KR101472006B1

KR101472006B1 - 수리취 추출물을 포함하는 세포노화 억제용 조성물

Info

Publication number: KR101472006B1
Application number: KR1020130025136A
Authority: KR
Inventors: 이승은; 김금숙; 노형준; 이정훈; 최재훈; 이대영; 김승유; 성정숙; 장인복; 김재룡
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2013-03-08
Filing date: 2013-03-08
Publication date: 2014-12-12
Also published as: KR20140111184A

Abstract

본 발명은 수리취 추출물을 포함하는 세포노화 억제용 조성물에 관한 것으로, 세포노화 억제 효능이 우수한 수리취 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물은 노화 관련 질환, 예를 들어 피부노화, 류마티스성 관절염, 골관절염, 간염, 만성 피부손상 조직, 동맥경화, 전립샘 증식증 또는 간암 등과 같은 질환의 예방에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

수리취 추출물을 포함하는 세포노화 억제용 조성물 {Composition comprising extract of surichui for inhibiting cell aging}

본 발명은 수리취 추출물을 포함하는 세포노화 억제용 조성물에 관한 것으로, 노화 관련 질환에 유용하게 사용될 수 있는 수리취 추출물을 포함하는 세포노화 억제용 조성물에 관한 것이다.

노화를 지연시켜 퇴행성질환이 발병하지 않고 건강하게 질병 없이 오래 사는 것은 모든 사람의 바람으로 노화를 억제시키는 물질을 찾는 노력은 과거부터 현재까지도 계속해서 진행되고 있다. 노화를 촉진시키는 원인의 하나로 슈퍼옥사이드, 과산화수소, 수산화기 및 일중항산소와 같은 활성산소종들에 의한 산화 작용을 들 수 있다. 활성산소종들의 대사산물로 생성된 자유기(free radical)들이 생체 내에서 단백질, 생체막, DNA 등에 작용하여 산화적 손상을 주는데, 이들 작용을 억제시키기 위해서 항산화 성분에 대해 많은 연구가 이루어졌고, 항산화 작용을 갖는 새로운 소재를 탐색하기 위한 연구가 국내외에서 활발 하게 이루어 지고 있다. 그러나 노화현상은 산화에 의해서만 이루어지는 것이 아니고 텔로미어, 세포복제능력, 유전자손상 및 회복능력 등 수많은 요인에 의해서 영향을 받는 것으로 알려져 있기 때문에 천연물 및 약제의 항산화 효과가 아닌 노화억제능력을 평가를 위해서는 세포의 노화를 이용하는 방법이 필요하다.

세포노화는 정상 체세포가 일정 횟수 분열한 후 더 이상 분열하지 못하는 현상으로, 개체 및 조직의 노화에 기여하며, 세포의 비정상적인 증식과 암 형성을 억제하는 중요한 기전이다. 세포노화는 반복되는 체세포의 분열로 인해 염색체의 끝 부분인 텔로미어가 짧아지므로 생기거나, 암유전자 또는 암억제 유전자의 활성 증가, 과다한 산화스트레스, 자외선이나 방사선 조사, 항암제와 같은 세포독성 물질, 염증반응 등에 의해서도 생긴다.

노화된 세포는 모양이 커지고, 편평해지며, 핵에 이질염색질이 증가하고, 세포질에 공포가 많아지는 형태학적 특징과 함께, SA-β-gal (senescence-associated β-galatosidase) 활성이 증가하며, p53, p16INK4, p21과 같은 세포성장을 억제하는 단백질들의 양이 많아지고, 인슐린양성장인자 결합단백질 (insulin-like growth factor binding proteins; IGFBPs), 인터루킨-6 (interleukin-6), 전환성장인자-β (transforming growth factor-β;TGF-β), 인터페론 (interferon)과 같은 여러 가지 염증 단백질들을 분비한다.

세포노화는 단순히 개체나 조직의 노화에 기여할 뿐만 아니라, 여러 가지 다양한 질병의 병인에 중요한 역할을 한다. 노화세포는 류마티스성 관절염, 골관절염, 간염, 만성 피부손상 조직, 동맥경화 혈관조직 등과 같은 염증성 병변 조직에서 많이 관찰된다. 또한, 전립샘 증식증과 간염, 간암 등에서도 세포노화 현상이 관찰된다.

이와 같이 노화세포가 축적되면 노화세포는 잘 분열하지 못하므로 손상된 조직이 적절히 복구되지 못할 뿐만 아니라, 주위 조직을 분해하는 효소나 염증성 싸이토카인 등을 분비하므로 조직의 손상을 가속시키므로, 노화와 관련된 질병의 병인에 기여한다.

세포성 노화가 노화의 필수 원인 요소인 것으로 여겨지기 때문에, 세포성 노화를 지연시키는 방법을 개발하려는 노력이 있어왔다. 그 중에서 세포노화를 조절할 수 있는 물질을 탐색하여, 이를 질병의 예방과 치료에 활용하고자 하는 연구가 일부 보고되고 있다.

세포노화를 조절하는 것으로 알려진 물질로는 SIRT1 활성을 증가시키는 것으로 알려진 붉은 포도주에 많이 들어 있는 레스베라트롤(resveratrol), 각질세포 (keratinocyte) 에서 세포성 노화를 지연시키기 위한 레티노산의 용도 등이 대표적이다. 아울러 식물 추출물로부터 세포노화를 조절할 수 있는 물질을 동정하고 분리하여 화장품과 건강 기능성 식품 등에 활용하고자 하는 연구가 보고 되고 있다.

한편, 수리취속은 우리나라를　포함한 동아시아, 시베리아, 몽고에 분포하고, 특히, 수리취 (Synurus deltoides Aiton, Nakai)는 전국의 산지에 분포하고 있는 여러해살이 식물로서 초록색의 착색매체로 이용되는 식용색소로 사용되어왔던 식물이다. 예로부터 봄에 식용하며, 한방에서는 종창, 부종, 지혈, 토혈, 안태, 이뇨, 방광염 등에 이용하였으며 독특한 향취가 미각을 돋구며, 항산화 기능이 있는 초본식물로 알려져 왔다. 수리취에 대한 종래의 연구결과로 각종 변이들에 의해 유도된 돌연변이 원성에 대한 수리취 추출물의 억제작용, 삶는 방법에 따른 수리취의 이화학적 특성, 수리취 추출물의 항염증 효과 등이 있었으나, 수리취 추출물의 세포노화 억제 효능에 대한 결과는 보고된 바 없었다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 세포노화 억제 효능이 있는 생약 추출물을 연구하던 중 수리취 추출물의 우수한 세포노화 억제 효능을 발견하였는바 세포노화 억제 효능이 우수한 수리취 추출물을 유효성분으로 함유하는 세포 증식 향상용 및 SA-β-갈락토시다아제 활성 저해를 통한 세포노화 억제용 조성물을 제공하고자 하는 목적이 있다.

상술한 과제를 해결하기 위하여 본 발명은,

수리취속(Synurus)에서 선택된 어느 하나 이상의 수리취로부터 추출한 수리취 추출물을 유효성분으로 함유하는 세포 증식 향상용 및 SA-β-갈락토시다아제 활성 저해를 통한 세포노화 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 추출물은 수리취(Synurus deltoides (Aiton) Nakai)로부터 추출할 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 추출물은 수리취 지상부로부터 추출할 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 수리취 추출물은 SA-β-갈락토시다아제 활성을 저해할 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 수리취 추출물은 혈관내피세포(HUVEC)의 노화를 저해할 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 수리취 추출물은 물, 알코올, 에틸아세테이트, 클로로포름 및 헥산으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 용매로 추출할 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 조성물은 수리취 추출물을 70 내지 130μg/ml 농도로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상술한 수리취 추출물을 유효성분으로 함유하는 세포 증식 향상용 및 SA-β-갈락토시다아제 활성 저해를 통한 세포노화 억제용 조성물을 포함하는 건강기능식품을 제공한다.

또한, 본 발명은 상술한 수리취 추출물을 유효성분으로 함유하는 세포 증식 향상용 및 SA-β-갈락토시다아제 활성 저해를 통한 세포노화 억제용 조성물을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상술한 수리취 추출물을 유효성분으로 함유하는 세포 증식 향상용 및 SA-β-갈락토시다아제 활성 저해를 통한 세포노화 억제용 조성물을 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 세포노화 억제 효능이 우수한 수리취 추출물을 포함하는 세포노화 억제용 조성물은 노화 관련 질환, 예를 들어 피부노화, 류마티스성 관절염, 골관절염, 간염, 만성 피부손상 조직, 동맥경화, 전립샘 증식증 또는 간암 등과 같은 질환의 예방에 유용하게 사용될 수 있다.

도1은 섬유아세포(HDF) 및 혈관내피세포(HUVEC)에서의 MTT 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도2는 혈관내피세포(HUVEC)에서의 SA-β-gal 활성 억제능을 평가한 광학현미경 관찰사진 및 그래프이다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

상술한 바와 같이 수리취는 종래에 각종 변이들에 의해 유도된 돌연변이 원성에 대한 수리취 추출물의 억제작용, 삶는 방법에 따른 수리취의 이화학적 특성, 수리취 추출물의 항염증 효과 등이 알려졌으나, 수리취 추출물의 세포노화 억제 효능에 대한 결과는 보고된 바 없었다.

이에 본 발명에서는 수리취속(Synurus)에서 선택된 어느 하나 이상의 수리취로부터 추출한 수리취 추출물을 유효성분으로 함유하는 세포 증식 향상용 및 SA-β-갈락토시다아제 활성 저해를 통한 세포노화 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명에서는 상기 수리취 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물에 대해 MTT 분석법을 실시하여 세포독성이 없고, 세포 생존력이 증가한 것을 확인하였으며, SA-β-갈락토시다아제(Senescence-associated β-galactosidase) 활성이 저해되는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해 수리취 추출물이 직접적으로 세포노화를 억제하는 효능을 가진 것을 확인할 수 있었다.

상기 수리취속(Synurus) 식물의 종으로는 수리취(Synurus deltoides (Aiton) Nakai), 큰　수리취(S. excelsus Kitam.), 국화수리취（S. palmatopinnatifidus Kitam. var.plamatopinnatifidus）등이 있으며, 이들의 단독 또는 혼합 형태의 수리취 추출물일 수 있고, 보다 바람직하게는 수리취(Synurus deltoides (Aiton) Nakai) 추출물이 세포노화 억제에 가장 효과적일 수 있다.

상기 수리취 추출물은 수리취 지상부로부터 추출하는 것이 바람직한데 지상부(地上部)란, 식물체에서 뿌리부분이 아닌 위의 경엽 부분을 의미한다. 어린잎은 식용으로 사용이 가능하고, 지상부는 약용으로 사용이 가능하나 식용여부는 확인되지 않고 있고 이외의 다른 부위에 대한 안전성은 확인되지 않고 있어 이점을 고려하여 사용하는 것이 바람직하다.

상기 수리취 추출물은 물, 알코올, 에틸아세테이트, 클로로포름 또는 헥산 등의 단독 또는 혼합 형태인 용매로 추출할 수 있으며, 보다 바람직하게는 C_1~4의 저급 알코올을 사용할 수 있다. 상기 용매를 이용한 일반적인 용매 추출법을 적용하여 추출할 수 있으며, 또한 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 정제한 분획물일 수도 있다. 본 발명에 따른 추출물의 제조방법은 본 기술분야에 속하는 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 식물 추출방법을 모두 적용할 수 있으며, 예컨대 물, 알코올 또는 혼합용매에 의한 추출, 중탕이나 상온에 의한 추출법 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

이와 같이 추출된 수리취 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물은 섬유아세포(HDF), 혈관내피세포(HUVEC) 등의 세포에서 세포독성을 나타내지 않고, 세포의 증식을 유의하게 증가시켰으며, SA-β-갈락토시다아제(Senescence-associated β-galactosidase) 활성을 저해시켜 세포노화를 억제하였다. 특히, 상기 수리취 추출물은 혈관내피세포(HUVEC)에서 현저히 우수한 세포노화 억제 효능을 보이는 것을 확인할 수 있다. (표2 및 도2 참조)

본 발명의 세포 증식 향상용 및 SA-β-갈락토시다아제 활성 저해를 통한 세포노화 억제용 조성물은 상기 수리취 추출물을 70 내지 130μg/ml의 농도로 포함할 수 있다. 상기 조성물의 용매로는 수리취 추출물의 세포노화 억제 효과를 방해하지 않는 것이라면 특별히 제한되지 않으나, 보다 바람직하게는 물, 에탄올, 프로필 알코올, DMSO 등일 수 있다. 상기 수리취 추출물 조성물의 농도가 70 μg/ml 미만일 경우 SA-β-갈락토시다아제 활성 저해 효과가 미흡하여 세포노화 억제 효능이 떨어지며, 130 μg/ml를 초과할 경우 농도 증가로 인한 효능의 향상이 적어 효율이 떨어지는 문제점이 있을 수 있다. 세포독성 효과가 없으면서 우수한 세포노화 억제 효능을 나타내는 수리취 추출물 조성물의 농도는 보다 바람직하게는 90 내지 110 μg/ml일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 수리취 추출물을 유효성분으로 함유하는 세포 증식 향상용 및 SA-β-갈락토시다아제 활성 저해를 통한 세포노화 억제용 조성물을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

상기 약학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 수리취 추출물을 유효성분으로 함유하는 세포 증식 향상용 및 SA-β-갈락토시다아제 활성 저해를 통한 세포노화 억제용 조성물을 포함하는 약학적 조성물은 여러 가지 제형으로 제제화 할 수 있다. 제제화 할 경우에는 통상적으로 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제 및 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제제화할 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 및 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 수리취 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제(예를 들면, 전분, 수크로스, 락토오스 및 젤라틴) 등이 섞여 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등을 들 수 있는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함될 수 있다. 비수용성용제와 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 글리세롤 및 젤라틴 등이 사용될 수 있다.

상기 약학적 조성물의 투여량은 대상의 연령, 성별, 상태, 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 병용되는 약물에 따라 달리 적용될 수 있다. 부작용이 없이 사용될 수 있는 1일 투여량은 0.1 내지 100mg/㎏의 양을 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다.

본 발명의 수리취 추출물을 유효성분으로 함유하는 세포 증식 향상용 및 SA-β-갈락토시다아제 활성 저해를 통한 세포노화 억제용 조성물을 포함하는 약학적 조성물을 인체에 투여하는 경우, 천연 추출물인 관계로 다른 합성 의약품에 비하여 부작용의 우려가 적어 안심하고 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 수리취 추출물을 유효성분으로 함유하는 세포 증식 향상용 및 SA-β-갈락토시다아제 활성 저해를 통한 세포노화 억제용 조성물을 포함하는 건강기능식품을 제공한다. 본 발명의 수리취 추출물을 유효성분으로 함유하는 세포노화 억제용 조성물을 포함하는 건강기능식품의 종류는 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등일 수 있다.

상기 건강식품은 상기 수리취 추출물 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 수리취 추출물을 유효 성분으로 함유하는 세포노화 예방용 음료는 수리취 추출물이 유효성분으로 포함되는 것 이외에 칼슘, 가시오가피 농축액, 액상과당, 정제수 등을 첨가 혼합하여 드링크용 병에 충진하여 살균한 후 실온으로 냉각하여 음료를 제조할 수 있다. 또한, 상기 수리취 추출물을 유효 성분으로 함유하는 세포노화 예방용 건강보조제는 수리취 추출물에 영양보조성분(비타민 B1, B2, B5, B6, E 및 초산에스테르, 니코틴산 아미드), 올리고당, 50% 에탄올, 정제수를 첨가 혼합하여 과립상으로 성형하여 진공건조기에서 건조시킨 후, 12~14 메쉬(mesh)를 통과시켜 균일하게 과립을 제조하여 적당량씩 압출 성형하여 정제 또는 분말로 하거나 경질캡슐에 충전하여 경질캡슐제품으로 제조할 수 있다.

상기 건강식품에 함유된 상기 수리취 추출물의 유효용량은 상기 약학조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으며, 유효성분의 혼합양은 예방 또는 치료적 처치 등의 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 수리취 추출물을 유효성분으로 함유하는 세포 증식 향상용 및 SA-β-갈락토시다아제 활성 저해를 통한 세포노화 억제용 조성물을 포함하는 화장료 조성물을 제공한다. 본 발명의 수리취 추출물을 유효성분으로 함유하는 세포노화 억제용 조성물을 포함하는 화장료 조성물에는 상기 수리취 추출물과 더불어 필요에 따라 통상 화장료에 배합되는 다른 성분을 배합할 수 있다. 이외에 첨가할 수 있는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.

상기 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 바람직하게는 피부외용연고, 세안제, 유연화장수, 영양화장수, 스킨, 로션, 영양로션, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 팩, 에멀젼, 오일젤 등의 제형일 수 있다.

상기 약학 조성물 및 건강기능식품은 세포노화 관련 질환을 치료하거나 예방할 수 있고, 특히 류마티스성 관절염, 골관절염, 간염, 만성 동맥경화, 전립샘 증식증, 간암 등의 질환을 예방하거나 치료하는데 유용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 화장료 조성물은 피부노화, 피부조직 손상 예방에 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기로 하지만, 하기 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니며, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로 해석되어야 할 것이다.

<실시예1>

1. 수리취 추출물 조성물의 제조

수리취(Synurus deltoides (Aiton) Nakai) 지상부를 2007년 8월 경기도 수원시 서둔동에서 채취하였으며, 이를 건조, 분쇄한 후 50℃조건의 가속용매추출장치에서 메탄올로 추출한 후 여과하였으며, 추출액 중의 용매는 감압농축장치를 이용해서 제거하고, 수분은 동결건조기에서 제거하여 실험에 사용하였다. 건조시료 100g으로부터 얻어진 추출물은 9.4g이었고, 수율은 9.4%였다.

얻어진 상기 수리취 추출물은 용매 DMSO에 100 μg/ml 농도로 녹여 수리취 추출물 조성물을 제조하였다.

2. 세포 배양

사람 섬유아세포(HDF)는 10% 우태아 혈청과 1% 항생제가 포함된 DMEM 배양액을 이용하여 직경100 mm 배양접시에 세포를 1 × 10⁵개로 분주한 후, 37℃의 5% 이산화탄소 배양기에서 배양하였다. 배양접시의 바닥에 80-90% 정도 세포가 자라면, 2.5 × 트립신-EDTA 용액을 처리하여 세포를 분리한 후, 계대 배양하였다. 제대혈관내피세포(HUVEC)는 EGM-2를 배양액으로 사용하여 같은 방법으로 세포를 배양하였다.

세포의 분열 횟수(population doubling, PD)는 다음 식으로 조사하였다.

PD= log₂F/log₂I (F=마지막 세포수, I=처음 세포수)

실험에 사용한 세포들은 분열횟수가 사람 섬유아세포의 경우 40회, 제대혈관내피세포는 30회 이하의 것을 사용하였다.

<실시예2>

수리취 추출물을 용매 DMSO에 10 μg/ml 농도로 녹여 수리취 추출물 조성물을 제조한 것을 제외하고는 실시예1과 동일하게 실시하여 제조하였다.

<실험예1> 세포 독성 측정

1. 세포 배양 및 수리취 추출물 처리

50ml tube에 10% 우태아 혈청과 1% 항생제가 포함된 DMEM 배양액에 섬유아세포는 5,000개/ml, EGM-2배양액에는 제대혈관내피세포가 10,000개/ml이 되도록 하고 96well 배양용기의 각 well에 100 μl씩 분주하였다. 최종적으로 각 well당 섬유아세포는 500개, 제대혈관내피세포는 1,000개씩 분주하고, 하루 동안 37℃, 5% 이산화탄소배양기에서 배양하였다. 각 well에 10% 우태아 혈청과 1% 항생제가 포함된 DMEM 배양액과 EGM-2배양액을 100 μl씩 더 넣어 준 후, 상기 실시예의 수리취 추출물 조성물을 처리하였다.

한편, 음성 대조군으로 용매인 dimethyl sulfoxide(DMSO)를 처리하였으며, 양성 대조군으로 5mM N-acetylcysteine 및 500mM Rapamycin 을 처리하였다.

2. MTT 분석

상기 처리 후 3일 동안 37℃, 5% 이산화탄소배양기에서 배양한 후, 세포의 성장 정도를 MTT 방법으로 확인하였다. 96 well 배양용기의 각 well에 0.1% MTT(3-(4, 5-dimethylthiazol-2yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide) 용액을 50 μl씩 넣고 3시간 동안 37℃, 5% 이산화탄소배양기에서 반응시키고, 배양액과 MTT용액을 제거한 후 dimethyl sulfoxide 100 μl를 첨가하여 형성된 결정을 녹여 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 시료를 처리하지 않은 대조실험결과에 대한 백분율 (%)로 표시한 결과를 표1 및 도1에 나타내었다.

<실험예2> SA-β-갈락토시다아제 활성 염색을 통한 세포노화 저해능 평가

1. 아드리아마이신에 의한 세포노화 유도

아드리아마이신은 항암제의 일종으로 높은 농도에서는 세포를 죽이지만, 낮은 농도에서는 세포노화를 유도하는 것으로 알려져 있다. 직경 100 mm 배양접시에 사람 제대혈관내피세포를 1.5 × 10⁵개 분주하고 3일간 37℃ 5% 이산화탄소배양기에서 배양한 후, 세포 배양액을 제거하고 세포를 1% 항생제가 포함된 DMEM 배양액으로 2회 세척한 후, 500 nM 아드리아마이신을 4시간 처리하였다.

2. 세포 배양 및 수리취 추출물 처리

아드리아마이신을 4시간 처리한 세포들을 트립신-EDTA로 배양접시에서 분리하여 24well 배양용기에 세포를 분주하였다. 50 ml tube에 10% 우태아 혈청과 1% 항생제가 포함된 EGM-2배양액에는 제대혈관내피세포를 넣어 배양용기의 각 well에 분주하였다. 최종적으로 24well 배양용기에 제대혈관내피세포는 5000개씩 분주하고, 하루 동안 37℃, 5% 이산화탄소배양기에서 배양하였다. 각 well에 10% 우태아 혈청과 1% 항생제가 포함된 DMEM 배양액과 EGM-2배양액을 갈아준 후, 수리취 추출물 조성물을 처리하였다.

3. SA-β-갈락토시다아제 활성 염색

상기 처리 후 3일 동안 37℃, 5% 이산화탄소배양기에서 배양한 후, 세포노화 저해에 대한 수리취 추출물의 효과를 SA-b-gal 활성 염색으로 조사하였다. SA-β-gal 염색법으로 노화된 세포는 세포질이 파란색으로 염색된다.

수리취 추출물을 3일 동안 처리한 후, 세포를 인산완충액으로 2번 세척하고, 3.7% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 세포를 1분간 고정한 후, 고정액을 제거하였다. SA-b-gal 염색 용액(40 mM citric acid/phosphate [pH 5.8], 5 mM potassium ferrocyanide, 5 mM potassium ferricyanide, 150 mM NaCl, 2 mM MgCl₂, X-gal 1 mg/ml)을 24well 배양용기에는 500μl를 넣어 준 후, 은박지로 싸서 37℃에서 18시간 동안 반응시켰다. 인산완충용액 (PBS)으로 2번 세척한 후, 1% 에오진 용액으로 1분간 염색하고 결정이 생겼을 경우 DMSO로 결정을 녹여 제거하였다. 인산완충용액으로 2회 세척 한 후, 광학현미경으로 파란색으로 염색된 세포를 관찰하였다. SA-β-gal 활성 정도는 총 50~100개의 세포 중에서 세포질에 파란색으로 염색된 세포 수를 측정하여 백분율 (%)로 표시한 결과를 표2 및 도2에 나타내었다.

	Cell proliferation (%)
	섬유아세포(HDF)	혈관내피세포(HUVEC)
실시예1	127.2 ± 14.2	121.0 ±14.3
대조군(Cont)	100 ± 0	100 ± 0
DMSO	91.0 ± 8.9	86.2 ± 18.0
NAC	91.5 ± 10.4	102.3 ± 11.7
Rapamycin	90.6 ± 4.6	77.4 ± 3.2

섬유아세포 및 혈관내피세포에서 상기 실시예에 따른 수리취 추출물이 세포독성 효과를 나타내지 않았으며, 세포의 증식을 유의하게 증가시킨 것을 확인할 수 있다.

	SA-β-gal staining (%)
	혈관내피세포(HUVEC)
실시예1	55.0 ± 11.2
실시예2	71.4 ± 11.5
대조군(Cont)	84.9 ± 8.6
DMSO	84.4 ± 4.2
NAC	68.8 ± 7.5
Rapamycin	36.1 ± 17.9

실시예에 따른 수리취 추추물 조성물이 우수한 SA-β-gal 활성 감소를 보여 세포노화 억제 효능이 우수한 것으로 나타났다.

이하, 본 발명의 수리취 추출물을 함유하는 약학 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

<제제예 1> 산제의 제조

수리취 추출물 300 mg, 유당 100 mg 및 탈크 10 mg을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

<제제예 2> 정제의 제조

수리취 추출물 50 mg, 옥수수전분 100 mg, 유당 100 mg 및 스테아린산 마그네슘 2 mg을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

<제제예 3> 캡슐제의 제조

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 수리취 추출물 50 mg, 옥수수전분 100 mg, 유당 100 mg 및 스테아린산 마그네슘 2 mg을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

<제제예 4> 주사제의 제조

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플 당(2㎖) 수리취 추출물 50 mg, 주사용 멸균 증류수 적량 및 pH 조절제 적량을 함유하여 제조하였다.

<제제예 5> 액제의 제조

통상의 액제의 제조방법에 따라 적량의 정제수에 수리취 추출물 100 mg, 이성화당 10 g 및 만니톨 5 g을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 후 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조하였다.

이하, 본 발명의 수리취 추출물을 함유하는 건강기능식품의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

<제제예6> 건강기능식품의 제조

수리취 추출물 200 ㎎, 비타민 혼합물 적량(비타민 A 아세테이트 70 ㎍, 비타민 E 1.0 ㎎, 비타민 B 1 0.13 ㎎, 비타민 B 2 0.15 ㎎, 비타민 B 6 0.5 ㎎, 비타민 B 12 0.2 ㎍, 비타민 C 10 ㎎, 비오틴10 ㎍, 니코틴산아미드 1.7 ㎎, 엽산 50 ㎍, 판토텐산 칼슘 0.5 ㎎) 및 무기질 혼합물 적량(황산제1철 1.75 ㎎, 산화아연 0.82 ㎎, 탄산마그네슘 25.3 ㎎, 제1인산칼륨 15 ㎎, 제2인산칼슘 55 ㎎, 구연산칼륨 90 ㎎, 탄산칼슘 100 ㎎, 염화마그네슘 24.8 ㎎)을 혼합한 다음 과립을 제조하고 통상의 방법에 따라 건강식품을 제조하였다.

이하, 본 발명의 수리취 추출물을 함유하는 화장료 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

<제제예7> 에센스의 제조

에틸 알코올 4.00 중량%

메틸 파라벤 0.10 중량%

향 0.10 중량%

수소처리된 캐스터 오일 0.60 중량%

DL-α-토코페릴 아세테이트 0.02 중량%

글리세린 5.00 중량%

1,3-부틸렌 글리콜 3.00 중량%

하이드록시 에틸 셀룰로오스 0.20 중량%

잔탄검 0.40 중량%

E.D.T.A-2Na 0.02 중량%

피쉬-콜라겐 4.00 중량%

수리취 추출물 조성물 0.5~2.0 중량%

증류수 잔량

<제제예8> 클렌징폼의 제조

스테아린산 6.5 중량%

미리스틴산 28.0 중량%

자기유화형 모노스테아린산 글리세린 3.0 중량%

프로필렌 글리콜 5.0 중량%

농글리세린 10.0 중량%

수산화나트륨 7.0 중량%

에틸렌디아민테트라초산나트륨 0.1 중량%

수리취 추출물 조성물 15.0 중량%

향료 미량

정제수 잔량

Claims

수리취속(Synurus)에서 선택된 어느 하나 이상의 수리취로부터 추출한 수리취 추출물을 유효성분으로 포함하는 세포 증식 향상용 및 SA-β-갈락토시다아제 활성 저해를 통한 세포노화 억제용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 추출물은 수리취(Synurus deltoides (Aiton) Nakai)로부터 추출한 것을 특징으로 하는 세포 증식 향상용 및 SA-β-갈락토시다아제 활성 저해를 통한 세포노화 억제용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 추출물은 수리취 지상부로부터 추출한 것을 특징으로 하는 세포 증식 향상용 및 SA-β-갈락토시다아제 활성 저해를 통한 세포노화 억제용 조성물.
삭제
제1항에 있어서,
상기 수리취 추출물은 혈관내피세포(HUVEC)의 노화를 저해하는 것을 특징으로 하는 세포 증식 향상용 및 SA-β-갈락토시다아제 활성 저해를 통한 세포노화 억제용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 수리취 추출물은 물, 알코올, 에틸아세테이트, 클로로포름 및 헥산으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 용매로 추출한 것을 특징으로 하는 세포노화 억제용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 수리취 추출물을 70 내지 130μg/ml 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 증식 향상용 및 SA-β-갈락토시다아제 활성 저해를 통한 세포노화 억제용 조성물.
삭제
삭제
제1항 내지 제3항 및 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 세포 증식 향상용 및 SA-β-갈락토시다아제 활성 저해를 통한 세포노화 억제용 조성물을 포함하는 화장료 조성물.