KR101945865B1

KR101945865B1 - 울릉국화 추출물을 포함하는 세포노화 억제용 조성물

Info

Publication number: KR101945865B1
Application number: KR1020160114105A
Authority: KR
Inventors: 이승은; 김금숙; 노형준; 이정훈; 최재훈; 이대영; 김승유; 안영섭
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2015-09-02
Filing date: 2016-09-05
Publication date: 2019-02-11
Also published as: KR20180026311A; KR20180026310A; KR101945864B1; KR101945862B1; KR20170027685A

Abstract

본 발명은 울릉국화 추출물을 유효성분으로 포함하는 세포노화 억제용 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 울릉국화 추출물을 포함하는 건강기능식품 및 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 울릉국화 추출물은 세포노화 관련 질환 및 염증성 질환을 치료하거나 예방할 수 있다.

Description

울릉국화 추출물을 포함하는 세포노화 억제용 조성물{Anti-aging Composition Including Dendranthema zawadskii Extract}

본 발명은 울릉국화 추출물을 유효성분으로 포함하는 세포노화 억제용 조성물에 관한 것으로, 노화 관련 질환에 유용하게 사용될 수 있는 울릉국화 추출물을 포함하는 세포노화 억제용 조성물에 관한 것이다.

노화를 지연시켜 퇴행성질환이 발병하지 않고 건강하게 질병 없이 오래 사는 것은 모든 사람의 바람으로 노화를 억제시키는 물질을 찾는 노력은 과거부터 현재까지도 계속해서 진행되고 있다. 노화를 촉진시키는 원인의 하나로 슈퍼옥사이드, 과산화수소, 수산화기 및 일중항산소와 같은 활성산소종들에 의한 산화 작용을 들 수 있다. 활성산소종들의 대사산물로 생성된 자유기(free radical)들이 생체 내에서 단백질, 생체막, DNA 등에 작용하여 산화적 손상을 주는데, 이들 작용을 억제시키기 위해서 항산화 성분에 대해 많은 연구가 이루어졌고, 항산화 작용을 갖는 새로운 소재를 탐색하기 위한 연구가 국내외에서 활발하게 이루어지고 있다. 그러나 노화현상은 산화에 의해서만 이루어지는 것이 아니고 텔로미어, 세포복제능력, 유전자손상 및 회복능력 등 수많은 요인에 의해서 영향을 받는 것으로 알려져 있기 때문에 천연물 및 약제의 항산화 효과가 아닌 노화억제능력을 평가를 위해서는 세포의 노화를 이용하는 방법이 필요하다.

세포노화는 정상 체세포가 일정 횟수 분열한 후 더 이상 분열하지 못하는 현상으로, 개체 및 조직의 노화에 기여하며, 세포의 비정상적인 증식과 암 형성을 억제하는 중요한 기전이다. 세포노화는 반복되는 체세포의 분열로 인해 염색체의 끝 부분인 텔로미어가 짧아져 생기거나, 암유전자 또는 암억제 유전자의 활성 증가, 과다한 산화스트레스, 자외선이나 방사선 조사, 항암제와 같은 세포독성 물질, 염증반응 등에 의해서도 생긴다.

노화된 세포는 모양이 커지고, 편평해지며, 핵에 이질염색질이 증가하고, 세포질에 공포가 많아지는 형태학적 특징과 함께, SA-β-gal (senescence-associated β-galactosidase) 활성이 증가하며, p53, p16INK4, p21과 같은 세포성장을 억제하는 단백질들의 양이 많아지고, 인슐린양성장인자 결합단백질 (insulin-like growth factor binding proteins; IGFBPs), 인터루킨-6 (interleukin-6), 전환성장인자-β (transforming growth factor-β;TGF-β), 인터페론 (interferon)과 같은 여러 가지 염증 단백질들을 분비한다.

세포노화는 단순히 개체나 조직의 노화에 기여할 뿐만 아니라, 여러 가지 다양한 질병의 병인에 중요한 역할을 한다. 노화세포는 류마티스성 관절염, 골관절염, 간염, 만성 피부손상 조직, 동맥경화 혈관조직 등과 같은 염증성 병변 조직에서 많이 관찰된다. 또한, 전립샘 증식증과 간염, 간암 등에서도 세포노화 현상이 관찰된다.

이와 같이 노화세포가 축적되면 노화세포는 잘 분열하지 못하므로 손상된 조직이 적절히 복구되지 못할 뿐만 아니라, 주위 조직을 분해하는 효소나 염증성 싸이토카인 등을 분비하므로 조직의 손상을 가속시키므로, 노화와 관련된 질병의 병인에 기여한다.

세포성 노화가 노화의 필수 원인 요소인 것으로 여겨지기 때문에, 세포성 노화를 지연시키는 방법을 개발하려는 노력이 있어왔다. 그 중에서 세포노화를 조절할 수 있는 물질을 탐색하여, 이를 질병의 예방과 치료에 활용하고자 하는 연구가 일부 보고되고 있다.

세포노화를 조절하는 것으로 알려진 물질로는 SIRT1 활성을 증가시키는 것으로 알려진 붉은 포도주에 많이 들어 있는 레스베라트롤(resveratrol), 각질세포 (keratinocyte) 에서 세포성 노화를 지연시키기 위한 레티노산의 용도 등이 대표적이다. 아울러 식물 추출물로부터 세포노화를 조절할 수 있는 물질을 동정하고 분리하여 화장품과 건강 기능성 식품 등에 활용하고자 하는 연구가 보고 되고 있다.

한편, 국화과 산국속(Dendranthema)은 우리나라를 포함한 유럽, 아메리카 등지에 분포하고, 특히, 울릉국화 (Dendranthema zawadskii var. lucidum (Nakai) J.H.Park)는 경상북도 울릉도 성인봉의 산지에 난다. 잎은 깊게 비교적 가늘게 갈라지고 갈래는 피침형으로 두껍고 광채가 나며 잎자루가 있는 특징이 있다. 울릉국화에 대한 종래의 연구결과로는 울릉국화의 꽃과 잎, 줄기에서 DPPH 라디칼 소거능 및 ABTS 라디칼 소거능이 우수하다는 내용의 울릉국화의 항산화 효과에 대한 연구가 개시되어 있다(우정향 외 2, 국화과 Dendranthema속 식물 2종 80% 에탄올 추출물의 항산화 효과, Korean J. Plant Res., 23(1):47, 2010). 하지만 울릉 국화 추출물의 세포노화 억제 효능에 대한 결과는 보고된 바 없었다.

본 발명은 울릉국화(Dendranthema zawadskii var. lucidum) 추출물을 유효성분으로 포함하는 세포노화 억제용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 울릉국화 추출물을 유효성분으로 포함하는 세포노화 억제용 조성물을 포함하는 건강기능식품을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 울릉국화 추출물을 유효성분으로 포함하는 세포노화 억제용 조성물을 포함하는 약학 조성물을 제공하는 것이다.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상술한 본 발명의 과제를 해결하기 위하여 본 발명은,

울릉국화(Dendranthema zawadskii var. lucidum) 추출물을 유효성분으로 포함하는 세포노화 억제용 조성물을 포함한다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 추출물은 울릉국화의 지상부로부터 추출할 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 울릉국화 추출물은 SA-β-갈락토시다아제 활성을 저해할 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 울릉국화 추출물은 섬유아세포의 노화를 저해할 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 울릉국화 추출물은 염증관련 인자를 억제할 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 울릉국화 추출물은 물, 알코올, 에틸아세테이트, 클로로포름 및 헥산으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 용매로 추출할 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 조성물은 울릉국화 추출물을 2 내지 10 μg/ml 농도로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상술한 울릉국화 추출물을 유효성분으로 포함하는 세포노화 억제용 조성물을 포함하는 건강기능식품을 제공한다.

또한, 본 발명은 상술한 울릉국화 추출물을 유효성분으로 포함하는 세포노화 억제용 조성물을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

본 발명은 울릉국화 추출물을 유효성분으로 포함하는 세포노화 억제용 조성물에 관한 것으로, 상기 울릉국화 추출물 조성물, 이를 포함하는 건강기능식품, 및 약학 조성물은 세포노화 관련 질환을 치료하거나 예방할 수 있다. 특히 혈액염증, 류마티스성 관절염, 골관절염, 간염, 만성 동맥경화 등의 염증성 질환 또는 노인성 질환을 예방하거나 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 울릉국화 사진이다.
도 2는 섬유아세포(HDF)에서 울릉국화 추출물에 대한 MTT 분석 결과를 나타낸 그래프이다(Doxo : doxorubicin 0.5 μM (27.18 μg/ml), 5 : 울릉국화 추출물 5 μg/ml, 10 : 울릉국화 추출물 10 μg/ml, 20 : 울릉국화 추출물 20 μg/ml).
도 3은 섬유아세포에서 울릉국화 추출물에 대한 MTT 분석 결과를 나타낸 그래프이다(Doxo : doxorubicin 0.5 μM (27.18 μg/ml), 2 : 울릉국화 추출물 2μg/ml, 4 : 울릉국화 추출물 4 μg/ml, 8 : 울릉국화 추출물 8 μg/ml, NAC(N-acetyl-L-cysteine) : 5 mM (815.97 μg/ml)).
도 4는 울릉국화 추출물의 SA-β-gal 활성 억제능을 섬유아세포(HDF)에서 평가한 그래프(A) 및 광학현미경 관찰사진(B)이다.
도 5는 저농도의 울릉국화 추출물에서의 SA-β-gal 활성 억제능을 섬유아세포(HDF)에서 평가한 그래프(A) 및 광학현미경 관찰사진(B)이다.
도 6은 울릉국화 추출물의 노화 동물 대동맥혈관에서 노화로 인해 발생한 ROS의 억제능을 평가한 그래프이다.
도 7은 울릉국화 추출물이 노화 동물의 대동맥혈관에서 염증발현 관련 물질인 NF-κB의 전사를 억제한다는 것을 확인한 전기영동 사진(A) 및 그래프(B)이다.
도 8은 울릉국화 추출물이 노화 동물의 대동맥혈관에서 염증발현 관련 단백질인 COX-2와 iNOS의 발현을 억제한다는 것을 확인한 전기영동 사진(A) 및 그래프(B : COX-2, C: iNOS)이다.
도 9 울릉국화 추출물 및 다른 구절초 추출물의 세포노화저해효과를 확인한 그래프이다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

상술한 바와 같이, 국화과 식물 6종의 항산화 활성 및 항염증 활성에 대한 연구(대한민국 공개특허 제2014-0088504호)는 알려져 있고, 울릉국화의 라디칼 소거능에 대한 연구(woo et al., Korean J.Plant Res., 23(1):47, 2010)는 이루어져 있으나, 울릉국화 추출물의 항염증, 항노화 및 피부의 주름 및 탄력 개선에 관한 연구는 이루어진 바 없었다.

이에 본 발명에서는 울릉국화 추출물을 유효성분으로 포함하는 세포 노화 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명에서의 "동안(童顔)"이란 나이 든 사람이 지니고 있는 어린아이 같은 얼굴을 의미하는 것으로, 피부의 노화가 억제되어 피부가 탄력이 있고, 주름이 없거나 적은 것을 의미한다.

상기 울릉국화 조성물은 노화 관련 질환, 예를 들어 피부노화, 류마티스성 관절염, 골관절염, 간염, 만성 피부손상 조직, 동맥경화, 전립샘 증식증 또는 간암 등과 같은 질환의 예방에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에서는 상기 울릉국화 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물에 대해 MTT 분석법을 실시하였으며, 이를 통하여 울릉국화 추출물이 세포독성이 낮으며, 울릉국화 추출물을 처리한 실험군에서 세포 생존력이 증가한 것을 확인하였으며, SA-β-gal 활성이 저해되는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해 울릉국화 추출물이 직접적으로 세포노화를 억제하는 효능, 특히 피부 주름 개선 및 피부 탄력 개선효과를 가진 것을 확인할 수 있었다.

본 발명에서의 울릉국화의 학명은 Dendranthema zawadskii var. lucidum (Nakai) J.H. Park 또는 Chrysanthemum zawadskii var. lucidum (Nakai) Y.Lee이며, 이명으로는 섬들국화, 울능국화 또는 울릉구절초로도 불린다(도 1 참조).

상기 울릉국화 추출물은 울릉국화의 지상부로부터 추출하는 것이 바람직한데 지상부(地上部)란, 식물체에서 뿌리부분이 아닌 식물 상부의 경엽 부분을 의미하며, 자세하게는 줄기, 잎, 꽃일 수 있다.

상기 울릉국화 추출물은 물, 알코올, 에틸아세테이트, 클로로포름 또는 헥산 등의 단독 또는 혼합 형태인 용매로 추출할 수 있으며, 보다 바람직하게는 C1~4의 저급 알코올을 사용할 수 있다. 보다 더 바람직하게는 에탄올일 수 있다. 상기 용매를 이용한 일반적인 용매 추출법을 적용하여 추출할 수 있으며, 또한 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 정제한 분획물일 수도 있다. 본 발명에 따른 추출물의 제조방법은 본 기술분야에 속하는 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 식물 추출방법을 모두 적용할 수 있으며, 예컨대 물, 알코올 또는 혼합용매에 의한 추출, 중탕이나 상온에 의한 추출법 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

이와 같이 추출된 울릉국화 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 섬유아세포(HDF)에서 세포독성을 거의 나타내지 않고, 세포의 증식을 유의하게 증가시켰다(도 2 및 3 참조).

또한, 울릉국화 추출물의 항노화 효과를 발견하였으며, 이를 증명하기 위해 콜라게네이즈(collagenase) 저해 활성 평가, 엘라테이즈(elastase) 저해 활성 평가, DPPH 활성 평가, 크산틴 옥시데이즈(Xanthine oxidase) 저해활성 평가 등 여러가지 방법으로 세포 노화 억제 효과를 확인할 수 있지만, 그 중 가장 일반적인 방법인 SA-β-gal 활성 평가 시험(Dimri et al., A biomarker that identifies senescent human cells in culture and aging skin in vivo, Proc Natl Acad Sci 92(1995): 9363-9367)을 실시하였다. 그 결과 SA-β-gal 활성을 저해시켜 세포노화를 억제하는 것을 확인하였다(도 4 및 5 참조). 특히, 상기 울릉국화 추출물은 섬유아세포에서 현저히 우수한 세포노화 억제 효능을 보이는 것을 확인할 수 있다.

덧붙여, 울릉국화 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 혈관 조직에서 ROS의 생성을 억제하며(도 6 참조), 혈관 조직에서의 염증발현 관련 물질인 NF-κB의 전사 억제효과를 확인하였으며(도 7 참조), 혈관 조직에서의 염증관련 단백질인 COX-2 및 iNOS가 현저히 억제되는 것을 확인하였다(도 8 참조). 이는, 본 발명의 울릉국화 추출물이 세포노화뿐 아니라, 염증성 질환의 치료에도 적용될 수 있음을 시사한다. 더욱 바람직하게는 노인성 염증성 질환 또는 혈관 염증일 수 있다.

본 발명의 세포노화 억제용 조성물은 상기 울릉국화 추출물을 2 내지 10 μg/ml의 농도로 포함할 수 있다. 상기 조성물의 용매로는 울릉국화 추출물의 세포노화 억제 효과를 방해하지 않는 것이라면 특별히 제한되지 않으나, 보다 바람직하게는 물, 에탄올, 프로필 알코올, DMSO 등일 수 있다.

도 4 및 도 5에 나타난 바와 같이, 울릉국화 추출물의 세포노화 억제능을 실험한 결과, 5 내지 20 μg/ml의 울릉국화 추출물이 섬유아세포에서 노화를 유의하게 감소시키는 효과가 있었으며, 2 내지 4 μg/ml의 울릉국화 추출물에서도 섬유아세포의 노화를 유의하게 감소시키는 효과를 발휘하였다.

세포 독성 시험의 경우, 울릉국화 추출물은 10 μg/ml 농도에서도 세포독성이 없었다. 따라서 세포독성효과가 없으면서 우수한 세포노화 억제 효능을 나타내는 울릉국화 추출물 조성물의 농도는 보다 바람직하게는 2 내지 10 μg/ml일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 울릉국화 추출물을 유효성분으로 포함하는 세포노화 억제용 조성물을 포함하는 건강기능식품을 제공한다. 본 발명의 울릉국화 추출물을 유효성분으로 포함하는 세포노화 억제용 조성물을 포함하는 건강기능식품의 종류는 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등일 수 있다.

상기 건강식품은 상기 울릉국화 추출물 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 울릉국화 추출물을 유효 성분으로 포함하는 세포노화 예방용 음료는 울릉국화 추출물이 유효성분으로 포함되는 것 이외에 칼슘, 가시오가피 농축액, 액상과당, 정제수 등을 첨가 혼합하여 드링크용 병에 충진하여 살균한 후 실온으로 냉각하여 음료를 제조할 수 있다. 또한, 상기 울릉국화 추출물을 유효 성분으로 포함하는 세포노화 예방용 건강보조제는 울릉국화 추출물에 영양보조성분(비타민 B₁, B₂, B₅, B₆, E 및 초산에스테르, 니코틴산 아미드), 올리고당, 50% 에탄올, 정제수를 첨가 혼합하여 과립상으로 성형하여 진공건조기에서 건조시킨 후, 12~14 메쉬(mesh)를 통과시켜 균일하게 과립을 제조하여 적당량씩 압출 성형하여 정제 또는 분말로 하거나 경질캡슐에 충전하여 경질캡슐제품으로 제조할 수 있다.

상기 건강식품에 포함된 상기 울릉국화 추출물의 유효용량은 상기 약학조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으며, 유효성분의 혼합양은 예방 또는 치료적 처치 등의 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 울릉국화 추출물을 유효성분으로 포함하는 세포노화 억제용 조성물을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

상기 약학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 울릉국화 추출물을 유효성분으로 포함하는 세포노화 억제용 조성물을 포함하는 약학적 조성물은 여러 가지 제형으로 제제화할 수 있다. 제제화할 경우에는 통상적으로 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제 및 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제제화할 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 및 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 울릉국화 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제(예를 들면, 전분, 수크로스, 락토오스 및 젤라틴) 등이 섞여 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등을 들 수 있는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함될 수 있다. 비수용성용제와 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 글리세롤 및 젤라틴 등이 사용될 수 있다.

상기 약학적 조성물의 투여량은 대상의 연령, 성별, 상태, 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 병용되는 약물에 따라 달리 적용될 수 있다. 부작용이 없이 사용될 수 있는 1일 투여량은 0.1 내지 20 mg/㎏의 양을 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다.

본 발명의 울릉국화 추출물을 유효성분으로 포함하는 세포노화 억제용 조성물을 포함하는 약학적 조성물을 인체에 투여하는 경우, 천연 추출물인 관계로 다른 합성 의약품에 비하여 부작용의 우려가 적어 안심하고 사용할 수 있다.

상기 약학 조성물 및 건강기능식품은 세포노화 관련 질환을 치료하거나 예방할 수 있고, 특히 혈액염증, 류마티스성 관절염, 골관절염, 간염, 만성 동맥경화 등의 염증성 질환 또는 노인성 질환을 예방하거나 치료하는데 유용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 화장료 조성물은 주름 및 탄력 개선에 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

1. 울릉국화 추출물 조성물의 제조

2012년 7월 30일, 충북 음성군 소재에서 채취된 울릉국화(Dendranthema zawadskii var. lucidum (Nakai) J.H.Park) 시료의 지상부를 사용하였다. 해당 시료를 건조, 분쇄한 후 상온에서 에탄올로 추출한 후 여과하였으며, 추출액 중의 용매는 감압농축장치를 이용해서 제거하고, 수분은 동결건조기에서 제거하여 실험에 사용하였다. 건조시료 100 g으로부터 얻어진 추출물은 7.52 g이었고, 수율은 7.52 %였다.

얻어진 상기 울릉국화 추출물은 용매 DMSO에 100 μg/ml 농도로 녹여 울릉국화 추출물 조성물을 제조하였다.

2. 세포 배양

사람 섬유아세포 (Human dermal fibroblasts, HDFs)는 1% 항생제가 포함된 섬유아세포 배양배지 (FGM-2, Lonza, 스위스)을 이용하여 직경 100 mm 배양접시에 세포를 1 x 10⁵개로 분주한 후, 37의 5% 이산화탄소 배양기에서 배양하였다. 배양접시의 바닥에 80~90% 정도 세포가 자라면, 2.5 x 트립신-EDTA 용액(Lonza, 스위스)을 처리하여 세포를 분리한 후, 계대 배양하였다.

세포의 분열 횟수(population doubling, PD)는 다음 식으로 조사하였다.

PD= log₂F/log₂I (F=마지막 세포수, I=처음 세포수)

실험에 사용한 섬유아세포는 분열횟수가 8회 이하의 것을 사용하였다.

1. 세포 노화 유도 및 울릉국화 추출물 처리

독소루비신(Sigma, USA)은 높은 농도에서는 세포를 죽이지만, 낮은 농도에서는 세포노화를 유도하는 것으로 알려져 있다. 상기 실시예 1-2의 방법으로 배양된 세포의 노화를 유도하기 위하여, 직경 100mm 배양접시에 섬유아세포를 150,000개 분주하고, 3일간 37, 5% 이산화탄소배양기에서 배양한 후, 세포 배양액을 제거하고, 세포를 1% 항생제가 포함된 섬유세포배양액으로 2회 세척한 후, 0.5 μM 독소루비신을 4시간 처리하였다.

독소루비신 0.5 μM을 4시간 처리한 세포를 50ml tube에 1% 항생제가 포함된 섬유세포배양액에 섬유아세포는 5,000개/ml가 되도록 하고 96웰 배양용기의 각 웰에 100 μl씩 분주하였다. 최종적으로 각 웰당 섬유아세포를 500개씩 분주하고, 하루 동안 37, 5% 이산화탄소배양기에서 배양하였다. 각 웰에 1% 항생제가 포함된 섬유세포배양액을 100 μl씩 더 넣어 준 후, 상기 실시예의 울릉국화 추출물을 처리하였다. 울릉국화 추출물은 각각 2, 4, 5, 8 또는 20 μg/ml 처리하였다. 이후 3일간 배양하여 SA-β-gal 염색을 실시하였다.

한편, 음성대조군으로 용매인 DMSO를 처리하였으며, 양성대조군으로는 양성대조군 5 mM (815.97 μg/ml) NAC를 3일간 처리 한 후 MTT 분석을 통해 독성 평가를 실시하였다.

2. 울릉국화 추출물의 세포 독성 평가 - MTT 분석

상기 처리 후 3일 동안 37, 5% 이산화탄소배양기에서 배양한 후, 세포의 성장 정도를 MTT 방법으로 확인하였다. 96 well 배양용기의 각 웰에 0.1% MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 용액(Sigma, USA)을 50 μl씩 넣고 3시간 동안 37, 5% 이산화탄소배양기에서 반응시키고, 배양액과 MTT용액을 제거한 후 DMSO 100 μl를 첨가하여 형성된 결정을 녹여 마이크로플레이트 리더를 이용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 시료를 처리하지 않은 대조실험결과에 대한 백분율 (%)로 표시한 결과를 표 1 또는 도2 및 도3에 나타내었다.

실험군 및 대조군	섬유아세포(HDF)의 Cell viability (% of Doxo)
음성 대조군(Doxo 0.5 μM + DMSO)	100 ± 2.6
Doxo 0.5 μM + 울릉국화 5 μg/ml	94.8 ± 2.7
Doxo 0.5 μM + 울릉국화 10 μg/ml	80.7 ± 2.7
Doxo 0.5 μM + 울릉국화 20 μg/ml	74.8 ± 3.1

실험군 및 대조군	섬유아세포(HDF)의 Cell viability (% of Doxo)
음성 대조군(Doxo 0.5 μM + DMSO)	100 ± 2.6
양성 대조군(Doxo 0.5 μM + NAC 5 mM)	96.63 ± 1.00
Doxo 0.5 μM + 울릉국화 2 μg/ml	98.32 ± 0.69
Doxo 0.5 μM + 울릉국화 4 μg/ml	97.84 ± 2.91
Doxo 0.5 μM + 울릉국화 8 μg/ml	94.81 ± 0.28

실험결과 표 1 및 도 2에서 보이는 바와 같이, 섬유아세포에서 상기 실시예에 따른 울릉국화 추출물이 5 μg/ml 에서는 94.8 ± 2.7%의 세포생존율을 보였으며, 10 μg/ml 에서는 80.7 ± 2.7%의 세포 생존율, 그리고 20 μg/ml 에서는 74.8 ± 3.1%의 세포 생존율을 보였다.

더욱 낮은 농도의 울릉국화 추출물로 실험한 결과는 표 2 및 도 3과 같다. 울릉국화 추출물이 2 μg/ml 에서는 98.32 ± 0.69 %의 세포생존율을 보였으며, 4 μg/ml 에서는 97.84 ± 2.91 %의 세포 생존율, 그리고 8 μg/ml 에서는 94.81 ± 0.28 %의 세포 생존율을 보였다.

즉, 도 2 및 도 3에 보이는 바와 같이, 2 내지 10 μg/ml 농도에서 세포독성이 거의 없거나 미미하게 나타난 것을 확인할 수 있다.

1. 세포 노화 유도 및 울릉국화 추출물 처리

상기 실시예 2-1과 같은 방법으로, 직경 100 mm 배양접시에 섬유아세포를 150,000개 분주하고, 3일간 37, 5% 이산화탄소배양기에서 배양한 후, 세포 배양액을 제거하고, 세포를 1% 항생제가 포함된 섬유세포배양액으로 2회 세척한 후, 0.5μM 독소루비신을 4시간 처리하였다.

독소루비신 0.5 μM을 4시간 처리한 세포를 50ml 튜브에 1% 항생제가 포함된 섬유세포배양액에 섬유아세포 5,000개/ml이 되도록 하고 96웰 배양용기의 각 웰에 100 μl씩 분주하였다. 최종적으로 각 웰당 섬유아세포 500개를 분주하고, 하루 동안 37, 5% 이산화탄소배양기에서 배양하였다. 각 웰에 1% 항생제가 포함된 섬유세포배양액을 100 μl씩 더 넣어 준 후, 상기 실시예의 울릉국화 추출물을 처리하였다. 울릉국화 추출물은 각각 2, 4, 5, 8 또는 20 μg/ml를 처리하였다. 이후 3일간 배양하여 SA-β-gal 염색을 실시하였다.

한편, 음성대조군으로 용매인 DMSO를 처리하였으며, 양성대조물질로는 5 mM (= 815.97 ug/ml) NAC 를 처리하여 비교실험하였다.

2. SA-β-갈락토시다아제 활성 염색

상기 처리 후 3일 동안 37, 5% 이산화탄소배양기에서 배양하고, 세포노화 저해에 대한 울릉국화 추출물의 효과를 SA-β-gal 활성 염색으로 조사하였다. β-갈락토시데이스는 갈락토스와 유기물 사이에 형성된 β-글라이코시딕 결합을 가수분해시키는 엑소글라이코시데이즈이며, 노화가 진행될수록 세포의 리소좀에 다량으로 축적되고, 그 발현 정도를 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-βD-galactopyranoside를 사용하여 식별하고 정량화시킬 수 있다. 이 때, SA-β-gal 염색법으로 노화된 세포는 세포질이 파란색으로 염색된다.

울릉국화 추출물을 3일 동안 처리한 후, 세포를 인산완충액으로 2번 세척하고, 3.7% 파라포름알데하이드로 세포를 1분간 고정한 후, 고정액을 제거하였다. SA-β-gal 염색 용액(40 mM citric acid/phosphate [pH 5.8], 5 mM potassium ferrocyanide, 5 mM potassium ferricyanide, 150 mM NaCl, 2 mM MgCl2, X-gal 1 mg/ml)을 24웰 배양용기에는 500μl를 넣어 준 후, 은박지로 싸서 37에서 18시간 동안 반응시켰다. 인산완충용액 (PBS)으로 2번 세척한 후 인산완충용액으로 2회 세척 한 후, 광학현미경으로 파란색으로 염색된 세포를 관찰하였다. SA-β-gal 활성 정도는 총 50개의 세포 중에서 세포질에 파란색으로 염색된 세포 수를 측정하여 DMSO 처리군을 100%로 하고, 울릉국화 추출물 처리군의 결과는 DMSO 처리군에 대한 백분율(%)로 표시하였다. 이러한 실험결과는 표2 또는 도3 및 도4에 평균 ± 편차로 나타내었으며, 통계적 유의성은 Newman-keuls 방법에 의해 결정하였다.

실험군 및 대조군	섬유아세포에서 SA-β-gal staining (%)
음성 대조군(Doxo 0.5μM + DMSO)	100 ± 0
Doxo 0.5 μM + 울릉국화 5 μg/ml	29.99 ± 8.84
Doxo 0.5 μM + 울릉국화 20 μg/ml	11.62 ± 0.60

실험군 및 대조군	섬유아세포에서 SA-β-gel staining(%)
음성 대조군(Doxo 0.5μM + DMSO)	100 ± 0
양성 대조군(Doxo 0.5μM + 5mM NAC)	82.07 ± 5.05
Doxo 0.5 μM + 울릉국화 2 μg/ml	61.19 ± 4.93
Doxo 0.5 μM + 울릉국화 4 μg/ml	54.81 ± 4.11
Doxo 0.5 μM + 울릉국화 8 μg/ml	39.35 ± 2.46

실험결과, 섬유아세포에서 상기 실시예에 따른 울릉국화 추출물이 5 μg/ml 에서는 29.99 ± 8.84%의 SA-β-gal 활성이 보였으며, 20 μg/ml 에서는 11.62 ± 0.60%의 SA-β-gal 활성을 보였다.

더욱 낮은 농도의 울릉국화 추출물로 실험한 결과는 도 5와 같다. 울릉국화 추출물 2 μg/ml 에서는 61.19 ± 4.93 %의 SA-β-gal 활성을 보였으며, 4 μg/ml 에서는 54.81 ± 4.11 %의 SA-β-gal 활성, 그리고 8 μg/ml 에서는 39.35 ± 2.46 %의 SA-β-gal 활성을 보였다.

즉, 도 4 및 도 5에 보이는 바와 같이, 2 내지 20 μg/ml 농도에서 울릉국화 추출물이 우수한 SA-β-gal 활성 감소를 보여, 세포노화 억제 효능이 우수한 것으로 나타났다.

1. 노화동물 혈관조직에서 발생하는 ROS 저해

노화 동물의 혈관조직에서 발생하는 ROS를 효과적으로 저해하는지 분석하기 위하여, 15개월령의 렛트(rat)를 대상으로 울릉국화 추출물 처리 농도에 따른 ROS 저해능을 측정하였다. 음성대조군으로는 5개월령의 렛트를 사용하였으며, 양성대조군으로는 15개월령의 렛트를 사용하였다. 실험군으로는 울릉국화 추출물을 1주동안 매일 3회 0.2mg/kg의 용량을 투여한 군과 1주동안 매일 3회 1 mg/kg의 용량을 투여한 군으로 나누어 실험을 진행하였다. 각 군에 대하여 총 6마리의 실험 렛트가 사용되었으며, 각각 ROS 저해 값의 평균으로 결과를 도시하였다.

혈관조직에서의 ROS 측정은 DCFDA 방법으로 측정하였다(LeBel 등, 1992). 최적 용적 250 μL의 조직균질액에 최종농도의 25 μM DCFDA용액을 넣어 발생되는 형광의 분당 변화를 여기파장 500nm 및 방출파장 536nm로 형광 마이크로플레이트 리더 (Synergy HT, BIO-TEK, USA)로 측정하였다.

그 결과, 도 6에서 보이는 바와 같이, 15개월령의 렛트의 혈관조직에서는 높은 ROS 발생이 관찰되고 있으나, 울릉국화 추출물을 투여한 군에서는 5개월령의 렛트보다도 낮은 ROS 발생이 관찰됨을 알 수 있다. 이는 울릉국화 추출물이 혈관조직 내에서의 ROS 발생을 효과적으로 저해하여, 세포의 노화를 억제한다는 것을 의미한다.

2. 노화동물 혈관조직에서 염증단백질의 확인

노화 동물의 혈관조직에서 염증 단백질의 발현을 효과적으로 억제하는 지 분석하기 위하여, 15개월령의 렛트를 대상으로 울릉국화 추출물 처리 농도에 따른 염증 단백질 발현량을 측정하였다. 음성대조군으로는 5개월령의 렛트를 사용하였으며, 양성대조군으로는 15개월령의 렛트를 사용하였다. 실험군으로는 울릉국화 추출물을 1주동안 매일 3회 0.2 mg/kg의 용량을 투여한 군과 1주동안 매일 3회 1 mg/kg의 용량을 투여한 군으로 나누어 실험을 진행하였다. 각 군에 대하여 총 6마리의 실험 렛트가 사용되었으며, 결과값은 평균값으로 도시하였다.

염증 단백질의 발현량을 측정하기 위하여, 일정량의 단백질이 포함된 조직 균질액을 준비하고, 겔 로딩 버퍼(0.125M Tris-HCl (pH 6.8), 4% SDS, 10% 2-mercaptoethanol, 0.2% bromophenol blue)를 혼합한 후 80로 5분간 가열하였다. 각각의 샘플을 6~10% SDS-폴리아크릴아마이드 미니-겔에서 2시간 동안 110V로 전기영동시켰다. 토우빈 버퍼(25mM Tris-HCl, 192mM glycin, 20% Methanol)를 이용하여 PVDF(polyvinylidene difluoride) 멤브레인에 단백질을 이동시킨 후, 1차 항체와 실온에서 5 시간 반응시켰다. 세척 버퍼로 3회 세척하고 horseradish - 퍼옥시데이즈가 결합된 2차 항체와 실온에서 30분 반응시켰다. 세척 버퍼로 3회 세척 한 후 ECL 탐지 물질을 가하여 생성되는 인광을 화학발광(Chemiluminescence) 이미징 시스템(Davinch-chemi, I-point, 대한민국)으로 촬영하여 신호를 확인하였다(Habib A 등, 1993).

그 결과, 도 7에서 보이는 바와 같이, 노화된 렛트에서는 134의 결과값이 나타났지만, 울릉국화 추출물을 0.2 mg/kg씩 투여한 군에서는 약 110의 결과값이 도출되었고, 1mg/kg씩 투여한 군에서는 약 78의 결과값이 도출되었다. 즉, 염증발현 관련 물질인 NF-κB의 전사가 울릉국화 추출물의 농도 의존적으로 억제됨을 확인할 수 있었다.

또한, 도 8에 보이는 바와 같이, 울릉국화 추출물이 염증 발현 관련 단백질인 COX-2와 iNOS 또한 효과적으로 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 특히, COX-2의 단백질 발현량에 있어서는 어린 5개월령의 rat에서의 COX-2 발현량보다 현저히 낮은 발현량을 보이고 있다(도 8 C참조). 이는 울릉국화 추출물이 효과적인 염증성 질환의 개선제 또는 치료제가 될 수 있음을 시사한다.

1. 세포 배양

사람 혈관내피세포 (Human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)는 10% 우태아혈청 및 1% 항생제가 포함된 혈관내피세포 배양배지 (FGM-2, Lonza, 스위스)을 이용하여 직경 100 mm 배양접시에 세포를 1 x 10⁵개로 분주한 후, 37의 5% 이산화탄소 배양기에서 배양하였다. 배양접시의 바닥에 80~90% 정도 세포가 자라면, 2.5 x 트립신-EDTA 용액(Lonza, 스위스)을 처리하여 세포를 분리한 후, 계대 배양하였다. 이 때 상기 배양은 EGM-2 배양액을 사용하였다.

PD= log₂F/log₂I (F=마지막 세포수, I=처음 세포수)

2. 세포 노화 유도 및 울릉국화 추출물 처리

상기 실시예 2-1과 같은 방법으로, 직경 100 mm 배양접시에 HUVEC(Human umbilical vein endothelial cell)을 150,000개 분주하고, 3일간 37, 5% 이산화탄소배양기에서 배양한 후, 세포 배양액을 제거하고, 세포를 1% 항생제가 포함된 EMDM배양액으로 2회 세척한 후, 0.5 μM 독소루비신을 4시간 처리하였다.

독소루비신 0.5 μM을 4시간 처리한 세포를 50ml 튜브에 10% 우태아혈청 및 1% 항생제가 포함된 EGM-2 배양액에 HUVEC 5,000개/ml이 되도록 하고 96웰 배양용기의 각 웰에 100 μl씩 분주하였다. 최종적으로 각 웰당 HUVEC 500개를 분주하고, 하루 동안 37, 5% 이산화탄소배양기에서 배양하였다. 각 웰에 1% 항생제가 포함된 EGM-2 배양액을 100 μl씩 더 넣어 준 후, 상기 실시예의 울릉국화 추출물을 처리하였다. 울릉국화 추출물은 20 μ/ml를 처리하였다. 이후 3일간 배양하여 SA-β-gal 염색을 실시하였다.

3. SA-β-갈락토시다아제 활성 염색

울릉국화 추출물을 3일 동안 처리한 후, 세포를 인산완충액으로 2번 세척하고, 3.7% 파라포름알데하이드로 세포를 1분간 고정한 후, 고정액을 제거하였다. SA-β-gal 염색 용액(40 mM citric acid/phosphate [pH 5.8], 5 mM potassium ferrocyanide, 5 mM potassium ferricyanide, 150 mM NaCl, 2 mM MgCl2, X-gal 1 mg/ml)을 24웰 배양용기에는 500μl를 넣어 준 후, 은박지로 싸서 37에서 18시간 동안 반응시켰다. 인산완충용액 (PBS)으로 2번 세척한 후 인산완충용액으로 2회 세척 한 후, 광학현미경으로 파란색으로 염색된 세포를 관찰하였다. SA-β-gal 활성 정도는 총 50개의 세포 중에서 세포질에 파란색으로 염색된 세포 수를 측정하여 DMSO 처리군을 100%로 하고, 울릉국화 추출물 처리군의 결과는 DMSO 처리군에 대한 백분율(%)로 표시하였다. 이러한 실험결과는 표 5 또는 도 6에 평균 ± 편차로 나타내었으며, 통계적 유의성은 Student's t-test 방법에 의해 결정하였다.

<비교예 1> 여러 구절초 추출물의 세포노화저해효과 확인

산구절초, 서흥구절초, 포천구절초를 사용한 점을 제외하고는 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 상기 구절초의 추출물을 제조 및 처리하여 실험하였다.

이 때, 울릉국화 추출물, 산구절초, 서흥구절초 및 포천구절초는 각각 DZ, G2, G3 및 G4로 나타냈다.

실험군 및 대조군	섬유아세포에서 SA-β-gel staining(%)
음성 대조군(Doxo 0.5μM + DMSO)	76.5 ± 6.3
양성 대조군(Doxo 0.5μM + 5mM NAC)	49.0 ± 3.9
Doxo 0.5 μM + 울릉국화 20 μg/ml	61.2 ± 3.1
Doxo 0.5 μM + 산구절초 20μg/ml	62.3 ± 6.2
Doxo 0.5 μM + 서흥구절초 20 μg/ml	61.4 ± 4.0
Doxo 0.5 μM + 포천구절초 20 μg/ml	66.9 ± 3.4

그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, 울릉국화 추출물은 포천구절초 추출물과 비교하여 약 5%p 내지 7%p 증가된 세포노화저해 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다. 즉, 울릉 국화 추출물은 산구절초, 서흥구절초, 포천구절초 추출물에 비해 세포노화저해 효능이 우수한 것을 확인할 수 있다.

< 제제예 1> 산제의 제조

울릉국화 추출물 60 mg, 유당 100 mg 및 탈크 10 mg을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

< 제제예 2> 정제의 제조

울릉국화 추출물 10 mg, 옥수수전분 100 mg, 유당 100 mg 및 스테아린산 마그네슘 2 mg을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

< 제제예 3> 캡슐제의 제조

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 울릉국화 추출물 10 mg, 옥수수전분 100 mg, 유당 100 mg 및 스테아린산 마그네슘 2 mg을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

< 제제예 4> 주사제의 제조

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플(2 ml)당 울릉국화 추출물 10 mg, 주사용 멸균 증류수 적량 및 pH 조절제 적량을 포함하여 제조하였다.

< 제제예 5> 액제의 제조

통상의 액제의 제조방법에 따라 적량의 정제수에 울릉국화 추출물 20 mg, 이성화당 10 g 및 만니톨 5 g을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 후 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체 100 ml로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조하였다.

이하, 본 발명의 울릉국화 추출물을 포함하는 건강기능식품의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

< 제제예6 > 건강기능식품의 제조

울릉국화 추출물 40 mg, 비타민 혼합물 적량(비타민 A 아세테이트 70 μg, 비타민 E 1.0 mg, 비타민 B₁ 0.13 mg, 비타민 B₂ 0.15 mg, 비타민 B₆ 0.5 mg, 비타민 B₁₂ 0.2 ㎍, 비타민 C 10 mg, 비오틴 10 μg , 니코틴산아미드 1.7 mg, 엽산 50 μg, 판토텐산 칼슘 0.5 mg) 및 무기질 혼합물 적량(황산제1철 1.75 mg, 산화아연 0.82 mg, 탄산마그네슘 25.3 mg, 제1인산칼륨 15 mg, 제2인산칼슘 55 mg, 구연산칼륨 90 mg, 탄산칼슘 100 mg, 염화마그네슘 24.8 mg)을 혼합한 다음 과립을 제조하고 통상의 방법에 따라 건강식품을 제조하였다.

Claims

줄기, 잎 및 꽃으로 이루어지는 울릉국화(Dendranthema zawadskii var. lucidum)의 지상부를 물, 알코올, 에틸아세테이트, 클로로포름 및 헥산으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 용매로 추출한 추출물을 유효성분으로 포함하는 독소루비신(doxorubicin)으로 인한 세포노화 억제용 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 울릉국화 추출물은 SA-β-갈락토시다아제 활성을 저해하여 주름개선 및 피부 탄력 개선 효과를 가지는 것을 특징으로 하는 독소루비신(doxorubicin)으로 인한 세포노화 억제용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 울릉국화 추출물은 독소루비신(doxorubicin)으로 인한 섬유아세포(human dermal fibroblasts, HDFs)의 노화를 저해하는 것을 특징으로 하는 독소루비신(doxorubicin)으로 인한 세포노화 억제용 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 조성물은 울릉국화 추출물을 2 내지 10 μg/ml 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는 독소루비신(doxorubicin)으로 인한 세포노화 억제용 조성물.
제1항, 제3항, 제4항 및 제6항 중 어느 한 항에 따른 울릉국화 추출물을 유효성분으로 함유하는 독소루비신(doxorubicin)으로 인한 세포노화 억제용 조성물을 포함하는 독소루비신(doxorubicin)으로 인한 세포노화 억제용 건강기능식품.
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