WO2018080139A1 - 흑효모균 및 유산균을 이용하여 발효한 인삼열매 발효물을 함유하는 화장료 조성물 - Google Patents

흑효모균 및 유산균을 이용하여 발효한 인삼열매 발효물을 함유하는 화장료 조성물 Download PDF

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ginseng fruit
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ginseng
lactic acid
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이동걸
노윤화
이경은
남진주
김민지
강승현
김연준
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Definitions

  • the present invention relates to a cosmetic composition containing a ginseng fruit fermented product, and more particularly to a cosmetic composition containing a ginseng fruit fermented product obtained by double fermentation of ginseng fruit with Aureobasidium pullulans CXHB-8 and lactic acid bacteria. .
  • Ginseng (Panax ginseng C.A. Meyer) is a plant belonging to the genus Ogapi and ginseng, which has been used in Korea, China, and Japan for more than 2,000 years, and has been used to prevent disease and extend life.
  • Ginsenoside a representative physiologically active ingredient of ginseng, is distributed evenly in the ground and underground parts of ginseng.
  • ginsenoside content and composition are different depending on the parts such as ginseng root (root), ginseng leaf and ginseng fruit.
  • ginseng fruit has been reported to show better results than ginseng root in antidiabetic efficacy based on the components and contents of ginseng root (root) and other ginsenosides (Dey L. et al., Phytomedicine, 10; 600-605, 2003).
  • ginseng is also being studied as a plant material having important skin effects of cosmetics, but most of them are extracts or ginseng roots of ginseng root. Only the side ingredients and ginseng polysaccharides are used, and there is no information on the effects of skin aging and wrinkle improvement by the ingredients of ginseng fruit. In addition, ginseng fruit is considered more precious than ginseng since ancient times, and has been selected and harvested for the purpose of obtaining seeds. Ginseng fruit is only harvested once every 4 years during the cultivation period of ginseng. It is difficult to produce good seedlings because seed is too small when grown in 3 years, and seeds are faithful and good when harvested in 5 years or more.
  • the tissue is not dense, so red ginseng quality may be greatly reduced when manufacturing red ginseng.
  • the number and frequency of red ginseng deterioration is greatly reduced when the number of crops is collected more than two times during the cultivation period.
  • US Patent No. 6624626 lyophilized ginseng berry juice is used in the cosmetic composition, by using a combination of ginseng berry juice and other natural products described that they exhibit a moisturizing and skin softening effect, which is according to the present invention It is clearly distinguished from cosmetic use as an anti-aging effect and an antiwrinkle effect exhibited by the extract.
  • Human skin is changed by a number of internal and external factors as it ages. That is, internally, the secretion of various hormones that regulate metabolism decreases, and the function of immune cells and the activity of cells decreases, thereby reducing the biosynthesis of immune proteins and constituent proteins necessary for living organisms. Due to the increase in the amount of ultraviolet rays that reach the surface of the sunlight and further increase environmental pollution, free radicals and free radicals, such as free radicals, skin thickness, wrinkles, elasticity not only decreases, The color of the skin becomes dull, skin problems frequently occur, and there are various changes such as blemishes, freckles, and black mushrooms.
  • the biosynthesis of the substrate material is reduced due to the decrease of cellular activity and micro-inflammatory due to the naturally occurring endogenous aging, and the external factors such as the increase of stress caused by various harmful environments and the increase of reactive oxygen species caused by sunlight.
  • Degradation and degeneration are accelerated by this, resulting in the destruction and thinning of the skin matrix, resulting in various symptoms of skin aging. Therefore, a lot of research is being conducted on the active ingredient that can prevent and improve the phenomenon of aging.
  • vitamin C As a material for improving wrinkles, vitamin C, ⁇ -tocopherol, retinol and derivatives thereof have been used in cosmetics and medicines, but they have disadvantages such as bad smell or poor chemical stability when formulated in formulations. have. In order to overcome these disadvantages, the development of a cosmetic composition for improving wrinkles using natural-derived materials has recently been in the spotlight and requires the excavation thereof.
  • the present inventors have made diligent research to overcome the problems of the prior art, in the case of the cosmetic composition containing the ginseng fruit fermentation product obtained by double fermentation of ginseng fruit with black yeast and lactic acid bacteria, promote cell proliferation, damaged By restoring cells, inhibiting collagen degradation, it was confirmed that skin aging and wrinkles could be improved, and the present invention was completed.
  • the main object of the present invention is to double-fermented ginseng fruit fermented product using black yeast and lactic acid bacteria that can suppress skin aging and improve wrinkles by promoting cell proliferation, repairing damaged cells, inhibiting collagen degradation It is to provide a cosmetic composition containing a.
  • the present invention provides a cosmetic composition containing a ginseng fruit fermented product obtained by double fermentation of ginseng fruit with Aureobasidium pullulans and lactic acid bacteria.
  • ginseng is being studied as one of cosmetic ingredients, but studies on the effects of ginseng fruit ingredient on skin aging and wrinkle improvement are still insufficient. Accordingly, the present inventors have confirmed that the fermented product obtained by double fermenting ginseng fruit with black yeast and lactic acid bacteria, is effective in suppressing skin aging and improving wrinkles, and completed the present invention.
  • Bacteria in the black yeast Aureobasidium are easily visible in the environment and usually exist as fruit or vegetable pathogens. It is the same in form, but it differs in that it is not yeast stain and mildew odor of black yeast. Colonies are gray or black, septum and irregularly occupied by long mycelia, forming multiple conidia in the dendritic spines of bulging terminal cells. Black yeast (Aureobasidium pullulans) is known to be used to make wine in Europe, but has not been used to ferment ginseng fruit.
  • the lactic acid bacteria is characterized in that at least one selected from the group consisting of Lactobacillus sp., Leuconostoc sp. And Bifidobacteria sp.
  • Lactobacillus sp. Leuconostoc sp.
  • Bifidobacteria sp Bifidobacteria sp.
  • L actobacillus sp. CXHB-5 strain was used.
  • the ginseng fruit fermentation is characterized in that the fermentation in the following two stages of fermentation process.
  • the solid phase fermentation means that the ground material is solidified and completely exposed to air to ferment in a solid state using air as a medium.
  • the solidification may be any solidification material known in the art, but preferably, agar is used.
  • Solid phase fermentation is known to maximize the diversity and production of functional materials when compared with liquid fermentation, and yield is also excellent.
  • liquid fermentation means fermentation material into a liquid medium and fermented in a liquid state using water as a medium.
  • liquid fermentation of ginseng fruit by yeast or lactic acid bacteria alone is already known, but after solid-phase fermentation using black yeast bacteria, liquid fermentation using lactic acid bacteria is not yet known.
  • the ginseng fruit exhibited a better effect than the fermentation of black yeast or lactic acid alone when the solid phase fermentation and the liquid fermentation using black yeast and lactic acid bacteria.
  • the experimental example of the present invention in the case of fermentation double fermentation using black yeast and lactic acid bacteria, it showed a better skin aging inhibitory and wrinkle improvement effect than fermentation alone with black yeast or lactic acid bacteria alone.
  • the ginseng fruit fermented product may contain 0.001 to 50.0% by weight based on the total weight of the cosmetic composition, preferably characterized in that it is contained in an amount of 0.001 to 30.0% by weight.
  • the content of the active ingredient is less than 0.001% by weight, the efficacy and effect is weak, and when it exceeds 30% by weight, there is a problem in stabilization of the formulation, and the increase in efficacy by the increase of the content is weak.
  • the composition is characterized in that it has a skin aging inhibitory and wrinkle improvement effect.
  • the composition exhibits an MMP-1 inhibitory effect, a collagen degrading enzyme, and is characterized by cell regeneration and cell proliferation effects.
  • the fermentation product obtained by solidifying only ginseng fruit with black yeast showed better collagen degradation and cell regeneration effect than the ginseng fruit crushed product
  • the fermentation product further fermented with ginseng fruit black yeast fermented product as lactic acid bacteria. It was confirmed that the case showed better collagen degradation inhibitory effect, cell proliferation, and cell regeneration effect than ginseng fruit crushed and ginseng fruit yeast fermented product.
  • the fermentation product of double ginseng fruit with black yeast and lactic acid bacteria is synergistic for inhibiting skin aging and wrinkle improvement. ), It can be seen that the effect (see Experimental Examples 1 to 3).
  • the composition is a skin lotion, skin softener, skin toner, astringent, lotion, milk lotion, moisturizing lotion, nutrition lotion, massage cream, nutrition cream, moisturizing cream, hand cream, foundation, essence, nutrition essence, pack It is characterized in that at least one formulation selected from the group consisting of, soap, cleansing foam, cleansing lotion, cleansing cream, body lotion and body cleanser.
  • Ginseng fruit fermentation of the present invention can be prepared in the following two steps.
  • Method for producing a fermentation extract of ginseng fruit used in the composition of the present invention is particularly limited, can be used a general method known in the art, specifically, can be obtained by adding the culture to the ginseng fruit, incubated and fermented have.
  • the cosmetic composition containing ginseng fruit fermented by double fermentation using black yeast and lactic acid bacteria can provide an effect of improving skin condition while improving safety and overall skin condition through skin aging inhibitory and wrinkle improvement effect. Can be.
  • 3 is a view showing the inhibitory effect of MMP-1 expression of Comparative Examples and Examples.
  • Comparative Example 1 Black yeast, lactic acid bacteria extract
  • PDA medium is subjected to 1 liter wet autoclaving (121 °C). After sterilization, the medium is poured into a 100 pie petri dish to solidify. The seed is inoculated in the solidified PDA medium and incubated in a 28 ° C. incubator for about 7 days. After incubation, the cells were formed using a sterile surgical knife, and then 5 g of the cells were dissolved in 50 ml of sterile distilled water, and the cells were disrupted for 1 minute using an ultrasonic crusher and then separated using a centrifuge (4000 Xg). The liquid was used for the comparative experiment.
  • MRS medium is subjected to 1 liter wet autoclaving (121 °C). After sterilization the temperature is cooled to 25 ° C. and seeded inoculated. The inoculated MRS medium was 37 ° C., and cultured for 5 days. When incubated for 5 days, the cell mass was found to be about 10 9 / ml. The culture solution was centrifuged at 4000 Xg for 1 hour using a centrifuge to remove the supernatant and washed twice with sterile distilled water.
  • the washed cells were dried at room temperature (25 ° C) for 4 days, 5 g of the dried cells were re-dissolved in 50 ml of sterile distilled water, and the cells were crushed for 1 minute using an ultrasonic crusher and separated using a centrifuge (4000 Xg). Supernatant was used for comparative experiments.
  • Raw ginseng fruit was harvested, seed was separated and removed, and the flesh and skin of ginseng fruit were pretreated by sun drying or washing with running water.
  • Aureobasidium pullulans CXHB-8 prepared in advance was inoculated to a level of 10 5 -10 7 and incubated in a 28 ° C incubator for 5 days.
  • Sterilized raw ginseng fruit was pulverized and extracted in a juicer, and the water content was reduced to proceed with the concentration process. At this time, the concentration was set to 6 Brix and concentrated to finally prepare a ginseng fruit extract.
  • Example 1 Ginseng fruit fermentation extract using black yeast and lactic acid bacteria
  • the black yeast bacteria pre-cultured to the ginseng fruit lysate of Comparative Example 2 was inoculated in the center of the tray and subjected to solid culture for 7 days (168 h). After 7 days, the fermented ginseng fruit on the tray is recovered and mixed with MRS media in a ratio of 1: 2 and autoclaved at 121 ° C. Lactobacillus sp. CXHB-4, which was developed on its own, was inoculated at 10 7 -10 9 cell / mL in the final sterilized MRS media and the black yeast solid fermentation ginseng fruit lysate mixed culture medium. Liver culture was performed and liquid culture was carried out while maintaining the conditions of pH 6.5-7.5, temperature 35-38 degreeC, and 1VVM. The fermentation broth was centrifuged at 10000 Xg for 30 minutes to obtain a final ginseng fruit fermentation extract from which polymer precipitates and cells were removed.
  • Hs68 fibroblast a human fibroblast line
  • Hs68 fibroblast a human fibroblast line
  • a human fibroblast line was dispensed in a 96 well plate at a concentration of 2x10 4 cells / well, and then cultured in an incubator at 37 ° C and 5% CO 2 for 24 hours. Thereafter, the samples of the Examples and Comparative Examples were replaced with the medium in which the medium was added at a concentration of 10 ⁇ g / mL, respectively, and then further cultured for 24 hours. After incubation, the medium of each well was removed, followed by a DPBS washing process once, and the reaction was performed at 37 ° C. for 4 hours by adding a 0.5 mg / mL concentration of MTT reagent.
  • the formazan crystal formed during the reaction was removed with MTT reagent, dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO), and the absorbance was measured at 590 nm using a spectrophotometer. Cell viability is expressed as a percentage of the mean absorbance values of the control group with no medium added.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • Exposure to ultraviolet rays has the effect of directly damaging cells and inhibiting cell proliferation.
  • a human fibroblast line Hs68
  • MMP-1 expression was measured using human fibroblast line (Hs68) to compare the inhibitory ability of Examples and Comparative Examples for MMP-1 (matrix metalloproteinase 1), which has the greatest effect on wrinkle formation through collagen degradation. Proceeded.
  • Fibroblast line Hs68 was dispensed into 6 well plates by the number of 4 ⁇ 10 5 , and then cultured in an incubator at 37 ° C. and 5% CO 2 for 24 hours. Thereafter, after removing the medium and adding DPBS, 15 mJ / cm 2 UVB was irradiated to the remaining cell groups except for the control, and the samples of Examples and Comparative Examples were each added at a concentration of 10 ⁇ g / mL for an additional 24 hours. Incubated.
  • real-time polymerase chain reaction was carried out in a real-time PCR machine using a mixture of the target protein MMP-1 template and the cyanine dye cyberrin (SYBR Green supermix, Applied Biosystems, USA). The expression level of the MMP-1 gene was evaluated.
  • the sequence and reaction conditions of the template were as shown in Table 1 below, and the expression level of the gene was finally analyzed through correction for the ⁇ -actin gene.
  • Primer order Reaction conditions MMP-1 F 5’-CGAATTTGCCGACAGAGATGA-3 ’ After activating the polymerase at 94 ° C. for 5 minutes, 40 cycles of polymerization were performed at 95 ° C. 30 seconds, 55 ° C. 30 seconds, and 72 ° C. 30 seconds.
  • the expression level of collagen degrading enzyme MMP-1 increased rapidly in the UVB irradiation group, while the mixed fermentation product of ginseng berry black yeast and lactic acid bacteria of Example 1 was ginseng berry black yeast fermentation product (Comparative Example). 4) and ginseng fruit lactobacillus fermented product (Comparative Example 3) showed significantly superior MMP-1 expression inhibition effect ( ## p ⁇ 0.01 for control control, * p ⁇ 0.05, ** p ⁇ 0.01 compared to UVB control) ).

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Abstract

본 발명은 인삼열매를 흑효모균(Aureobasidium pullulans CXHB-8) 및 유산균으로 이중 발효시켜 얻은 인삼 열매 발효물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 인삼열매를 흑효모균 및 유산균으로 이중 발효시켜 얻은 인삼 열매 발효물을 함유하는 화장료 조성물의 경우, 세포증식을 촉진하고, 손상된 세포를 회복시키며, 콜라겐 분해를 저해시킴으로써 피부노화를 억제하고 주름을 개선할 수 있다.

Description

흑효모균 및 유산균을 이용하여 발효한 인삼열매 발효물을 함유하는 화장료 조성물
본 발명은 인삼열매 발효물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 인삼열매를 흑효모균(Aureobasidium pullulans CXHB-8) 및 유산균으로 이중 발효시켜 얻은 인삼열매 발효물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.
인삼(Panax ginseng C.A. Meyer)은 오가피과 인삼 속에 속하는 식물로서 한국, 중국 및 일본 등지에서 2,000여 년 전부터 사용되어 온 생약이며, 경험적으로 질병을 예방하고 수명을 연장시킬 목적으로 사용되어 왔다. 지금까지 알려진 인삼의 효능 및 효과는 중추신경계에 대한 작용, 항발암 작용, 항암활성, 면역기능 조절작용, 항당뇨 작용, 간기능 항진효능, 심혈관 장해개선, 항동맥경화 작용, 혈압조절 작용, 갱년기 장애 개선, 골다공증에 미치는 효과, 항스트레스 및 항피로 작용, 항산화 활성 및 노화억제 효능 등이 있다(최신고려인삼 '성분 및 효능편', 한국인삼연초연구원, 56-112, 1996). 인삼의 대표적 생리활성 성분인 진세노사이드(Ginsenoside)는 인삼의 지상 및 지하부에 고르게 분포되어 있으며, 특히 인삼근(뿌리), 인삼엽 및 인삼열매 등 부위에 따라 진세노사이드 함량뿐만 아니라 조성도 다른 것으로 알려져 있다(Attele AS et al, Biochem Pharmacol, 58; 1685-1693, 1999). 특히 인삼열매는 인삼근(뿌리)과 다른 진세노사이드의 성분과 그 함량을 바탕으로 항당뇨 효능에 있어서 인삼근 보다 우수한 결과를 나타내는 것으로 보고되어 있다(Dey L. et al., Phytomedicine, 10; 600-605, 2003).
최근 천연 화장품에 대한 소비자의 관심이 증대되고 동시에 한방 소재를 활용하는 많은 화장품들이 출시되면서 인삼도 화장품의 중요한 피부효능을 가진 식물 소재로 연구되고 있으나, 대부분 인삼근을 이용한 추출물 또는 인삼근의 진세노사이드 성분과 인삼 다당체를 활용한 것일 뿐 인삼열매의 성분에 의한 피부 노화억제와 주름개선 효능에 대한 것은 전무한 실정이다. 또한 인삼열매는 예로부터 인삼보다도 귀하게 여겨지는 것으로서 종자 획득을 목적으로 선별되어 수확되어 왔다. 인삼열매는 인삼의 재배기간 중 4년생에 한해서 1회만 채종하게 되며, 3년생에서 채종하면 종자가 너무 작기 때문에 좋은 묘삼을 생산하기가 어렵고 5년생 이상에서 채종하면 종자는 충실하고 좋으나 인삼뿌리의 비대발육을 억제할 뿐만 아니라 조직이 치밀하지 못하여 홍삼을 제조할 때 홍삼품질이 크게 저하될 수 있다. 또 채종횟수를 재배기간 중에 2회 이상으로 채종하면 수량 및 홍삼품질이 크게 저하된다(최신고려인삼 '재배편', 한국인삼연초연구원, 130-131, 1996).
미국등록특허 제6524626호에서 인삼열매즙을 동결건조하여 화장료 조성물에 사용하고 있으며, 인삼열매즙과 다른 천연물을 복합적으로 사용함으로써 이들이 보습과 피부유연효과를 나타낸다고 기재하고 있으나, 이는 본 발명에 의한 인삼열매 추출물이 나타내는 피부 노화억제 효능 및 주름개선 효능으로서의 화장품 용도와는 분명 구분되는 것이다.
인간의 피부는 나이가 들어감에 따라 여러 가지 내적, 외적 요인에 의해 변화를 겪는다. 즉, 내적으로는 신진대사를 조절하는 각종 호르몬의 분비가 감소하고, 면역 세포의 기능과 세포들의 활성이 저하되어 생체에 필요한 면역 단백질 및 생체 구성 단백질들의 생합성이 줄어들게 되며, 외적으로는 오존층 파괴로 인하여 태양광선 중 지표에 도달하는 자외선의 함량이 증가하고 환경오염이 더욱 심화됨에 따라 자유 라디칼 및 활성 유해 산소 등이 증가함으로써, 피부의 두께가 감소하고, 주름이 증가하며, 탄력이 감소될 뿐 아니라 피부 혈색도 칙칙해지고, 피부 트러블이 자주 발생하며, 기미와 주근깨 및 검버섯 또한 증가하는 등 여러 가지 변화를 일으키게 된다.
노화가 진행될수록 피부를 구성하는 물질인 콜라겐, 엘라스틴, 히아루론산 및 당단백질의 함유량 및 배열이 변하거나 감소하는 증상들이 나타나게 되고, 자유라디칼 및 활성 유해 산소에 의한 산화적 스트레스를 받게 된다. 또한 피부를 구성하는 대부분의 세포에서는 노화가 진행되거나 자외선에 의해서 염증을 일으킨다고 알려져 있는 전염증성 사이토카인(proinflammatory cytokine)을 생성하는 효소인 사이클로옥시게나제-2(Cox-2, cyclooxygenase)의 생합성이 증가하고, 이들 염증성 인자에 의해 피부조직을 분해하는 효소인 매트릭스 메탈로프로테아제(MMP, Matrix metalloproteinase)의 생합성이 증가하며, iNOS(inducible nitric oxide synthase)에 의한 NO(nitric oxide) 생성이 증가하는 것으로 알려져 있다. 즉, 자연적으로 진행되는 내인성 노화에 따른 세포 활성의 감소 및 미세염증에 의해 기질물질의 생합성이 감소되고, 여러 가지 유해 환경에 의한 스트레스의 증가 및 태양 광선에 의한 활성산소종의 증가와 같은 외적 요인에 의해 분해 및 변성이 가속화되어 피부 기질이 파괴되고 얇아지면서 피부 노화의 제반 증상들이 나타나게 된다. 따라서, 이러한 노화의 현상들을 방지하고, 개선시킬 수 있는 활성성분에 대하여 많은 연구가 행해지고 있는 것이 현실이다.
그동안 주름개선을 위한 소재로는 주로 비타민C, α-토코페롤, 레티놀 및 그의 유도체 등이 화장품 및 의약품에 배합되어 이용되어 왔으나 이들은 제형에 배합되었을 경우 변취 현상이 발생하거나 화학적 안정성이 좋지 못하다는 단점이 있다. 이러한 단점을 극복하기 위해 최근 천연물 유래 물질들을 이용한 주름개선용 화장료 조성물의 개발이 각광받고 있으며 이의 발굴을 필요로 한다.
이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 인삼열매를 흑효모균 및 유산균으로 이중 발효시켜 얻은 인삼열매 발효물을 함유하는 화장료 조성물의 경우, 세포증식을 촉진하고, 손상된 세포를 회복시키며, 콜라겐 분해를 저해시킴으로써 피부노화를 억제하고 주름을 개선시킬 수 있음을 확인하고, 본　발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 주된 목적은 세포증식을 촉진하고, 손상된 세포를 회복시키며, 콜라겐 분해를 저해시킴으로써 피부노화를 억제하고 주름을 개선 시킬 수 있는 흑효모균 및 유산균을 이용하여 이중 발효한 인삼열매 발효물을 함유하는 화장료 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 인삼열매를 흑효모균(Aureobasidium pullulans) 및 유산균으로 이중 발효시켜 얻은 인삼열매 발효물을 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.
최근 천연 화장품에 대한 소비자의 관심이 증대되면서 인삼도 화장품 소재 중 하나로 연구되고 있으나, 인삼 열매 성분의 피부노화 억제 및 주름 개선 효능에 대한 연구는 아직 미미하다. 이에, 본 발명자들은 인삼열매를 흑효모균 및 유산균으로 이중 발효한 발효물의 경우, 피부노화 억제 및 주름 개선에 효과적인 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
흑효모균 Aureobasidium 속의 균은 환경에서 쉽게 볼 수 있고, 보통 과실이나 야채의 병원균으로 존재한다. 형태적으로는 동일하나 흑효모균으로 딸기의 오염곰팡이와 곰팡이 냄새를 갖지 않는 점에서 다르다. 콜로니(colony)는 회색 또는 흑색, 격벽을 내며 길이가 긴 기균사로부터 불규칙하게 지분되어 팽대한 말단세포의 방상의 치상 돌기에서 다수의 분생자를 형성한다. 흑효모균(Aureobasidium pullulans)은 유럽에서는 포도주를 제조할 때 이용된다고 알려져 있으나, 인삼열매를 발효하기 위하여 이용된 적은 없다.
본 발명에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스(Lactobacillus sp.), 류코노스톡(Leuconostoc sp.) 및 비피도박테리아(Bifidobacteria sp.)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상임을 특징으로 한다. 본원발명에서는 Lactobacillus sp. CXHB-5 균주를 이용하였다.
본 발명에 있어서, 상기 인삼열매 발효물은 다음 2단계의 발효공정으로 발효시키는 것을 특징으로 한다.
a) 인삼열매를 고체 백지위에 놓고 흑효모균을 접종하여 고상 발효하는 1차 발효 단계, 및
b) 상기 1차 발효된 인삼열매를 액체 배지에 넣고 유산균으로 액상발효하는 2차 발효 단계.
본 발명에서 상기 고상 발효란 분쇄된 소재를 고체화시켜 놓고 공기에 완전히 노출시켜 공기를 매체로 이용하여 고체 상태로 발효하는 것을 의미한다. 상기 고체화는 당업계에 알려진 어떠한 고체화 소재도 사용가능하나 바람직하게는 아가(agar) 를 사용하는 것이 좋다. 고상발효는 액상발효와 비교하였을 때, 기능성물질의 다양성과 생산량이 극대화 되는 것으로 알려져 있으며, 수율 또한 우수하다. 이에 반하여, 액상 발효란 발효 소재를 액체 배지에 넣고 물을 매체로 이용하여 액체 상태로 발효하는 것을 의미한다.
종래에 인삼열매를 효모 또는 유산균 단독으로 액상 발효하는 것은 이미 알려져 있으나, 흑효모균을 이용하여 고상 발효한 후, 유산균을 이용하여 액상 발효하는 것은 아직 알려진 바 없다. 또한, 인삼열매를 흑효모균 및 유산균을 이용하여 고상발효 및 액상발효하는 경우, 흑효모균 또는 유산균 단독으로 발효하는 것보다 더 우수한 효과를 나타내는 것을 본 발명에서 확인하였다. 구체적으로, 본 발명의 실험예에서, 흑효모균 및 유산균을 이용하여 이중 발효한 발효물의 경우, 흑효모균 또는 유산균 단독으로 발효하는 것보다 더 우수한 피부노화 억제 및 주름개선 효과를 나타내었다.
본 발명에 있어서, 상기 인삼 열매 발효물은 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 50.0중량% 함유할 수 있으며, 바람직하게는 0.001 내지 30.0중량%의 양으로 함유됨을 특징으로 한다. 상기 유효성분의 함량이 0.001중량% 미만일 경우에는 효능· 효과가 미약하고, 30중량%를 초과할 경우에는 제형 안정화에 문제가 있으며, 함량의 증가에 따른 효능의 증가가 미약하다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 피부 노화억제 및 주름개선 효과를 갖는 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 조성물은 콜라겐 분해효소인 MMP-1 억제효과를 나타내며, 세포재생과 세포증식 효과를 나타내는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 실험예에 따르면, 인삼열매를 흑효모균만으로 고상 발효한 발효물이 인삼열매 파쇄물보다 우수한 콜라겐분해 억제 및 세포재생 효과를 나타내었으나, 인삼열매 흑효모균 발효물을 유산균으로 추가 발효한 발효물의 경우가 인삼열매 파쇄물 및 인삼열매 흑효모균 발효물보다 더욱 우수한 콜라겐분해 억제효과 및 세포증식, 세포재생 효과를 나타내는 것을 확인하였다. 또한, 인삼열매의 흑효모균 단독 발효물 또는 인삼열매의 유산균 단독 발효물에 비하여, 본원발명에 따라 인삼열매를 흑효모균 및 유산균으로 이중 발효한 발효물이 피부노화 억제 및 주름 개선에 대한 상승적(synergetic) 효과를 나타낼 수 있음을 알 수 있었다(실험예 1 내지 3 참조).
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클렌저로 구성된 그룹에서 선택된 하나 이상의 제형인 것을 특징으로 한다. 예를 들면 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 아이에센스, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 파우더, 보디로션, 보디크림, 보디오일, 보디에센스 등의 화장료 제형을 가질 수 있으며, 또한 로션, 연고, 겔, 크림, 패취 또는 분무제와 같은 경피 투과형 제형을 갖는 화장료 조성물 일 수 있다.
이하, 본 발명을 단계별로 보다 구체적으로 설명한다.
본원발명의 인삼열매 발효물은 다음 2 단계로 제조할 수 있다.
a) 인삼열매 파쇄물을 고체화시키고 흑효모균을 접종하여 고상 발효하는 발효 단계; 및
b) 상기 a) 단계에서 1차 발효된 인삼열매를 액체 배지에 넣고 유산균을 추가 접종하여 액상 발효하는 2차 발효 단계.
본 발명의 조성물에 사용되는 인삼열매의 발효 추출물의 제조방법은 특별히 한정되며, 당업계에 공지된 일반적인 방법을 이용할 수 있고, 구체적으로는 인삼열매에 상기 균을 첨가, 배양하고 발효시켜 수득할 수 있다.
보다 구체적으로, 발효시 흑효모균(Aureobasidium pullulans CXHB-8)을 사용할 경우에는 열매전체를 분쇄하고 고체화 소재를 첨가하여, Aureobasidium pullulans CXHB-8 종균을 접종하여 5일간 배양한다. 이때 사용되는 균체는(약 105 ~107 cell/mL)로 접종하여 배양한다. 5일간 배양 후 1차 발효된 인삼열매 착즙액 고체화 소재는 재회수하여 70% ETOH 로 2일간 추출한 뒤 추출액은 동결건조 시킨다.
이상 설명한 바와 같이, 흑효모균 및 유산균을 이용하여 이중 발효한 인삼열매 발효물을 함유하는 화장료 조성물의 경우, 피부노화 억제 및 주름 개선 효과를 통해 피부에 안전하면서도 전반적인 피부 상태를 개선시키는 효과를 제공할 수 있다.
도 1은 비교예들 및 실시예의 세포증식 효과를 나타내는 도면이다.
도 2는 비교예들 및 실시예의 세포손상 재생 효과를 나타내는 도면이다.
도 3은 비교예들 및 실시예의 MMP-1 발현 저해 효과를 나타내는 도면이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
비교예 1: 흑효모균, 유산균 추출물
1-1. 흑효모균 추출물
인삼에서 분리한 흑효모균(Aureobasidium pullulans CXHB-8)을 배양하기 위해 PDA배지를 1리터 습식 고압멸균(121℃)을 실시한다. 멸균후 배지를 100 파이 패트리접시에 부어 고체상태로 굳힌다. 굳힌 PDA 배지 가운데에 종균을 접종하여 약 7일간 28℃ 인큐베이터에서 배양한다. 배양후 균체가 형성된 부분을 멸균된 수술용 칼을 사용하여 잘라낸 뒤 균체 5g 을 멸균증류수 50ml 에 용해시키고 초음파 파쇄기를 사용하여 1분간 세포를 파쇄한 뒤 원심분리기를 사용하여(4000 Xg) 분리된 상층액을 비교실험에 사용하였다.
1-2. 유산균 추출물
인삼에서 분리한 유산균종균(Lactobacillus sp. CXHB-5)을 배양하기 위해 MRS배지를 1리터 습식 고압멸균(121℃) 을 실시한다. 멸균 후 온도를 25℃까지 냉각하고, 종균을 접종한다. 접종된 MRS 배지는 37℃, 정치배양을 5일간 실시하였다. 5일간 배양하였을때 균체량이 균체량이 109 /ml정도로 확인되었다. 배양액은 원심분리기를 사용하여 4000 Xg 로 1시간 원심분리하여 상층액을 제거 후 3차 멸균증류수로 2번 세척하였다. 세척이 완료된 균체는 상온(25℃)에서 4일간 건조시키고 건조가 완료된 균체 5g 을 멸균증류수 50ml에 재용해시키고 초음파 파쇄기를 사용하여 1분간 세포를 파쇄한 뒤 원심분리기를 사용하여(4000 Xg) 분리된 상층액을 비교실험에 사용하였다.
비교예 2: 인삼열매 추출물의 제조
1) 인삼열매 전처리
생(生)인삼열매를 수확하여 종자를 분리하여 제거한 후 인삼열매의 과육과 과피를 일광건조 또는 흐르는 물 세척을 통하여 전처리 하였다.
2) 인삼열매 멸균처리 및 고체화
생(生)인삼열매를 세척 후 121℃ 고압 습식멸균을 실시하고, 열매 전체를 분쇄한다. 분쇄가 완료된 인삼열매에 아가(agar)를 1.5% 첨가고 60℃로 가열한 뒤 냉각시켜 고체화 시킨다.
3) 종균 준비
미리 준비된 종균 Aureobasidium pullulans CXHB-8 을 105-107 수준이 되도록 접종하였으며 28도 항온기에서 5일간 배양하였다.
4) 인삼열매 추출물
멸균처리된 생 인삼열매를 분쇄하여 착즙기에서 추출을 실시하고, 수분함량을 줄여 농축과정을 진행하였다. 이때 농축정도는 6브릭스가 되도록 설정하여 농축하여 최종적으로 인삼열매 추출물을 제조하였다.
비교예 3: 유산균을 이용한 인삼열매 발효 추출물
상기 비교예 2의 인삼열매 파쇄물에 유산균을 접종한 뒤 사전 배양된 자체 분리 개발한 유산균(Lactobacillus sp. CXHB-4)을 인삼열매 파쇄물: MRS media의 비율이 1:2비율이 되도록 접종하여 5일(120h) 간 배양을 실시한다. 접종에 사용되는 균체량은 105-107 이며, 배양온도는 37℃로 항온배양 실시한다. 5일 뒤에는 인삼열매파쇄 유산균 발효물을 회수하고, 70% 에탄올로 2일간 추출 후 추출된 액상을 동결건조 시킨다.
비교예 4: 흑효모균을 이용한 인삼열매 발효 추출물
상기 비교예 2의 인삼열매 파쇄물을 tray에 살포한 뒤 사전 배양된 흑효모균(Aureobasidium pullulans CXHB-8)을 tray 가운데에 접종하여 5일(120h)간 1차 배양 실시한다. 접종에 사용되는 균체량은 105-107 이며, 배양온도는 28℃로 항온배양 실시한다. 5일 뒤에는 고체화시킨 인삼열매 발효물을 회수하고, 70% 에탄올로 2일간 추출 후 추출된 액상을 동결건조 시킨다.
실시예 1: 흑효모균 및 유산균을 이용한 인삼열매 발효 추출물
상기 비교예 2의 인삼열매 파쇄물에 사전 배양된 흑효모균을 tray 가운데에 접종하여 7일(168h)간 고체배양을 실시한다. 7일 뒤에는 tray 위의 발효된 인삼열매를 재회수하고 MRS media와 1:2의 비율로 혼합하여 121℃ 고압 멸균처리한다. 최종 멸균된 MRS media와 흑효모균 고체발효처리 인삼열매 파쇄물 혼합배양 배지에 자체 분리 개발한 락토바실러스 (Lactobacillus sp. CXHB-4)를 107-109cell/mL로 접종하고, 5일(120h)간 배양을 실시하고, pH 6.5~7.5, 온도 35~38℃, 통기량 1VVM의 조건을 유지하면서 액체 배양하였다. 상기 발효액을 10000 Xg에서 30분간 원심분리하여 고분자 침전물과 균체가 제거된 최종 인삼열매 발효 추출물을 얻었다.
시험예 1: 세포증식 촉진능 평가
실시예와 비교예들의 세포증식 촉진능 비교를 위해 인간 섬유아세포주인 Hs68 fibroblast에서 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 시약을 이용한 측정법으로 실험을 수행하였다.
인간 섬유아세포주인 Hs68 fibroblast를 2x104 cells/well 농도로 96 well plate에 분주한 후, 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 실시예와 비교예들의 샘플을 각각 10㎍/mL의 농도로 첨가하는 배지로 세포배양액을 교체해 준 다음 24시간 동안 추가로 배양하였다. 배양 후 각 well의 배지를 제거하고 DPBS washing 과정을 1회 거친 다음 0.5mg/mL 농도의 MTT 시약을 첨가하여 37℃에서 4시간 동안 반응시켰다. 반응과정에서 형성된 formazan crystal을 MTT 시약을 제거한 다음 DMSO(dimethyl sulfoxide)로 용해시킨 다음 spectrophotometer를 이용하여 590 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율은 샘플 없이 배지만 첨가한 대조군의 평균 흡광도 값에 대한 백분율로 나타내었다.
그 결과, 도면 1에 나타낸 바와 같이 본원발명의 실시예 1의 인삼열매 흑효모균 및 유산균 혼합 발효물이 동일 농도의 모든 샘플 중에서 가장 뛰어난 세포증식 촉진 효능을 나타냄을 확인하였다. (control 대조군에 대하여 # p<0.05, ## p<0.01)
시험예 2: 세포손상 회복능 평가
자외선에의 노출은 세포에 직접적인 손상을 주어 세포 증식을 억제하는 작용을 갖는다. 이에 대한 실시예와 비교예들의 세포손상 회복능을 비교하기 위하여 자외선을 조사한 인간 섬유아세포주(Hs68)를 이용한 실험을 수행하였다.
시험예 1에서와 동일 농도로 접종 및 배양한 섬유아세포에서 배지를 제거하고 DPBS를 넣어준 다음 control을 제외한 나머지 세포군에 15 mJ/cm2의 UVB를 조사한 뒤 실시예와 비교예들의 샘플을 각각 10㎍/mL 농도로 첨가하는 배지로 세포배양액을 교체하여 24시간 동안 추가 배양하였다. 이후의 MTT 시약을 이용한 시험법은 시험예 1에서와 동일한 방법으로 진행하였다.
그 결과, 도면 2의 결과와 같이 본원발명의 실시예 1의 인삼열매 흑효모균 및 유산균 혼합 발효물에서 가장 뛰어난 세포손상 회복 효능을 나타냄을 확인하였다. (control 대조군에 대하여 ## p<0.01, UVB 대조군에 비하여 * p<0.05)
시험예 3: 콜라겐 분해 억제능 평가
콜라겐 분해를 통해 주름생성에 가장 큰 영향을 미치는 MMP-1(matrix metalloproteinase 1)에 대한 실시예와 비교예들의 발현 억제능을 비교하기 위해 인간 섬유아세포주(Hs68)를 이용한 MMP-1 발현량 측정을 진행하였다.
섬유아세포주 Hs68을 6 well plate에 4x105의 수만큼 분주한 후, 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 배지를 제거하고 DPBS를 넣어준 후, control을 제외한 나머지 세포군에 15 mJ/cm2의 UVB를 조사한 뒤 실시예와 비교예들의 샘플을 각각 10 ㎍/mL의 농도로 첨가하여 24시간 동안 추가로 배양하였다. 이후 각 샘플을 처리한 세포에서 트리졸(RNA iso, DAKARA, 일본)을 이용하여 RNA를 분리한 뒤 nanodrop으로 260nm 파장에서 RNA를 정량하고 각각 2 ㎍의 RNA를 사용하여 증폭기에서 cDNA를 합성하였다(C1000 Thermal Cycler, Bio-Rad, 미국). 합성된 cDNA에 타겟 단백질인 MMP-1 주형과 시아닌 염료인 사이버그린(SYBR Green supermix, Applied Biosystems, 미국)을 첨가한 혼합물을 이용하여 real-time PCR 기계에서 실시간 중합효소 연쇄반응을 실시함으로써 최종적으로 MMP-1 유전자의 발현 정도를 평가하였다. 주형의 서열과 반응 조건은 하기 표 1과 같았으며, 유전자의 발현량은 β-actin 유전자에 대한 보정을 통해 최종적으로 분석하였다.
주형(primer) 서열 반응 조건
MMP-1 F 5’-CGAATTTGCCGACAGAGATGA-3’ 94℃, 5분 동안 중합효소 활성화 후, 95℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 30초 조건에서 40사이클로 중합반응
R 5’-GTCCCTGAACAGCCCAGTACTT-3’
β-Actin F 5’-GGCCATCTCTTGCTCGAAGT-3’
R 5’-GAGACCTTCAACACCCCAGC-3’
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 UVB 조사군에서 콜라겐 분해효소인 MMP-1의 발현량이 급격히 증가한 것에 반해 실시예 1의 인삼열매 흑효모균 및 유산균 혼합 발효물이 인삼열매 흑효모균 발효물(비교예 4)과 인삼열매 유산균 발효물(비교예 3)에 비해 월등히 뛰어난 MMP-1 발현 억제 효능을 보였다(control 대조군에 대하여 ## p<0.01, UVB 대조군에 비하여 * p<0.05, ** p<0.01).

Claims (7)

  1. 인삼열매를 흑효모균(Aureobasidium pullulans CXHB-8) 및 유산균으로 이중 발효시켜 얻은 인삼열매 발효물을 함유하는 화장료 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 유산균은 락토바실러스(Lactobacillus sp.), 류코노스톡(Leuconostoc sp.) 및 비피도박테리아(Bifidobacteria sp.)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 인삼열매 발효물은 다음 2단계의 발효공정으로 발효시키는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물:
    a) 인삼열매를 고체 백지위에 놓고 흑효모균을 접종하여 고상 발효하는 1차 발효 단계, 및
    b) 상기 1차 발효된 인삼열매를 액체 배지에 넣고 유산균으로 액상발효하는 2차 발효 단계.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 인삼열매 발효물은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 30.0중량% 함유하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 피부 노화억제 및 주름개선용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 콜라겐분해효소인 MMP-1 억제효과를 나타내고, 세포재생과 세포증식 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클렌저로 구성된 그룹에서 선택된 하나 이상의 제형인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
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