 항염증, 및 피부 보습용 화장료 조성물에서, 상기 조성물은 마스크팩, 용액, 외용연고, 크림, 폼, 영양화장수, 유연화장수, 유연수, 유액, 메이크업 베이스, 에센스, 비누, 액체 세정료, 입욕제, 선스크린 크림, 선오일, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 패치 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 항균, 항염증, 및 피부 보습용 화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급 알콜, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 항균, 항염증, 및 피부 보습용 화장료 조성물에 포함되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체는 제형에 따라 다양하다.
본 발명의 제형이 연고, 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는, 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되며, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일이 이용될 수 있으며, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 비누인 경우에는 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속 염, 지방산 헤미에스테르 염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알콜, 식물성 유, 글리세롤, 당 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 항균, 항염증, 및 피부 보습용 화장료 조성물에서, 여주 발효 추출물은 구체적으로는 건조 중량으로, 화장료 조성물 총 중량의 0.0001 중량% 내지 50 중량%로 포함될 수 있으며, 보다 구체적으로는 0.0005 중량% 내지 10 중량%로 포함될 수 있다. 상기 범위 내에서 피부 보습, 항균, 및 항염증에 대한 우수한 효능을 나타내는 이점이 있으며, 조성물의 제형이 안정화되는 이점이 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 락토바실러스 사케이(기탁번호: KCTC 14130BP) 균주로 발효된 여주 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 항균, 항염증, 및 피부 보습용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 락토바실러스 사케이(기탁번호: KCTC 14130BP) 균주로 발효된 여주 발효 추출물은 피부 보습에 우수한 활성을 갖는 동시에 우수한 항균 및 항염증활성을 나타내어 피부 상태 개선을 위한 식품 조성물로 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 여주 발효 추출물과 항균, 항염증, 및 피부 보습에 대한 효과는 상기에서 설명한 바와 같다. 상기 식품 조성물은 건강기능식품의 형태로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 식품 조성물은 여주 발효 추출물의 분획물 또는 이의 가공물의 형태로 포함될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 유효성분 이외에 식품학적으로 허용 가능한 식품보조첨가제를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, "식품보조첨가제"란 식품에 보조적으로 첨가될 수 있는 구성요소를 의미하며, 각 제형의 건강기능식품을 제조하는데 첨가되는 것으로서 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 식품보조첨가제의 예로는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함되지만, 상기 예들에 의해 본 발명의 식품보조첨가제의 종류가 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 식품 조성물에는 건강기능식품이 포함될 수 있다. 본 발명에 있어서, "건강기능식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 “기능성”이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법으로 제조 가능하며, 상기 제조시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다.
또한, 상기 건강기능식품의 제형 또한 건강기능식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식용 과일을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나며, 피부에 수분 함유량을 증진시키고, 여드름 원인균 및 염증의 발생을 줄여주는 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취할 수 있다.
본 발명의 건강기능식품이 취할 수 있는 형태에는 제한이 없으며, 통상적인 의미의 식품을 모두 포함할 수 있고, 기능성 식품 등 당업계에 알려진 용어와 혼용하여 사용할 수 있다. 아울러 본 발명의 건강기능식품은 당업자의 선택에 따라 식품에 포함될 수 있는 적절한 기타 보조 성분과 공지의 첨가제를 혼합하여 제조할 수 있다. 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 본 발명에 따른 여주 발효 추출물을 주성분으로 하여 제조한 즙, 차, 젤리 및 주스 등에 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 동물을 위한 사료로 이용되는 식품도 포함된다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 락토바실러스 사케이(기탁번호: KCTC 14130BP) 균주로 발효된 여주 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증 또는 여드름 질환에 대한 치료 및 예방용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 락토바실러스 사케이(기탁번호: KCTC 14130BP) 균주로 발효된 여주 발효 추출물은 여드름 및 염증에 우수한 효과를 나타내어 여드름과 염증의 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 여주 발효 추출물과 여드름 원인균에 대한 항균 효과와 항염 효과는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 "치료"는 상기 조성물의 투여로 염증성 질환 또는 여드름 원인균에 의해 발생하는 여드름 증세가 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 의미하며, "예방"은 상기 조성물의 투여로 여드름 원인균에 의해 발생하는 여드름 질환 또는 염증성 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 1일 투여량은 예컨대 0.001-100㎎/㎏이다.
본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나, 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 락토바실러스 사케이(기탁번호: KCTC 14130BP) 균주로 발효된 여주 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 항균 또는 항염증용 약학적 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 세균성 여드름 질환 및 염증성 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다. 본 발명의 용어 "투여"란 개체에 적절한 방법으로 소정의 물질을 도입하는 것을 의미한다. 본 발명의 용어 "개체"란 염증성 질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 동물을 의미한다. 구체적인 예로, 인간을 포함한 포유동물일 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(1) 본 발명은 락토바실러스 사케이(기탁번호: KCTC 14130BP) 균주로 발효된 여주 발효 추출물을 유효 성분으로 함유하는 항균, 항염증, 및 피부 보습용 조성물을 제공한다.
(2) 본 발명의 조성물은 세포 독성이 없고, 피부 보습에 우수한 효과가 있으며, 여드름 원인균에 대한 우수한 항균 활성이 있고, 대표적인 염증 관련 유전자인 iNOS 및 COX-2 유전자를 효과적으로 억제하여 우수한 항염증 효과가 있으므로, 화장품, 식품, 및 의약외품 분야에서 피부 보습과 여드름 및 염증성 질환의 치료 및 예방 목적으로 유용하게 이용 가능하다.
(3) 또한, 본 발명의 조성물은 인체에 매우 안전할 뿐만 아니라, 안정성도 매우 탁월하다.
도 1은 여주 발효 추출물 처리에 따른 인간각질형성세포의 세포 생존능을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 2는 인간각질형성세포에서 여주 발효 추출물 처리에 따른 히알루론산(Hyaluronan) 생성량 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 3은 인간각질형성세포에서 여주 발효 추출물 처리에 따른 필라그린(Filaggrin) 생성량 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 4는 여주 발효 추출물 처리에 따른 RAW 264.7 세포의 세포 생존능을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 5는 RAW 264.7 세포에서 여주 발효 추출물 처리에 따른 염증 유발 인자인 iNOS 및 COX-2 유전자의 발현 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 2는 인간각질형성세포에서 여주 발효 추출물 처리에 따른 히알루론산(Hyaluronan) 생성량 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 3은 인간각질형성세포에서 여주 발효 추출물 처리에 따른 필라그린(Filaggrin) 생성량 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 4는 여주 발효 추출물 처리에 따른 RAW 264.7 세포의 세포 생존능을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 5는 RAW 264.7 세포에서 여주 발효 추출물 처리에 따른 염증 유발 인자인 iNOS 및 COX-2 유전자의 발현 변화를 측정하여 나타낸 그래프이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1. 여주 추출물 및 이의 발효 추출물의 제조
1-1. 여주 추출물 제조
여주를 흐르는 물에 세척하여 불순물을 제거하였다. 여주 600g에 정제수 6L를 첨가한 후, 3일간 실온에서 교반하여 추출하였다. 상기 과정은 3-Batch로 진행하였다. 얻어진 추출액을 모은 후, 40℃ 이하에서 감압 농축하여 엑기스 형태의 여주 농축 추출물을 제조하였다(제조예 1).
1-2. 여주 발효 추출물의 제조
상기 실시예 1-1에서 준비된 여주 농축 추출물을 정제수 10mL에 1mg 비율로 녹인 후, 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 균주를 접종하여 55℃ 배양기에서 24시간 배양하였다.
배양물을 121℃에서 15분간 멸균하여 균주를 불활성화시킨 뒤 원심분리하여 상층액만을 모았다. 이렇게 얻은 여주의 유산균 발효 복합 추출물을 감압농축기(Rotary evaporator N-1000, EYELA, Japan)를 이용하여 55℃에서 감압 농축한 후, 동결건조하여 분말형태로 제조하였다(제조예 2).
실시예 2. 세포 독성 실험
실시예 1에서 제조한 여주 추출물(제조예 1)과 여주 발효 추출물(제조예 2)이 인간각질형성세포(HaCaT, Human immortalized keratinocyte)의 생장에 미치는 효과를 아래와 같은 방법으로 확인하였다.
우선, 10% FBS(fetal bovine serum, Cambrex)가 포함된 전용 배지인 DMEM(Dulbeccos modified Eagles medium) 배지에 인간각질형성세포를 24 well 세포 배양 접시에 1×105 농도로 접종한 후 24시간 동안, 37℃, 5% CO2 습윤 조건에서 배양하였다. 배양된 인간각질형성세포를 40㎜ 조직 배양 플레이트(1.0×105 세포들)에 시딩하였다. 세포들이 80% 융합에 도달할 때, 세포를 인산 완충 식염수(PBS)로 두 차례 씻어내었다.
이후, 제조예 1 및 2의 샘플이 각각 10, 50, 및 100㎍/㎖의 농도로 첨가된 신선한 세럼-프리 배지 2mL를 각 웰에 첨가한 후, 72시간 동안 배양하였다. 72시간 후, 1mg/mL의 MTT를 처리하고 2시간 후, 세포에 MTT 처리로 생성된 포마잔(formazan)을 DMSO로 녹여 570nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 인간각질형성세포에 여주 추출물과 여주 발효 추출물을 처리한 경우, 이들이 인간 피부 표피 각질 세포주의 세포 생존율을 증가시키는 것으로 나타났다. 특히, 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 균주를 접종하여 발효한 여주 발효 추출물이 단순 여주 추출물에 비해 10, 50, 및 100㎍/㎖ 농도에서 각각 101%, 105%, 114% 개선된 세포 증식 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과를 통해 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 균주를 접종하여 발효한 여주 발효 추출물은 인체에 독성이 없고, 세포 증식을 촉진하여 피부상태 개선 작용이 있는 것을 확인할 수 있었다(도 1 참조).
실시예 3. 피부보습 활성
3-1. 히알루론산 합성 촉진
본 발명의 여주 발효 추출물이 갖는 피부 보습 효과를 검증하기 위해 히알루론산(Hyaluronan) 합성 촉진에 미치는 영향을 실험하였다.
히알루론산(HA, Hyaluronan, Hyaluronic acid)은 주로 표피 각질형성세포와 진피 섬유아세포에 의해 합성되며, 수분과 결합하여 세포가 정상적으로 활동할 수 있는 환경을 조성하는 중요한 역할을 하는 물질이다. 피부에서 히알루론산의 감소는 피부 탄력 저하 및 수분 함유량 감소의 직접적인 원인 중 하나이다. 따라서 본 실험에서는 인간 섬유아세포 내에서 히알루론산의 생성량을 확인하였다.
인간각질형성세포(HaCaT)를 24 well 세포배양 접시에 1㎖의 배양액을 넣고 약 1×105의 농도로 세포를 접종한 후, 37℃, 5% CO2 환경에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 상기 실시예 1에 따라 준비된 여주 추출물(제조예 1)과 여주 발효 추출물(제조예 2)을 각각 10, 50, 및 100㎍/㎖를 포함한 배지로 교체하여 24시간 배양하였다. 이후 배양액을 회수(harvest)하여 4℃, 7,500rpm 환경에서 5분간 원심분리(centrifuge)한 뒤, ELISA 방법을 이용하여 Hyaluronan(Hyaluronan kit, R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA)의 발현량 변화를 확인하였다.
그 결과, 도 2를 참조하면, 여주 추출물 처리군에 비해 여주 발효 추출물 처리군은 10㎍/㎖ 용량에서 103% 개선된 히알루론산 합성 증가 효과를 나타내었고, 50㎍/㎖ 용량에서 110% 개선된 히알루론산 합성 증가 효과를 나타내었으며, 100㎍/㎖ 용량에서 각각 111% 개선된 히알루론산 합성 증가 효과를 나타내었다(도 2 참조).
상기와 같은 결과를 통해, 본 발명의 여주 발효 추출물은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 균주를 통한 발효 과정을 통해 피부 보습에 관여하는 유효 활성 성분들의 생산이 촉진되고 이를 통해 히알루론산 합성이 증가하는 효과가 발생하는 것을 추론할 수 있다.
3-2. Filaggrin 유전자 발현 증진
본 발명의 여주 발효 추출물이 갖는 피부 보습 효과를 검증하기 위해 이들이 필라그린(Filaggrin, FLG, 각질층 형성 인자) 유전자 발현에 미치는 영향을 실험하였다.
먼저, 100mm 세포 배양 접시에 인간각질형성세포(HaCaT)를 10% FBS를 첨가한 DMEM 배지에 1×106 세포 농도로 접종하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 배양하여 상기 실시예 1에 따라 준비된 여주 추출물(제조예 1)과 여주 발효 추출물(제조예 2)을 각각 50μg/mL 및 100μg/mL 농도가 되도록 DMEM 배지에 희석하여 제조한 희석용액을 첨가하여 24시간 동안 동일 조건에서 배양하였다. 이후 Trizol reagent(invitrogen, USA)를 이용하여 세포를 회수하여 RNA를 분리하였다. RT-PCR 방법을 이용하여 Filaggrin 및 hyaluronan synthase-3의 mRNA 발현량을 확인하였다. 사용한 프라이머는 다음과 같다:
- Filaggrin : 정방향 5′-AAG CTT CAT GGT GAT GCG AC-3′, 역방향 5′-TCA AGC AGA AGA GGA AGG CA-3′
- GAPDH: 정방향 5'-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3', 역방향 5'-CCA CCA CCC TGT TGC TGT AG-3'.
상기와 같은 프라이머를 이용하여 RT-PCR 수행하고, 그 결과를 도 3에 정리하였다.
필라그린은 표피 과립층에서 케라토히알린과립(keratohyalin granule)을 형성하는 단백질인 프로필라그린(profilaggrin)의 형태로 존재하다가, 각질형성세포의 최종분화과정에서 필라그린으로 분해된 후에 각질세포막을 형성할 때 케라틴 필라멘트를 응집하여 각질세포의 단단하고 편평한 구조를 만듦으로써 피부장벽에서 벽돌(brick)의 역할을 수행하게 된다.
따라서, 본 실시예에서는 피부 보습과 직접적으로 관련된 인간각질형성세포 내에서 필라그의 mRNA 발현을 확인하였다. 그 결과, 시료 무처리군이나 여주 추출물 처리군에 비해, 여주 발효 추출물 처리군에서는 필라그린(filaggrin)의 mRNA 발현량이 현저하게 증가한 것으로 관찰되었다.
상기와 같은 결과를 통해, 본 발명의 여주 발효 추출물은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 균주를 통한 발효 과정을 통해 피부 보습에 관여하는 유효 활성 성분들의 생산이 촉진되고 이를 통해 피부장벽에서 벽돌(brick)의 역할을 수행하는 필라그린(filaggrin) 생성을 현저하게 증가시켜 피부 보습에 직접적으로 작용하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4. 여드름 원인균에 대한 항균 활성
실시예 2 및 3에서 피부세포 증식, 보습 및 피부 진정 활성이 우수한 것으로 나타난 여주 발효 추출물이 여드름 원인균에 대한 직접적인 항균 활성이 있는지를 확인하기 위하여 여드름 원인균으로 알려진 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes) 균주, 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis) 균주, 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 균주를 대상으로 여드름 유발 원인균의 생장 억제 효능을 검증하였다.
[표 1]
먼저, 프로피오니박테리움 아크네스 균주는 RCM 배지, 스타필로코커스 에피더미디스 균주는 NB 배지, 스타필로코커스 아우레우스 균주는 NA 배지를 이용하여 배양하였고, 상기 [표 1]의 배양 조건으로 배양한 후 시험에 사용하였다.
각 균주별 액체 배지와 실시예 1에서 제조한 여주 발효 추출물(제조예 2)을 각각 혼합하여 3종의 균주를 1×106 CFU/ml의 초기 균수로 준비하여 미생물 저감 효능 시험을 실시하였다. 준비된 3종 균주를 대조군, 비교군을 포함하여 각각 접종하여 균주별 최적 조건에서 배양하였으며, 0, 1, 24시간마다 시료를 채취하여 멸균된 식염수를 이용하여 10배수로 희석하여 한천배지에 도말하였다.
도말한 플레이트들은 최적 조건에서 배양한 후, 전형적인 집락을 확인 및 계수하여 감소율을 확인하였고, 이를 통해 3종 미생물에 대한 저감 효능을 확인할 수 있었다(표 2). 비교 검증을 위해 종래 여드름 원인균에 대해 항균 효과가 잘 알려진 항균물질인 살리실산(Salicylic acid)(비교예 1)과 티트리 오일(Tea Tree oil)(비교예 2)을 사용하였다.
[표 2]
실험 결과, 상기 [표 2]에 나타난 바와 같이, 제조예 2의 여주 발효 추출물은 비교예 1의 살리실산 수준으로 항균력이 우수한 것으로 관찰되었고, 비교예 2의 티트리 오일에 비해 오히려 항균력이 높은 것으로 관찰되었다.
또한, 여주 발효 추출물의 여드름 원인균에 대한 객관적인 항균력 검증을 위해 메틸파라벤(비교예 3) 처리군을 대조군으로 하여 액체배지 희석법에 따라 프로피오니박테리움 아크네스 균주(KACC 11946), 스타필로코커스 에피더미디스 균주(KACC 13234), 및 스타필로코커스 아우레우스(KCTC 3881) 균주에 대한 최소 성장억제농도(Minimun Inhibitory Concentration, MIC)를 구하여 검증하였다.
그 결과, 본 발명의 여주 발효 추출물의 최소저해농도 값은 프로피오니박테리움 아크네스 균주에 대해 5ug/ml, 스타필로코커스 에피더미디스 및 스타필로코커스 아우레우스 균주에 대해 7.5ug/ml 수준인 것으로 나타났으며, 발효하지 않은 여주 추출물이나 항균 소재로 사용되는 메틸파라벤에 비해 월등하게 개선된 항균 효과가 있이 확인되었다.
[표 3]
상기와 같은 결과를 토대로 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 균주를 통한 발효 과정을 통해 여주 추출물의 항균 활성이 더욱 증가하는 것을 확인할 수 있었고, 본 발명의 여주 발효 추출물이 여드름 원인균들을 효과적으로 사멸시켜 여드름 피부의 개선에 매우 유용하게 사용할 수 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 5. 항염증 활성
5-1. 세포 보호 효과
여주 발효 추출물이 LPS 처리된 대식세포주인 RAW 264.7 세포의 생장에 미치는 영향을 통해 세포 보호 효과를 아래와 같은 방법으로 확인하였다.
대식세포주인 RAW 264.7 세포를 한국세포주은행(KTCC, Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였고, 10% FBS(Fetal bovine serum)를 함유한 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)에 10% FBS, 100㎍/㎖ 페니실린 및 100㎍/㎖ 스트렙토마이신을 첨가한 배지에 상기 세포를 접종하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
상기 RAW 264.7 세포를 1×106 cells/mL의 농도(in DMEM)로 96웰 플레이트에 접종하고 24시간 배양 후, 실시예 1에서 제조된 여주 발효 추출물(제조예 2)을 10, 50, 및 100㎍/㎖ 농도로 희석한 시료와 내독소로 알려진 LPS(1μg/ml)를 함유한 새로운 배지를 동시에 처리하여 24시간 배양하였다. 이후, 1mg/mL의 MTT 시약을 처리하고 2시간 후, 세포에 MTT 처리로 인해 생성된 포마잔(formazan)을 DMSO로 녹여 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 본 발명의 여주 발효 추출물의 성능을 비교하기 위해 덱사메타손(Dexamethasone)을 양성대조군으로 사용하였다.
실험 결과, LPS 처리로 감소한 RAW 264.7 세포의 세포 생존률이 여주 발효 추출물의 첨가로 농도 의존적으로 증가하는 현상이 관찰되었으며, 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 균주를 통한 발효 과정을 통해 여주 추출물의 세포 보호 효과가 더욱 개선된 것을 확인할 수 있었다. 또한, 이러한 여주 발효 추출물의 세포 보호 효과는 덱사메타손을 처리한 양성대조군과 비교하여 현저히 개선된 것을 확인할 수 있었다(도 4 참조).
5-2. 염증 유발 인자의 발현
염증 유발 인자인 iNOS 및 COX-2 유전자의 발현 조절과 관련된 여주 발효 추출물의 효과를 검증하였다.
우선, 10% FBS(fetal bovine serum, Cambrex)가 포함된 전용 배지인 DMEM(Dulbeccos modified Eagles medium) 배지에 RAW 264.7 세포를 24 well 세포 배양 접시에 1×105 농도로 접종한 후, 37℃, 5% CO2 습윤 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 이후, 배지를 제거하고 무혈청 DMEM 배지로 희석한 제조예 1의 여주 추출물과 제조예 2의 여주 발효 추출물을 50, 및 100㎍/㎖ 농도로 희석한 시료와 내독소로 알려진 LPS(1μg/ml)를 함유한 새로운 배지를 동시에 처리하여 24시간 배양하였다.
실험은 RT-PCR 방법을 이용하여 iNOS 및 COX-2의 mRNA 발현량을 확인하였다. 사용한 프라이머는 다음과 같다:
- iNOS : 정방향 5′-AAT GGC AAC ATC AGG TCG GCC ATC ACT-3′, 역방향 5′-GCT GTG TGT CAC AGA AGT CTC GAA CTC-3′
- COX-2 : 정방향 5′-TGC TGG TGG AAA AAC CTC GT-3′, 역방향 5′-AAA ACC CAC TTC GCC TCC AA-3′
- GAPDH: 정방향 5'-TGA AGG TCG GTG TGA ACG GAT TTT GGC-3', 역방향 5'-TGG TTC ACA CCC ATC ACA AAC ATG G-3'.
상기와 같은 프라이머를 이용하여 RT-PCR 수행하였다.
실험 결과, 여주 발효 추출물의 iNOS와 COX-2 발현 억제 효과는 음성대조군과 비교하여 50, 및 100㎍/㎖ 농도에서 각각 43%, 및 68% 개선된 iNOS 발현 억제 효과와 49%, 및 78% 개선된 COX-2 발현 억제 효과를 나타내는 것으로 나타났으며, 여주 추출물에 비해 현저히 개선된 염증개선 인자 발현 억제 효과가 있는 것으로 확인되었다(도 5 참조).
상기와 같은 결과를 통해, 본 발명의 여주 발효 추출물을 포함하는 염증성 질환의 치료 및 예방용 조성물이 세포 독성이 없고, iNOS와 COX-2 유전자의 발현을 억제하여 염증성 질환의 치료 및 예방에 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (6)
- 락토바실러스 사케이(기탁번호: KCTC 14130BP) 균주로 발효된 여주 발효 추출물을 유효성분으로 함유하되,
상기 조성물은 히알루론산(Hyaluronic acid) 및 필라그린(Filaggrin)의 합성을 촉진하여 피부 보습 활성을 갖는 것을 특징으로 하고,
상기 조성물은 여드름 원인균인 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes) 균주, 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis) 균주, 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 균주에 대한 항균 활성을 갖는 것을 특징으로 하는,
항균, 항염증, 및 피부 보습용 화장료 조성물. - 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 항염증 활성은 염증 유발 인자인 iNOS 및 COX-2 유전자의 발현 억제를 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 항균, 항염증, 및 피부 보습용 화장료 조성물. - 락토바실러스 사케이(기탁번호: KCTC 14130BP) 균주로 발효된 여주 발효 추출물을 유효성분으로 함유하되,
상기 조성물은 히알루론산(Hyaluronic acid) 및 필라그린(Filaggrin)의 합성을 촉진하여 피부 보습 활성을 갖는 것을 특징으로 하고,
상기 조성물은 여드름 원인균인 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes) 균주, 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis) 균주, 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 균주에 대한 항균 활성을 갖는 것을 특징으로 하는,
항균, 항염증, 및 피부 보습용 식품 조성물. - 락토바실러스 사케이(기탁번호: KCTC 14130BP) 균주로 발효된 여주 발효 추출물을 유효성분으로 함유하되,
상기 조성물은 히알루론산(Hyaluronic acid) 및 필라그린(Filaggrin)의 합성을 촉진하여 피부 보습 활성을 갖는 것을 특징으로 하고,
상기 조성물은 여드름 원인균인 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes) 균주, 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis) 균주, 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 균주에 대한 항균 활성을 갖는 것을 특징으로 하는,
염증 또는 여드름 질환의 치료 및 예방용 약학적 조성물.
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