KR102572961B1

KR102572961B1 - 황칠나무 추출물을 포함하는 치주질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR102572961B1
Application number: KR1020210013943A
Authority: KR
Inventors: 조창수
Original assignee: 농업회사법인 휴림황칠(주)
Priority date: 2021-02-01
Filing date: 2021-02-01
Publication date: 2023-08-31
Also published as: KR20220110931A

Abstract

본 발명은 치주질환의 원인균인 포르피로모나스 진지발리스에 대해 항균활성 및 치주질환에 의한 염증에 항염증효과가 있는 황칠나무 추출물 또는 황칠나무 추출물과 천연추출물을 혼합한 혼합물을 유효성분으로 포함하는 조성물로서, 포르피로모나스 진지발리스의 증식을 억제해 치주질환 예방, 개선 또는 치료 효과가 있다.

Description

황칠나무 추출물을 포함하는 치주질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물{COMPOSITIONS FOR PREVENTING, IMPROVING OR TREATING PERIODONTAL DISEASE CONTAINING DENDROPANAX MORBIFERA LEV. EXTRACTS}

본 발명은 황칠나무 추출물을 포함하는 치주질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물로서, 구체적으로는 치주질환의 원인균인 포르피로모나스 진지발리스에 대한 항균활성 및 치주질환에 의한 염증에 항염증효과가 있는 황칠나무 추출물 또는 황칠나무 추출물과 천연추출물을 혼합한 혼합물을 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것이다.

치주질환은(periodontal disease, 齒周疾患)은 치아를 둘러싸고 있는 치은과 치주인대 및 치조골 등 치아 주위조직에 나타나는 질환으로서, 충치와 더불어 구강의 2대 질환이다. 치주질환은 흔히 풍치라고도 하는데, 병의 정도에 따라 치은염(gingivitis)과 치주염(periodontitis)으로 나뉜다. 비교적 가볍고 회복이 빠른 형태의 치주질환으로 잇몸 즉, 연조직에만 국한된 형태를 치은염이라고 하고, 이러한 염증이 잇몸과 잇몸 뼈 주변까지 진행된 경우를 치주염이라고 한다. 치주질환은 연령과도 관계가 깊은데 20세 이상의 성인의 경우에는 과반수에서, 35세 이후에는 4명당 3명꼴로, 그리고 40세 이상의 장년층이나 노년층의 경우 80~90%에서 잇몸질환이 발생하고 있다.

치주질환의 주요한 발생 원인은 치아에 지속적으로 형성되는 플라크(plaque)라는 세균막이다. 입 속에는 300여 종의 세균들이 살고 있으며, 음식 섭취 후 세균들이 타액 및 음식과 섞여서 치아에 부착되어 끈끈한 무색의 얇은 막을 만든다. 이와 같이 세균들이 덩어리를 형성하여 치아면에 부착한 얇은 막을 플라크 또는 치태(齒苔)라고 부른다. 치아를 제대로 닦지 않으면 플라크가 그대로 굳어져서 딱딱한 돌처럼 되며, 이것을 치석이라고 한다. 일단 치석이 만들어지면 그 표면이 거칠어져서 세균막이 점점 더 쌓이기 좋은 상황이 된다. 잇몸 근처에 부착된 세균막에서 독소를 방출하게 되면 주변 조직에 염증반응이 나타나게 되고, 그 결과로 치아를 지탱해주는 조직이 손상된다. 염증이 진행될수록 잇몸과 치아 사이가 더욱 벌어지게 되고 결국에는 치아가 흔들리게 되는데, 치료를 하지 않고 이대로 방치할 경우 저절로 치아가 탈락하기도 한다. 또한, 흡연, 스트레스, 단백질, 비타민 등의 영양부족, 임신한 경우나 당뇨병 등과 같은 호르몬 장애, 흡연, 후천성면역결핍증(AIDS) 등이 치주질환을 악화시킬 수 있다.

치주질환을 일으키는 세균으로는 대표적으로 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis)가 있다. 포르피로모나스 진지발리스는 그램음성(Gram-negative)의 간균으로 혐기성인 병원성 세균이다. 포르피로모나스 진지발리스는 구강의 상피세포내로 침습하여 치주염을 유발시킬 수 있다고 알려져 있다. 포르피로모나스 진지발리스는 치아와 잇몸사이의 치주낭에 서식하면서 플라크의 당과 단백질을 분해하여 생존하면서, 병원성 인자(LPS, 단백질분해효소 등)를 분비한다. 이들은 독소로 작용하여 잇몸을 약화시킨다. 모든 그램음성균은 외막에 내독소를 보유하고 있는데, LPS(lipopolysaccharide, 지질다당류)는 내독소(endotoxin)로서 대식세포의 전염증성 사이토카인 생성을 유도하여 골흡수와 아교질파괴를 유도한다. 포르피로모나스 진지발리스가 생성하는 진지페인(Gingipain) 같은 단백분해효소(protease)는 기세포외기질과 면역물질을 분해하여 불활성화시킨다.

이들 세균에 의한 치은염이 적절히 치료되지 않을 경우, 치아 및 치주의 표면이 손상되어 손상부위를 통해 세균이 치은내로 직접 침투하거나 또는 세균의 외막이 떨어져 나와 형성된 둥근 모양의 소포가 내부에 포함된 세균의 병원성 인자를 조직으로 운반하여 염증을 일으킴으로써 이들 조직을 약화시킨다.

포르피로모나스 진지발리스는 전염성이 강해 침으로도 전염이 가능한 것으로 알려졌으며, 구강에서 주로 발견되어 치주질환과 관련이 있는 것으로 알려져 있지만, 상부위장관, 기도, 큰창자 등에서도 발견되고, 여성의 세균성 질염과도 관련이 있다.

한편, 황칠나무(DENDROPANAX MORBIFERA LEV.)는 두릅나무과에 딸린, 사철 내내 잎이 푸른 나무이다. 기존의 연구에 따르면 황칠나무는 Streptococcus mutans(입 속에 있는 충치균)와 Candida albicans(칸디다증의 원인균)에 대해 항균 및 항진균 효과가 있다고 보고되었다. 황칠나무에는 폴리페놀(polyphenol)의 중합체인 수용성 타닌(tanin)이 함유되어 있는데, 타닌은 Streptococcus mutans의 glucosyltransferase(포도당전달효소)가 불용성 다당류 glucan을 합성하는 것을 저해함으로써 세균의 증식을 억제한다. 이외에도 황칠나무에는 다량의 사포닌(saponin)이 함유되어 있으며, 대부분의 항진균제가 세포막 투과성 변화로 인하여 균체 성분이 세포 외로 누출되어 증식이 억제되는 것과 같이 사포닌이 Candida albicans(칸디다증의 원인균)의 세포막 주요성분인 ergosterol 합성에 영향을 미치게 되면서 항진균 효과를 나타낸다.

하지만, 이와 같이 황칠나무의 항균 효과에 대하여 연구된 바는 있으나, 황칠나무가 치주질환의 주요한 원인균인 포르피로모나스 진지발리스에 대해서도 항균활성을 가지는지는 확인되지 않았다.

[문헌1] 김려운 : 구강 및 의치 세정제 조성을 위한 황칠나무 추출물의 항균, 항산화 효과 및 세포 독성에 관한 연구(Antimicrobial, antioxidant and cytotoxic activities of Dendropanax morbifera extract for mouthwash and denture cleaner solution), 조선대학교 석사학위논문, 2015

본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 황칠나무 추출물이 치주질환의 원인균인 포르피로모나스 진지발리스에 대한 항균활성 및 치주질환에 의한 염증에 항염증효과가 있는지 확인하고, 황칠나무 추출물 또는 황칠나무 추출물과 천연추출물을 혼합한 혼합물을 포함하는 치주질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명에 따른 과제의 해결 수단으로 치주질환의 원인균인 포르피로모나스 진지발리스에 대해 항균활성 및 치주질환에 의한 염증에 항염증효과가 있는 황칠나무 추출물 또는 황칠나무 추출물과 천연추출물을 혼합한 혼합물을 유효성분으로 포함하는 치주질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 황칠나무 추출물은 황칠나무 잎 및/또는 줄기의 추출물로 하며, 천연추출물은 은행나무잎, 감초, 녹차잎 중에서 선택되는 하나 이상인 것의 추출물로 한다. 본 발명에 따른 황칠나무 추출물과 천연추출물을 혼합한 혼합물은 황칠나무 추출물과 천연추출물을 1:1의 중량비로 혼합하여 만들어진다.

또한, 본 발명의 조성물에 대하여 포르피로모나스 진지발리스에 대한 항균활성을 확인하고, 치주질환에 의한 염증에 효과적으로 작용하는지 확인하기 위해 항염증 실험을 수행하였다.

본 발명의 황칠나무 추출물을 포함하는 조성물은 치주질환의 원인균인 포르피로모나스 진지발리스에 대한 항균활성이 있어 포르피로모나스 진지발리스의 증식을 억제하며, 치주질환에 의한 염증에 대해 항염증효과가 있어 치주질환 예방, 개선 또는 치료 효과가 있다.

본 발명의 황칠나무 추출물을 포함하는 치주질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물은 치약류, 껌, 구강 세정제, 구강 청정제, 구강용 스프레이, 구강용 연고제 및 구강용 패치 중 어느 하나 이상의 제형으로 적용될 수 있다.

아래에서는 본 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용, <실시예> 및 <시험예>를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하는 것이지만, 본 발명의 실시형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으므로 본 발명의 범위가 아래 설명하는 실시형태로 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 본 발명의 명세서 전체에서, 어떤 단계가 다른 단계와 "상에" 또는 "전에" 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 단계가 다른 단계와 직접적 시계열적인 관계에 있는 경우 뿐만 아니라, 각 단계 후의 혼합하는 단계와 같이 두 단계의 순서에 시계열적 순서가 바뀔 수 있는 간접적 시계열적 관계에 있는 경우와 동일한 권리를 포함할 수 있다.

본 발명의 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본 발명의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "~ (하는) 단계" 또는 "~의 단계"는 "~를 위한 단계"를 의미하지 않는다.

본 발명은 황칠나무 추출물을 포함하는 치주질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물로서, 본 발명에 따른 조성물은 치주질환의 원인균인 포르피로모나스 진지발리스에 대한 항균활성 및 치주질환에 의한 염증에 항염증효과가 있는 황칠나무 추출물 또는 황칠나무 추출물과 천연추출물을 혼합한 혼합물을 유효성분으로 포함하는 조성물이다. 상기 천연추출물은 은행나무잎, 감초, 녹차잎 추출물 중에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 한다.

치주질환을 일으키는 세균으로는 대표적으로 포르피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis)가 있다. 포르피로모나스 진지발리스는 구강의 상피세포내로 침습하여 치주염을 유발시킬 수 있다고 알려져 있다. 포르피로모나스 진지발리스는 치아와 잇몸사이의 치주낭에 서식하면서 치태의 당과 단백질을 분해하여 생존하면서, 병원성 인자(LPS, 단백질분해효소 등)를 분비한다. 이들은 독소로 작용하여 잇몸을 약화시킨다.

황칠나무(Dendropanox morbifera LEV.)는 두릅나무에 속하는 상록 활엽교목으로 우리나라의 남부 해변과 섬의 산록 수림 속에 살며 높이는 15m이다. 껍질에 상처가 나면 황색 액이 나오는 데 이것을 황칠(黃漆)이라고 한다. 수액은 가구의 칠용으로 쓰이며 관상용으로 심는다. 뿌리와 가지를 풍하리(楓荷梨) 또는 풍하이라 부르며 약으로 쓴다. 성미는 달고 따뜻하며, 풍습(風濕)을 제거하고 혈맥(血脈)의 운행을 활발히 하는 효능이 있다. 황칠나무의 뿌리 및 줄기는 편두통, 월경 곤란증, 피부 질환 등을 치료하는데 이용되어 왔으며, 황칠나무 잎은 플라보노이드 및 폴리아세틸렌 화합물 등을 함유하고 있는 것으로 확인되었다. 황칠나무가 함유하고 있는 폴리아세틸렌(polyacetylene) 화합물은 식물이 외상에 의하여 자극을 받으면 분비되는 항균성 물질이다.

또한, 황칠나무의 뿌리 및 줄기는 전통 의학에서 편두통, 월경 곤란증, 피부 질환 등을 치료하는데 이용되어 왔다. 연구 결과에 따르면 항암 효과, 간세포 재생, 당뇨 치료, 경조직 세포 재생 등에 효과적인 것으로 밝혀졌다.

기존의 연구에 따르면 황칠나무는 Streptococcus mutans(입 속에 있는 충치균)와 Candida albicans(칸디다증의 원인균)에 대해 항균 및 항진균 효과가 있다고 보고되었다. 황칠나무에는 폴리페놀(polyphenol)의 중합체인 수용성 타닌(tanin)이 함유되어 있는데, 타닌은 Streptococcus mutans의 glucosyltransferase(포도당전달효소)가 불용성 다당류 glucan을 합성하는 것을 저해함으로써 세균의 증식을 억제한다. 이외에도 황칠나무에는 다량의 사포닌(saponin)이 함유되어 있으며, 대부분의 항진균제가 세포막 투과성 변화로 인하여 균체 성분이 세포 외로 누출되어 증식이 억제되는 것과 같이 사포닌이 Candida albicans(칸디다증의 원인균)의 세포막 주요성분인 ergosterol 합성에 영향을 미치게 되면서 항진균 효과를 나타낸다.

본 발명에서는 황칠나무 잎 및/또는 줄기를 열수추출 후, 동결건조한 것을 사용하며, 황칠나무 추출물 또는 황칠나무 추출물과 천연추출물을 혼합한 혼합물의 포르피로모나스 진지발리스에 대한 항균 효과를 확인하였다.

은행나무잎은 은행나무과의 은행나무(Ginkgo biloba)의 잎을 의미한다. 은행나무잎은 다른 대부분의 겉씨식물과는 달리 부채꼴 모양으로 중간 부위가 갈라져 있으며, 봄에 새로 나온 파란 잎이 가을에 노랗게 단풍이 든다. 오래 전부터 한방에서 약재로 사용되어 왔으며, 생약으로는 종자 및 잎을 사용하고, 이를 은행 및 은행엽이라 한다. 종자는 진해, 거담, 활열작용을 하며, 잎 또는 잎의 추출액은 혈전용해제, 말초순환기 장애 치료, 기억력 회복, 고혈압 예방 등에 사용한다. 현대의학에서도 은행잎 추출물은 뇌 및 말초혈관 혈류량 저하, 감각신경 질환, 기억력 및 인지기능 저하 등에서 치료제로 사용되고 있으며, 항암 억제 효과도 보고되었다.

은행나무잎에서 유효성분을 추출한 물질을 은행엽엑스라고 하며, 혈액 순환 개선 및 항산화 작용을 나타내는 약물이다. 말초동맥 순환장애, 어지러움, 이명 및 치매 등의 뇌기능 장애에 사용된다. 은행엽엑스는 포르피로모나스 진지발리스와 같은 구강 내 유해세균에 대한 항균 효과가 있을 뿐만 아니라, 치주 조직을 손상시켜 치주 질환을 유발하거나 진행 중인 치주 질환을 악화시키는 활성 산소를 제거하고 치근막의 콜라겐을 분해하여 잇몸 질환을 일으키는 콜라게나아제(collagenase)의 활성을 억제하여 치주 질환의 예방 및 개선에 효과를 나타낸다. 또한, 상기 은행엽 엑스는 항산화 작용을 하며 잇몸의 혈행을 촉진하여 잇몸질환을 개선시켜주는 효과를 나타낼 수 있다. 상기 은행엽 엑스는 주요성분으로 플라보노이드와 바이플라보노이드, 프로안토시아니딘, 테르펜 락톤 등을 함유하고 있으며, 이들 물질은 항염증 작용과 잇몸의 혈행개선 등의 역할을 할 수 있다.

본 발명에서는 천연추출물로서 은행나무잎을 열수추출 후, 동결건조하여 사용한다.

감초(Glycyrrhiza uralensis Fischer)는 쌍떡잎식물 장미목 콩과에 속하는 약용 식물로, 뿌리를 채취하여 한약재, 감미료 등으로 사용한다. 감초 안에 들어 있는 약용 성분은 약리작용이 뛰어나 다수의 질환에 효과가 있으며, 이게 빠진 한약은 매우 써 먹기 힘들다고 한다. 약재로서의 직접적인 효능은 위장 보호 및 독성 중화이며, 다른 약재의 독을 중화하고 효능을 완화시켜 효능이 적절히 배합되도록 하는 역할을 주로 한다. 또한, 맛이 달아 탕약의 역한 맛을 줄이는 역할도 한다.

감초는 포르피로모나스 진지발리스를 억제하고 구취를 만드는 휘발성 황화합물(VSC)을 줄이는 효과가 있다. 감초는 포르피로모나스 진지발리스의 독소를 방어하기 위해 체내의 대식세포들이 만들어내는 염증성 싸이토카인의 양을 감소시켜 치주염이나 구내염 등의 염증반응을 완화시킨다. 또한, 치주염 세균인 Aggregatibacter actinomycetemcomitans의 독소를 방어하기 위해 우리 몸의 면역세포들이 만드는 단백질 분해효소(MMP)의 양도 줄여주어 치주염의 특징인 잇몸뼈(치조골흡수)를 방어할 수 있다.

본 발명에서는 천연추출물로서 감초를 열수추출 후, 동결건조하여 사용한다.

녹차는 동백나무과의 차나무(Camellia Sinensis)의 싹이나 잎을 이용하여 차엽속에 존재하는 산화효소를 화열(火熱)이나 증기로 처리함으로써 산화효소를 파괴시켜 녹색을 그대로 유지하도록 제조한 것이다. 녹차는 기원전부터 기호차로서 음용되어 왔을 뿐만 아니라 최근 들어 녹차에 함유된 여러 성분의 약리적인 메커니즘이 점차 밝혀짐에 따라 그 가치가 재인식되고 있다. 녹차의 활용법에 있어서 음료 이외에도 탈취제, 신선도 유지, 각종 식품의 첨가물, 마사지팩 등으로 그 활용이 넓어지고 있다.

녹차에 함유되어 있는 주요 성분은 카페인, 탄닌, 테아닌, 세키세놀, 비타민 C(150∼500㎎), 비타민 B1, B2, 나이아신, 펜토텐산, 이노시톨, 루틴 등이다. 기름기가 많은 음식을 먹고 차를 마시면 개운하고 강한 알칼리성이므로 위산 과다에도 좋다. 또한, 충치 예방에도 효과가 있다고 한며, 녹차 추출물에는 항산화 작용이 있다.

녹차의 맛은 카테킨(catechin)이라 불리는 탄닌 성분 때문이다. 항산화 작용을 하는 폴리페놀의 한 종류인 카테킨은 녹차 한 잔에 대략 100㎎이 들어 있으며, 그중 가장 강력한 성분인 'EGCG'는 비타민 C보다 항산화 효능이 20배나 높은 것으로 알려져 있다. 카테킨 성분은 항암 효과와 혈관 건강을 지키는 기능을 한다고 알려져 있다. 카테킨은 위암, 폐암 등을 예방하는 효과가 있고, 혈압을 낮추어주며 심장으로의 혈류를 늘리는 효과도 있다. 소화기관 내에서의 콜레스테롤의 흡수를 저해하고 지질의 체내 침착을 억제한다. 이에 혈압을 떨어뜨리고, 심장을 강화하며, 지방간이나 동맥경화를 예방한다. 또한, 녹차의 여러 카테친 성분들은 포르피로모나스 진지발리스가 분비하는 단백질 분해효소(proteinase)를 억제하고, 잇몸세포들의 결합을 탄탄하게 한다.

본 발명에서는 천연추출물로서 녹차잎을 열수추출 후, 동결건조하여 사용한다.

본 발명에서는 황칠나무 추출물 또는 황칠나무 추출물과 천연추출물을 혼합하여 조성물을 제조하였으며, 포르피로모나스 진지발리스에 대한 각 추출액 및 조성물의 항균활성 및 항염증효과를 실험을 통해 확인하였다. 이러한 실험에 대한 보다 구체적인 사항은 후술한다.

본 발명에 따라 황칠의 잎 및/또는 줄기 부분을 준비하여, 세척한 후 분쇄기를 이용하여 분쇄한다. 건조되거나 건조되지 않은 것을 제한없이 사용할 수 있다. 분쇄크기는 특별히 제한되지 않으며, 1~3cm의 크기로 분쇄될 수 있다. 황칠나무의 잎과 줄기는 각각 분쇄하여 혼합하거나, 함께 혼합하여 분쇄할 수 있다.

다음으로 물을 이용하여 열수추출액을 얻는다. 상기 분쇄물의 20배 중량의 정제수를 가하고 비점에서 2시간 30분간 가열 교반하여 황칠나무 추출액을 얻는다. 이를 여과한 후 동결건조한다.

천연추출물도 상기의 방법으로 실행되며, 은행나무잎, 감초, 녹차잎 중에서 선택되는 하나 이상인 것으로 한다.

상기 황칠나무 추출물과 천연추출물을 혼합한 혼합물은 황칠나무 추출물과 천연추출물을 1:1의 중량비로 혼합하여 만들어진다.

또한, 각 조성물에 대하여 포르피로모나스 진지발리스에 대한 항균활성을 확인하고, 치주질환에 의한 염증에 효과적으로 작용하는지 확인하기 위해 항염증 실험을 수행하였다.

이하, 본 발명의 실시예에 따른 황칠나무 추출물을 포함하는 치주질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 대하여 상세히 설명하도록 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

<실시예 1> 황칠나무 추출물 제조

황칠나무 잎 및/또는 줄기 부분을 준비하여, 세척한 후 분쇄기를 이용하여 분쇄하고, 분쇄물 50g을 물 1L에 넣었다. 이를 100℃에서 2시간 30분 동안 가열하여 추출한 한 후, 여과하고 동결건조하여 분말로 만들었다.

<실시예 2> 천연추출물 제조

상기 천연추출물에는 은행나무잎, 감초, 녹차잎 중에서 선택되는 하나인 것으로 하며, 실시예 1과 동일한 과정으로 실행되었다.

<실시예 3> 황칠나무 추출액과 천연추출물의 혼합물

상기 실시예 1에서 제조한 황칠나무 추출물과 실시예 2에서 제조한 천연추출물을 1:1의 중량비로 혼합하였다.

[항균활성 실험]

본 발명의 황칠나무 추출물을 포함하는 치주질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물은 액체희석배양법과 페이퍼 디스크법을 통하여 각 조성물의 포르피로모나스 진지발리스에 대한 항균활성을 확인하였다.

<실험예 1> 최소 억제 농도(MIC) 및 최소 살균 농도(MBC) 분석 실험

액체희석배양법은 분리된 세균에 대해 특정 항균제의 역가를 결정하는 검사이다. 액체배지에서 항균제의 희석계열을 만들어 각각의 시험관에 일정량의 배양균액을 접종하고 37℃에서 배양 후, 균의 증식을 판정한다. 액체희석배양법을 통해 최소 억제 농도(MIC, Minimum inhibitory concentration)와 최소 살균 농도(MBC, Minimun bactericidal contentration, 최소 살균 농도)를 측정하였다.

MIC는 세균의 성장을 억제, 즉 정균하는 데에 필요한 항균제의 최소량이며, MBC는 세균을 살균하는데 필요한 항균제의 최소량이다. MBC는 세균의 양을 99. 9% (즉 10^5~6/mL에서 ≤ 10^2~3/mL) 이상 감소시키는 항생제의 최소 농도로 정의한다.

MIC는 세균의 가시적 성장을 억제하는데 필요한 항균제의 최저 농도인 반면, MBC는 세균을 사멸시키는 항균제의 최소 농도이다. 일반적으로 MIC가 MBC보다 낮은 값을 가지는데, MIC가 MBC에 가까울수록 항생제가 더 살균을 많이 하게 된다. 대부분의 살균 항생제는 MIC로도 99.9% 이상 균을 감소시키기 때문에 MIC와 MBC는 동일한 경우가 대다수이다. 일반적으로는 MIC의 측정만으로도 살균 여부를 예측하는데 무리가 없으나, 뇌수막염, 심내막염, 호중구감소증 환자의 경우와 같이 숙주 방어기전의 결함으로 원인균을 제거하기 위해서 살균력이 높은 항생제를 사용할 필요가 있을 경우 MBC가 지표로 사용된다.

1-1. 실험 준비

본 실험의 포르피로모나스 진지발리스는 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC; Korean collection for type culture)에서 입수하였다.(KCTC5352)

① 포르피로모나스 진지발리스를 yeast extract (5mg/ml), hemin (5μg/ml) 및 vitamin K1 (0.2μg/ml)이 첨가된 half-strength brain heart infusion(BHI) 액체배지와 면 양적혈구가 5% 첨가된 BHI 혈액한천배지에서 48시간 37˚C에서 혐기적으로 배양하였다.

② 배양한 균액을 BHI 혈액한천배지를 이용하여 1×10⁵ colony forming units (CFU)/ml로 희석하여 실험에 사용하였다.

1-2. MIC 측정

① 포르피로모나스 진지발리스 (1×10⁵ CFU/ml) 균액을 96-well plate의 각 well에 0.1ml씩 분주한 다음, 균액이 들어 있는 각 well에 황칠나무 추출물을 농도별로 0.1ml을 넣고, 48시간 동안 37℃에서 배양하였다.

② 천연추출물, 및 황칠나무 추출물과 천연추출물을 혼합한 혼합물에 대해서도 동일한 과정으로 실행되었다.

③ 배양 후, 생리식염수만을 넣은 대조군과 비교하여 최초로 균의 증식이 억제된 농도를 포르피로모나스 진지발리스에 대한 최소억제농도(MIC)로 하였다.

1-3. MBC 측정

① 포르피로모나스 진지발리스 (1×10⁵ CFU/ml) 균액을 96-well plate의 각 well에 0.1ml씩 분주한 다음, 균액이 들어 있는 각 well에 최소억제농도를 포함하여 전후의 농도의 황칠나무 추출물 0.1ml을 넣고, 48시간 동안 37℃에서 혐기적으로 배양하였다.

③ 배양 후, 육안적으로 균의 증식이 일어나지 않은 well에서 0.1ml을 취하여 yeast extract (5mg/ml), hemin (5μg/ml) 및 vitamin K1 (0.2μg/ml)이 첨가된 half-strength brain heart infusion (BHI) agar에 도포하여 48시간 동안 37℃에서 혐기적으로 배양하였다.

④ 배양 후, 균의 증식이 확인되지 않은 최소농도를 포르피로모나스 진지발리스에 대한 최소살균농도(MBC)로 하였다.

1-4. 실험 결과

[표 1]은 황칠나무 추출물, 천연추출물 및 황칠나무 추출액과 천연추출물의 혼합물의 MIC 및 MBC를 나타낸 결과이다.

구 분	MIC(mg/ml)	MBC(mg/ml)
황칠나무 추출물	0.78	3.13
은행나무잎 추출물	3.13	12.50
감초 추출물	12.50	25.00
녹차잎 추출물	12.50	50.00
황칠나무+은행나무잎	0.39	1.56
황칠나무+감초	3.13	6.25
황칠나무+녹차잎	3.13	12.50

MIC의 수치가 낮을수록 항생제 감수성이 높다는 것을 의미하며, 항생제 감수성이 높다는 것은 항균력이 높음을 의미한다. MBC의 수치 역시 MIC 수치와 마찬가지로 낮을수록 항생제 감수성이 높고 세균에 대한 항균력이 높음을 의미한다.

상기 [표 1]를 참조하면, 각 추출물 0.1ml를 포르피로모나스 진지발리스 배양액이 있는 96-well plate에 넣고 배양했을 때, 각 추출물의 희석농도는 황칠나무 추출물 단독사용의 경우, MIC와 MBC가 각각 0.78mg/ml 및 3.13mg/ml이었고, 황칠나무 추출물과 은행잎 추출물을 병용한 경우에는, MIC와 MBC가 각각 0.39mg/ml및 1.56mg/ml로 나타나 가장 높은 항균효과를 나타내었다. 이에 따라 황칠나무 추출물에 은행잎 추출물을 혼합한 혼합물의 가장 항균력이 높음을 알 수 있다.

<실험예 2> 페이퍼 디스크법 실험

페이퍼 디스크법(Paper disc)은 항균 활성을 대략적으로 측정하기 위해 사용되는 방법이다. 미리 일정한 농도로 맞춘 균을 한천배지에 골고루 도포하고 항균제가 함유되어 있는 페이퍼 디스크를 배지 위에 붙인 후 배양한다. 배양하는 동안 항균제가 페이퍼 디스크로부터 한천배지에 확산된다.

디스크와 일정 거리에 있는 한천의 항균제 농도는 디스크로부터 멀리 확산되어 갈수록 농도가 낮아지며 디스크로부터 일정거리에 MIC 농도가 형성된다. 이 거리의 바깥쪽에서는 균의 생장이 이루어지지만 그 안쪽에서는 균의 생장이 억제된다.

MIC 농도의 주위에는 균의 생장이 이루어지지 않아 생장저해구역(zone of inhibition)이 형성되며, 각 균의 배양조건에서 배양 후 각 배지에 형성된 클리어존(clear zone)의 지름(mm)을 자로 측정한다. 생장저해구역의 지름은 여과지에 가한 검액의 농도 및 용해도, 확산상수 및 항균 효능에 비례한다. 이 방법은 어느 균에 대해서 항균성을 가지는지를 대략적으로 조사하기 위하여 많이 사용되며, 항균성이 나타난 클리어존의 넓이를 측정함으로써 항균성평가를 할 수 있다.

2-1. 실험 준비

본 실험의 포르피로모나스 진지발리스는 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에서 입수하였다.(KCTC5352)

포르피로모나스 진지발리스를 BHI broth 배지에 72시간 동안 37℃, CO₂ 인큐베이터에서 배양한 후, 100㎕씩 취해서 한천배지에 균일하게 도말하였다.

2-2. 실험 과정

멸균된 disk paper(Toyo seisakusho, 8 mm)를 준비하고 각 추출물 10.0㎕를 각각 disc에 주입하고 평평한 부분이 밑으로 가게 하여 도말된 고체배지에 올려놓았다. disc에 올려진 균주를 24시간 동안 37℃, CO₂ 인큐베이터에서 배양 후 클리어존(mm)을 확인하여 클리어 존의 크기로 항균능을 측정하였다.

2-3. 실험 결과

[표 2]는 황칠나무 추출물, 천연추출물 및 황칠나무 추출액과 천연추출물의 혼합물의 Paper disc diffusion 항균활성 측정 결과이다.

구 분	클리어존(mm)
황칠나무 추출물	11.20±0.09
은행나무잎 추출물	8.70±0.10
감초 추출물	7.92±0.050
녹차잎 추출물	10.10±0.61
황칠나무+은행나무잎	20.29±0.60
황칠나무+감초	10.00±0.20
황칠나무+녹차잎	12.01±0.90
살리실산	32.18±0.80

상기 [표 2]를 참조하면, 살리실산(1%)을 비교대조군으로 사용하여 살리실산(1%) 10.0㎕를 주입한 disc를 배지에 올려놓고 배양했을 때, 클리어존이 32.18±0.80mm로 나타났다. 황칠나무 추출물 10.0㎕의 클리어존은 11.20±0.09mm로 나타났으며, 황칠나무 추출물에 은행잎 추출물을 혼합한 혼합물 10.0㎕의 클리어존은 20.29±0.60mm로 나타났다. 이에 따라 황칠나무 추출물을 단독으로 사용하는 것보다 황칠나무 추출물과 은행잎 추출물을 병용하여 사용할 때의 클리어존의 크기가 크게 증가한 것을 확인할 수 있었다.

[항염증 실험]

포르피로모나스 진지발리스는 대표적으로 치주질환을 일으키는 세균으로서 잇몸 건강에 부정적인 영향을 주는 각종 인자들을 지니고 있다. LPS(단백질분해효소)를 분비하여 치주조직을 손상시키는데, 이는 구강 내 염증을 유발한다. 이러한 염증은 치아와 잇몸 사이를 벌어지게 하고, 잇몸 조직과 치조골을 손상시킨다. 따라서, 본 발명이 조성물은 포르피로모나스 진지발리스로 인해 생기는 염증에 대해 효과적으로 작용할 수 있어야 한다. 염증을 억제하는 효능을 항염이라 하며, 본 발명의 조성물이 치주질환에 의한 염증에 효과적으로 작용하는지 확인하기 위해 항염증 실험으로 NO Assay 및 PGE₂ 생성량 측정을 수행하였다.

<실험예 3> NO Assay

염증 반응에서 대식세포(Macrophage)는 리포다당류(lipopolysaccharide, LPS)와 같은 염증 유발 인자에 의해 NO를 생성한다. 일산화질소(nitric oxide, NO)는 높은 반응성을 가진 생체 생성분자로, 신경전달, 혈관의 이완 및 세포 매개성 면역반응에 관여하는데, 생체의 피부가 염증 상태에 빠지게 되면 inducible NOS(iNOS)가 발현되면서 다량의 NO가 생성된다. 이렇게 생성된 NO는 피부염을 더욱 악화시키게 된다. 과도하게 생성된 NO는 조직의 손상, 유전자 변이, 신경 손상 등을 유발하고, 혈관 투과성을 증가시켜 부종 등과 같은 염증 반응을 촉진시킨다.

NO Assay는 대식세포의 활성을 측정하는 방법 중의 하나로서, in vitro(생체 외 실험; 시험관실험) 상에서 cell supernatant(상층액)에 녹아있는 NO의 양을 정량하는 것이다. 실험쥐의 대식세포(RAW 264.7)에 염증유발 물질(LPS)과 시료를 함께 처리하고 일정 시간 이후 생성된 NO의 양을 측정하여 항염증 효과의 정도를 파악한다. 즉, 면역세포의 활성 후 분비되는 물질들 중 NO라는 특정 물질의 양을 확인하는 것이다.

3-1. 실험 준비

RAW 264.7 세포를 96-well plate에 4×10³ cells/well 농도로 분주한 후, 80% 증식할 때까지 배양한다. 80% 증식한 세포에 LPS(Lipopolysaccharide, Sigma-Aldrich, MO, USA) 1㎍/㎖를 처리하여 염증을 유도했다. 이때 추출물의 항염증 효과를 알아보기위해 추출물을 넣고 24시간 동안 세포를 배양하여 분석했다.(Control 1 : LPS를 넣지 않아 염증을 유발하지 않은 세포, Control 2 : LPS를 처리한 염증유발 세포)

3-2. 실험 과정

NO 생성량을 Griess시약으로 측정한다. Griess 시약은 2.5% phosphate용액, 1% sulfanilamide, 0.1% naphthylethylene-diamine-dihydrochloride를 혼합하여 만든다. 배양한 세포의 상등액 50㎕를 96-well plate에 취하고 여기에 Griess시약 50㎕를 가해 15분간 실온에서 반응시킨 후 microplate reader (Molecular Devices, Versa Max ELISA Microplate Reader, USA)로 540nm에서 흡광도를 측정하였다.

3-3. 실험 결과

[표 3]은 황칠나무 추출물, 천연추출물 및 황칠나무 추출액과 천연추출물의 혼합물의 NO Assay 결과이다.(Data represent the mean±SD. of four independent experiments (n=4). *p<0.05 when compared the groups treated with LPS (1 ㎍/ml) alone.)

시료명	LPS	NO 생성활성(%)
Control 1	-	2.22±1.18*
Control 2	+	100.00±3.03
황칠나무 추출물	+	70.24±4.12*
은행나무잎 추출물	+	80.20±4.35*
감초 추출물	+	86.31±3.39*
녹차잎 추출물	+	78.23±3.93*
황칠나무+은행나무잎	+	47.26±4.36*
황칠나무+ 감초	+	71.11±4.40*
황칠나무+녹차잎	+	70.03±3.36*

상기 [표 3]을 참조하면, Control 2(LPS를 처리한 염증유발 세포)의 NO 생성활성이 100.00±3.03%로 나타났다. 이와 비교하여 각 추출물들의 NO 생성활성은 그보다 낮게 나타났다. 이에 따라 각 추출물들이 RAW 264.7세포에서의 NO생성을 효과적으로 억제시킴을 확인함으로써 항염증효과를 증명하였다. 상기의 결과에 대하여 황칠나무 추출물에 은행잎 추출물을 혼합한 혼합물의 NO 생성활성이 47.26±4.36%로 가장 낮게 나타나 가장 항염증효과가 뛰어나다는 것을 알 수 있다.

<실험예 4> PGE ₂ (프로스타글란딘 E ₂ ) 생성량 측정

프로스타글란딘은 필수지방산인 아라키돈산(Arachidonic Acid)의 대사산물로서, 불포화 오메가6 지방산(polyunsaturated omega-6 fatty acid)으로 20개의 탄소로 이루어져 있다. 아라키돈산은 일련의 반응을 거치게 되며, 이 연쇄반응을 통해 COX(사이클로옥시게나제, Cyclooxygenase)라는 효소의 도움을 받아 프로스타글란딘을 생성한다. 그중에서 PGE₂는 일반적으로 염증의 초기 단계에서 국소적인 혈관 확장 및 호중구, 대식세포, 비만세포의 활성화를 촉진하는 염증의 활성을 일으키는 매개체이다. 염증을 유발하는 PGE₂의 양을 억제시켜 염증반응을 줄일 수 있다.

본 발명에서는 RAW 264.7 cell에서 LPS로 유도된 염증성 대사산물인 PGE₂의 생성 저해 효과의 확인하여 항염증 효과를 파악한다. 즉, 실험을 통해 PGE₂의 생성량을 측정하여 항염증 효과의 정도를 확인하는 것이다.

4-1. 실험 준비

PGE₂ 측정은 Prostaglandin E₂ EIA Kit를 Cayman Chemical Company(Ann Arbor, Michigan, USA)에서 구매하여 측정하였다.

4-2. 실험 과정

RAW 264.7 세포에 1μg LPS/ml와 각 추출물을 처리하고, 24시간 배양 후 PGE2 활성을 goat anti-mouse antibody로 코팅된 96-well plate에서 50㎕ 세포 상층액, 50㎕ 1 차 항체 및 50㎕ PGE₂ 접합체를 혼합하여 측정했다. 4℃에서 18시간 후, 플레이트를 세척 완충액으로 5회 세척한 다음 Ellman 시약 200㎕를 처리했다. 60~90분 동안 교반한 후, 405~420nm에서 흡광도를 측정하였다.(Control 1 : LPS를 넣지 않아 염증을 유발하지 않은 세포, Control 2 : LPS를 처리한 염증유발 세포)

4-3. 실험 결과

[표 4]는 황칠나무 추출물, 천연추출물 및 황칠나무 추출액과 천연추출물의 혼합물의 PGE₂ 생성량 측정 결과이다.(Data represent the mean±SD. of four independent experiments (n=4). *p<0.05 when compared the groups treated with LPS (1 ㎍/ml) alone.)

시료명	LPS	PGE ₂ 함량(%)
Control 1	-	11.48±1.38*
Control 2	+	100.00±8.59
황칠나무 추출물	+	65.45±4.75*
은행나무잎 추출물	+	72.23±3.98*
감초 추출물	+	73.12±3.60*
녹차잎 추출물	+	70.31±4.70*
황칠나무+은행나무잎	+	50.17±7.51*
황칠나무+감초	+	63.15±3.40*
황칠나무+녹차잎	+	65.31±3.31*

상기 [표 4]를 참조하면, Control 2(LPS를 처리한 염증유발 세포)의 PGE₂ 함량이 100.00±8.59%로 나타났다. 이와 비교하여 각 추출물들의 PGE₂ 함량은 그보다 낮게 나타났다. 이에 따라 각 추출물들에서 RAW 264.7 cell에서 LPS로 유도된 염증성 대사산물인 PGE₂의 생성 저해 효과의 확인함으로써 항염증효과를 증명하였다. 상기의 결과에 대하여 황칠나무 추출물에 은행잎 추출물을 혼합한 혼합물의 PGE₂ 함량이 50.17±7.51%로 가장 낮게 나타나 가장 항염증효과가 뛰어나다는 것을 알 수 있다.

상기 <실험예 1>와 <실험예 2>를 통해 본 발명의 조성물이 포르피로모나스 진지발리스에 대해 항균활성이 있는 것을 확인하였다. 또한, <실험예 3>와 <실험예 4>를 통해 본 발명의 조성물이 항염증효과가 있는 것을 확인하였다. 이에 대해 본 발명의 조성물의 포르피로모나스 진지발리스에 대한 항균효과로 균이 감소하여 균으로 인해 생기는 염증이 감소함으로써 항염효과를 나타내는 것으로 파악된다.

전술된 바와 같이, 본 발명의 실시예에 따른 황칠나무 추출물 또는 황칠나무 추출물과 천연추출물을 혼합한 혼합물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 치주질환의 원인균인 포르피로모나스 진지발리스에 대한 항균활성이 있어 포르피로모나스 진지발리스의 증식을 억제하며, 치주질환에 의한 염증에 대해 항염증효과가 있어 치주질환 예방, 개선 또는 치료 효과가 있다. 또한, 상기 조성물은 치약류, 껌, 구강 세정제, 구강 청정제, 구강용 스프레이, 구강용 연고제 및 구강용 패치 중 어느 하나 이상의 제형으로 적용될 수 있다.

이상, 실시예 및 실험예를 들어 본 발명을 상세하게 설명하였으나, 본 발명은 상기 실시예들에 한정되지 않으며, 여러 가지 다양한 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 기술적 사상 내에서 당 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의하여 여러 가지 많은 변형이 가능함이 명백하다. 또한, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 형태의 치환, 변형 및 변경이 가능할 것이며, 이 또한 본 발명의 범위에 속한다고 할 것이다.

Claims

황칠나무 추출물을 유효성분으로 포함하고, 포르피로모나스 진지발리스에 대해 항균활성을 갖는 것을 특징으로 하며,
상기 황칠나무 추출물은 물을 이용한 열수추출물을 동결건조하여 제조되는 것을 특징으로 하는 치주질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물.
청구항 1항에 있어서,
상기 황칠나무 추출물과 천연추출물을 1:1의 중량비로 혼합한 것을 특징으로 하며,
상기 천연추출물은 은행나무잎, 감초, 녹차잎 추출물 중에서 선택되는 하나 이상이고,
상기 천연추출물은 물을 이용한 열수추출물을 동결건조하여 제조되는 것을 특징으로 하는 치주질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물.
청구항 1항에 있어서,
상기 황칠나무 추출물은 황칠나무의 잎 및/또는 줄기를 사용하여 추출한 것을 특징으로 하는 치주질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물.
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