KR102690551B1 - 능이버섯 추출물을 유효성분으로 포함하는 구강 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 능이버섯 추출물을 유효성분으로 포함하는 구강 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 구강 질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물은, 천연물인 능이버섯 추출물을 이용하여 구강 내에 존재하는 다양한 종류의 세균, 그 중에서도 구강 질환의 주요 원인이 되는 병원 균의 활성을 억제, 구강의 세균막(바이오필름; biofilm)의 형성을 억제하여, 충치나 치은염, 치주염을 등을 효과적으로 예방, 개선 혹은 치료할 수 있으면서도, 인체 독성이 강하지 않아, 장기간 사용이 가능하여, 구강질환의 예방, 치료 또는 개선용 약학적 조성물, 식품 조성물 및 의약외품 조성물로 유용할 수 있다.

Description

능이버섯 추출물을 유효성분으로 포함하는 구강 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 {Composition for preventing, improving or treating of oral diseases comprising extract of Sarcodon aspratus as effective component}
본 발명은 능이버섯 추출물을 유효성분으로 포함하는 구강 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
충치라고도 불리는 치아 우식증(dental caries)과, 풍치 등으로 일컬어지는 치주염 등의 잇몸 질환(periodontitis)은 발병률이 매우 높은 질환으로, 통증, 저작 기능 장애, 치주 조직의 파괴, 구취 및 시린이와 같은 다양한 임상적인 증상을 유발하며, 치아 상실을 초래하는 주된 요인이다.
충치는 치아의 씹는 면이나, 치아와 치아 사이의 인접 면에서 주로 발생하며, 상아질을 둘러싸는 에나멜질을 파괴하는데, 이로 인해 상아질과 상아 세관이 노출되어 치아가 시린 증상을 느끼게 된다. 이러한 충치 질환은 유아기에서 청소년기에 에나멜질이 충분히 강화되지 못한 연령대에 주로 발생하게 된다.
잇몸 질환으로 알려진 풍치(치주염)는 치아와 치조골을 서로 이어주는 치주 인대가 손상되면서 발생하며, 여러 원인에 의해 구강 미생물의 생태계가 붕괴되면서 하부 조직의 만성 염증이 지속되고, 활성 산소, 염증성 신호 물질 등의 국소적 과다 농축 등에 의해 치주조직 하부의 치조골과 치주인대가 흡수된다. 이 치조골과 치주 인대의 손상에 의해 치조골의 치아에 대한 지지가 감소하여 치아 동요도가 증가되고, 치아 뿌리 부분을 둘러싸고 있던 시멘트질이 노출되면서, 치아가 시린 증상을 느끼게 된다. 이러한 치주질환은 주로 30대 이후의 성인에서 많이 나타나는데, 대부분이 이 질환에 무감각한 것이 현실이다.
이러한 충치나 풍치는, 구강 내 존재하는 세균에 의해 발병되는 세균감염성 질환이며 구강 세균은 음식물 섭취를 통해 영양분을 공급받고 세균 밀도가 높아지면 치아표면에 치면세균막(dental biofilm)이라 불리는 바이오필름(biofilm)을 형성하게 된다. 치면세균막은 치아 표면에 부착된 당 단백질(glycoprotein) 성분의 얇은 막에 약 700여 종 이상의 세균들이 부착하여 형성된 점착성 세균막(바이오필름; biofilm)이다.
구강 내 치면세균막은 물리적으로 두꺼운 층을 형성하기 때문에 외부 물질의 침투가 어렵고, 세포 간 상호작용을 통해 유전적 변이가 일어나기 때문에 부유 세균에 비해 항균 물질에 대한 저항성이 높다.
치면세균막이 적절하게 제거되지 못하면 치면에 침착하게 되고 시간이 지나면서 치석으로 변하게 된다. 치석은 계속 방치하게 되면 치은출혈, 부종, 치조골 흡수로 인한 치아 흔들림이 발생될 수 있고 치아우식증과 치주질환의 원인이 된다.
치주질환과 관련된 세균들은 주로 치은연하 치면세균막에 존재하는 그람음성 혐기성세균으로 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis 또는 P gingivalis)가 대표적이다. 포르피로모나스 진지발리스(P.gingivalis)는 콜라겐을 분해하고 암모니아, 황화수소, 아민, 리포폴리사카라이드 등과 같은 독소를 분비하여 치주조직에 직접적인 영향을 미친다. 또한, 포르피로모나스 진지발리스(P. gingivalis)의 대사산물들은 생체 면역계를 자극하고 자극된 체액성 및 세포성 면역계는 여러 작용에 의해 활성산소, 인터루킨과 같은 사이토카인을 분비하여 잇몸 염증을 유발하기도 한다.
이러한 구강 병원 균의 증식을 억제하는 방법으로는, 균들의 서식처인 치태나 치석을 제거하는 요법이 알려져 있고, 병원 균 자체에 작용하는 항균제 혹은 살균 및 정균 작용을 할 수 있는 항생제를 사용하는 요법이 알려져 있다.
그러나, 항생제는 알러지 등, 우리 몸에 대한 전신적인 부작용을 발생시킬 수 있고, 구강 내 내성균을 출현시키거나 균교대증(superinfection)을 유발할 수 있기 때문에 장기 사용이 어렵다.
또한, 구강 청결제에 사용되고 있는 항균제들은, 아직 구강 내에서 세균에 대한 작용 효과가 명확히 밝혀지지 않았고, 특히 잇몸 질환의 치료 효과에 대해 논란이 있으며, 역시 장시간 사용 시, 인체 독성 등 구강 내 조직에 대한 부작용이 발생할 수 있는 문제점이 있어, 이를 대체할 수 있는 천연물 유래 구강건강 소재 개발에 관한 연구가 주목을 받고 있다.
한국공개특허 10-2022-0138171호
본 발명의 목적은 구강 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 구강 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 구강 질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 능이버섯 추출물을 유효성분으로 포함하는 구강 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 능이버섯 추출물을 유효성분으로 포함하는 구강 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
나아가 본 발명은, 능이버섯 추출물을 유효성분으로 포함하는 구강 질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.
본 발명의 구강 질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물은, 천연물인 능이버섯 추출물을 이용하여 구강 내에 존재하는 다양한 종류의 세균, 그 중에서도 구강 질환의 주요 원인이 되는 병원 균의 활성을 억제, 구강의 세균막(바이오필름; biofilm)의 형성을 억제하여, 충치나 치은염, 치주염을 등을 효과적으로 예방, 개선 혹은 치료할 수 있으면서도, 인체 독성이 강하지 않아, 장기간 사용이 가능하여, 구강질환의 예방, 치료 또는 개선용 약학적 조성물, 식품 조성물 및 의약외품 조성물로 유용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예 1 내지 6의 추출물을 처리한 포르피로모나스 진지발리스(Porphylomonas gingivalis)균의 생장곡선을 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 실시예 1 내지 3의 추출물을 처리한 포르피로모나스 진지발리스(Porphylomonas gingivalis)균의 호흡활동을 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 실시예 1 내지 3의 추출물의 MG63 세포에서 세포독성을 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 실시예 1, 실시예 3 및 실시예 4의 추출물 처리에 따른 바이오필름의 형성 억제 효과를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 실시예 1, 실시예 3 및 실시예 4의 추출물 처리에 따른 세포 내 ROS(활성산소) 제거 효과를 나타낸 도이다.
도 6은 HGF-1 세포에서 실시예 1의 능이버섯 추출물(NY) 처리에 따른 항염증 효과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명에 대하여 보다 상세하게 설명하도록 한다.
본 발명에서 사용되는 용어 (terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.
본 발명자들은 구강 질환의 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 천연물을 연구하던 중에 능이버섯 추출물이 구강 내에 존재하는 다양한 종류의 세균, 그 중에서도 구강 질환의 주요 원인이 되는 병원 균의 활성을 억제, 구강의 세균막(바이오필름; biofilm)의 형성을 억제하여, 충치나 치은염, 치주염을 등을 효과적으로 예방, 개선 혹은 치료할 수 있는 것을 확인함으로써 상기 추출물을 구강질환의 예방, 치료 또는 개선용 약학적 조성물, 식품 조성물 및 의약외품 조성물로 활용하고자 하였다.
따라서, 본 발명은 능이버섯 추출물을 유효성분으로 포함하는 구강 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "능이버섯"이란 한국과 일본에 분포하는 민주름버섯목(Aphyllophorales)의 굴뚝버섯과(Thelphoraceae) 노루털버섯속 담자균류로 향기가 진하여 향버섯이라 불리기도 하며 균근성 버섯이며, 능이버섯의 주요성분은 단백질과 다당류 비타민 등이 함유되어 있고 lentian, enltedenine의 성분이 다량 함유되어 있어서 암 예방 및 고혈압, 동맥 경화 등에 효과가 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 약학적 조성물은 여주(Momordica charantia) 추출물 또는 오매(Fructus Mume) 추출물을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일구현예에 있어서, 상기 능이버섯 및 (여주 또는 오매)의 혼합 추출물은 능이버섯과 (여주 또는 오매)가 1-5:1-5, 1-4:1-4, 1-3:1-3, 1-2:1-2, 또는 1:1의 중량비로 혼합되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용되는 용어 "여주(Momordica charantia)"란 박과에 속하는 한해살이 덩굴성 풀로서 잎은 크고 콩팥 모양의 원형인 모양을 가지고 있으며, 길이와 너비는 약 5~12 cm이고 일반적으로 5~7개의 깊은 갈래가 있다. 열매는 긴 타원형 모양이거나 난형이며 양끝이 모두 좁고, 길이는 8~30 cm로 자라며 전체가 뭉뚝하고 혹 모양의 도드라진 돌기가 무작위로 덮여 있다. 여주는 또한 고과(苦瓜)로 불리기도 하며 특히 여주를 영어권에서는 "bitter melon"이라 불리며 열대 아시아, 아프리카, 지중해 등에서 재배가 되는 섭취 가능한 과일로 그 맛이 매우 쓰므로 비터멜론으로 알려져 있다. 또한 비타민 C, 사포닌, 알칼로이드, 글루코사이드 등의 유용물질을 다량 함유하고 있으며, 특히 혈당 강하 기능이 있는 카란틴이라는 성분이 높게 함유되어 있다고 알려져 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "오매(Mume Fructus)"란 장미과의 매실나무(Prunus mume.)의 덜 익은 열매를 매연으로 훈증시킨 약재를 말한다. 형태는 둥그스름한 모양이며 지름이 1.5~3 cm이며 표면은 윤기있는 흑색 혹은 갈흑색으로 쭈글쭈글하고 과핵은 단단하고 황갈색이며 표면에는 볼록한 점이 있다. 열매는 편원형으로 담황색이고 특이한 냄새가 있고 맛은 시다. 성분은 citric acid 19%, malic acid 15%, 호박산, 탄수화물, sitosterol, oleic acid를 함유하고 있다.
본 명세서상의 용어 "추출물"은 용매 조추출물, 특정 용매 가용 추출물(용매 분획물) 및 용매 조추출물의 용매 분획물을 의미하고, 상기 추출물은 용액, 농축물 또는 분말 상태일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 각 추출물은 메탄올, 에탄올, 아세톤, 에틸 아세테이트, 헥산, 부탄올, 메틸렌 클로라이드, 물 또는 이들의 혼합 용매로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 용매로 추출된 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는 메탄올 또는 에탄올로 추출된 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 메탄올로 추출된 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 각 추출물 제조에 사용되는 한 용매에 물과 알코올의 혼합물을 사용하는 경우에는 10 %(v/v) 이상 내지 100 %(v/v) 미만, 20 %(v/v) 이상 내지 100 %(v/v) 미만, 30 %(v/v) 이상 내지 100 %(v/v) 미만, 40 %(v/v) 이상 내지 100 %(v/v) 미만, 50 %(v/v) 이상 내지 100 %(v/v) 미만, 60 %(v/v) 이상 내지 100 %(v/v) 미만, 10 %(v/v) 이상 내지 90 %(v/v) 미만, 10 %(v/v) 이상 내지 80 %(v/v) 미만, 10 %(v/v) 이상 내지 70 %(v/v) 미만, 10 %(v/v) 이상 내지 60 %(v/v) 미만, 10 %(v/v) 이상 내지 50 %(v/v) 미만, 10 %(v/v) 이상 내지 40 %(v/v) 미만, 10 %(v/v) 이상 내지 35 %(v/v) 미만, 20 %(v/v) 이상 내지 90 %(v/v) 미만, 20 %(v/v) 이상 내지 80 %(v/v) 미만, 20 %(v/v) 이상 내지 70 %(v/v) 미만, 20 %(v/v) 이상 내지 60 %(v/v) 미만, 20 %(v/v) 이상 내지 50 %(v/v) 미만, 20 %(v/v) 이상 내지 40 %(v/v) 미만, 20 %(v/v) 이상 내지 35 %(v/v) 미만, 예를 들어, 30 %(v/v)의 탄소수 1 내지 4개의 직쇄 또는 분지형 알코올 수용액일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 알코올 수용액은 메탄올(methanol) 수용액, 에탄올(ethanol) 수용액, 이소프로판올(isopropanol) 수용액, 프로판올(propanol) 수용액 및 부탄올(butanol) 수용액으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 사용된 추출 방법은 통상적으로 사용되는 모든 방법일 수 있으며, 예를 들어, 열수 추출법, 냉침 추출법, 환류 냉각 추출법, 용매 추출법, 수증기 증류법, 초음파 추출법, 용출법, 압착법일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 추출 방법으로 추출된 추출물은 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 추출 방법으로 추출된 추출물은 통상의 정제방법을 이용하여 정제될 수 있다.
본 발명에 있어서 각 추출물은 상기 추출 방법으로 추출된 추출물을 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조의 추가과정에 의해 분말 상태로 제조할 수 있다.
본 발명에 있어서 각 추출물은 상기 추출 방법으로 추출된 추출물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography), 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 등과 같은 다양한 크로마토그래피를 이용하여 추가로 정제된 분획을 얻을 수도 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 구강 질환은 이에 제한되지는 않으나, 구강 내 세균에 의해 발생되는 치주염, 임플란트 주위염, 치아 우식증, 치은염, 구취 및 구강 내 점막 궤양일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 바이오필름(biofilm)의 형성을 억제하거나, 또는 형성된 바이오필름을 제거할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 구강 질환은 포르피로모나스 진지발리스(Porphylomonas gingivalis), 스트렙토코쿠스 무탄(Streptococcus mutans), 스트렙토코쿠스 소브리누스(Streptococcus sobrinus), 스트렙토코쿠스 산구이스(Streptococcus sanguinis), 아그레가티벡터 악티노마이세템코미탄스(Aggregatibacter actinomycetemcomitans) 또는 퓨조박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum)로 인하여 발생하는 구강 질환일 수 있으며, 바람직하게는 진지발리스(Porphylomonas gingivalis)로 인하여 발생하는 구강 질환일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "예방"이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 혈전성 질환의 발생, 확산 및 재발을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
또한, 본 발명에서 사용되는 용어 "치료"란 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미하며, 본원에서 사용된 상기 치료란 용어는 치료하는 행위를 말한다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 사용되는 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 건강상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여, 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 약학적으로 유효한 양의 능이버섯 추출물을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 면역질환의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다. 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다.
또한, 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 생리식염수, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유, 덱스트린, 칼슘카보네이트, 프로필렌글리콜 및 리퀴드 파라핀으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 통상의 담체, 부형제 또는 희석제 모두 사용 가능하다. 상기 성분들은 유효성분인 능이버섯 추출물에 독립적으로 또는 조합하여 추가될 수 있다.
또한, 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함될 수 있으며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스 (sucrose) 또는 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌 글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween)61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.
본 발명은 능이버섯 추출물을 유효성분으로 포함하는 구강 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 식품 조성물은 여주(Momordica charantia) 추출물 또는 오매(Fructus Mume) 추출물을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "개선"은 능이버섯 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용하여 예방 또는 치료되는 구강 질환의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 말한다.
본 발명에서 용어, "식품"은 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료, 비타민 복합제, 건강기능식품등의 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함하며, 본 발명의 능이버섯 추출물을 포함할 수 있는한, 이에 제한되지 않는다. 또한, 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐, 또는 액제 등의 형태를 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "건강기능식품"은 건강기능식품에 관한 법률 제16295호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조(가공을 포함한다)한 식품을 의미하며, '기능성'은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 한편, 건강식품은 일반식품에 비해 적극적인 건강유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품은 건강 보조 목적의 식품을 의미하는데, 경우에 따라, 건강기능식품, 건강식품, 건강보조식품의 용어는 혼용될 수 있다. 본 발명의 건강기능식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조 가능하다. 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고 휴대성이 뛰어날 수 있다.
상기 식품 조성물 제조 시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있으며, 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 통상의 식품과 같이 여러 가지 생약 추출물, 식품학적으로 허용 가능한 식품보조첨가제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 포함할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 능이버섯 추출물을 유효성분으로 포함하는 구강 질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 의약외품 조성물은 여주(Momordica charantia) 추출물 또는 오매(Fructus Mume) 추출물을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 섬유, 고무제품 또는 이와 유사한 것, 인체에 대한 작용이 약하거나 인체에 직접 작용하지 아니하며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것, 감염형 예방을 위하여 살균, 살충 및 이와 유사한 용도로 사용되는 제제 중 하나에 해당하는 물품으로서, 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것 및 사람이나 동물의 구조와 기능에 약리학적 영향을 줄 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것을 제외한 물품을 의미한다.
상기 의약외품은 특별히 이에 제한되지 않으나, 구체적으로는 치약, 구강 세정제, 구강용 스프레이, 구강용 연고제, 구강용 패치 또는 검일 수 있다.
본 발명의 능이버섯 추출물을 의약외품 첨가물로 사용할 경우, 상기 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 또는 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있으며 유효성분 혼합량은 사용목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
본 발명은 능이버섯 추출물을 유효성분으로 포함하는 항균 또는 항염증 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 여주(Momordica charantia) 추출물 또는 오매(Fructus Mume) 추출물을 추가로 포함할 수 있다.
이하, 발명의 구체적인 실시예를 통해, 발명의 작용 및 효과를 보다 상술하기로 한다. 다만, 이러한 실시예는 발명의 예시로 제시된 것에 불과하며, 이에 의해 발명의 권리범위가 정해지는 것은 아니다.
<실시예 1> 능이버섯( Sarcodon aspratus ) 추출물 준비
능이 에탄올 추출물은 경동시장 지운당 한약국에서 구매하여 5 cm　이하의　크기로　파쇄한　후, 30g을　500ml　둥근　플라스크에　넣고, 300mL의　에탄올 (000E0219, SAMCHUN)을　용매로　하여　3시간　동안　50℃　항온수조에서　침지　추출하였다.
30분　간격으로　6회　플라스크를　흔들어　용매와　혼합해주었다.　추출　후　Whatman™　No.1 qualitative filter paper (1002110, CYTIVA)를　이용하여　감압장치로　고형분을　여과하여　제거하였다.　여과된　추출물은　회전　농축기IKA RV-10 (IKA,　독일)를　이용하여　농축하고　-80℃ deep freezer에　보관하여　얼린　후,　동결건조기　EYELA FDU-2110 (EYELA,　일본)를　이용하여　72시간　동안　에탄올을　승화시켜　고형분의　추출물을　얻었다.　
능이 메탄올 추출물은 용매로 메탄올을 사용하는 것 외에 위 추출방법과 동일하다.
고형분의 추출물은 1μg/1μL로 DMSO(dimethyl sulfoxide)에 용해시킨 후, centrifugation을 진행해 상층액만 실험에 사용하였다. 추출물의 농도는 실험 용매의 전체 볼륨에 대한 %로 계산하였다.
<실시예 2> 여주( Momordica charantia ; 고과) 추출물 준비
여주 에탄올 추출물은 경동시장 지운당 한약국에서 구매하여 5 cm　이하의　크기로　파쇄한　후, 30 g을　500 ml　둥근　플라스크에　넣고, 300 mL의　에탄올(000E0219, SAMCHUN)을　용매로　하여　3시간　동안　50℃　항온수조에서　침지　추출하였다.
30분　간격으로　6회　플라스크를　흔들어　용매와　혼합해주었다.　추출　후　Whatman™　No.1 qualitative filter paper (1002110, CYTIVA)를　이용하여　감압장치로　고형분을　여과하여　제거하였다.　여과된　추출물은　회전　농축기IKA RV-10 (IKA,　독일)를　이용하여　농축하고　-80℃ deep freezer에　보관하여　얼린　후,　동결건조기　EYELA FDU-2110 (EYELA,　일본)를　이용하여　72시간　동안　에탄올을　승화시켜　고형분의　추출물을　얻었다.　
여주 메탄올 추출물은 용매로 메탄올을 사용하는 것 외에 위 추출방법과 동일하다.
고형분의 추출물은 1μg/1μL로 DMSO(dimethyl sulfoxide)에 용해시킨 후, centrifugation을 진행해 상층액만 실험에 사용하였다. 추출물의 농도는 실험 용매의 전체 볼륨에 대한 %로 계산하였다.
<실시예 3> 오매( Fructus Mume ) 추출물 준비
오매 에탄올 추출물은 경동시장 지운당 한약국에서 구매하여 5 cm　이하의　크기로　파쇄한　후, 30 g을　500 ml　둥근　플라스크에　넣고, 300 mL의　에탄올(000E0219, SAMCHUN)을　용매로　하여　3시간　동안　50℃　항온수조에서　침지　추출하였다.
30분　간격으로　6회　플라스크를　흔들어　용매와　혼합해주었다.　추출　후　Whatman™　No.1 qualitative filter paper (1002110, CYTIVA)를　이용하여　감압장치로　고형분을　여과하여　제거하였다.　여과된　추출물은　회전　농축기IKA RV-10 (IKA,　독일)를　이용하여　농축하고　-80℃ deep freezer에　보관하여　얼린　후,　동결건조기　EYELA FDU-2110 (EYELA,　일본)를　이용하여　72시간　동안　에탄올을　승화시켜　고형분의　추출물을　얻었다.　
오매 메탄올 추출물은 용매로 메탄올을 사용하는 것 외에 위 추출방법과 동일하다.
고형분의 추출물은 1μg/1μL로 DMSO(dimethyl sulfoxide)에 용해시킨 후, centrifugation을 진행해 상층액만 실험에 사용하였다. 추출물의 농도는 실험 용매의 전체 볼륨에 대한 %로 계산하였다.
<실시예 4> 능이버섯 추출물 및 여주 추출물의 혼합물 준비
고형분의 추출물은 1μg/1μL로 DMSO(dimethyl sulfoxide)에 용해시킨 후, centrifugation을 진행해 상층액만 실험에 사용하였다. 추출물의 농도는 실험 용매의 전체 볼륨에 대한 %로 계산하였다. 혼합물의 경우, 실험에 사용할 농도가 0.5%일 경우, 각 0.25%씩 섞어 실험에 사용하였다.
<실시예 5> 능이버섯 추출물 및 오매 추출물의 혼합물 준비
고형분의 추출물은 1μg/1μL로 DMSO(dimethyl sulfoxide)에 용해시킨 후, centrifugation을 진행해 상층액만 실험에 사용하였다. 추출물의 농도는 실험 용매의 전체 볼륨에 대한 %로 계산하였다. 혼합물의 경우, 실험에 사용할 농도가 0.5%일 경우, 각 0.25%씩 섞어 실험에 사용하였다.
<실시예 6> 여주 추출물 및 오매 추출물의 혼합물 준비
고형분의 추출물은 1μg/1μL로 DMSO(dimethyl sulfoxide)에 용해시킨 후, centrifugation을 진행해 상층액만 실험에 사용하였다. 추출물의 농도는 실험 용매의 전체 볼륨에 대한 %로 계산하였다. 혼합물의 경우, 실험에 사용할 농도가 0.5%일 경우, 각 0.25%씩 섞어 실험에 사용하였다.
<실험예 1> 항균 테스트
<1-1> 균주의 생장억제능 확인
실험에 사용된 추출물은 국민대학교 김태종 교수 실험실로부터 제공받아 실험에 사용하였다.
P. gingivalis를 seeding 하기 전, 배지를 준비하였다. 배지는 10mL씩 분주한 뒤, 추출물을 넣을 볼륨을 제거하였다. 단일 추출물은 0.125%씩, 혼합 추출물은 0.125%씩(최종 농도 0.25%) 조합하였다. 이후 산소를 치환하기 위해 혐기성 챔버에 24시간 인큐베이션을 진행하였다.
P. gingivalis(ATCC 33277, KCOM) 500 μL를 BHI 배지(BHI, Hemin 5 μg/mL, 및 Vitamin K1 1μg/mL) 9.5 mL에 넣고 24 시간 동안 37 ℃에서 배양한 후, 배양액을 1.5 mL e-tube에 1 mL씩 담고 12,000 rpm에서 3 분 동안 원심분리하였다. 상층액을 버린 후, BHI 배지 1 mL를 첨가하여 펠릿(pellet)을 풀어주었다. 그 다음, 20 μL를 따서 BHI 배지 380 μL에 1/20로 희석하였다. 희석한 배양액 200 μL를 96-웰 플레이트에 넣고, OD600을 측정하였다. 측정된 OD600 값을 바탕으로, 1Х108 CFU/mL로 하기의 방법을 이용하여 P. gingivalis의 투입 부피(input volume)를 계산하였다.
[1 mL 안에 들어 있는 P. gingivalis의 총 CFU, 원액]
= {7156.4(0.281; OD 희석 값 - 0.087; OD 배지) - 20.258
= (1368.0836 Х106 CFU/mL) Х 20
= 27361.672 Х106 CFU/mL
= 273.61672 Х108 CFU/mL
이때, 전체 부피가 10 mL이므로 투입 부피(하기 X)는,
X μL = (1Х108 CFU/mL)/(273.61672 Х108 CFU/mL) Х 10 mL
= (1Х108 CFU/mL)/(273.61672Х108 CFU/mL) Х 10,000 μL
=36.5474741455858…..
= 36.5 μL
또한, 하기 계산식 1을 사용하여 에탄올 추출물의 투입 부피를 계산하였다.
[계산식 1]
Figure 112023043527842-pat00001
BHI 배지 10 mL에서, 상기에서 계산된 P. gingivlais의 투입 부피인 36.5 μL 및 에탄올 추출물의 투입 부피인 12.5 μL(0.125%) 및 25 μL(0.25%)를 제거하였다. 각 부피가 제거된 배지에 상기에서 준비된 P. gingivlais 배양액 36.5 μL 및 에탄올 추출물(단일 - 0.125%, 혼합 - 각 0.125%씩 최종 농도 0.25%) 25 μL(0.25%) 또는 12.5 μL(0.125%)씩 첨가한 뒤, 파이펫으로 섞어주었다. 이후 혐기성 챔버에 인큐베이션을 진행하면서, 시간(0h, 4h, 8h, 12h, 24h, 48h, 72h, 96h, 120h, 144h, 168h)에 맞춰 Microplate reader를 사용해 흡광도(OD 600 nm)를 측정하였다.
그 결과, 도 1과 같이, 실시예 1 내지 2 및 실시예 4 내지 6의 추출물은 포르피로모나스 진지발리스(Porphylomonas gingivalis)균의 생장을 최소 96시간까지 억제하고 있는 반면, 실시예 2의 오매 추출물의 경우, P. 진지발리스균의 생장을 최대 8시간까지 밖에 억제하지 못하는 것을 확인하였다.
<1-2> 균주의 viability 확인
실험에 사용된 추출물은 국민대학교 김태종 교수 실험실로부터 제공받아 실험에 사용하였다.
P. gingivalis(ATCC 33277, KCOM) 500 μL를 BHI 배지(BHI, Hemin 5 μg/mL, 및 Vitamin K1 1μg/mL) 9.5 mL에 넣고 24 시간 동안 37 ℃에서 배양한 후, 배양액을 1.5 mL e-tube에 1 mL씩 담고 12,000 rpm에서 3 분 동안 원심분리하였다. 상층액을 버린 후, BHI 배지 1 mL를 첨가하여 펠릿(pellet)을 풀어주었다. 그 다음, 20 μL를 따서 BHI 배지 380 μL에 1/20로 희석하였다. 희석한 배양액 200 μL를 96-웰 플레이트에 넣고, OD600을 측정하였다. 측정된 OD600 값을 바탕으로, 1Х108 CFU/mL로 하기의 방법을 이용하여 P. gingivalis의 투입 부피(input volume)를 계산하였다.
[1 mL 안에 들어 있는 P. gingivalis의 총 CFU, 원액]
= {7156.4(0.163; OD 희석 값 - 0.083; OD 배지) - 20.258
= (552.254 Х106 CFU/mL) Х 20
= 11045.08 Х106 CFU/mL
= 110.4508 Х108 CFU/mL
이때, 전체 부피가 1 mL이므로 투입 부피(하기 X)는,
X μL = (1Х108 CFU/mL)/(110.4508 Х108 CFU/mL) Х 1 mL
= (1Х108 CFU/mL)/(110.4508Х108 CFU/mL) Х 1000 μL
=9.05380495206916…..
= 9.05 μL
또한, 하기 계산식 1을 사용하여 에탄올 추출물의 투입 부피를 계산하였다.
[계산식 1]
Figure 112023043527842-pat00002
BHI 배지 1 mL에서, 상기에서 계산된 P. gingivlais의 투입 부피인 9.05 μL 및 에탄올 추출물의 투입 부피인 5 μL(0.5%), 2.5 μL(0.25%), 1.25 μL(0.125%) 를 제거하였다. 각 부피가 제거된 배지에 상기에서 준비된 P. gingivlais 배양액 9.05 μL을 첨가하고, 시간(0h, 1h, 2h, 3h, 4h)에 맞춰 각 농도의 에탄올 추출물을 각 5 μL(0.5%), 2.5 μL(0.25%), 1.25 μL(0.125%)씩 첨가한 이후, 파이펫으로 섞어주었다. 이후 96 well plate에 150 μL씩 분주하고, Microbial Viability Assay Kit-WST(DOJINDO) 시약을 분주하였다. 1시간동 혐기성 챔버에서 인큐베이션을 진행한 후 Microplate reader를 사용해 흡광도(OD 450 nm)를 측정하였다.
그 결과, 도 2(a)와 같이, 0.5% 농도의 실시예 1 내지 3의 추출물 모두 P. 진지발리스균의 호흡활동을 억제하는 것을 확인하였다. 또한, 도 2(b) 및 도 2(c)에 나타낸 바와 같이, 0.25% 및 0.125% 농도의 능이버섯 추출물 및 여주(고과) 추출물은 P. 진지발리스균의 호흡활동을 억제하는 반면, 0.25% 및 0.125% 농도의 오매 추출물은 P. 진지발리스균의 호흡활동을 억제하지 못하는 것을 확인하였다.
<실험예 2> 세포 독성 테스트
실험에 사용된 추출물은 국민대학교 김태종 교수 실험실로부터 제공받아 실험에 사용하였다.
상기 실시예 1 내지 3에서 준비한 능이버섯 추출물, 여주(고과) 추출물 및 오매 추출물의 생체 독성을 알아보기 위하여, 각각의 추출물 농도(0.0625, 0.125, 0.25, 0.5 및 1%) 변화에 따른 MG63 배양 생존 실험을 진행하였다.
골육종 세포 주인 MG63 세포는 10% FBS, 100 unit/㎖ penicillin, 100 ㎎/㎖ streptomycin 등을 포함시킨 DMEM 배양액을 사용하였고, 37℃ 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
일정 기간동안 배양 후, 실험에 사용하기 위한 최초 배양 밀도(seeding density)는 96 well 기준으로 5000 cells/well로 하였고, 배양 조건은 다음과 같다.
조건: DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 10%; + FBS(Fetal Bovine Serum) 1%; 37℃ 5% CO2.
시딩(seeding) 12시간 후에, 세포 독성을 알아보기 위해 상기 실시예 1 내지 3에서 준비한 능이버섯 추출물, 여주(고과) 추출물 및 오매 추출물을 1%, 0.5%, 0.25%, 0.125%, 0.0625%로 각각 처리하였고, 처리 24시간 후에, Dojindo Cell Counting Kit-8을 well 당 10㎕씩 분주하고 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션한 후, 450nm Absorbance를 측정하여 세포 생존률(cell viability)을 확인하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 능이버섯 에탄올 추출물 및 여주(고과) 에탄올 추출물을 제외한 나머지 추출물은 모든 농도에서 80% 이상의 세포 생존율을 나타내는 것을 확인하였다. 능이버섯 에탄올 추출물 및 여주(고과) 에탄올 추출물은 0.25% 이하 농도에서 80% 이상의 세포 생존율을 나타내는 것을 확인하였다.
<실험예 3> 바이오필름 형성 억제 확인(Titanium disc_confocal)
실험에 사용된 능이, 여주(고과) 에탄올 추출물은 국민대학교 김태종 교수 실험실로부터 제공받아 실험에 사용하였다.
티타늄 디스크(지름 10 mm, Dentium) 위에 여과한 타액(saliva)을 200μl씩 뿌려준 후 ∞ 모양으로 살살 흔들어주었다. 4 시간 동안 37℃에서 인큐베이션한 후, 타액을 제거하였다.
P. gingivalis(ATCC 33277, KCOM) 500 μL를 BHI 배지(BHI, Hemin 5 μg/mL, Vitamin K1 1 μg/mL) 9.5 mL에 넣고 24 시간 동안 37℃에서 배양한 후, 배양액을 1.5 mL e-tube에 1 mL씩 담고 12,000 rpm에서 3 분 동안 원심분리하였다. 상층액을 버린 후, BHI 배지 1 mL를 첨가하여 펠릿(pellet)을 풀어주었다. 그 다음, 20 μL를 따서 BHI 배지 380 μL에 1/20로 희석하였다. 희석한 배양액 200 μL를 96-웰 플레이트에 넣고, OD600을 측정하였다. 측정된 OD600 값을 바탕으로, 1Х108 CFU/mL로 하기의 방법을 이용하여 P. gingivalis의 투입 부피(input volume)를 계산하였다.
[1 mL 안에 들어 있는 P. gingivalis의 총 CFU, 원액]
= {7156.4(0.254; OD 희석 값 - 0.085; OD 배지) - 20.258
= (1189.1736 Х106 CFU/mL) Х 20
= 23783.472 Х106 CFU/mL
= 237.83472 Х108 CFU/mL
이때, 전체 부피가 14 mL(각 디스크에 1 mL씩 분주)라 할 때, 투입 부피(하기 X)는,
X μL = (1Х108 CFU/mL)/(237.83472Х108 CFU/mL) Х 4 mL
= (1Х108 CFU/mL)/(237.83472Х108 CFU/mL) Х 14,000 μL
=85.8644080225124…..
= 58.9 μL
BHI 배지 14 mL에서, 상기에서 계산된 P. gingivlais의 투입 부피인 58.9 μL를 제거하였다. 부피가 제거된 배지에서 상기에서 준비된 P. gingivlais 배양액 58.9 μL를 첨가한 뒤, 파이펫으로 섞어주었다. 그 다음, 24-웰 플레이트의 각 웰에 1 mL씩 넣고 Δ모양으로 살살 흔들어주었다. 37 ℃의 혐기성 챔버(anaerobic chamber, Whitley DG 250 Workstation 230v/50Hz; 80% N2, 10% CO2 및 10% H2 and N2 100%)에서 24 시간 동안 인큐베이션하였다.
이후, well 내 media를 제거한 뒤, 추출물이 섞인 media 1mL씩 넣고, Δ모양으로 살살 흔들어주었다. 37℃ 의 혐기성 챔버(anaerobic chamber, Whitley DG 250 Workstation 230v/50Hz; 80% N2, 10% CO2 및 10% H2 and N2 100%)에서 24 시간 동안 인큐베이션하였다.
에탄올 추출물의 투입 볼륨은 하기 계산식 1을 사용하여 계산하였다.
[계산식 1]
Figure 112023043527842-pat00003
단일 추출물은 0.125%로, 조합 추출물은 추출물 당 0.125%씩 최종 농도 0.25%로 계산하여 에탄올 추출물을 첨가하였다.
총 48시간동안 혐기성 챔버에서 인큐베이션을 진행한 후, 공초점 레이저 주사현미경(Confocal Laser Scanning Microscope (Carl Zeiss))으로 디스크 표면을 촬영하기 위해 Hoechst 33342와 Propidium iodide solution(PI, sigma-aldrich)을 이용해 염색을 진행하였다. 염색약은 각 well 당 300 μL씩 넣고 상온에서 30분간 인큐베이션을 진행한 후, 촬영하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 단일 추출물의 경우, 능이버섯 추출물이 여주(고과) 추출물보다 바이오필름(biofilm)을 제거하는 능력이 상대적으로 크다는 것을 확인하였으며, 실시예 4의 능이버섯 추출물 및 여주(고과)추출물의 혼합물의 경우, 실시예 1 및 실시예 3의 추출물 대비 바이오필름(biofilm)을 제거 효과가 현저한 것을 확인하였다.
<실험예 4> 구강 바이오필름(Oral Biofilm; OB) ROS (Reactive oxygen species) 제거 효과 확인
실험에 사용된 능이, 여주(고과) 에탄올 추출물은 국민대학교 김태종 교수 실험실로부터 제공받아 실험에 사용하였다.
티타늄 디스크(지름 10 mm, Dentium) 위에 여과한 타액(saliva)을 200μl씩 뿌려준 후 ∞ 모양으로 살살 흔들어주었다. 4 시간 동안 37℃에서 인큐베이션한 후, 타액을 제거하였다.
P. gingivalis(ATCC 33277) 500 μL를 BHI 배지(BHI, Hemin 5 μg/mL, Vitamin K1 1 μg/mL) 9.5 mL에 넣고 24 시간 동안 37 ℃에서 배양한 후, 배양액을 1.5 mL e-tube에 1 mL씩 담고 12,000 rpm에서 3 분 동안 원심분리하였다. 상층액을 버린 후, BHI 배지 1 mL를 첨가하여 펠릿(pellet)을 풀어주었다. 그 다음, 20 μL를 따서 BHI 배지 380 μL에 1/20로 희석하였다. 희석한 배양액 200 μL를 96-웰 플레이트에 넣고, OD600을 측정하였다. 측정된 OD600 값을 바탕으로, 1Х108 CFU/mL로 하기의 방법을 이용하여 P. gingivalis의 투입 부피(input volume)를 계산하였다.
[1 mL 안에 들어 있는 P. gingivalis의 총 CFU, 원액]
= {7156.4(0.254; OD 희석 값 - 0.085; OD 배지) - 20.258
= (1189.1736 Х106 CFU/mL) Х 20
= 23783.472 Х106 CFU/mL
= 237.83472 Х108 CFU/mL
이때, 전체 부피가 3.5 mL(각 디스크에 1 mL씩 분주)라 할 때, 투입 부피(하기 X)는,
X μL = (1Х108 CFU/mL)/(237.83472Х108 CFU/mL) Х 3.5 mL
= (1Х108 CFU/mL)/(237.83472Х108 CFU/mL) Х 3500 μL
=14.7161020056281……..
= 14.7 μL
또한, 하기 계산식 1을 사용하여 에탄올 추출물의 투입 부피를 계산하였다.
[계산식 1]
Figure 112023043527842-pat00004
BHI 배지 3.5mL에서, 상기에서 계산된 P. gingivlais의 투입 부피인 14.7 μL 및 에탄올 추출물의 투입 부피인 4.38 μL(0.125%), 8.75 μL(0.25%)를 제거하였다. 각 부피가 제거된 배지에 상기에서 준비된 P. gingivlais 배양액 14.7 μL 및 에탄올 추출물(단일 - 0.125%, 혼합 - 각 0.125%씩 최종 농도 0.25%) 4.38 μL(0.125%), 8.75 μL(0.25%)씩 첨가한 뒤, 파이펫으로 섞어주었다. 그 다음, 24-웰 플레이트의 각 웰에 1 mL씩 넣고 Δ모양으로 살살 흔들어주었다. 37 ℃의 혐기성 챔버(anaerobic chamber, Whitley DG 250 Workstation 230v/50Hz; 80% N2, 10% CO2 및 10% H2 and N2 100%)에서 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 배양 후, disc는 MG63 세포를 seeding 하기 위해 새로운 plate에 옮겼다.
골육종 세포 주인 MG63 세포는 10% FBS, 100 unit/㎖ penicillin, 100 ㎎/㎖ streptomycin 등을 포함시킨 DMEM 배양액을 사용하였고, 37℃ 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
일정 기간동안 배양 후, 실험에 사용하기 위한 seeding 전에 CellTrackerTM Red CMTPX를 사용해 cell 염색을 진행하였다. 염색한 cell은 5000 cells/20 μL 기준으로 disc 위에 seeding 하였다. Seeding 후 7분간 CO2 인큐베이터에서 인큐베이션 진행 후, 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 각 well 당 1에서 1.5mL씩 분주하였다. CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하였다.
세포 내부의 ROS를 측정하기 위해 CellROXTM Deep Red Reagent를 배지에 2 uM (final concentration)을 넣고 30 분 간 CO2 인큐베이터에서 incubation 하였으며 이후 디스크를 따뜻한 PBS 로 1회 씻어낸 뒤 꺼냈다. 마운팅용액을 confocal dish 위에 70 uL 떨어트린 곳에 거품이 생기지 않게 디스크로 덮으며 마운팅 하였고 공초점 레이저 주사현미경(Confocal Laser Scanning Microscope (Carl Zeiss))으로 디스크 표면을 촬영하였다. ROS 시그널은 647 nm 레이져로 촬영되었으며 세포를 표지하는 CellTracker Red는 594 nm 레이져로, 그리고 바이오필름을 염색한 Wheat Germ Agglutinin-FITC 는 488nm 레이져로 촬영되었다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, DMSO만 처리했을 때보다, 실시예 1 및 실시예 3의 능이버섯 추출물, 여주(고과) 추출물을 처리했을 때 ROS(활성산소)가 제거된다는 것을 확인하였으며, 실시예 4의 능이버섯 추출물 및 여주(고과)추출물의 혼합물의 경우, 실시예 1 및 실시예 3의 추출물 대비 세포 내 ROS(활성산소) 제거 효과가 현저한 것을 확인하였다.
<실험예 5> 능이 에탄올 추출물의 항염증 효과 확인
<5-1> 실험재료
HGF-1 세포, DMEM(FBS 10%, Antibiotics 1%-페니실린, 스트렙토마이신) 배지, Trypsin/EDTA, PBS, 6 well plate, DMEM(FBS -, Antibiotics 1%-페니실린, 스트렙토마이신) 배지, DMSO(D8418-250mL, sigma-aldrich), 능이 에탄올 추출물(국민대), LPS-PG(1mg, InvivoGen), Trizol(ambion, REF 15596018), 1.5mL e-tube, pipette aid, serological pipette, 15mL conical tube, LUNA-IITM Automated Cell Counter, Direct-zolTM RNA MiniPrep(CAT. No: R2050, Lot No. ZRC203699), EtOH absolute(Supelco), 1.5mL e-tube, UV-Visible Spectrophotometer(ThermoFisher, Nanodrop One), SuperScriptTM IV First-Strand Synthesis System, Nuclease-Free Water(not depc treated, Ambion), MJ Mini Personal Thermal Cycler(BIO-RAD), RealHelixTM Premier qPCR Kit(SYBR Green with high ROX, Cat No, PQH-S500), PCR tube Rack, Nuclease-Free Water(not depc treated, Ambion), MicroAmp Fast Reaction Tubes(8 tutub/Strip, 0.1mL, applied biosystems), MicroAmp Optical 8-Cap Strip(applied biosystems), StepOnePlus Real-Time PCR System(Applied Biosystems/US)
<5-2> 세포 배양 및 염증반응 유도
LPS 및 능이 에탄올 추출물을 처리하여 HGF-1의 염증반응을 qRT-PCR로 확인하기 위해, Control(LPS -, 능이 에탄올 추출물 -), Sample1(LPS -, 능이 에탄올 추출물 +), Sample2(LPS +, 능이 에탄올 추출물 -), Sample3(LPS +, 능이 에탄올 추출물 +)에 대해 실험 진행하였다.
6 well plate에 웰 당 1 X 106 cells 시딩하고, Media는 2mL 분주하여, 5% CO2 인큐베이터에서, 37℃, 6시간 배양하였다. 그 후, DMEM(FBS -, phenol red -, Ab +)에 DMSO(7mL의 0.25% = 17.5μL) 및 추출물(13mL의 0.25% = 32.5μL)을 각각 0.25% 처리 후 볼텍싱해주었다. FBS는 성장에 영향을 끼치므로 제거한 DMEM media를 사용하였다.
배양액이 제거된 DMEM media에서 2mL을 따 well에 분주하여, 5% CO2 인큐베이터에서, 37℃, 2시간 배양하였다. Control 군은 LPS를 처리하지 않으므로 24시간 배양 진행하였다.
각 well에 LPS를 1μg/mL를 첨가하고, 5% CO2 인큐베이터에서, 37℃, 22시간 배양하고, PBS로 세척한 뒤, PBS 제거후 Trizol 500μL 분주한 후, 5분간 Incubation RT하였다. 이후 파이펫팅을 꼼꼼히 진행하여 plate에 붙은 cell을 다 떼어내고, e-tube에 상층액 이동하여, -20℃ 보관하였다.
<5-3> Trizol을 사용한 세포 수집
well plate에 Well 당 5 X 105 cells seeding(하나만 seeding하면 됨)하고, Media는 2mL 분주하여, 5% CO2 인큐베이터에서, 37℃, 6시간 배양하였다.
DMEM(FBS -, phenol red -, Ab +)에 DMSO(3mL의 0.25% = 7.5μL) 0.25% 처리 후 볼텍싱하였다. 배양액이 제거된 DMEM media에서 2mL을 따 well에 분주하여 5% CO2 인큐베이터에서, 37℃, 24시간 배양하였다. PBS로 세척한 뒤, PBS 제거후 Trizol 500μL 분주한 후, 5분간 Incubation RT하였다. 이후 파이펫팅을 꼼꼼히 진행하여 plate에 붙은 cell을 다 떼어내고, e-tube에 상층액 이동하여, -80℃ 보관하였다.
<5-4> Trizol 샘플에서 mRNA 추출
상기 5-2 및 5-3에서 mRNA 추출을 진행하였다. Direct-zolTM RNA MiniPrep Kits의 프로토콜을 준수하여 실험을 진행하였으며, 원심분리의 세기는 12,000rpm에서 진행하였다.
키트 프로토콜에 따라 추출한 RNA 농도를 나노드롭(nanodrop)을 이용하여 측정하고, 측정 후 -80℃ 보관하였다.
<5-5> qRT-PCR 진행
상기 5-4에서 추출한 mRNA로 cDNA 합성을 진행하였으며, cDNA 합성은 superscript iv first strand synthesis 프로토콜에 따라 진행하였다. 합성된 cDNA를 하기 표 2의 프라이머를 사용한 실시간 중합효소 연쇄반응에 이용하였다. 실시간 중합효소 연쇄반응은 RealHelixTM Premier qPCR Kit(SYBR Green with high ROX, Cat No, PQH-S500)를 이용하여 StepOnePlus Real-Time PCR System(Applied Biosystems/US)에서 진행되었다. 실시간 중합효소 연쇄반응은 95℃, 10분, 95℃, 15초, 60℃, 1분, 95℃, 15초를 조건으로 진행하였다.
Target gene Primer sequence (5'->3')
TNF-α AACATCCAACCTTCCCAAACGC (서열번호 1)
TGGTCTCCAGATTCCAGATGTCAGG (서열번호 2)
IL-8 CTCTTGGCAGCCTTCCTGATTTC (서열번호 3)
TTTTCCTTGGGGTCCAGACAGAG (서열번호 4)
IL-6 CGCCTTCGGTCCAGTTGCC (서열번호 5)
GCCAGTGCCTCTTTGCTGCTTT (서열번호 6)
IL-1β TAGGGCTGGCAGAAAGGGAACA (서열번호 7)
GTGGGAGCGAATGACAGAGGGT (서열번호 8)
GTCGCTGTTGAAGTCAGAGGAG (서열번호 9)
β-actin GACTTAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG (서열번호 10)
CTGTCACCTTCACCGTTCCAGTTTT (서열번호 11)
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, LPS에 의해 유도된 HGF-1세포의 염증사이토카인의 발현량이 능이버섯 추출물(NY)처리에 의해 감소된 것을 확인하였으며, 이로인해 본 발명의 능이버섯 추출물은 세균 내 독소에 노출되어 염증이 발생한 잇몸에 항염증 효과가 있는 것을 확인하였다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특히 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (12)

  1. 능이버섯 추출물을 유효성분으로 포함하는 치주염 또는 임플란트 주위염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 능이버섯 추출물은 메탄올, 에탄올, 아세톤, 에틸 아세테이트, 헥산, 부탄올, 메틸렌 클로라이드, 물 또는 이들의 혼합 용매로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 용매로 추출된 것을 특징으로 하는 치주염 또는 임플란트 주위염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 여주(Momordica charantia) 추출물 또는 오매(Fructus Mume) 추출물을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 치주염 또는 임플란트 주위염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 바이오필름(biofilm)의 형성을 억제하거나, 또는 형성된 바이오필름을 제거하는 것을 특징으로 하는 치주염 또는 임플란트 주위염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 치주염 또는 임플란트 주위염은 포르피로모나스 진지발리스(Porphylomonas gingivalis), 스트렙토코쿠스 무탄(Streptococcus mutans), 스트렙토코쿠스 소브리누스(Streptococcus sobrinus), 스트렙토코쿠스 산구이스(Streptococcus sanguinis), 아그레가티벡터 악티노마이세템코미탄스(Aggregatibacter actinomycetemcomitans) 및 퓨조박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum) 중 어느 하나의 균주에 의하여 발생하는 것을 특징으로 하는 치주염 또는 임플란트 주위염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 능이버섯 추출물을 유효성분으로 포함하는 치주염 또는 임플란트 주위염의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 식품 조성물은 여주(Momordica charantia) 추출물 또는 오매(Fructus Mume) 추출물을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 치주염 또는 임플란트 주위염의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  9. 능이버섯 추출물을 유효성분으로 포함하는 치주염 또는 임플란트 주위염의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 의약외품 조성물은 여주(Momordica charantia) 추출물 또는 오매(Fructus Mume) 추출물을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 치주염 또는 임플란트 주위염의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 의약외품은 치약, 구강 세정제, 구강용 스프레이, 구강용 연고제, 구강용 패치 및 검 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 치주염 또는 임플란트 주위염의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물.
  12. 능이버섯 추출물을 유효성분으로 포함하는 포르피로모나스 진지발리스(Porphylomonas gingivalis)에 대한 항균 조성물.
KR1020230050651A 2023-04-18 2023-04-18 능이버섯 추출물을 유효성분으로 포함하는 구강 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 KR102690551B1 (ko)

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