WO2020055171A1 - 갈대 발효 추출물을 포함하는 주름 개선 및 탄력 증가용 화장료 조성물 - Google Patents

갈대 발효 추출물을 포함하는 주름 개선 및 탄력 증가용 화장료 조성물 Download PDF

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extract
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fermentation
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박명례
곽경민
임효선
함수련
정수희
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㈜한국생명과학연구소
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Definitions

  • the present invention relates to a cosmetic composition and a food composition for improving wrinkles or increasing elasticity of skin, comprising a ferment extract of Phragmites Communis.
  • Skin aging is divided into naturally occurring endogenous aging and exogenous aging caused by external factors. Genetic factors are mentioned as the main factor in endogenous aging, which determines the structure and changes of skin cells and tissues. On the other hand, the factors of exogenous aging are derived from the outside, and may have nutritional deficiencies, ultraviolet rays, and environmental pollution. This is a preventable and avoidable factor unlike genetic factors.
  • wrinkles and elasticity decreases which are referred to as typical skin aging symptoms
  • MMPs matrix metalloproteinase
  • the inventors of the present invention are anti-aging fermentation cosmetic materials, while using natural materials to secure safety when applied to the skin, while substantially improving the skin wrinkles or elasticity to develop a substance that can help to develop a courtesy
  • the extract of fermented fermented roots of Phragmites Communis with Phellinus Linteus does not show cytotoxicity and has an excellent effect on collagen production and inhibition of elastin-degrading enzymes.
  • the present invention was completed by confirming that it can be used for the purpose of improving wrinkles or increasing elasticity.
  • One object of the present invention is to provide a cosmetic composition for improving wrinkles or increasing elasticity of skin, comprising a fermented extract of Phragmites Communis .
  • Another object of the present invention is to provide a food composition for improving wrinkles or increasing elasticity of skin, comprising a reed fermentation extract.
  • composition of the present invention comprises an extract of fermentation fermented by inoculation of Phellinus Linteus with Phellinus Linteus on the reed root, and the extract promotes collagen production and inhibits elastin-degrading enzymes to improve wrinkles and elasticity of the skin. It can be used for increasing purposes.
  • FIG. 1 shows a process for preparing a reed ferment extract of the present invention.
  • Figure 2 shows the change according to the fermentation period, when fermenting the reed root with Phellinus Linteus .
  • Figure 3 shows the results of confirming the production of caffeic acid (caffeic acid) during the process of fermenting the reed roots into the mycelium mushrooms situation by HPLC analysis.
  • Figure 4 shows the results of confirming the production of caffeic acid by 1H NMR analysis during the process of fermenting the reed roots into the situation mycelia.
  • Figure 5a is the analysis result of the standard substance caffeic acid
  • Figure 5b shows the analysis results of the reed fermentation extract.
  • Figure 6 shows the collagen expression level according to the treatment concentration of the reed fermentation extract.
  • Figure 7 shows the amount of collagen expression according to the treatment concentration of caffeic acid.
  • Figure 9 shows the inhibition rate of elastin degrading enzyme according to the treatment concentration before / after fermentation of the reed extract.
  • Figure 10 shows the survival rate of fibroblast Hs68 according to the treatment concentration of the reed fermentation extract.
  • Figure 11 shows the survival rate of fibroblast Hs68 according to the treatment concentration of caffeic acid.
  • One aspect of the present invention for achieving the above object provides a cosmetic composition for improving wrinkles or increasing elasticity of skin, comprising a fermented extract of Phragmites Communis .
  • the present invention finds that the reed root, which is a natural material, is fermented using a mycelium mushroom, and the extracted extract is safe when applied to the skin, but has an excellent effect on skin collagen production and inhibition of elastin degrading enzyme, and improves skin wrinkles or increases elasticity
  • the surprising effect of the fermented extract of the situation mushroom of the reed root was first identified by the present inventors.
  • the term "reed ( Phragmites Communis )” is a perennial plant of a monocotyledonous shrub, a plant growing in colonies on wetland, mudflats, or sandy grounds around lakes.
  • the reed may mean the root of the reed, but is not particularly limited thereto.
  • the root of the reed is also referred to as "no-geun ( ⁇ )", meaning that the root of the reed is dried in one shot.
  • Nogeun The pharmacological action of Nogeun is known for its diuretic action, antipyretic action, liver protection action, and hematopoietic function strengthening action.
  • the term "fermentation” means to decompose an organic substance by using an enzyme possessed by a microorganism.
  • the reed specifically, the root of the reed may be fermented using a microbial strain, and more specifically, the microorganism may be Phellinus Linteus .
  • the mycelium mushrooms may be mixed with the sperm mushrooms.
  • the term “fermentation product” refers to the result of a liquid component obtained through a fermentation process and a solid component obtained by removing a solvent from the liquid component.
  • the "situation mushroom” refers to a mushroom of the genus Mushroom of the genus Genus fungi, and is known to have physiological activities such as anti-cancer, immune-enhancing, and antioxidant, including active substances such as beta-glucan, flavonoid, and ergosterol.
  • extract is a product obtained by immersing a desired substance in various solvents, and then extracting it for a period of time at room temperature, low temperature, or heating, and solid components obtained by removing the solvent from the liquid component.
  • it can be comprehensively interpreted to include all of the diluents of the resultant product, their concentrates, and dried products obtained by drying the extracts, or their modifiers and purified products.
  • the extract can be extracted without limitation from natural, hybrid, and varietal plants, and can be obtained by extraction using water (purified water), alcohols of C1 to C6, and mixed solvents thereof.
  • the method for obtaining the extract is not particularly limited as long as the reed fermentation extract of the present invention can be obtained, but specifically, the reed, the reed root or the fermented product of the reed root is immersed in the solvent and at room temperature.
  • Cold extraction method, heat extraction method, ultrasonic extraction method to extract by applying ultrasonic waves, reflux extraction method using a reflux cooler can be used.
  • the term "fermented extract” may mean the useful substance itself generated by extracting the fermentation, and more specifically, fermentation by removing the fermentation strain from the fermentation strain culture medium in which the fermentation strain and the fermentation product coexist. Water, a fermented product from which the fermentation strain is filtered from the culture medium, a fermentation strain from the culture medium is sterilized and filtered, a fermented product from which the fermentation product is diluted, and a dried product from which the fermentation product is dried is extracted. It can contain all substances.
  • the term fermentation extract may be used as a reed fermentation extract, or a fermentation extract of reed root.
  • the fermentation extract may be an extract of a reed fermentation, specifically, an extract of a reed root fermentation, or more specifically, an extract of a situation mushroom mycelium fermentation of a reed root.
  • the reed ferment extract of the present invention may include caffeic acid as an active ingredient.
  • the caffeic acid has a molecular formula of C 9 H 8 O 4 , a compound having a molecular weight of 180.157, and may be represented by Formula 1 below.
  • wrinkle improvement or “skin wrinkle improvement” refers to alleviating wrinkles present in the skin of an individual using the composition of the present invention.
  • the term "increased elasticity” or “increased skin elasticity” refers to enhancing the elasticity of the skin by strengthening the subcutaneous fat layer structure of an individual using the composition of the present invention.
  • the reed ferment extract of the present invention may be to promote the synthesis of collagen and inhibit elastin degrading enzyme (elastase), thereby improving wrinkles and increasing elasticity of the skin.
  • elastin degrading enzyme elastase
  • the treatment of reed fermentation extract and caffeic acid in human skin fibroblast Hs68 confirmed that the amount of collagen production increased and the collagen degrading enzyme and elastin degrading enzyme were inhibited in proportion to the concentration, before fermentation of the reed extract. / After comparison, it was confirmed that the reed fermentation extract significantly inhibits the elastin-degrading enzyme than the unfermented reed extract, and the degree of cytotoxicity of the reed fermentation extract and caffeic acid in human skin fibroblast Hs68. Through this, it was confirmed that the composition comprising the reed fermentation extract and caffeic acid of the present invention can be used as a cosmetic composition for improving wrinkles or increasing elasticity of skin.
  • composition of the present invention may further include a fermented extract of cereals in addition to the reed fermented extract.
  • the grain may mean brown rice, barley, rice, etc., and is not particularly limited thereto.
  • the cosmetic composition of the present invention may contain the reed fermentation extract in an amount of 0.0001 to 50% by weight (w / w) based on the total weight of the composition, specifically 0.001 to 5% by weight (w / w), It is not limited to this.
  • the cosmetic composition is flexible cosmetic, convergent cosmetic, nutrient cosmetic, nutrition cream, massage cream, essence, pack, skin adhesive patch, skin adhesive gel, powder, ointment, paste, gel, suspension, emulsion, spray, cosmetic liquid or capsule It may be formulated as, but is not particularly limited thereto.
  • the cosmetic composition of the present invention may further include one or more cosmetically acceptable carriers formulated in general skin cosmetics, and for example, oil, water, surfactant, moisturizer, lower alcohol, thickener, etc. Chelating agents, coloring agents, preservatives, fragrances, etc. may be appropriately blended, but are not limited thereto.
  • the cosmetically acceptable carrier included in the cosmetic composition of the present invention varies depending on the formulation.
  • the formulation of the present invention is an ointment, paste, cream or gel, animal oil, vegetable oil, wax, paraffin, starch, tracant, cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica, talc, zinc oxide or Mixtures of these can be used.
  • lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate, polyamide powder or a mixture thereof may be used as a carrier component, especially in the case of a spray, additional chloro And propellants such as fluorohydrocarbon, propane / butane or dimethyl ether.
  • a solvent, solubilizing agent or emulsifying agent is used as a carrier component, such as water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, propylene glycol, 1,3-Butylglycol oil can be used, in particular cottonseed oil, peanut oil, corn seed oil, olive oil, castor oil and sesame oil, glycerol aliphatic esters, polyethylene glycol or fatty acid esters of sorbitan. have.
  • liquid diluents such as water, ethanol or propylene glycol as carrier components, ethoxylated isostearyl alcohols, suspensions such as polyoxyethylene sorbitol esters and polyoxyethylene sorbitan esters, micro Crystalline cellulose, aluminum metahydroxide, bentonite, agar or trakant, etc. can be used.
  • the formulation of the present invention when it is a capsule, it may be formulated in the form of an alginate capsule, an agar capsule, a gelatin capsule, a wax capsule, or a double capsule, and It is not limited to this.
  • the cosmetic composition of the present invention is auxiliaries commonly used in addition to the reed fermentation extract, such as hydrophilic or lipophilic gelling agents, hydrophilic or lipophilic active agents, preservatives, antioxidants, solvents, fragrances, fillers, blockers, pigments, odorants and Dyes and the like.
  • Another aspect of the present invention for achieving the above object is to provide a food composition for improving wrinkles or increasing elasticity of skin, comprising a reed fermentation extract.
  • the reed, fermentation, extract, wrinkle improvement and elasticity increase are as described above.
  • the term "food” includes, for example, various foods, beverages, gums, teas, vitamin complexes, health function (sex) foods, and the like, and includes all foods in the ordinary sense.
  • the food can be prepared in the form of tablets, granules, powders, capsules, liquid solutions and pills, etc. according to a known manufacturing method, and the content of the reed fermentation extract according to the present invention is based on the total weight of the food composition according to the formulation It can be adjusted to 0.0001% by weight to 100% by weight.
  • the food composition of the present invention is not particularly limited to other ingredients except that the reed fermentation extract is included as an active ingredient, and may include various conventional flavoring agents or natural carbohydrates as additional ingredients. Supplementary additives may be included.
  • food supplement additive means a component that can be supplementally added to food, and is added to prepare a health functional food of each formulation and can be appropriately selected and used by those skilled in the art.
  • food additives include flavors such as various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), synthetic flavors and natural flavors, colorants and fillers, pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloidal thickeners , pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohol, carbonic acid used in carbonated beverages, etc. are included, but the types of food supplements of the present invention are not limited by the examples.
  • the food composition of the present invention may include a health functional (sex) food.
  • the "health function (sex) food” is the same term as food for special health use (FoSHU), and means food with high medical and medical effects processed to efficiently exhibit bio-control functions in addition to nutrition. do.
  • the "function (sex)” means obtaining a useful effect for health use, such as adjusting nutrients or physiological effects on the structure and function of the human body.
  • the health functional food of the present invention can be manufactured by a method commonly used in the art, and may be prepared by adding raw materials and ingredients that are commonly added in the art when manufacturing the health functional food.
  • the formulation of the health functional food can also be prepared without limitation as long as the formulation is recognized as food.
  • the health functional food composition of the present invention may be manufactured in various types of formulations, and unlike general medicines, there is no side effect that may occur when taking medicines for a long time using food as a raw material, and has excellent portability.
  • the health functional food of the present invention can take, it may include all foods in a common sense, and it is interchangeable with terms known in the art, such as functional food.
  • the health functional food of the present invention can be prepared by mixing appropriate other auxiliary ingredients and known additives that may be included in the food according to the choice of those skilled in the art.
  • Examples of foods that can be added include meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, dairy products including gums, ice cream, various soups, beverages, teas, drinks, alcoholic beverages, and There are vitamin complexes and the like, and can be prepared by adding reed fermentation extract according to the present invention as a main ingredient, and adding it to juice, tea, jelly, and juice. It also includes foods used as feed for animals.
  • the health functional food composition may further include a physiologically acceptable carrier, the type of the carrier is not particularly limited, and any carrier commonly used in the art may be used.
  • the health functional food composition is commonly used in food compositions, and may include, without limitation, additional ingredients that can improve odor, taste, vision, etc., and may be selected according to the type of food and used in an appropriate amount.
  • Another aspect of the present invention for achieving the above object provides a method for producing the reed fermentation extract.
  • the reed, fermentation and extract are as described above.
  • the manufacturing method (a) reed ( Phragmites Communis ) inoculated into the root mycelium mushroom ( Phellinus Linteus ) to prepare a fermented product; And (b) extracting and fractionating the fermented product with an extraction solvent.
  • the inoculated situation mushroom mycelium may be cultured at 25 to 28 ° C for 40 to 50 days, but is not particularly limited thereto.
  • Another aspect of the present invention for achieving the above object provides a method for improving wrinkles or increasing elasticity of skin, comprising administering a composition comprising the reed fermentation extract to an individual.
  • the "reed”, “fermentation”, “extract”, “wrinkle improvement” and “elasticity increase” are as described above.
  • Another aspect of the present invention for achieving the above object provides a use for improving wrinkles or increasing elasticity of skin, comprising administering a composition comprising the reed fermentation extract to an individual.
  • the "reed”, “fermentation”, “extract”, “wrinkle improvement” and “elasticity increase” are as described above.
  • administration means introducing the composition of the present invention to an individual by any suitable method, and the route of administration of the composition reaches any target tissue so long as it can exhibit the effect of improving wrinkles or increasing elasticity of the skin. It can be administered via a common route.
  • the administration may be intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, oral administration, topical administration, intranasal administration, but is not limited thereto.
  • the administration route of the composition may be applied to the skin and administered.
  • composition of the present invention may be administered daily or intermittently, and the number of administrations per day can be administered once or divided into 2-3 times.
  • composition of the present invention can be used alone or in combination with other materials to improve skin wrinkles or increase elasticity. Considering all of the above factors, it is important to administer an amount that can achieve the maximum effect in a minimal amount without side effects, which can be easily determined by those skilled in the art.
  • “individual” refers to all animals such as rats, mice, livestock, including humans, where skin wrinkles have occurred or skin elasticity has decreased. Specifically, it may be a mammal, with or without a human.
  • a fermented product of reed roots grains (brown rice, barley, rice) and reed roots were prepared, washed, and immersed for 12 hours. Then, based on the total weight of 55% by weight (w / w) based on grains, the reed root was added at a ratio of 45% by weight (w / w) to prepare a basic medium by putting about 500 g in vinyl. The medium was sterilized by wet heat at 121 ° C. for 1 hour.
  • the nutrient solution prepared by mixing at a ratio of 3% yellow sugar, 1% starch syrup, and 0.3% soy flour was inoculated to inoculate the liquid spawn (Chenella mycelium, Phellinus Linteus), and fermented and cultured for 10 days to augment the seed culture medium. It was prepared. Phellinus linteus were inoculated in solids by inoculating about 10 ml per 500 g of the above-mentioned medium. The inoculated situation mushroom spawns were cultured at 25 to 28 ° C for 40 to 50 days, and then dried by hot air at 55 ° C for 24 hours to prepare fermented products (FIGS. 1 and 2).
  • the fermented product prepared in Example 1-1 was extracted at room temperature for 24 hours using 100% ethanol (sold alcohol), and ethanol was evaporated to prepare a fermented extract of reed root with a final yield of 2% (FIG. 1). .
  • Example 2 Confirming the active ingredient of the reed root ferment extract
  • a C18, 150 * 4.6 mm, 5 ⁇ m column was maintained at 30 ° C. using a PDA detector, and purified water and acetonitrile to which 0.1% trifluoroacetic acid was added as a mobile phase solvent were used at a ratio of 80:20.
  • the sample to be analyzed was injected with 5 ⁇ l, and the analysis result was confirmed at UV 320 nm.
  • caffeic acid a standard substance, was detected in the 3.9 minute and caffeic acid was detected in 3.927 minutes as a result of analyzing the reed fermentation extract (FIGS. 5A and 5B).
  • human skin fibroblast Hs68 was attached to a 48-well plate at 5 ⁇ 104 cells / well, and the reed fermentation extract was treated with the cells. After 24 hours, the medium was removed, washed with 1X PBS, and RNA was extracted from the cells using an RNA extraction kit. The extracted RNA was synthesized cDNA using the cDNA synthesis kit. To the 2 ⁇ l of the cDNA treated with the reed fermentation extract, 1 ⁇ l of COL1A1 forward primer, 1 ⁇ l of reverse primer, 10 ⁇ l of PCR Master Mix (2X), 1 ⁇ l of SYBR Green 1 Nucleic acid was added, and purified water was added to make 20 ⁇ l. . The mixed sample was subjected to 45 cycles qPCR of annealing steps under the conditions of 94 ° C 5 minutes, 94 ° C 30 seconds, 58 ° C 30 seconds, 72 ° C 30 seconds, and 72 ° C 5 minutes.
  • human skin fibroblast Hs68 was inoculated at 5 ⁇ 104 cells / well in a 48-well plate and treated with caffeic acid. After 24 hours, the medium was removed, washed with 1X PBS, and RNA was extracted from cells using an RNA extraction kit. The extracted RNA was synthesized cDNA using the cDNA synthesis kit, and 1 ⁇ l of COL1A1 forward primer, 1 ⁇ l reverse primer, 10 ⁇ l of Emerald Amp PCR Master Mix, 10 ⁇ l of SYBR Green 1 Nucleic acid gel stain 1 was added to 2 ⁇ l of cDNA treated with caffeic acid. ⁇ l was added and 5 ⁇ l of purified water was added to make 20 ⁇ l.
  • the mixed sample was put in a real time PCR tube and PCR was performed under denaturation 94 ° C 5 minutes, annealing 94 ° C 30 seconds, 60 ° C 30 seconds, 72 ° C 30 seconds 35 cycles, and extension 72 ° C 5 minutes.
  • the PCR results were divided into 4 ⁇ l each on an agarose gel, and electrophoresis was performed at 100 V for 1 hour to confirm the band.
  • the reed fermentation extract containing caffeic acid of the present invention as an active ingredient can be used as a composition for improving skin wrinkles and increasing elasticity by promoting collagen production in human skin fibroblasts.
  • an active ingredient of the reed fermentation extract of the present invention on collagen degradation, the expression of MMP1 was measured through genetic analysis.
  • the method for measuring expression of MMP1 is the same as the method for measuring COL1A1 described above.
  • the reed ferment extract containing caffeic acid of the present invention as an active ingredient can be used as a composition for improving skin wrinkles and increasing elasticity by inhibiting the production of collagenase in human skin fibroblasts.
  • Example 5 Before and after fermentation of reed extract, confirming the inhibition of elastin degrading enzyme (elastase)
  • the reed fermentation extract was prepared by concentration using 0.2M Tris-HCL buffer (pH 8.0) as a solvent.
  • Elastin degrading enzyme elastase 150mU
  • the substrate STANA was prepared as 50mM
  • ursolic acid ursolic acid
  • a positive control was prepared.
  • Each prepared sample was dispensed in 10 ⁇ l of 50 mM STANA 2 ⁇ l, reed extract, reed ferment extract, ursolic acid and 0.2 M Tris buffer in a 96-well plate, and 90 ⁇ l of elastin degrading enzyme was simultaneously reacted. Thereafter, the reaction was performed at room temperature for 5 to 10 minutes to measure the absorbance at 405 nm with an ELISA reader, and the inhibition rate (%) of the elastin-degrading enzyme was 100- ⁇ (test group-blank test group of the test group) / (negative control group-negative control group). Blank test group) x 100.
  • the reed ferment extract of the present invention shows a significantly higher elastin degrading enzyme inhibitory activity than the reed extract without fermentation, and thus the reed ferment extract has an excellent effect as a composition for improving skin wrinkles and increasing elasticity Confirmed.
  • human skin fibroblast Hs68 was attached to a 48-well plate at 5 ⁇ 10 4 cells / well and the reed fermentation extract was treated to the cells. After 24 hours, using the EZ-CYTOX cell viability assay kit, 20 ⁇ l of reagent is added to each well and shaken gently, incubated for 1 to 4 hours in a 37 ° C, 5% CO 2 incubator and absorbance at 450 nm is measured with an ELISA reader. Did.
  • the reed fermentation extract of the present invention does not show toxicity in human fibroblasts, as it shows a cell viability of about 102% even at a treatment concentration of 1000 ppm.
  • human skin fibroblasts Hs68 were inoculated into 48-well plates at 2.5 ⁇ 10 5 cells / well and cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 incubator for 24 hours. After 24 hours, the medium of the cells was removed, washed with 1X DPBS, and caffeic acid was added to the cells at 1, 5, 10, 50, 100, 500 ⁇ g / mL, and 0.5 ng / mL of TGF- ⁇ , a positive control, 200 ⁇ L I was busy.
  • the reed fermentation extract active ingredient of the present invention caffeic acid does not show toxicity in human fibroblasts within 100 ⁇ m, as it shows a cell survival rate of about 100% when treated with ⁇ 100 ⁇ m. Was confirmed.
  • the reed fermentation extract using caffeic acid as the active ingredient of the present invention can be used as a safe material for cosmetic compositions for the purpose of improving skin wrinkles or increasing elasticity.

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Abstract

본 발명은 갈대(Phragmites Communis) 발효 추출물을 포함하는, 피부의 주름 개선 또는 탄력 증가용 화장료 조성물 및 식품 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 갈대 뿌리에 상황버섯 균사체(Phellinus Linteus)를 접종하여 발효시킨 발효물의 추출물을 포함하는 것으로, 상기 추출물은 콜라겐 생성을 촉진하고 엘라스틴 분해효소를 억제함으로써 피부의 주름을 개선하고 탄력을 증가시키는 용도로 활용될 수 있다.

Description

갈대 발효 추출물을 포함하는 주름 개선 및 탄력 증가용 화장료 조성물
본 발명은 갈대(Phragmites Communis) 발효 추출물을 포함하는, 피부의 주름 개선 또는 탄력 증가용 화장료 조성물 및 식품 조성물에 관한 것이다.
피부노화는 자연히 발생하는 내인성 노화와 외부 요인에 의해 일어나는 외인성 노화로 구분된다. 내인성 노화의 주된 요인으로 유전적인 요인이 언급되며, 이는 피부 세포 및 조직의 구조와 변화를 결정한다. 한편 외인성 노화의 요인은 외부에서 유래된 것으로, 영양 부족, 자외선, 환경오염에 의한 영향 등이 있을 수 있으며 이는 유전적인 요인과 달리 얼마든지 예방 가능하고 피할 수 있는 요인이다.
이러한 요인으로 인해 피부노화가 진행됨으로써, 피부가 건조해지고 거칠어지며 주름 생성, 탄력 저하, 색소 침착 등의 증상이 일어나게 된다. 특히, 대표적인 피부노화 증상으로 언급되는 주름 및 탄력 저하의 경우, 진피 내 주 단백질인 콜라겐 및 엘라스틴의 감소 및 변형이 직접적으로 관여하는 것으로 알려져 있다. 즉, 피부 주름의 시작은 진피의 노화에서부터 진행되는 것으로, 탄력 섬유인 엘라스틴의 구조가 변화되어 피부는 늘어지면서 주름이 생기게 되며, 진피의 콜라겐을 비롯한 결합조직 성분을 분해시키는 MMPs(matrix metalloproteinase) 활성 증가로 인해 콜라겐 합성이 저해되어 주름이 증가한다는 연구가 많이 보고되어 있다.
최근에는 라이프 스타일의 변화와 웰빙에 대한 관심과 더불어, 고령화의 급속한 진행에 따라 건강하고 아름답게 살기를 추구하는 이른바 웰에이징에 대한 수요가 점차 증가하고 있는 추세이다. 이에 피부 미용 분야에 있어서도 특히 항노화에 대한 수요자들의 관심이 높아지고 있으며, 관련 항노화 제품의 개발도 다양하게 이루어지고 있으나, 그 효능에 대한 실제 소비자들의 신뢰도는 그다지 높지 않은 상황이다. 한편, 최근 자연주의 바람이 불면서 천연 재료로 만든 제품에 대한 선호도가 높아지고 있으며, 항노화 제품에 있어서도 생물전환(bioconversion) 기술을 기반으로 하는, 발효 화장품 시장이 급격히 증가하고 있는 추세이다. 발효 화장품은 유용 미생물을 이용하여 각종 천연 재료가 갖는 유효성분의 흡수율과 안전성을 높일 수 있는 장점이 있다.
이에, 본 발명의 발명자들은 항노화 기능의 발효 화장품의 소재로, 천연 재료를 활용하여 피부에 적용시 안전성을 확보하면서도, 실질적으로 피부 주름 개선 또는 탄력 증가에 도움을 줄 수 있는 물질을 개발하고자 예의 노력한 결과, 갈대(Phragmites Communis) 뿌리를 상황버섯 균사체(Phellinus Linteus)로 발효시킨 발효물의 추출물이 세포 독성을 나타내지 않으면서도 콜라겐 생성 및 엘라스틴 분해효소의 억제에 탁월한 효과가 있음을 최초로 발견하고, 이를 피부 주름 개선 또는 탄력 증가 목적으로 사용할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 갈대(Phragmites Communis) 발효 추출물을 포함하는, 피부의 주름 개선 또는 탄력 증가용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 갈대 발효 추출물을 포함하는, 피부의 주름 개선 또는 탄력 증가용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 조성물은 갈대 뿌리에 상황버섯 균사체(Phellinus Linteus)를 접종하여 발효시킨 발효물의 추출물을 포함하는 것으로, 상기 추출물은 콜라겐 생성을 촉진하고 엘라스틴 분해효소를 억제함으로써 피부의 주름을 개선하고 탄력을 증가시키는 용도로 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 갈대 발효 추출물을 제조하는 공정을 나타낸 것이다.
도 2는 갈대 뿌리를 상황버섯 균사체(Phellinus Linteus)로 발효시킬 경우, 발효 기간에 따른 변화를 나타낸 것이다.
도 3은 갈대 뿌리를 상황버섯 균사체로 발효시키는 과정 중 카페산(caffeic acid)의 생산을 HPLC 분석으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 갈대 뿌리를 상황버섯 균사체로 발효시키는 과정 중 카페산의 생산을 1H NMR 분석으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5a는 표준물질 카페산의 분석 결과이며, 도 5b는 갈대 발효 추출물의 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 갈대 발효 추출물의 처리 농도에 따른 콜라겐 발현량을 나타낸 것이다.
도 7은 카페산의 처리 농도에 따른 콜라겐 발현량을 나타낸 것이다.
도 8은 카페산의 처리 농도에 따른 콜라겐 분해 억제능을 나타낸 것이다.
도 9는 갈대 추출물의 발효 전/후의 처리 농도에 따른 엘라스틴 분해효소의 저해율을 나타낸 것이다.
도 10은 갈대 발효 추출물의 처리 농도에 따른 섬유아세포 Hs68의 생존율을 나타낸 것이다.
도 11은 카페산의 처리 농도에 따른 섬유아세포 Hs68의 생존율을 나타낸 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 갈대(Phragmites Communis) 발효 추출물을 포함하는, 피부의 주름 개선 또는 탄력 증가용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명은 천연 소재인 갈대 뿌리를 상황버섯 균사체를 이용해 발효시키고 추출한 추출물이 피부에 적용시 안전하면서도 피부 콜라겐 생성 및 엘라스틴 분해효소의 억제에 탁월한 효과가 있음을 발견하고, 이를 피부 주름 개선 또는 탄력 증가에 활용하고자 한 기술사상에 기초한 것으로, 이러한 갈대 뿌리의 상황버섯 발효 추출물의 놀라운 효과는 본 발명자들에 의하여 최초로 규명된 것이다.
본 발명에서 용어 "갈대(Phragmites Communis)"는 외떡잎식물 화본목 벼과의 여러해살이풀로, 습지나 갯가, 호수 주변의 모래땅에 군락을 이루고 자라는 식물을 의미한다. 구체적으로, 본 발명에서 갈대는 갈대의 뿌리를 의미하는 것일 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다. 상기 갈대의 뿌리는 "노근(蘆根)"이라고도 하며, 한방에서는 갈대의 뿌리를 말린 것을 의미한다. 노근의 약리 작용으로는 이뇨 작용, 해열 작용, 간 보호 작용, 조혈 기능 강화 작용 등이 알려져 있다.
본 발명에서 용어 "발효"는 미생물이 가지고 있는 효소를 이용하여 유기물을 분해시키는 것을 의미한다. 본 발명에서는 갈대, 구체적으로는 갈대의 뿌리를 미생물 균주를 이용하여 발효시키는 것일 수 있으며, 보다 구체적으로 상기 미생물은 상황버섯 균사체(Phellinus Linteus)일 수 있다. 본 명세서 내에서 상기 상황버섯 균사체는 상황버섯 종균과 혼용될 수 있다. 본 발명에서 용어 "발효물"은 발효 과정을 거쳐 수득한 액상성분, 상기 액상성분으로부터 용매를 제거하여 수득한 고형분 등의 결과물을 의미한다.
상기 "상황버섯"은 담자균류 민주름버섯목 진흙버섯과의 버섯을 의미하는 것으로, 베타글루칸, 플라보노이드, 에르고스테롤 등 활성물질을 포함하여 항암, 면역 증강, 항산화 등의 생리활성이 있다고 알려져 있다.
본 발명에서 용어 "추출물"은 목적하는 물질을 다양한 용매에 침지한 다음, 상온, 저온 또는 가온 상태에서 일정시간 동안 추출하여 수득한 액상성분, 상기 액상성분으로부터 용매를 제거하여 수득한 고형분 등의 결과물을 의미한다. 뿐만 아니라, 상기 결과물의 희석액, 이들의 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 이들의 조정제물, 정제물 등을 모두 포함하는 것으로 포괄적으로 해석될 수 있다.
상기 추출물은 천연, 잡종, 변종식물로부터 제한없이 추출될 수 있으며, 물(정제수), C1 내지 C6의 알코올 및 이들의 혼합용매를 이용하여 추출하여 수득될 수 있다. 또한, 상기 추출물을 수득하기 위한 방법은 본 발명의 갈대 발효 추출물을 수득할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 구체적으로는 상기 갈대, 갈대 뿌리 또는 갈대 뿌리의 발효물 등을 상기 용매에 침지하고 상온에서 추출하는 냉침추출법, 가열추출법, 초음파를 가하여 추출하는 초음파추출법, 환류 냉각기를 이용한 환류추출법 등의 방법을 사용할 수 있다.
본 발명에서 용어 "발효 추출물"은 상기 발효물을 추출하여 생성된 유용한 물질 자체를 의미할 수 있으며, 보다 구체적으로 발효 균주 및 발효물이 공존하는 발효 균주 배양 배지로부터 발효 균주를 원심분리하여 제거한 발효물, 상기 배양 배지로부터 발효 균주를 여과시킨 발효물, 상기 배양 배지로부터 발효 균주를 멸균 처리하고 이를 여과시킨 발효물, 상기 발효물을 희석시킨 희석액, 상기 발효물을 건조시킨 건조물을 추출 하여 생성된 물질을 모두 포함할 수 있다. 본 명세서 내에서 용어 발효 추출물은 갈대 발효 추출물, 또는 갈대 뿌리의 발효 추출물과 혼용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 발효 추출물은 갈대 발효물의 추출물일 수 있고, 구체적으로 갈대 뿌리 발효물의 추출물일 수 있으며, 보다 구체적으로 갈대 뿌리의 상황버섯 균사체 발효물의 추출물일 수 있다.
본 발명의 갈대 발효 추출물은 카페산(caffeic acid)을 유효성분으로 포함하는 것일 수 있다. 상기 카페산은 분자식은 C9H8O4, 분자량 180.157의 화합물로, 아래 화학식 1로 나타낼 수 있다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2019011841-appb-I000001
본 발명의 일 실시예에서는, 갈대 뿌리의 발효 추출물을 제조하는 과정 에서 갈대에 존재하는 p-쿠마르산에 대해 하이드록실기의 부가 반응이 일어나 카페산으로의 생물 전환(bioconversion)이 일어남을 확인하였다.
본 발명에서 용어 "주름 개선" 또는 "피부 주름 개선"은 본 발명의 조성물을 이용하여 개체의 피부에 존재하는 주름을 완화시키는 것을 의미한다.
본 발명에서 용어 "탄력 증가" 또는 "피부 탄력 증가"는 본 발명의 조성물을 이용하여 개체의 피하 지방층 구조를 강화시켜 피부의 탄력을 높이는 것을 의미한다.
본 발명의 갈대 발효 추출물은 콜라겐의 합성을 촉진하고 엘라스틴 분해효소(elastase)를 억제하는 것일 수 있으며, 이를 통해 피부의 주름을 개선하고 탄력을 증가시키는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 인간 피부 섬유아세포 Hs68에서 갈대 발효 추출물 및 카페산을 처리하여 농도에 비례하게 콜라겐 생성량이 증가 및 콜라겐 분해효소 및 엘라스틴 분해효소가 억제됨을 확인하였고, 갈대 추출물의 발효 전/후를 비교하여 갈대 발효 추출물이 발효하지 않은 갈대 추출물 보다 월등히 엘라스틴 분해 효소를 억제하는 것을 확인하였으며, 인간 피부 섬유아세포 Hs68에서 갈대 발효 추출물 및 카페산의 세포 독성 정도를 확인하였다. 이를 통해, 본 발명의 갈대 발효 추출물 및 카페산을 포함하는 조성물은 피부의 주름 개선 또는 탄력 증가용 화장료 조성물로 사용될 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 조성물은 상기 갈대 발효 추출물 이외에 곡류의 발효 추출물을 추가로 포함하는 것일 수 있다. 상기 곡류는 현미, 보리, 쌀 등을 의미하는 것일 수 있으며, 특별히 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 화장료 조성물은 갈대 발효 추출물을 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 내지 50 중량%(w/w)로 포함할 수 있고, 구체적으로 0.001 내지 5 중량%(w/w)로 포함할 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다. 상기 화장료 조성물은 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 팩, 피부접착용 패치, 피부접착용 겔, 파우더, 연고, 페이스트, 젤, 서스펜션, 에멀젼, 스프레이, 미용액 또는 캡슐로 제형화되는 것일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 화장료 조성물은 일반 피부 화장료에 배합되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 추가로 포함할 수 있으며, 통상의 성분으로 예를 들면 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급 알콜, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체는 제형에 따라 다양하다.
본 발명의 제형이 연고, 페이스트, 크림 또는 젤인 경우에는, 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되며, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일이 이용될 수 있으며, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
한편, 본 발명의 제형이 캡슐인 경우에는, 알지네이트(alginate) 캡슐, 아가(agar) 캡슐, 젤라틴(gelatin) 캡슐, 왁스(wax)류 캡슐, 또는 이중 캡슐의 형태로 제형화될 수 있으며, 특별히 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 화장료 조성물은 갈대 발효 추출물 이외에 통상적으로 이용되는 보조제, 예컨대 친수성 또는 친지성 겔화제, 친수성 또는 친지성 활성제, 보존제, 항산화제, 용매, 방향제, 충전제, 차단제, 안료, 흡취제 및 염료 등을 포함할 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 하나의 양태는 갈대 발효 추출물을 포함하는, 피부의 주름 개선 또는 탄력 증가용 식품 조성물을 제공한다. 상기 갈대, 발효, 추출물, 주름 개선 및 탄력 증가는 전술한 바와 같다.
본 발명에서 용어 "식품"은 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능(성)식품류 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다. 상기 식품은 공지의 제조방법에 따라 정제, 과립, 분말, 캅셀, 액상의 용액 및 환 등의 제형으로 제조할 수 있으며, 본 발명에 따른 갈대 발효 추출물의 함량은 제형에 따라 식품 조성물 총 중량을 기준으로 0.0001 중량% 내지 100 중량%로 조절할 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 갈대 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며, 통상의 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 포함할 수 있으며, 이외에 식품학적으로 허용 가능한 식품보조첨가제를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, "식품보조첨가제"란 식품에 보조적으로 첨가될 수 있는 구성요소를 의미하며, 각 제형의 건강기능식품을 제조하는데 첨가되는 것으로서 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 식품보조첨가제의 예로는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함되지만, 상기 예들에 의해 본 발명의 식품보조첨가제의 종류가 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 식품 조성물에는 건강기능(성)식품이 포함될 수 있다. 상기 "건강기능(성)식품"은 특정 보건용 식품(food for special health use, FoSHU)와 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미한다. 상기 "기능(성)"은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 건강기능식품의 제조시 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 건강기능식품의 제형 또한 식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 건강기능식품 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없으며, 휴대성이 뛰어난 장점이 있다.
본 발명의 건강기능식품이 취할 수 있는 형태에는 제한이 없으며, 통상적인 의미의 식품을 모두 포함할 수 있고, 기능성 식품 등 당업계에 알려진 용어와 혼용 가능하다. 아울러 본 발명의 건강기능식품은 당업자의 선택에 따라 식품에 포함될 수 있는 적절한 기타 보조성분과 공지의 첨가제를 혼합하여 제조할 수 있다. 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 본 발명에 따른 갈대 발효 추출물을 주성분으로 하여 제조한 즙, 차, 젤리 및 주스 등에 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 동물을 위한 사료로 이용되는 식품도 포함한다.
또한, 상기 건강기능식품 조성물은 생리학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있는데, 담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 또한, 상기 건강기능식품 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 제한없이 포함할 수 있으며, 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용될 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 갈대 발효 추출물의 제조방법을 제공한다. 상기 갈대, 발효 및 추출물은 전술한 바와 같다.
구체적으로, 상기 제조방법은 (a) 갈대(Phragmites Communis) 뿌리에 상황버섯 균사체(Phellinus Linteus)를 접종하여 발효물을 제조하는 단계; 및 (b) 상기 발효물을 추출용매로 추출 및 분획하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 (a) 단계에 있어서, 접종한 상황버섯 균사체는 25~28℃에서 40~50일간 배양될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 갈대 발효 추출물을 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 피부의 주름 개선 또는 탄력 증가 방법을 제공한다. 상기 “갈대”, “발효”, “추출물”, “주름 개선” 및 “탄력 증가”는 전술한 바와 같다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 갈대 발효 추출물을 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 피부의 주름 개선 또는 탄력 증가 용도를 제공한다. 상기 “갈대”, “발효”, “추출물”, “주름 개선” 및 “탄력 증가”는 전술한 바와 같다.
본 발명에서 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 개체에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달하여 피부의 주름 개선 또는 탄력 증가의 효과를 나타낼 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 상기 투여는 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 본 발명의 조성물이 피부 주름 개선 또는 탄력 증가에 효과가 있는 특성상, 상기 조성물의 투여 경로는 피부에 도포하여 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 매일 또는 간헐적으로 투여해도 좋고, 1일당 투여 횟수는 1회 또는 2~3회로 나누어 투여하는 것이 가능하다. 또한, 본 발명의 조성물은 피부 주름 개선 또는 탄력 증가를 위하여 단독으로, 또는 다른 물질과 병용하여 사용할 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명에서 "개체"는 피부 주름이 발생하였거나 피부 탄력이 감소한, 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 동물을 의미한다. 구체적으로, 인간을 포함하거나 포함하지 않는 포유동물일 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 갈대 발효 추출물의 제조
1-1: 갈대 뿌리 발효물의 제조
먼저 갈대 뿌리의 발효물을 제조하기 위해, 곡류(현미, 보리, 쌀)와 갈대 뿌리를 준비하여 세척 후, 12시간 동안 침지하였다. 이후 총 중량을 기준으로 55 중량%(w/w)의 곡류를 기반으로 갈대 뿌리 45 중량%(w/w) 비율로 첨가하여 약 500g씩 비닐에 담아 기본 배지를 준비하였다. 상기 배지는 습열로 121℃에서 1시간 동안 멸균하였다. 이후, 황설탕 3%, 물엿 1%, 콩가루 0.3%의 비율로 혼합하여 제조된 영양액을 멸균하여 액체 종균(상황버섯 균사체, Phellinus Linteus)을 접종하였고, 이를 10일 간 통기배양발효하여 종균 배지를 제조하였다. 상황버섯 종균은 상기 기본 배지 500g 당 약 10ml씩 접종하여 고체배양하였다. 접종한 상황버섯 종균은 25 ~ 28℃에서 40 ~ 50일간 배양하였고, 이후 55℃에서 24시간 동안 열풍 건조하여 발효물을 제조하였다(도 1 및 도 2).
1-2: 갈대 뿌리 발효 추출물의 제조
상기 실시예 1-1에서 제조된 발효물을 100% 에탄올(주정)을 이용하여 상온에서 24시간 동안 추출하였고, 에탄올을 증발시켜 최종 수율 2%로 갈대 뿌리의 발효 추출물을 제조하였다(도 1).
실시예 2: 갈대 뿌리 발효 추출물의 유효 성분 확인
실시예 1의 과정을 통해 갈대 뿌리의 발효 추출물을 제조하는 과정 중 갈대에 존재하던 p-쿠마르산(p-coumaric acid)에 대해 하이드록실(hydroxyl)기의 부가 반응이 일어나 카페산(caffeic acid)으로의 생물 전환(bioconversion)이 일어나는 것을 HLPC 분석, 질량 스펙트럼(mass spectrum) 분석 및 1H NMR을 통해 확인하였다. 카페산의 양은 약 0.05g/batch로 확인되었다(도 3 및 4).
구체적으로, PDA 검출기를 이용하여 C18, 150*4.6mm, 5㎛ 칼럼을 30℃로 유지하고 이동상 용매는 0.1% 트리플루오로아세트산을 첨가한 정제수와 아세토니트릴을 80:20의 비율로 사용하였다. 분석할 시료는 5㎕를 주사하였고 분석결과는 UV 320nm에서 확인하였다. 그 결과, 표준 물질인 카페산은 3.9분대에 검출되었고 갈대 발효 추출물을 분석한 결과 3.927분에 카페산이 검출되었다(도 5a 및 5b). 이를 통해, 상황버섯 균사체로 갈대 뿌리를 발효시 높은 항산화 활성을 갖는 카페산이 다량으로 생성됨으로써, 본 발명 조성물의 우수한 피부 주름 개선 또는 탄력 증가 효과를 예측할 수 있었다.
실시예 3: 콜라겐 생성 증가 확인
3-1: 콜라겐 발현 증가 확인
본 발명의 갈대 발효 추출물이 콜라겐 발현에 미치는 영향을 측정하기 위하여 유전자 분석을 통해 COL1A1의 발현을 측정하였다.
보다 구체적으로, 인간 피부 섬유아세포 Hs68을 48-well plate에 5×104cell/well 부착시키고 갈대 발효 추출물을 세포에 처리하였다. 24시간 후 배지를 제거하고 1X PBS로 세척하고, RNA 추출 키트를 이용하여 세포로부터 RNA를 추출하였다. 추출된 RNA는 cDNA 합성키트를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 갈대 발효 추출물이 처리된 cDNA 2㎕에 COL1A1 forward primer 1㎕, reverse primer 1㎕, PCR Master Mix(2X) 10㎕, SYBR Green 1 Nucleic acid 1㎕를 첨가하고, 정제수를 첨가하여 20㎕가 되도록 하였다. 혼합한 시료는 94℃ 5분, 94℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 30초, 72℃ 5분의 조건으로 annealing 단계를 45 cycle qPCR하였다.
그 결과, 도 6에서 볼 수 있듯이, 섬유아세포 Hs68에서 갈대 발효 추출물을 500ppm 처리할 경우 콜라겐 생성량이 양성 대조군인 TGF-β(0.5ng/ml) 처리시 보다 높은 146% 증가함을 확인하였다.
3-2: 콜라겐 발현 측정
본 발명의 갈대 발효 추출의 유효성분인 카페산이 콜라겐 발현에 미치는 영향을 측정하기 위하여 유전자 분석을 통해 COL1A1의 발현을 측정하였다.
보다 구체적으로, 인간 피부 섬유아세포 Hs68을 48-well plate에서 5 × 104cell/well 접종하고 카페산을 세포에 처리하였다. 24시간 후, 배지를 제거하고 1X PBS로 세척한 뒤, RNA 추출 키트를 이용하여 세포로부터 RNA를 추출하였다. 추출된 RNA는 cDNA 합성키트를 사용하여 cDNA를 합성하였으며, 카페산이 처리된 cDNA 2㎕에 COL1A1 forward primer 1㎕, reverse primer 1㎕, Emerald Amp PCR Master Mix 10㎕, SYBR Green 1 Nucleic acid gel stain 1㎕를 첨가하고, 정제수 5㎕를 첨가하여 20㎕가 되도록 하였다. 혼합한 시료는 real time PCR tube에 넣어 denaturation 94℃ 5분, annealing 94℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 30초 35 cycle 및 extension 72℃ 5분 조건으로 PCR을 진행하였다. PCR 결과는 아가로스 겔에 4㎕씩 분주하여 100V에서 1시간동안 전기영동 하여 밴드를 확인하였으며, Ct(threshold cycle) 값을 가지고 β-actin을 통해 상대정량화 하였다.
그 결과, 도 7에서 볼 수 있듯이, 섬유아세포 Hs68에서 카페산을 500ppm 처리할 경우 콜라겐 생성량이 양성 대조군인 TGF-β(0.5ng/ml) 처리시 보다 높은 것을 확인하였다.
이를 통해, 본 발명의 카페산을 유효성분으로 포함하는 갈대 발효 추출물이 인간 피부 섬유아세포에서 콜라겐 생성을 촉진함으로써 피부 주름을 개선하고 탄력을 증가시키기 위한 조성물로써 사용될 수 있음을 확인하였다.
실시예　4: 콜라겐 분해 억제능 확인
본 발명의 갈대 발효 추출물의 유효성분인 카페산이 콜라겐 분해에 미치는 영향을 측정하기 위하여 유전자 분석을 통해 MMP1의 발현을 측정하였다.
MMP1의 발현 측정 방법은 상기에서 서술한 COL1A1을 측정한 방법과 동일하다.
그 결과, 도 8에서 볼 수 있듯이, 섬유아세포 Hs68에서 카페산을 처리할 경우 콜라겐분해효소인 MMP1의 생성이 농도에 비례하여 억제되는 것을 확인하였다.
이를 통해, 본 발명의 카페산을 유효성분으로 포함하는 갈대 발효 추출물이 인간 피부 섬유아세포에서 콜라겐분해효소의 생성을 억제함으로써 피부 주름을 개선하고 탄력을 증가시키기 위한 조성물로써 사용될 수 있음을 확인하였다.
실시예 5: 갈대 추출물의 발효 전/후의 엘라스틴 분해효소(elastase) 억제 확인
본 발명의 갈대 추출물의 발효 전/후의 엘라스틴 분해효소 억제능을 비교하기 위하여 갈대 추출물과 갈대 발효 추출물의 비교 실험을 진행하였다.
보다 구체적으로, 갈대 발효 추출물은 0.2M Tris-HCL buffer(pH 8.0)를 용매로 하여 농도별로 준비하였다. 엘라스틴 분해효소(elastase)는 150mU, 기질인 STANA는 50mM로 준비하였고, 양성대조군으로 0.1mM로 희석한 우르솔산(ursolic acid)을 준비하였다.
준비한 각각의 시료는 96-well plate에서 50mM STANA 2㎕, 갈대 추출물, 갈대 발효 추출물, 우르솔산 및 0.2M Tris buffer 10㎕씩 분주하고, 엘라스틴 분해효소 90㎕를 동시에 넣어 반응시켰다. 이후 실온에서 5 ~ 10분 동안 반응시켜 ELISA reader로 405nm에서 흡광도를 측정하였고, 엘라스틴 분해효소의 저해율(%)은 100 - {(시험군-시험군의 공시험군)/(음성대조군-음성대조군의 공시험군) × 100으로 계산하였다.
그 결과, 도 9에서 볼 수 있듯이, 갈대 발효 추출물이 발효를 하지 않은 갈대 추출물보다 월등히 높은 엘라스틴 분해효소 억제능을 보임을 확인하였다.
이를 통해, 본 발명의 갈대 발효 추출물이 발효를 하지 않은 갈대 추출물 보다 월등히 높은 엘라스틴 분해효소 저해 활성을 보이며, 따라서 상기 갈대 발효 추출물은 피부 주름을 개선하고 탄력을 증가시키기 위한 조성물로서 우수한 효과가 있음을 확인하였다.
실시예 6: 갈대 발효 추출물 및 카페산의 세포 독성 확인
6-1: 갈대 발효 추출물의 세포 독성 확인
본 발명의 갈대 발효 추출물의 독성을 확인하기 위하여 세포 독성 실험을 진행하였다.
보다 구체적으로, 인간 피부 섬유아세포 Hs68을 48-well plate에 5 × 104cell/well 부착시키고 갈대 발효 추출물을 세포에 처리하였다. 24시간 후 EZ-CYTOX cell viability assay kit를 사용하여 시약 20㎕를 각 well에 첨가하고 가볍게 흔들어 섞어, 37℃, 5% CO2 incubator에서 1 ~ 4시간 동안 배양하고 ELISA reader로 450nm의 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 10에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 갈대 발효 추출물은 1000ppm의 처리 농도에서도 약 102%의 세포 생존율을 보임에 따라, 인간 섬유아세포에서 독성을 나타내지 않음을 확인하였다.
6-2: 카페산의 세포 독성 확인
본 발명의 갈대 발효 추출물인 카페산의 독성을 확인하기 위하여 세포 독성 실험을 진행하였다.
보다 구체적으로, 인간 피부 섬유아세포 Hs68을 48-well plate에 2.5 × 105cell/well씩 접종하고 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양하였다. 24시간 후, 세포의 배지를 제거하고 1X DPBS로 세척한 뒤, 세포에 카페산을 1, 5, 10, 50, 100, 500 μg/㎖ 및 양성대조군인 TGF-β 0.5ng/㎖를 200㎕씩 분주하였다. 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 추가 배양한 후, EZ-CYTOX cell viability assay kit를 사용하여 시약 20㎕를 각 well에 첨가하고 가볍게 흔들어 섞어, 1시간마다 ELISA reader로 450nm 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 11에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 갈대 발효 추출물 유효성분인 카페산은 ~100㎛ 처리할 때 약 100%의 세포 생존율을 보임에 따라, 100㎛ 이내에서 인간 섬유아세포에서 독성을 나타내지 않음을 확인하였다.
이를 통해, 본 발명의 카페산을 유효성분으로 하는 갈대 발효 추출물은 피부 주름 개선 또는 탄력 증가 목적의 화장료 조성물 등에 안전한 소재로서 활용될 수 있음을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (9)

  1. 갈대(Phragmites Communis) 발효 추출물을 포함하는, 피부의 주름 개선 또는 탄력 증가용 화장료 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 갈대는 갈대의 뿌리인 것인, 화장료 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 발효는 상황버섯 균사체(Phellinus Linteus)를 이용하여 수행되는 것인, 화장료 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 발효 추출물은 물, C1 내지 C6의 알코올 및 이들의 혼합용매로 구성되는 군으로부터 선택되는 용매로 추출하여 제조되는 것인, 화장료 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 발효 추출물은 카페산(caffeic acid)을 유효성분으로 포함하는 것인, 화장료 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 발효 추출물은 콜라겐의 합성을 촉진하는 것인, 화장료 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 발효 추출물은 엘라스틴 분해효소(elastase)를 억제하는 것인, 화장료 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 팩, 피부접착용 패치, 피부접착용 겔, 파우더, 연고, 서스펜션, 에멀젼, 스프레이, 미용액 또는 캡슐로 제형화되는 것인, 화장료 조성물.
  9. 갈대(Phragmites Communis) 발효 추출물을 포함하는, 피부의 주름 개선 또는 탄력 증가용 식품 조성물.
PCT/KR2019/011841 2018-09-13 2019-09-11 갈대 발효 추출물을 포함하는 주름 개선 및 탄력 증가용 화장료 조성물 WO2020055171A1 (ko)

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