KR101244752B1 - 피부 미백, 노화 방지, 항산화 및 항균성 화장료 조성물 - Google Patents

피부 미백, 노화 방지, 항산화 및 항균성 화장료 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 국화과 식물인 구절초, 학슬, 희렴, 한련초의 추출물을 포함하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 구절초 에탄올 추출물을 포함하고, 학슬, 희렴, 한련초의 메탄올 추출물 또는 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올, 물 분획 추출물로 이루어진 군에서 선택된 추출물을 더 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따르면 부작용이 적으며 항산화, 항균, 항주름, 피부미백, 자외선 차단 효과를 나타내는 화장료를 제조할 수 있다.

Description

피부 미백, 노화 방지, 항산화 및 항균성 화장료 조성물{Cosmetic ingredient containing whitening, anti-aging, anti-oxidation and anti-microbial activities}
본 발명은 피부 미백, 노화 방지, 항산화 및 항균성 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 구절초 에탄올 추출물을 포함하고, 학슬, 희렴, 한련초의 메탄올 추출물 또는 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올, 물 분획 추출물로 이루어진 군에서 선택된 추출물을 더 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.
생체 내에서 에너지 생산을 위한 산화과정 중에 상당량의 활성산소들이 생성된다. 이들 활성산소는 생체 내 제거기작에 의해 대부분 소멸되지만 순간적으로 활성산소가 다량으로 발생되거나 만성적으로 활성산소가 발생되어 항산화방어계와의 균형이 깨지면 각종 질환의 원인이 된다. 활성산소의 독성을 억제하기 위한 항산화성 물질로는 아스코르빈산, 토코페롤, 카로티노이드, 플라보노이드, 단백질, 인지질 등의 천연 항산화제와 butylated hydroxy anisol(BHA) 및 butylated hydroxy toluene(BHT) 등 합성 항산화제가 있다. 천연 항산화제들은 항산화력이 비교적 낮고, 합성 항산화제의 경우 생체 효소 및 지방의 변이원성과 독성으로 인체에 암을 유발할 수 있다는 보고가 있어, 보다 안전하고 효력이 강한 항산화제의 연구가 요구되고 있고, 현재 산화반응을 억제하는 항산화물질에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다.
한편, 천연물 특히 약용식물이나 허브를 중심으로 한 미백효과, 노화 억제 및 자외선 차단 기능을 가진 기능성화장품의 개발이 활발히 이루어지고 있다. 피부노화 현상은 여러 가지 구조적, 기능적 변화를 보이는데 특히 나이, 자외선 등 내외적인 여러 가지 스트레스는 피부의 탄력성과 윤택성을 감소시키고 기미, 주근깨 등 피부 색소를 침착시켜 주름이 생기게 하는 등 피부노화 현상을 촉진한다. 자연계에 널리 존재하는 페놀류의 고분자 천연 색소인 멜라닌은 피부에서 세포내의 tyrosinase라는 효소의 생합성 과정에서 만들어지며, 자외선, 건조, 극한 온도 등에 대한 피부의 저항력을 높여주지만, 과도한 멜라닌 생성은 인체에 기미, 주근깨, 검버섯 등과 같은 색소 침착을 일으키고, 피부의 노화를 촉진시킨다. 그러므로 피부 노화의 주원인인 tyrosinase의 활성을 저하시킴으로써 피부노화를 억제할 수 있다.
본 발명자들은 이러한 상황을 토대로 하여 안전하고 효력이 강한 항산화제 및 피부 미백, 항균, 항주름, 자외선 차단 등의 효과를 나타내는 물질을 개발하여 화장품에 이용하고자 하였다.
대량으로 얻을 수 있는 장점과 한방에서 다양한 약리작용에 의해 오래전부터 사용되어온 국내전역에서 서식하며 식용 가능한 국화과의 식물을 대상으로 하여 항산화, 항균, 항주름, 피부미백, 자외선 차단 등의 효과 및 세포독성을 조사한 결과, 구절초, 학슬, 희렴 및 한련초의 각 추출물에서 우수한 효과를 확인하였고, 이를 화장품에 적용할 경우, 우수한 효과의 기능성 화장품을 제조할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 주된 목적은 부작용이 적으며 항산화, 항균, 항주름, 피부미백, 자외선 차단 효과를 나타내는 기능성 화장품을 제공하는데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 구절초(Chrysanthemum zawadskii var. latilobum)의 에탄올 추출물을 포함하고,
1) 학슬(Carpesium abrotanoides L.)을 메탄올과 물의 혼합액으로 추출한 다음 추출액을 건조시켜 제조한 추출물,
2) 상기 1)의 추출물을 헥산과 물의 혼합액에 용해시켜 혼합용액을 제조하고, 이 혼합용액을 헥산과 물 층으로 분리한 다음 헥산 층을 수득하고, 수득한 헥산 층에서 헥산을 제거하여 제조한 추출물,
3) 상기 2)의 혼합용액을 헥산과 물 층으로 분리한 다음 물 층을 수득하고, 수득한 물 층을 클로로포름과 혼합하여 혼합용액을 제조하고, 이 혼합용액을 클로로포름과 물 층으로 분리한 다음 클로로포름 층을 수득하고, 수득한 클로로포름 층에서 클로로포름을 제거하여 제조한 추출물,
4) 상기 3)의 혼합용액을 클로로포름과 물 층으로 분리한 다음 물 층을 수득하고, 수득한 물 층을 에틸아세테이트와 혼합하여 혼합용액을 제조하고, 이 혼합용액을 에틸아세테이트와 물 층으로 분리한 다음 에틸아세테이트 층을 수득하고, 수득한 에틸아세테이트 층에서 에틸아세테이트를 제거하여 제조한 추출물,
5) 상기 4)의 혼합용액을 에틸아세테이트와 물 층으로 분리한 다음 물 층을 수득하고, 수득한 물 층을 부탄올과 혼합하여 혼합용액을 제조하고, 이 혼합용액을 부탄올과 물 층으로 분리한 다음 부탄올 층을 수득하고, 수득한 부탄올 층에서 부탄올을 제거하여 제조한 추출물,
6) 상기 5)의 혼합용액을 부탄올과 물 층으로 분리한 다음 물 층을 수득하고, 수득한 물 층에서 수분을 제거하여 제조한 추출물,
7) 희렴(Siegesbeckia glabrescens)을 메탄올과 물의 혼합액으로 추출한 다음 추출액을 건조시켜 제조한 추출물,
8) 상기 7)의 추출물을 헥산과 물의 혼합액에 용해시켜 혼합용액을 제조하고, 이 혼합용액을 헥산과 물 층으로 분리한 다음 헥산 층을 수득하고, 수득한 헥산 층에서 헥산을 제거하여 제조한 추출물,
9) 상기 8)의 혼합용액을 헥산과 물 층으로 분리한 다음 물 층을 수득하고, 수득한 물 층을 클로로포름과 혼합하여 혼합용액을 제조하고, 이 혼합용액을 클로로포름과 물 층으로 분리한 다음 클로로포름 층을 수득하고, 수득한 클로로포름 층에서 클로로포름을 제거하여 제조한 추출물,
10) 상기 9)의 혼합용액을 클로로포름과 물 층으로 분리한 다음 물 층을 수득하고, 수득한 물 층을 에틸아세테이트와 혼합하여 혼합용액을 제조하고, 이 혼합용액을 에틸아세테이트와 물 층으로 분리한 다음 에틸아세테이트 층을 수득하고, 수득한 에틸아세테이트 층에서 에틸아세테이트를 제거하여 제조한 추출물,
11) 상기 10)의 혼합용액을 에틸아세테이트와 물 층으로 분리한 다음 물 층을 수득하고, 수득한 물 층을 부탄올과 혼합하여 혼합용액을 제조하고, 이 혼합용액을 부탄올과 물 층으로 분리한 다음 부탄올 층을 수득하고, 수득한 부탄올 층에서 부탄올을 제거하여 제조한 추출물,
12) 상기 11)의 혼합용액을 부탄올과 물 층으로 분리한 다음 물 층을 수득하고, 수득한 물 층에서 수분을 제거하여 제조한 추출물,
13) 한련초(Eclipta prostrata)를 메탄올과 물의 혼합액으로 추출한 다음 추출액을 건조시켜 제조한 추출물,
14) 상기 13)의 추출물을 헥산과 물의 혼합액에 용해시키고, 헥산과 물 층으로 분리한 다음 물 층을 수득하고, 수득한 물 층을 클로로포름과 혼합하여 혼합용액을 제조하고, 이 혼합용액을 클로로포름과 물 층으로 분리한 다음 클로로포름 층을 수득하고, 수득한 클로로포름 층에서 클로로포름을 제거하여 제조한 추출물,
15) 상기 14)의 혼합용액을 클로로포름과 물 층으로 분리한 다음 물 층을 수득하고, 수득한 물 층을 에틸아세테이트와 혼합하여 혼합용액을 제조하고, 이 혼합용액을 에틸아세테이트와 물 층으로 분리한 다음 에틸아세테이트 층을 수득하고, 수득한 에틸아세테이트 층에서 에틸아세테이트를 제거하여 제조한 추출물,
16) 상기 15)의 혼합용액을 에틸아세테이트와 물 층으로 분리한 다음 물 층을 수득하고, 수득한 물 층을 부탄올과 혼합하여 혼합용액을 제조하고, 이 혼합용액을 부탄올과 물 층으로 분리한 다음 부탄올 층을 수득하고, 수득한 부탄올 층에서 부탄올을 제거하여 제조한 추출물 및
17) 상기 16)의 혼합용액을 부탄올과 물 층으로 분리한 다음 물 층을 수득하고, 수득한 물 층에서 수분을 제거하여 제조한 추출물로 이루어진 군에서 선택된 추출물을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 미백, 노화 방지, 항산화 및 항균성 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 추출물을 제조하기 위해, 구절초, 학슬, 희렴, 한련초의 모든 부위를 사용할 수 있으나, 구절초의 경우 꽃이나 잎을 사용하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 꽃을 사용하는 것이 좋다.
본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 상기 구절초 에탄올 추출물은 구절초 꽃을 70 내지 90% 에탄올에 담가 상온에서 12 내지 36시간 추출한 다음, 추출액을 여과하여 고형물을 제거하고, 에탄올 및 수분을 제거하여 제조하는 것이 바람직하다.
본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 상기 1)추출물은 학슬 100중량부를 잘게 부수고, 3 : 1 내지 5 : 1 부피비의 메탄올과 물의 혼합액 600 내지 1000중량부와 혼합하여, 60 내지 70℃에서 1 내지 2일간 추출한 후 여과하여 수득한 추출액을 건조시켜 제조하는 것이 바람직하다.
본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 상기 7)추출물은 희렴 100중량부를 잘게 부수고, 3 : 1 내지 5 : 1 부피비의 메탄올과 물의 혼합액 600 내지 1000중량부와 혼합하여, 60 내지 70℃에서 1 내지 2일간 추출한 후 여과하여 수득한 추출액을 건조시켜 제조하는 것이 바람직하다.
본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 상기 13)추출물은 한련초 100중량부를 잘게 부수고, 3 : 1 내지 5 : 1 부피비의 메탄올과 물의 혼합액 600 내지 1000중량부와 혼합하여, 60 내지 70℃에서 1 내지 2일간 추출한 후 여과하여 수득한 추출액을 건조시켜 제조하는 것이 바람직하다.
본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 구절초의 에탄올 추출물을 포함하고, 상기 1) 내지 6)추출물에서 선택된 하나의 추출물, 상기 7) 내지 12)추출물에서 선택된 하나의 추출물, 상기 13) 내지 17)추출물에서 선택된 하나의 추출물을 더 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 구절초 에탄올 추출물을 포함하고, 상기 4)추출물, 10)추출물, 및 15)추출물을 더 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 상기 각 추출물의 농도가 0.1 내지 0.5중량%인 것이 바람직하다.
이하, 본 발명의 화장료 조성물을 보다 구체적으로 설명한다.
본 발명은 국화과 식물을 대상으로 여러 가지 용매로 추출 또는 분획하고, 이들의 항산화, 항균, 항주름, 피부미백, 자외선 차단 효과 등을 조사하여, 효과가 우수한 추출물을 포함시켜 화장료 조성물을 제조하는 것이라고 할 수 있다.
우선, 국화과 식물 중 구절초의 에탄올 추출물을 제조하였고, 이 추출물의 항균, 미백, 항주름 효과 등을 조사하였다.
먼저 HPLC(high performance liquid chromatography)를 이용하여 구절초 추출물에 포함되어 있는 페놀류 성분의 함량을 조사한 결과 3,4-디하이드로벤조산(3,4-dihydroxybenzoic acid)(154.384 ppm), 메틸 몰식자산염(methyl gallate)(86.715 ppm), 카페인산(caffeic acid)(453.065 ppm), 4-히드록시-3-메톡시벤조산(4-hydroxy-3-methoxybenzoic acid)(965.947 ppm), 시린지산(syringic acid)(214.776 ppm), 쿠마르산(p-coumaric acid)(41.465 ppm), 시냅산(sinapic acid)(172.194 ppm), 4-메톡시벤조산(4-methoxybenzoic acid)(1,315.751 ppm); 나린진(naringin)(56.440 ppm), 플라본(flavone)(856.867 ppm)을 함유하고 있는 것으로 나타났다(도 1 및 도 2 참조). 비록 많은 폴리페놀 성분들이 함유되어 있지는 않지만, 나린진의 경우 미백효과가 있는 것으로 알려져 있어 구절초 추출물의 미백효과를 기대할 수 있다.
구절초 추출물의 항균력을 확인하기 위하여 대상 균주로 칸디다 알비칸스(Candida albicans)와 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)를 사용하였고, 항균활성 실험 결과(도 3 및 도 4 참조), 구절초 추출물이 이들에 대한 항균활성을 갖고 있는 것으로 나타나, 화장품에 적용할 경우, 미생물에 의한 피부손상을 효과적으로 예방할 수 있을 것이다.
또한, 미백효과를 조사하기 위하여 티로시나제(tyrosinase) 활성 저해능을 측정하였고, 이의 결과 비록 알부틴(기존에 이미 미백활성제로 시판 중)에 미치지는 못하지만, 농도가 증가할수록 저해율이 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 5 참조). 이는 구절초 추출물이 미백효과를 나타낼 수 있다는 것을 의미한다.
학슬, 희렴, 한련초의 경우에는 메탄올 추출물을 수득한 다음, 도 6에 나타난 바와 같이 단계적으로 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올, 물의 순서로 분획하여 추출물을 수득하고, 이들 추출물의 항균, 항산화 및 미백효과를 조사하였다.
피부상재균으로서 공기, 토양 등의 자연계에 광범위하게 분포하는 원인균인 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)과 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 병원성 대장균인 대장균(Escherichia coli), 사람의 진균증을 나타내는 기회감염균인 흑색국균(Aspergillus niger)에 대한 항균활성을 조사한 결과, 표 1에 나타난 바와 같이 각각 다양한 항균활성을 나타내었다. 이중 희렴의 80% 메탄올 추출물 및 용매 분획물에 의해 생긴 생육 저해환을 3일간 계속적으로 배양하면서 관찰한 결과, 대장균과 녹농균에 대하여 생육 저지대인 환(clear zone)이 지속적으로 유지되어 생육저해효과는 물론 살균효과를 가지는 항균활성 소재로 활용할 수 있을 것으로 생각된다.
강(Kang) 등은 전자공여능이 페놀산(phenolic acids)과 플라보노이드(flavonoids) 및 기타 페놀성 물질에 대한 항산화작용의 지표라 하였으며, 이러한 물질은 환원력이 큰 것 일수록 전자공여능이 높다고 하였다. DPPH(1,1-diphenyl-2-picrydrazyl)는 아스코르빈산, 토코페롤, 폴리히드록시(polyhydroxy) 방향족 화합물, 방향족 아민류에 의하여 환원되어 짙은 자색이 탈색됨으로써 전자공여능의 차이 측정이 가능하다. 도 7은 국화류 3종의 MeOH 80% 추출물 및 추출물로부터 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올, 물 분획에 대해 DPPH를 이용하여 항산화활성을 측정한 결과이다. 대조시료인 비타민 C 는 79% 정도의 활성을 보인반면, 80% 메탄올 추출물에서는 학슬과 희렴이 90%이상의 항산화활성을 나타내었으며, 용매별 분획에서는 희렴의 경우 에틸아세테이트 분획 및 부탄올 분획이, 학슬의 경우 헥산 분획, 클로로포름 분획, 에틸아세테이트 분획, 부탄올 분획에서 90%이상의 활성을 나타내었다. 한련초의 경우 에틸아세테이트 분획 및 부탄올 분획에서 90% 이상의 항산화활성을 나타내었다. 3가지 식물중 학슬이 다른 식물에 비해 모든 분획에서 우수한 항산화 활성을 나타내었으며, 반면, 3종의 모든 물분획에서 대조시료인 비타민 C 보다 낮은 활성을 나타내었다. 이 실험에서 에틸아세테이트 분획 및 부탄올 분획이 비타민 C보다 높은 활성을 보인 것은 사용된 식물의 전초나 지상부 등에 함유된 플라보노이드 성분 등이 극성용매에 상당부분 추출되었을 가능성이 높다. 이런 항산화력을 가지는 식물 성분들은 체내에서 활성산소를 제거할 수 있는 물질일 가능성이 높으므로 기능성식품과 기능성화장품을 위한 천연물로 개발할 수 있을 것이며, 천연물에서 얻는 것이므로 보다 안정성을 갖는 천연항산제의 개발로 이어질 가능성이 높다고 사료된다.
도 8은 국화류 3종의 MeOH 80% 추출물 및 추출물로부터 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올, 물 분획에 대해 DOPA 산화효소(oxidase) 활성저해에 의한 티로시나제(tyrosinase) 저해효과를 나타낸 것이다. 양성대조군으로 사용한 알부틴이 약 22% 정도의 억제활성을 나타낸 반면, 추출물 및 분획 추출물에서는 희렴과 학슬, 한련초 모두 에틸아세테이트 분획물만이 각각 39.7%, 40.5%, 18.7%로 알부틴보다 더 높거나 비슷한 활성을 나타내었다. 티로시나제 저해활성은 폴리페놀의 종류 및 그 구조와 상관과계가 있는 것으로 김(Kim) 등은 보고하였다. 따라서 국화류 3종의 유효성분 중 극성과 비극성용매에 걸쳐 추출된 페놀화합물 등이 티로시나제를 비교적 강하게 저해하였을 것으로 판단된다. 이러한 각각의 용매별 분획물은 여러 가지 물질이 혼합되어 있으나 알부틴은 순수한 단일 물질이다. 따라서 각 분획물을 단일물질로 분리할 경우 미백활성효과는 용매별 분획물보다 더 강하게 나타날 것으로 사료된다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 부작용이 적으며 항산화, 항균, 항주름, 피부미백, 자외선 차단 효과를 나타내는 화장료를 제조할 수 있다.
도 1은 HPLC를 통한 구절초 꽃 추출물의 폴리페놀 분석 크로마토그램을 나타낸 그래프이다.
도 2는 HPLC를 통한 구절초 잎 추출물의 폴리페놀 분석 크로마토그램을 나타낸 그래프이다.
도 3은 구절초 추출물에 따른 칸디다 알비칸스(Candida albicans)의 생장억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 구절초 추출물에 따른 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)의 생장억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 구절초 추출물에 따른 티로시나제 억제활성을 나타낸 그래프이다.
도 6은 학슬, 희렴, 한련초의 80% 메탄올 추출물 및 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올, 물 분획 추출물의 제조 과정을 나타낸 것이다.
도 7은 학슬(A), 희렴(B), 한련초(C) 각 추출물의 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrydrazyl) 자유라디칼 소거활성을 나타낸 그래프이다.
도 8은 학슬(A), 희렴(B), 한련초(C) 각 추출물의 티로시나제 억제활성을 타나낸 그래프이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1. 구절초 추출물의 제조
구절초 꽃 또는 잎을 9 ~ 10월에 채취하여 -40℃에 냉동보관하였고, 이후 1, 2, 3, 4주 및 2, 3, 4, 6, 9, 12개월 마다 꺼내어 추출물 제조에 사용하였다.
80% 에탄올 1ℓ 또는 100㎖에 구절초 꽃 20g을 담그고, 용기를 호일로 두 번 감싸(암조건) 상온에서 하루 동안 추출하였고, 이를 여과하여 수득한 추출액을 4℃에 보관하거나 감압농축으로 분말화한 구절초 추출물을 제조하였다. 이 구절초 추출물은 -40℃에서 냉동보관하였다.
실험예 1. 구절초 추출물의 폴리페놀 성분 분석
메탄올을 용매로 사용하여 구절초 꽃 또는 잎 추출물의 농도가 30㎎/10㎖ 이 되도록 용액을 제조하였고, 이를 0.45㎛ 막 여과 필터(membrane filter, Sartorius AG, Germany)로 여과한 다음, HPLC(high performance liquid chromatography)로 분석하여 이의 결과를 도 1 및 도 2에 나타내었다.
분석 결과 구절초 추출물에 메틸 갈릭산(methyl gallate, 8.885ppm) 및 나린진(naringin, 65.195ppm) 성분이 포함되어 있었다.
실험예 2. 구절초 추출물의 항균성 조사
2-1. 칸디다 알비칸스에 대한 항균활성
칸디다 알비칸스(Candida albicans)를 실험균주로 사용하였으며, 이들의 증식배양 배지로는 PDB(potato dextrose broth) 배지를 사용하였다. PDB 배지에 상기 실시예 1의 구절초 추출물을 1㎎/㎖의 농도로 용해시키고, 실험균주를 접종하여 30℃의 배양기에서 12 ∼ 48시간 배양하였다. 배양 후 균주의 성장률을 분광광도계(spectrophotometer)로 측정하여 도 3에 나타내었다.
2-2. 프로피오니박테리움 아크네스에 대한 항균활성
프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)를 실험균주로 사용하였으며, 이들의 증식배양 배지로는 Sheep Blood Agar 배지를 사용하였다. Reduced brucella broth 배지에 상기 실시예 1의 구절초 추출물을 1㎎/㎖의 농도로 용해시키고, 실험균주를 접종하여 35℃의 배양기에서 48시간 배양하였다. 배양 후 균주의 성장률을 분광광도계(spectrophotometer)로 측정하여 도 4에 나타내었다.
실험예 3. 구절초 추출물의 미백활성 조사
미백 효과를 조사하기 위해 티로시나제(tyrosinase) 활성 저해능을 측정하였다.
상기 실시예 1의 추출물을 에탄올이나 적당한 용매에 녹이고 0.1M 인산염완충액(pH 7.0)등의 완충액으로 희석하여 30, 60, 120, 240, 480ppm의 농도로 시료액을 제조하였다. 시험관에 0.1M 인산염완충액(pH 7.0) 850㎕와 시료액 50㎕, 그리고 버섯 티로시나제액(1500~2000U/㎖) 50㎕를 순서대로 넣고 37℃에서 6분간 반응시켰다. 이 용액에 0.06μM L-DOPA(L-3,4-dihydroxy phenylalanine)액 50㎕를 넣고 37℃에서 1분 동안 반응시킨 후 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 475nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성대조용 시료로 기존에 이미 미백활성제로 시판중인 알부틴을 동일농도로 하여 사용하였다. 그리고 DOPA 산화활성 저해율을 100 - 각 시료액의 반응 흡광도 / 음성대조군 시료액의 반응 흡광도 × 100(%)으로 산출하여 도 5에 나타내었다.
실시예 2. 학슬, 희렴, 한련초의 메탄올 추출물 및 유기용매 분획 추출물의 제조
경북 영천에서 재배되어 2009년 7월에 구입한 학슬, 희렴, 한련초를 각각 건조기에서 충분히 건조시킨 뒤 100g을 달아 분쇄하여 4℃에서 저온 저장하며 필요시 꺼내어 사용하였다.
2-1. 메탄올 추출물 제조
도 6에서와 같이 상기 건조된 각각 100g의 학슬, 희렴, 한련초를 잘게 부순 후, 여기에 80% 메탄올 800㎖을 가하여 65℃에서 가온하면서 24시간 동안 1차 추출하였고, 이를 여과하여 추출액을 수득한 다음 여과된 잔류물을 다시 같은 방법으로 24시간동안 2차 추출하고 감압 농축하여 학슬, 희렴, 한련초 각각의 80% 메탄올 추출물을 제조하였다.
2-2. 헥산 분획 추출물 제조
상기 2-1의 메탄올 추출물을 헥산(n-hexane)과 물의 혼합액에 용해시키고, 25℃에서 24시간 방치하여 헥산층과 물층으로 분획한 다음, 헥산층을 수득하고 진공감압 농축기로 헥산을 제거하여 헥산 분획 추출물을 제조하였다.
2-3. 클로로포름 분획 추출물 제조
상기 2-2의 물층을 수득하여 클로로포름(chloroform)과 혼합하고, 25℃에서 24시간 방치하여 클로로포름층과 물층으로 분획한 다음, 클로로포름층을 수득하고 진공감압 농축기로 클로로포름을 제거하여 클로로포름 분획 추출물을 제조하였다.
2-4. 에틸아세테이트 분획 추출물 제조
상기 2-3의 물층을 수득하여 에틸아세테이트(ethylacetate)와 혼합하고, 25℃에서 24시간 방치하여 에틸아세테이트층과 물층으로 분획한 다음, 에틸아세테이트층을 수득하고 진공감압 농축기로 에틸아세테이트를 제거하여 에틸아세테이트 분획 추출물을 제조하였다.
2-5. 부탄올 분획 추출물 제조
상기 2-4의 물층을 수득하여 부탄올(n-butanol)와 혼합하고, 25℃에서 24시간 방치하여 부탄올층과 물층으로 분획한 다음, 부탄올층을 수득하고 진공감압 농축기로 부탄올을 제거하여 부탄올 분획 추출물을 제조하였다.
2-6. 물 분획 추출물 제조
상기 2-5의 물층을 수득하고 진공감압 농축기로 물을 제거하여 물 분획 추출물을 제조하였다.
상기 수득한 메탄올 추출물 및 각각의 용매 분획 추출물의 무게를 측정한 다음, 이들 추출물에 메탄올을 가하여 각각 10㎎/㎖의 농도가 되도록 제조하였고, 이를 실험예의 샘플로 사용하였다.
실험예 4. 학슬, 희렴, 한련초 추출물의 항균활성 조사
4-1. 황색포도상구균에 대한 항균활성
황색포도상구균(Staphylococcus aureus)의 표준균주 ATCC 6538을 실험균주로 사용하였으며, 이들의 증식배양 배지로는 영양배지(nutrient medium)를 사용하였다. TSA(tryptic soy agar) 배지에 황색포도상구균을 도말한 다음, 이 위에 멸균된 10㎜ 종이 디스크(filter paper disc)를 올려놓고, 여기에 상기 실시예 2의 샘플을 각각 50㎕(50㎎)씩 흡수시켜 30℃의 BOD 배양기에서 24∼72시간 동안 배양하였다. 배양 후 종이 디스크 주변의 균주 성장억제환의 유무와 크기를 확인하였다.
4-2. 녹농균에 대한 항균활성
녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 표준균주 ATCC 9027을 실험균주로 사용하여, 상기 4-1과 동일한 방법으로 항균활성을 측정하였다.
4-3. 대장균에 대한 항균활성
대장균(Escherichia coli)의 표준균주 ATCC 8739를 실험균주로 사용하여, 상기 4-1과 동일한 방법으로 항균활성을 측정하였다.
4-4. 흑색국균에 대한 항균활성
흑색국균(Aspergillus niger)의 표준균주 ATCC 8642를 실험균주로 사용하고 PDA(potato dextrose agar) 배지를 실험배지로 하여, 상기 4-1과 동일한 방법으로 항균활성을 측정하였다.
이의 결과를 표 1에 나타내었다.

실험균주
추출물
메탄올 헥산 클로로포름 에틸아세테이트 부탄올


학슬
황색포도상구균 + - ++ - + +
대장균 - ++ - - - +
녹농균 - ++ + - + -
흑색국균 - - - - - -


희렴
황색포도상구균 - - ++ + - +
대장균 - + + ++ - -
녹농균 + + + ++ + -
흑색국균 - - - - - -


한련초
황색포도상구균 + - + - - +
대장균 + - + - + +
녹농균 - - + - - -
흑색국균 - - - - - -
* +++ : 매우 강함, ++ : 중간, + : 약함, - : 없음.
실험예 5. 학슬, 희렴, 한련초 추출물의 항산화 효과 조사
하타노(Hatano) 등의 방법에 따라 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrydrazyl) 자유라디칼 소거법을 이용하여 실시예 2 추출물의 항산화 활성을 조사하였다. DPPH 200μM 농도의 에탄올 용액 1㎖에 실시예 2의 샘플 0.5㎖를 가하고 24℃에서 30분간 방치한 후 517㎚에서의 흡광도를 측정하여 소거된 DPPH의 농도를 정량하였다. 자유라디칼 소거활성(scavenging activity)은 다음 계산식에 의해 산출하였으며, 이의 결과를 도 7에 나타내었다. 양성대조군으로 동일 농도로 제조한 비타민 C를 사용하였다.
[계산식 1]
소거율(scavenging, %) = [1-(B-C)/A]×100(%)
계산식 1에서 A는 샘플을 첨가하지 않은 채 반응한 후의 흡광도, B는 샘플을 첨가하여 반응한 후의 흡광도, C는 DPPH 대신 증류수로 대체하였을 때의 흡광도이다.
실험예 6. 학슬, 희렴, 한련초 추출물의 미백 효과 조사
미백 효과를 조사하기 위해 티로시나제(tyrosinase) 활성 저해능을 측정하였다.
상기 실시예 2의 추출물을 에탄올이나 적당한 용매에 녹이고 0.1M 인산염완충액(pH 7.0)등의 완충액으로 희석하여 DOPA 산화반응에 대한 활성을 억제하기 위한 적당한 농도범위로 희석한 것을 시료액으로 하였다. 시험관에 0.1M 인산염완충액(pH 7.0) 850㎕와 시료액 50㎕, 그리고 버섯 티로시나제액(1500~2000U/㎖) 50㎕를 순서대로 넣고 37℃에서 6분간 반응시켰다. 이 용액에 0.06μM L-DOPA(L-3,4-dihydroxy phenylalanine)액 50㎕를 넣고 37℃에서 1분 동안 반응시킨 후 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 475nm에서 흡광도를 측정하였다. 음성대조용 시료액으로 시료액 대신 0.1M 인산염완충액(pH 7.0)을 사용하였으며, 양성대조용 시료로 기존에 이미 미백활성제로 시판중인 알부틴을 동일농도로 하여 사용하였다. 그리고 DOPA 산화활성 저해율을 100 - 각 시료액의 반응 흡광도 / 음성대조군 시료액의 반응 흡광도 × 100(%)으로 산출하여 도 8에 나타내었다.
제조예 1. 화장료 조성물의 제조
1-1. 로션 제조
TIO 2g, Dermofeel BGC 2g, Squalane 3g, Shea butter 0.5g, Arlacel 165 0.5g, Cetanol 1g, DM/DP 0.1g/0.05g, Montanov-L 1g, DC-245 3g, Glycerine 3g, 1,3 BG 2g, 히아루론산나트륨(1%) 1g, Carbopol Ultrez-21(2%) 5g, TEA(10%) 1g, 상기 실시예 1의 구절초 추출물 0.2g 및 상기 실시예 2-4의 학슬 에틸아세테이트 분획 추출물, 희렴 에틸아세테이트 분획 추출물, 한련초 에틸아세테이트 분획 추출물 각 0.2g을 D.I.Water에 첨가 및 혼합한 다음 최종 100㎖가 되도록 하여 로션을 제조하였다.
1-2. 에센스 마스크팩 제조
Alcohol(95%) 5g, MDF 1g, 향(?) 0.07g, DM/DP 0.1g/0.05g, Nikkol HCO-60 0.8g, Glycerine/1,3BG 3g/2g, 히아루론산 나트륨(1%) 1g, Carbopol Ultrea-21(2%) 5g, TEA(10%) 1g, 상기 실시예 1의 구절초 추출물 0.2g 및 상기 실시예 2-4의 학슬 에틸아세테이트 분획 추출물, 희렴 에틸아세테이트 분획 추출물, 한련초 에틸아세테이트 분획 추출물 각 0.2g을 D.I.Water에 첨가 및 혼합한 다음 최종 100㎖가 되도록 하여 에센스 마스크팩을 제조하였다.

Claims (8)

  1. 구절초의 에탄올 추출물;을 포함하고,
    학슬을 메탄올과 물의 혼합액으로 추출한 다음 추출액을 건조시켜 제조한 추출물을 헥산과 물의 혼합액에 용해시켜 혼합용액을 제조하고, 이 혼합용액을 헥산과 물 층으로 분리한 다음 물 층을 수득하고, 수득한 물 층을 클로로포름과 혼합하여 혼합용액을 제조하고, 이 혼합용액을 클로로포름과 물 층으로 분리한 다음 물 층을 수득하고, 수득한 물 층을 에틸아세테이트와 혼합하여 혼합용액을 제조하고, 이 혼합용액을 에틸아세테이트와 물 층으로 분리한 다음 에틸아세테이트 층을 수득하고, 수득한 에틸아세테이트 층에서 에틸아세테이트를 제거하여 제조한 추출물;
    희렴을 메탄올과 물의 혼합액으로 추출한 다음 추출액을 건조시켜 제조한 추출물을 헥산과 물의 혼합액에 용해시켜 혼합용액을 제조하고, 이 혼합용액을 헥산과 물 층으로 분리한 다음 물 층을 수득하고, 수득한 물 층을 클로로포름과 혼합하여 혼합용액을 제조하고, 이 혼합용액을 클로로포름과 물 층으로 분리한 다음 물 층을 수득하고, 수득한 물 층을 에틸아세테이트와 혼합하여 혼합용액을 제조하고, 이 혼합용액을 에틸아세테이트와 물 층으로 분리한 다음 에틸아세테이트 층을 수득하고, 수득한 에틸아세테이트 층에서 에틸아세테이트를 제거하여 제조한 추출물; 및
    한련초를 메탄올과 물의 혼합액으로 추출한 다음 추출액을 건조시켜 제조한 추출물을 헥산과 물의 혼합액에 용해시켜 혼합용액을 제조하고, 이 혼합용액을 헥산과 물 층으로 분리한 다음 물 층을 수득하고, 수득한 물 층을 클로로포름과 혼합하여 혼합용액을 제조하고, 이 혼합용액을 클로로포름과 물 층으로 분리한 다음 물 층을 수득하고, 수득한 물 층을 에틸아세테이트와 혼합하여 혼합용액을 제조하고, 이 혼합용액을 에틸아세테이트와 물 층으로 분리한 다음 에틸아세테이트 층을 수득하고, 수득한 에틸아세테이트 층에서 에틸아세테이트를 제거하여 제조한 추출물;을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 미백, 노화 방지, 항산화 및 항균성 화장료 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 구절초 에탄올 추출물은 구절초 꽃을 70 내지 90% 에탄올에 담가 상온에서 12 내지 36시간 추출한 다음, 추출액을 여과하여 고형물을 제거하고, 에탄올 및 수분을 제거하여 제조한 추출물인 것을 특징으로 하는 피부 미백, 노화 방지, 항산화 및 항균성 화장료 조성물.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 학슬을 메탄올과 물의 혼합액으로 추출한 다음 추출액을 건조시켜 제조한 추출물은 학슬 100중량부를 잘게 부수고, 3 : 1 내지 5 : 1 부피비의 메탄올과 물의 혼합액 600 내지 1000중량부와 혼합하여, 60 내지 70℃에서 1 내지 2일간 추출한 후 여과하여 수득한 추출액을 건조시킨 것을 특징으로 하는 피부 미백, 노화 방지, 항산화 및 항균성 화장료 조성물.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 희렴을 메탄올과 물의 혼합액으로 추출한 다음 추출액을 건조시켜 제조한 추출물은 희렴 100중량부를 잘게 부수고, 3 : 1 내지 5 : 1 부피비의 메탄올과 물의 혼합액 600 내지 1000중량부와 혼합하여, 60 내지 70℃에서 1 내지 2일간 추출한 후 여과하여 수득한 추출액을 건조시킨 것을 특징으로 하는 피부 미백, 노화 방지, 항산화 및 항균성 화장료 조성물.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 한련초를 메탄올과 물의 혼합액으로 추출한 다음 추출액을 건조시켜 제조한 추출물은 한련초 100중량부를 잘게 부수고, 3 : 1 내지 5 : 1 부피비의 메탄올과 물의 혼합액 600 내지 1000중량부와 혼합하여, 60 내지 70℃에서 1 내지 2일간 추출한 후 여과하여 수득한 추출액을 건조시킨 것을 특징으로 하는 피부 미백, 노화 방지, 항산화 및 항균성 화장료 조성물.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제 1항에 있어서, 상기 각 추출물의 농도가 0.1 내지 0.5중량%인 것을 특징으로 하는 피부 미백, 노화 방지, 항산화 및 항균성 화장료 조성물.
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