KR101881319B1

KR101881319B1 - 흑효모균 및 유산균을 이용하여 발효한 인삼열매 발효물을 함유하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR101881319B1
Application number: KR1020160139498A
Authority: KR
Inventors: 박지은; 이동걸; 노윤화; 이경은; 남진주; 김민지; 강승현; 김연준
Original assignee: 코스맥스 주식회사
Priority date: 2016-10-25
Filing date: 2016-10-25
Publication date: 2018-07-27
Also published as: WO2018080139A1; KR20180045932A; CN109843263B; CN109843263A

Abstract

본 발명은 인삼열매를 흑효모균(Aureobasidium pullulans CXHB-8) 및 유산균으로 이중 발효시켜 얻은 인삼 열매 발효물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 인삼열매를 흑효모균 및 유산균으로 이중 발효시켜 얻은 인삼 열매 발효물을 함유하는 화장료 조성물의 경우, 세포증식을 촉진하고, 손상된 세포를 회복시키며, 콜라겐 분해를 저해시킴으로써 피부노화를 억제하고 주름을 개선할 수 있다.

Description

흑효모균 및 유산균을 이용하여 발효한 인삼열매 발효물을 함유하는 화장료 조성물{Cosmetic composition comprising ginseng fruit Fermentation Product by Aureobasidium pullulans and lactic acid bacteria}

본 발명은 인삼열매 발효물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 인삼열매를 흑효모균(Aureobasidium pullulans CXHB-8) 및 유산균으로 이중 발효시켜 얻은 인삼열매 발효물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

인삼(Panax ginseng C.A. Meyer)은 오가피과 인삼 속에 속하는 식물로서 한국, 중국 및 일본 등지에서 2,000여 년 전부터 사용되어 온 생약이며, 경험적으로 질병을 예방하고 수명을 연장시킬 목적으로 사용되어 왔다. 지금까지 알려진 인삼의 효능 및 효과는 중추신경계에 대한 작용, 항발암 작용, 항암활성, 면역기능 조절작용, 항당뇨 작용, 간기능 항진효능, 심혈관 장해개선, 항동맥경화 작용, 혈압조절 작용, 갱년기 장애 개선, 골다공증에 미치는 효과, 항스트레스 및 항피로 작용, 항산화 활성 및 노화억제 효능 등이 있다(최신고려인삼 '성분 및 효능편', 한국인삼연초연구원, 56-112, 1996). 인삼의 대표적 생리활성 성분인 진세노사이드(Ginsenoside)는 인삼의 지상 및 지하부에 고르게 분포되어 있으며, 특히 인삼근(뿌리), 인삼엽 및 인삼열매 등 부위에 따라 진세노사이드 함량뿐만 아니라 조성도 다른 것으로 알려져 있다(Attele AS et al, Biochem Pharmacol, 58; 1685-1693, 1999). 특히 인삼열매는 인삼근(뿌리)과 다른 진세노사이드의 성분과 그 함량을 바탕으로 항당뇨 효능에 있어서 인삼근 보다 우수한 결과를 나타내는 것으로 보고되어 있다(Dey L. et al., Phytomedicine, 10; 600-605, 2003).

최근 천연 화장품에 대한 소비자의 관심이 증대되고 동시에 한방 소재를 활용하는 많은 화장품들이 출시되면서 인삼도 화장품의 중요한 피부효능을 가진 식물 소재로 연구되고 있으나, 대부분 인삼근을 이용한 추출물 또는 인삼근의 진세노사이드 성분과 인삼 다당체를 활용한 것일 뿐 인삼열매의 성분에 의한 피부 노화억제와 주름개선 효능에 대한 것은 전무한 실정이다. 또한 인삼열매는 예로부터 인삼보다도 귀하게 여겨지는 것으로서 종자 획득을 목적으로 선별되어 수확되어 왔다. 인삼열매는 인삼의 재배기간 중 4년생에 한해서 1회만 채종하게 되며, 3년생에서 채종하면 종자가 너무 작기 때문에 좋은 묘삼을 생산하기가 어렵고 5년생 이상에서 채종하면 종자는 충실하고 좋으나 인삼뿌리의 비대발육을 억제할 뿐만 아니라 조직이 치밀하지 못하여 홍삼을 제조할 때 홍삼품질이 크게 저하될 수 있다. 또 채종횟수를 재배기간 중에 2회 이상으로 채종하면 수량 및 홍삼품질이 크게 저하된다(최신고려인삼 '재배편', 한국인삼연초연구원, 130-131, 1996).

미국등록특허 제6524626호에서 인삼열매즙을 동결건조하여 화장료 조성물에 사용하고 있으며, 인삼열매즙과 다른 천연물을 복합적으로 사용함으로써 이들이 보습과 피부유연효과를 나타낸다고 기재하고 있으나, 이는 본 발명에 의한 인삼열매 추출물이 나타내는 피부 노화억제 효능 및 주름개선 효능으로서의 화장품 용도와는 분명 구분되는 것이다.

인간의 피부는 나이가 들어감에 따라 여러 가지 내적, 외적 요인에 의해 변화를 겪는다. 즉, 내적으로는 신진대사를 조절하는 각종 호르몬의 분비가 감소하고, 면역 세포의 기능과 세포들의 활성이 저하되어 생체에 필요한 면역 단백질 및 생체 구성 단백질들의 생합성이 줄어들게 되며, 외적으로는 오존층 파괴로 인하여 태양광선 중 지표에 도달하는 자외선의 함량이 증가하고 환경오염이 더욱 심화됨에 따라 자유 라디칼 및 활성 유해 산소 등이 증가함으로써, 피부의 두께가 감소하고, 주름이 증가하며, 탄력이 감소될 뿐 아니라 피부 혈색도 칙칙해지고, 피부 트러블이 자주 발생하며, 기미와 주근깨 및 검버섯 또한 증가하는 등 여러 가지 변화를 일으키게 된다.

노화가 진행될수록 피부를 구성하는 물질인 콜라겐, 엘라스틴, 히아루론산 및 당단백질의 함유량 및 배열이 변하거나 감소하는 증상들이 나타나게 되고, 자유라디칼 및 활성 유해 산소에 의한 산화적 스트레스를 받게 된다. 또한 피부를 구성하는 대부분의 세포에서는 노화가 진행되거나 자외선에 의해서 염증을 일으킨다고 알려져 있는 전염증성 사이토카인(proinflammatory cytokine)을 생성하는 효소인 사이클로옥시게나제-2(Cox-2, cyclooxygenase)의 생합성이 증가하고, 이들 염증성 인자에 의해 피부조직을 분해하는 효소인 매트릭스 메탈로프로테아제(MMP, Matrix metalloproteinase)의 생합성이 증가하며, iNOS(inducible nitric oxide synthase)에 의한 NO(nitric oxide) 생성이 증가하는 것으로 알려져 있다. 즉, 자연적으로 진행되는 내인성 노화에 따른 세포 활성의 감소 및 미세염증에 의해 기질물질의 생합성이 감소되고, 여러 가지 유해 환경에 의한 스트레스의 증가 및 태양 광선에 의한 활성산소종의 증가와 같은 외적 요인에 의해 분해 및 변성이 가속화되어 피부 기질이 파괴되고 얇아지면서 피부 노화의 제반 증상들이 나타나게 된다. 따라서, 이러한 노화의 현상들을 방지하고, 개선시킬 수 있는 활성성분에 대하여 많은 연구가 행해지고 있는 것이 현실이다.

그동안 주름개선을 위한 소재로는 주로 비타민C, α-토코페롤, 레티놀 및 그의 유도체 등이 화장품 및 의약품에 배합되어 이용되어 왔으나 이들은 제형에 배합되었을 경우 변취 현상이 발생하거나 화학적 안정성이 좋지 못하다는 단점이 있다. 이러한 단점을 극복하기 위해 최근 천연물 유래 물질들을 이용한 주름개선용 화장료 조성물의 개발이 각광받고 있으며 이의 발굴을 필요로 한다.

이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 인삼열매를 흑효모균 및 유산균으로 이중 발효시켜 얻은 인삼열매 발효물을 함유하는 화장료 조성물의 경우, 세포증식을 촉진하고, 손상된 세포를 회복시키며, 콜라겐 분해를 저해시킴으로써 피부노화를 억제하고 주름을 개선시킬 수 있음을 확인하고, 본　발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 세포증식을 촉진하고, 손상된 세포를 회복시키며, 콜라겐 분해를 저해시킴으로써 피부노화를 억제하고 주름을 개선 시킬 수 있는 흑효모균 및 유산균을 이용하여 이중 발효한 인삼열매 발효물을 함유하는 화장료 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 인삼열매를 흑효모균(Aureobasidium pullulans) 및 유산균으로 이중 발효시켜 얻은 인삼열매 발효물을 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.

최근 천연 화장품에 대한 소비자의 관심이 증대되면서 인삼도 화장품 소재 중 하나로 연구되고 있으나, 인삼 열매 성분의 피부노화 억제 및 주름 개선 효능에 대한 연구는 아직 미미하다. 이에, 본 발명자들은 인삼열매를 흑효모균 및 유산균으로 이중 발효한 발효물의 경우, 피부노화 억제 및 주름 개선에 효과적인 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

흑효모균 Aureobasidium 속의 균은 환경에서 쉽게 볼 수 있고, 보통 과실이나 야채의 병원균으로 존재한다. 형태적으로는 동일하나 흑효모균으로 딸기의 오염곰팡이와 곰팡이 냄새를 갖지 않는 점에서 다르다. 콜로니(colony)는 회색 또는 흑색, 격벽을 내며 길이가 긴 기균사로부터 불규칙하게 지분되어 팽대한 말단세포의 방상의 치상 돌기에서 다수의 분생자를 형성한다. 흑효모균(Aureobasidium pullulans)은 유럽에서는 포도주를 제조할 때 이용된다고 알려져 있으나, 인삼열매를 발효하기 위하여 이용된 적은 없다.

본 발명에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스(Lactobacillus sp.), 류코노스톡(Leuconostoc sp.) 및 비피도박테리아(Bifidobacteria sp.)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상임을 특징으로 한다. 본원발명에서는 Lactobacillus sp. CXHB-5 균주를 이용하였다.

본 발명에 있어서, 상기 인삼열매 발효물은 다음 2단계의 발효공정으로 발효시키는 것을 특징으로 한다.

a) 인삼열매를 고체 백지위에 놓고 흑효모균을 접종하여 고상 발효하는 1차 발효 단계, 및

b) 상기 1차 발효된 인삼열매를 액체 배지에 넣고 유산균으로 액상발효하는 2차 발효 단계.

본 발명에서 상기 고상 발효란 분쇄된 소재를 고체화시켜 놓고 공기에 완전히 노출시켜 공기를 매체로 이용하여 고체 상태로 발효하는 것을 의미한다. 상기 고체화는 당업계에 알려진 어떠한 고체화 소재도 사용가능하나 바람직하게는 아가(agar) 를 사용하는 것이 좋다. 고상발효는 액상발효와 비교하였을 때, 기능성물질의 다양성과 생산량이 극대화 되는 것으로 알려져 있으며, 수율 또한 우수하다. 이에 반하여, 액상 발효란 발효 소재를 액체 배지에 넣고 물을 매체로 이용하여 액체 상태로 발효하는 것을 의미한다.

종래에 인삼열매를 효모 또는 유산균 단독으로 액상 발효하는 것은 이미 알려져 있으나, 흑효모균을 이용하여 고상 발효한 후, 유산균을 이용하여 액상 발효하는 것은 아직 알려진 바 없다. 또한, 인삼열매를 흑효모균 및 유산균을 이용하여 고상발효 및 액상발효하는 경우, 흑효모균 또는 유산균 단독으로 발효하는 것보다 더 우수한 효과를 나타내는 것을 본 발명에서 확인하였다. 구체적으로, 본 발명의 실험예에서, 흑효모균 및 유산균을 이용하여 이중 발효한 발효물의 경우, 흑효모균 또는 유산균 단독으로 발효하는 것보다 더 우수한 피부노화 억제 및 주름개선 효과를 나타내었다.

본 발명에 있어서, 상기 인삼 열매 발효물은 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 50.0중량% 함유할 수 있으며, 바람직하게는 0.001 내지 30.0중량%의 양으로 함유됨을 특징으로 한다. 상기 유효성분의 함량이 0.001중량% 미만일 경우에는 효능· 효과가 미약하고, 30중량%를 초과할 경우에는 제형 안정화에 문제가 있으며, 함량의 증가에 따른 효능의 증가가 미약하다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 피부 노화억제 및 주름개선 효과를 갖는 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 조성물은 콜라겐 분해효소인 MMP-1 억제효과를 나타내며, 세포재생과 세포증식 효과를 나타내는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 실험예에 따르면, 인삼열매를 흑효모균만으로 고상 발효한 발효물이 인삼열매 파쇄물보다 우수한 콜라겐분해 억제 및 세포재생 효과를 나타내었으나, 인삼열매 흑효모균 발효물을 유산균으로 추가 발효한 발효물의 경우가 인삼열매 파쇄물 및 인삼열매 흑효모균 발효물보다 더욱 우수한 콜라겐분해 억제효과 및 세포증식, 세포재생 효과를 나타내는 것을 확인하였다. 이러한 결과로 볼 때, 인삼열매를 흑효모균 및 유산균으로 이중 발효한 발효물은 피부노화 억제 및 주름 개선 효과를 나타낼 수 있음을 알 수 있다(실험예 1 내지 3 참조).

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클렌저로 구성된 그룹에서 선택된 하나 이상의 제형인 것을 특징으로 한다. 예를 들면 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 아이에센스, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 파우더, 보디로션, 보디크림, 보디오일, 보디에센스 등의 화장료 제형을 가질 수 있으며, 또한 로션, 연고, 겔, 크림, 패취 또는 분무제와 같은 경피 투과형 제형을 갖는 화장료 조성물 일 수 있다.

이하, 본 발명을 단계별로 보다 구체적으로 설명한다.

본원발명의 인삼열매 발효물은 다음 2 단계로 제조할 수 있다.

a) 인삼열매 파쇄물을 고체화시키고 흑효모균을 접종하여 고상 발효하는 발효 단계; 및

b) 상기 a) 단계에서 1차 발효된 인삼열매를 액체 배지에 넣고 유산균을 추가 접종하여 액상 발효하는 2차 발효 단계.

본 발명의 조성물에 사용되는 인삼열매의 발효 추출물의 제조방법은 특별히 한정되며, 당업계에 공지된 일반적인 방법을 이용할 수 있고, 구체적으로는 인삼열매에 상기 균을 첨가, 배양하고 발효시켜 수득할 수 있다.

보다 구체적으로, 발효시 흑효모균(Aureobasidium pullulans CXHB-8)을 사용할 경우에는 열매전체를 분쇄하고 고체화 소재를 첨가하여, Aureobasidium pullulans CXHB-8 종균을 접종하여 5일간 배양한다. 이때 사용되는 균체는(약 10⁵ ~10⁷ cell/mL)로 접종하여 배양한다. 5일간 배양 후 1차 발효된 인삼열매 착즙액 고체화 소재는 재회수하여 70% ETOH 로 2일간 추출한 뒤 추출액은 동결건조 시킨다.

이상 설명한 바와 같이, 흑효모균 및 유산균을 이용하여 이중 발효한 인삼열매 발효물을 함유하는 화장료 조성물의 경우, 피부노화 억제 및 주름 개선 효과를 통해 피부에 안전하면서도 전반적인 피부 상태를 개선시키는 효과를 제공할 수 있다.

도 1은 세포증식 효과를 나타내는 도면이다.
도 2는 세포손상 재생 효과를 나타내는 도면이다.
도 3은 MMP-1 발현 저해 효과를 나타내는 도면이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

비교예 1: 흑효모균, 유산균 추출물

1. 흑효모균 추출물

인삼에서 분리한 흑효모균(Aureobasidium pullulans CXHB-8)을 배양하기 위해 PDA배지를 1리터 습식 고압멸균(121℃)을 실시한다. 멸균후 배지를 100 파이 패트리접시에 부어 고체상태로 굳힌다. 굳힌 PDA 배지 가운데에 종균을 접종하여 약 7일간 28℃ 인큐베이터에서 배양한다. 배양후 균체가 형성된 부분을 멸균된 수술용 칼을 사용하여 잘라낸 뒤 균체 5g 을 멸균증류수 50ml 에 용해시키고 초음파 파쇄기를 사용하여 1분간 세포를 파쇄한 뒤 원심분리기를 사용하여(4000 Xg) 분리된 상층액을 비교실험에 사용하였다.

2. 유산균 추출물

인삼에서 분리한 유산균종균(Lactobacillus sp. CXHB-5)을 배양하기 위해 MRS배지를 1리터 습식 고압멸균(121℃) 을 실시한다. 멸균 후 온도를 25℃까지 냉각하고, 종균을 접종한다. 접종된 MRS 배지는 37℃, 정치배양을 5일간 실시하였다. 5일간 배양하였을때 균체량이 균체량이 10⁹ /ml정도로 확인되었다. 배양액은 원심분리기를 사용하여 4000 Xg 로 1시간 원심분리하여 상층액을 제거 후 3차 멸균증류수로 2번 세척하였다. 세척이 완료된 균체는 상온(25℃)에서 4일간 건조시키고 건조가 완료된 균체 5g 을 멸균증류수 50ml에 재용해시키고 초음파 파쇄기를 사용하여 1분간 세포를 파쇄한 뒤 원심분리기를 사용하여(4000 Xg) 분리된 상층액을 비교실험에 사용하였다.

비교예 2: 인삼열매 추출물의 제조

1. 인삼열매 전처리

생(生)인삼열매를 수확하여 종자를 분리하여 제거한 후 인삼열매의 과육과 과피를 일광건조 또는 흐르는 물 세척을 통하여 전처리 하였다.

2. 인삼열매 멸균처리 및 고체화

생(生)인삼열매를 세척 후 121℃ 고압 습식멸균을 실시하고, 열매 전체를 분쇄한다. 분쇄가 완료된 인삼열매에 아가(agar)를 1.5% 첨가고 60℃로 가열한 뒤 냉각시켜 고체화 시킨다.

3. 종균 준비

미리 준비된 종균 Aureobasidium pullulans CXHB-8 을 10⁵-10⁷수준이 되도록 접종하였으며 28도 항온기에서 5일간 배양하였다.

4. 인삼열매 추출물

멸균처리된 생 인삼열매를 분쇄하여 착즙기에서 추출을 실시하고, 수분함량을 줄여 농축과정을 진행하였다. 이때 농축정도는 6브릭스가 되도록 설정하여 농축하여 최종적으로 인삼열매 추출물을 제조하였다.

비교예 3: 유산균을 이용한 인삼열매 발효 추출물

상기 비교예 2의 인삼열매 파쇄물에 유산균을 접종한 뒤 사전 배양된 자체 분리 개발한 유산균(Lactobacillus sp. CXHB-4)을 인삼열매 파쇄물: MRS media의 비율이 1:2비율이 되도록 접종하여 5일(120h) 간 배양을 실시한다. 접종에 사용되는 균체량은 10⁵-10⁷ 이며, 배양온도는 37℃로 항온배양 실시한다. 5일 뒤에는 인삼열매파쇄 유산균 발효물을 회수하고, 70% 에탄올로 2일간 추출 후 추출된 액상을 동결건조 시킨다.

비교예 4: 흑효모균을 이용한 인삼열매 발효 추출물

상기 비교예 2의 인삼열매 파쇄물을 tray에 살포한 뒤 사전 배양된 흑효모균(Aureobasidium pullulans CXHB-8)을 tray 가운데에 접종하여 5일(120h)간 1차 배양 실시한다. 접종에 사용되는 균체량은 10⁵-10⁷ 이며, 배양온도는 28℃로 항온배양 실시한다. 5일 뒤에는 고체화시킨 인삼열매 발효물을 회수하고, 70% 에탄올로 2일간 추출 후 추출된 액상을 동결건조 시킨다.

실시예 1: 흑효모균 및 유산균을 이용한 인삼열매 발효 추출물

상기 비교예 2의 인삼열매 파쇄물에 사전 배양된 흑효모균을 tray 가운데에 접종하여 7일(168h)간 고체배양을 실시한다. 7일 뒤에는 tray 위의 발효된 인삼열매를 재회수하고 MRS media와 1:2의 비율로 혼합하여 121℃ 고압 멸균처리한다. 최종 멸균된 MRS media와 흑효모균 고체발효처리 인삼열매 파쇄물 혼합배양 배지에 자체 분리 개발한 락토바실러스 (Lactobacillus sp. CXHB-4)를 10⁷-10⁹cell/mL로 접종하고, 5일(120h)간 배양을 실시하고, pH 6.5~7.5, 온도 35~38℃, 통기량 1VVM의 조건을 유지하면서 액체 배양하였다. 상기 발효액을 10000 Xg에서 30분간 원심분리하여 고분자 침전물과 균체가 제거된 최종 인삼열매 발효 추출물을 얻었다.

시험예 1: 세포증식 촉진능 평가

실시예와 비교예들의 세포증식 촉진능 비교를 위해 인간 섬유아세포주인 Hs68 fibroblast에서 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 시약을 이용한 측정법으로 실험을 수행하였다.

인간 섬유아세포주인 Hs68 fibroblast를 2x10⁴ cells/well 농도로 96 well plate에 분주한 후, 37℃, 5% CO₂ 조건의 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 실시예와 비교예들의 샘플을 각각 10㎍/mL의 농도로 첨가하는 배지로 세포배양액을 교체해 준 다음 24시간 동안 추가로 배양하였다. 배양 후 각 well의 배지를 제거하고 DPBS washing 과정을 1회 거친 다음 0.5mg/mL 농도의 MTT 시약을 첨가하여 37℃에서 4시간 동안 반응시켰다. 반응과정에서 형성된 formazan crystal을 MTT 시약을 제거한 다음 DMSO(dimethyl sulfoxide)로 용해시킨 다음 spectrophotometer를 이용하여 590 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율은 샘플 없이 배지만 첨가한 대조군의 평균 흡광도 값에 대한 백분율로 나타내었다.

그 결과, 도면 1에 나타낸 바와 같이 본원발명의 실시예 1의 인삼열매 흑효모균 및 유산균 혼합 발효물이 동일 농도의 모든 샘플 중에서 가장 뛰어난 세포증식 촉진 효능을 나타냄을 확인하였다. (control 대조군에 대하여 ^# p<0.05, ^## p<0.01)

시험예 2: 세포손상 회복능 평가

자외선에의 노출은 세포에 직접적인 손상을 주어 세포 증식을 억제하는 작용을 갖는다. 이에 대한 실시예와 비교예들의 세포손상 회복능을 비교하기 위하여 자외선을 조사한 인간 섬유아세포주(Hs68)를 이용한 실험을 수행하였다.

시험예 1에서와 동일 농도로 접종 및 배양한 섬유아세포에서 배지를 제거하고 DPBS를 넣어준 다음 control을 제외한 나머지 세포군에 15 mJ/cm²의 UVB를 조사한 뒤 실시예와 비교예들의 샘플을 각각 10㎍/mL 농도로 첨가하는 배지로 세포배양액을 교체하여 24시간 동안 추가 배양하였다. 이후의 MTT 시약을 이용한 시험법은 시험예 1에서와 동일한 방법으로 진행하였다.

그 결과, 도면 2의 결과와 같이 본원발명의 실시예 1의 인삼열매 흑효모균 및 유산균 혼합 발효물에서 가장 뛰어난 세포손상 회복 효능을 나타냄을 확인하였다. (control 대조군에 대하여 ^## p<0.01, UVB 대조군에 비하여 ^* p<0.05)

시험예 3: 콜라겐 분해 억제능 평가

콜라겐 분해를 통해 주름생성에 가장 큰 영향을 미치는 MMP-1(matrix metalloproteinase 1)에 대한 실시예와 비교예들의 발현 억제능을 비교하기 위해 인간 섬유아세포주(Hs68)를 이용한 MMP-1 발현량 측정을 진행하였다.

섬유아세포주 Hs68을 6 well plate에 4x10⁵의 수만큼 분주한 후, 37℃, 5% CO₂ 조건의 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 배지를 제거하고 DPBS를 넣어준 후, control을 제외한 나머지 세포군에 15 mJ/cm²의 UVB를 조사한 뒤 실시예와 비교예들의 샘플을 각각 10 ㎍/mL의 농도로 첨가하여 24시간 동안 추가로 배양하였다. 이후 각 샘플을 처리한 세포에서 트리졸(RNA iso, DAKARA, 일본)을 이용하여 RNA를 분리한 뒤 nanodrop으로 260nm 파장에서 RNA를 정량하고 각각 2 ㎍의 RNA를 사용하여 증폭기에서 cDNA를 합성하였다(C1000 Thermal Cycler, Bio-Rad, 미국). 합성된 cDNA에 타겟 단백질인 MMP-1 주형과 시아닌 염료인 사이버그린(SYBR Green supermix, Applied Biosystems, 미국)을 첨가한 혼합물을 이용하여 real-time PCR 기계에서 실시간 중합효소 연쇄반응을 실시함으로써 최종적으로 MMP-1 유전자의 발현 정도를 평가하였다. 주형의 서열과 반응 조건은 하기 표 1과 같았으며, 유전자의 발현량은 β-actin 유전자에 대한 보정을 통해 최종적으로 분석하였다.

주형(primer)		서열	반응 조건
MMP-1	F	5’-CGAATTTGCCGACAGAGATGA-3’	94℃, 5분 동안 중합효소 활성화 후, 95℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 30초 조건에서 40사이클로 중합반응
MMP-1	R	5’-GTCCCTGAACAGCCCAGTACTT-3’
β-Actin	F	5’-GGCCATCTCTTGCTCGAAGT-3’
β-Actin	R	5’-GAGACCTTCAACACCCCAGC-3’

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 UVB 조사군에서 콜라겐 분해효소인 MMP-1의 발현량이 급격히 증가한 것에 반해 실시예 1의 인삼열매 흑효모균 및 유산균 혼합 발효물이 인삼열매 흑효모균 발효물(비교예 4)과 인삼열매 유산균 발효물(비교예 3)에 비해 월등히 뛰어난 MMP-1 발현 억제 효능을 보였다(control 대조군에 대하여 ^## p<0.01, UVB 대조군에 비하여 ^* p<0.05, ^** p<0.01).

Claims

인삼열매를 흑효모균(Aureobasidium pullulans) 및 락토바실러스(Lactobacillus sp.) 유산균으로 이중 발효시켜 얻은 인삼열매 발효물을 함유하는 화장료 조성물로서, 상기 인삼열매 발효물은 다음 2단계의 발효공정으로 발효시키는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물:
a) 인삼열매가 포함된 고체 배지에 흑효모균을 접종하여 고상 발효하는 1차 발효 단계, 및
b) 상기 1차 발효된 인삼열매를 액체 배지에 넣고 락토바실러스 유산균으로 액상발효하는 2차 발효 단계.
삭제
삭제
제 1항에 있어서, 상기 인삼열매 발효물은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 30.0중량% 함유하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 피부 주름개선용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 콜라겐분해효소인 MMP-1 억제효과를 나타내고, 세포재생과 세포증식 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클렌저로 구성된 그룹에서 선택된 하나 이상의 제형인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.