WO2017142330A1 - 감 추출 분획물을 유효성분으로 포함하는 미백용 화장료 조성물 - Google Patents

감 추출 분획물을 유효성분으로 포함하는 미백용 화장료 조성물 Download PDF

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WO2017142330A1
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persimmon
fermented
fraction
cosmetic composition
mfst
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PCT/KR2017/001724
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한기동
정호정
송효진
김효정
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영남대학교 산학협력단
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/02—Preparations for care of the skin for chemically bleaching or whitening the skin

Definitions

  • the present invention relates to a whitening cosmetic composition
  • a whitening cosmetic composition comprising a fermented persimmon extract fraction as an active ingredient.
  • Persimmon is rich in vitamin A, vitamin C, minerals or dietary fiber and has unique natural pigments and fragrances. It is known to act as an energy source for lactic acid bacteria because it is rich in sugars such as glucose and fructose. In addition, persimmon promotes intestinal contraction and secretion of serous fluid in the human body, and is known to have various physiological activities such as anti-oxidation, anti-arteriosclerosis, anti-cancer, alcohol metabolism promotion, anti-blood coagulation, anti-allergy and the like.
  • persimmons with this effect are 390,820 M / T in Korea, the second largest fruit in Korea, and the production of young persimmons continues to increase to 219,124 M / T.
  • Persimmon persimmons are processed in various forms such as freezing, semi-dry, semi-dry, semi-dry, wine production, persimmon dyeing, and persimmon persimmon dyeing is drawing attention.
  • Persimmon dyeing is excellent in color fastness compared to the existing natural dyeing material, UV and light barrier properties and breathability is good even without additional processing, and has many practical features such as increased durability after dyeing.
  • the number of persimmon dye-related companies has increased to 30 in Qingdao alone, and 600 M / T per year is processed for persimmon dyeing.
  • Pigments that determine human skin color include melanin, hemoglobin, carotenoids, and the like, and various colors of skin, hair, and eyes are determined by these pigments.
  • the most important pigment that determines skin color is melanin.
  • the amount, nature, and distribution of melanin are determined by genetic factors, and melanin production is also influenced by environmental factors such as sun ultraviolet rays and physiological factors such as fatigue and stress.
  • Melanin is converted from tyrosin to dopa (DOPA) and dopaquinone by tyrosinase, which is a melanin synthase that is present in pigment cells, and then is produced through non-enzymatic oxidation.
  • DOPA dopa
  • tyrosinase which is a melanin synthase that is present in pigment cells, and then is produced through non-enzymatic oxidation.
  • Asian women have preferred white and fine skin and have used it as a standard of beauty. Therefore, the development of whitening agents to meet cosmetic needs is being actively conducted. Specific examples include inhibitors that inhibit the activity of tyrosinase such as kojic acid, arbutin, etc., but their use is limited due to insufficient safety on the skin, stability in the formulation and whitening effect. Therefore, whitening is generally used to reduce the production of melanin by inhibiting some reactions during the melanin production process.
  • the ideal whitening action is to inhibit and improve the overexpression of tyrosinase by skin cells by stimulation such as ultraviolet light.
  • stimulation such as ultraviolet light.
  • side effects of several commercially available whitening materials are due to direct inhibition of the enzymatic activity of the expressed tyrosinase.
  • to obtain a fraction of the persimmon extract fermented using lactic acid bacteria and yeast with excellent fermentation ability to determine the overexpression inhibition (tyrosinase indirect inhibition) of tyrosinase by external stimulation in a specific fraction.
  • Patent Document 1 discloses a whitening cosmetic containing persimmon leaf extract, but for a cosmetic composition using persimmon sludge containing all the persimmon pulp, rind, leaves, stems, seeds, etc. It has not been reported yet.
  • An object of the present invention to provide a cosmetic composition for whitening comprising a fraction of the persimmon sludge extract fermented with microorganisms as an active ingredient.
  • the present invention provides a cosmetic composition for whitening comprising a fraction of the persimmon sludge extract fermented with microorganisms as an active ingredient.
  • Fermented persimmon extract fraction can inhibit tyrosinase activity and melanin production, increase the antioxidant capacity through polyphenol increase and radical scavenging inhibition.
  • the main active substance of the fermented persimmon extract fraction is a low molecular weight degradation product derived from tannin.
  • the fermented persimmon extract fraction having the above effect can be utilized as a cosmetic composition for whitening to contribute to the reduction of treatment cost and additional profits used for disposal of persimmon sludge, without directly inhibiting tyrosinase activity. It can be utilized as a tyrosinase indirect inhibitory material capable of inhibiting tyrosinase production.
  • Figure 3 is a schematic diagram showing the process of producing a fraction of the fermented persimmon extract (FPSM, persimmon sludge fermented with Issatchenkia orientalis MFST),
  • FPSM fermented persimmon extract
  • Figure 11 shows the results confirming the inhibition of tyrosinase activity and cytotoxicity by tannins in B16F10 cells.
  • the present invention provides a cosmetic composition for whitening comprising a fraction of the persimmon sludge extract as an active ingredient.
  • Pigments that determine human skin color include melanin, hemoglobin, carotenoids, and the like, and various colors of skin, hair, and eyes are determined by these pigments.
  • the most important pigment that determines skin color is melanin.
  • the amount, nature, and distribution of melanin are determined by genetic factors, and melanin production is also influenced by environmental factors such as sun ultraviolet rays and physiological factors such as fatigue and stress.
  • Melanin is converted from tyrosin to dopa (DOPA) and dopaquinone by tyrosinase, which is a melanin synthase that is present in pigment cells, and then is produced through non-enzymatic oxidation.
  • DOPA dopa
  • tyrosinase which is a melanin synthase that is present in pigment cells, and then is produced through non-enzymatic oxidation.
  • the present invention provides a cosmetic composition for whitening comprising a fraction of the persimmon sludge extract fermented with a microorganism as an active ingredient.
  • the fraction of the persimmon sludge extract may be obtained by fermenting the persimmon sludge with a microorganism and then extracting it with ethanol and distilling it into one eluting solvent selected from the group consisting of C1 to C4 alcohol, water, acetone or a mixed solvent thereof. Specifies that it is not limited.
  • the fraction of the persimmon sludge extract is a first step of grinding dry persimmon sludge, a second step of adding fermented distilled water to the ground persimmon sludge and inoculating the microorganism at 2 to 5% by volume, the fermentation.
  • a third step of extracting by adding ethanol to the fermentation a fourth step of separating the extracted fermentation with one eluting solvent selected from the group consisting of C1 to C4 alcohol, water, acetone or a mixed solvent thereof to obtain a fraction
  • a fifth step of concentration of the obtained fractions under reduced pressure is a first step of grinding dry persimmon sludge, a second step of adding fermented distilled water to the ground persimmon sludge and inoculating the microorganism at 2 to 5% by volume, the fermentation.
  • a third step of extracting by adding ethanol to the fermentation a fourth step of separating the extracted fermentation with one eluting solvent selected from the group consisting of C1
  • the microorganism is Wesselella chibaria MFST ( Weissella cibaria MFST, FPSK) and Issachenkia Orientalis MFST ( Issatchenkia orientalis MFST, FPSM), and the fermentation may be performed at 30 ° C. to 40 ° C. for 50 to 80 hours, but is not limited thereto.
  • the eluting solvent may be one selected from the group consisting of C1 to C4 alcohol, water, acetone or a mixed solvent thereof, more preferably selected from the group consisting of 3: 7, 5: 5, 7: 3 and 10: 0. Methanol: distilled water in one volume ratio, or methanol: acetone in a 1: 1 volume ratio. It is not limited to this.
  • the fraction of the persimmon sludge extract is a first step of grinding persimmon sludge, distilled water is added to the ground persimmon sludge, and Weissella chibaria MFST ( Weissella) cibaria MFST, FPSK) and Issatchenkia orientalis MFST ( Isatchenkia orientalis MFST, FPSM) inoculated with 2 to 5 parts by volume of one or more microorganisms inoculated at 30 °C to 40 °C for 50 to 80 hours Step 2; Elution of the third step of extracting by adding 2 to 8 weight times of ethanol with respect to 100 parts by weight of the fermented fermentation and the elution of the extracted fermented product selected from the group consisting of C1 to C4 alcohol, water, acetone or mixed solvents It can be obtained by a fourth step of separating the solvent and column to obtain a fraction.
  • Weissella chibaria MFST Weis
  • the cosmetic composition may include stabilizers, solubilizers, conventional auxiliaries such as vitamins, pigments and flavors, and a carrier, in addition to the persimmon sludge extract fraction or the fermented persimmon sludge extract fraction as an active ingredient.
  • the cosmetic composition may be prepared in any formulation conventionally prepared in the art, for example, solutions, suspensions, emulsions, pastes, gels, creams, lotions, powders, oils, powder foundations, emulsion foundations, It may be formulated as a wax foundation and spray, but is not limited thereto. More specifically, it may be prepared in the form of a sun cream, a flexible lotion, a convergent lotion, a nourishing lotion, a nourishing cream, a massage cream, an essence, an eye cream, a pack, a spray or a powder.
  • the formulation is a paste, cream or gel, animal oil, vegetable oil, wax, paraffin, starch, tracant, cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica, talc or zinc oxide may be used as a carrier component. .
  • the formulation is a powder or a spray
  • lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate or polyamide powder may be used, in particular in the case of a spray additionally chlorofluorohydrocarbon, propane / butane Or propellants such as dimethyl ether.
  • a solvent, solubilizer or emulsion is used as carrier component, such as water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, propylene glycol, 1,3 Fatty acid esters of butylglycol oil, glycerol aliphatic ester, polyethylene glycol or sorbitan.
  • liquid carrier diluents such as water, ethanol or propylene glycol
  • suspending agents such as ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol esters and polyoxyethylene sorbitan esters, microcrystalline cellulose as carrier components , Aluminum metahydroxy, bentonite, agar or tracant and the like can be used.
  • the persimmons were crushed and juiced to extract the persimmon juice, and the dried persimmon peels generated during the production of persimmon sludge or dried persimmons, which were produced, were dried, ground and frozen for use in this experiment.
  • Mouse melanoma B16F10 cells were distributed from Korean cell line bank (KCLB), 10% fetal bovine serum (FBS, gibco, USA), sodium bicarbonate, Sigma , USA), 1% penicilin (Dulbecco's Modified Eagle Medium, gibco, USA) medium was added to culture in 37 °C, 5% CO 2 incubator.
  • HMV-II cells human melanoma cells, were purchased from the RIKEN Bio Resource Center in Japan, and 37 ° C., 5% CO 2 using Ham's F-12 medium supplemented with 10% fetal calf serum and 1% penicillin / streptomycin. Cultured in the incubator.
  • Tyrosinase activity by fermented persimmon extract was analyzed using human melanoma cells. Tyrosinase activity was measured by colorimetric quantitation of the amount of dopachrome produced by L-DOPA and tyrosinase reaction to determine the change in activity of tyrosinase according to the sample.
  • Human melanoma HMV-II cells were incubated for 24 hours in a 96 well plate and then cultured for 3 hours by treatment with persimmon extract (PS) or fermented persimmon extract (FPSK and FPSM). . Subsequently, 5 ⁇ M of melanin-producing promoter, forskolin stimulant, was incubated for 72 hours.
  • PS persimmon extract
  • FPSK and FPSM fermented persimmon extract
  • the substrate solution containing L-DOPA (2% NN-dimethylformamide in 100 mM sodium phosphate, pH 7.1), 5 mM L-DOPA in 100 mM Sodium phosphate (pH 7.1), 20 mM MBTH in H 2 O) was added to the reaction at 37 °C, the absorbance was measured at 505 nm.
  • tyrosinase overexpressed by phospholine stimulation a melanogenesis-promoting substance
  • PS persimmon extract
  • FPSK and FPSM fermented persimmon extracts
  • the ideal whitening is to inhibit and improve overexpression of tyrosinase by stimuli such as ultraviolet light.
  • stimuli such as ultraviolet light.
  • the side effects of several whitening materials on the market are due to the direct inhibition of these tyrosinase activities.
  • Direct inhibition of tyrosinase activity is likely to cause a number of side effects, including vitiligo, so persimmon extracts (PS) and fermented persimmon extracts (FPSK and FPSM) have a direct effect on tyrosinase overexpressed by phospholine stimulation. It was confirmed whether to give.
  • PS persimmon extracts
  • FPSK and FPSM fermented persimmon extracts
  • Fermented persimmon extract fractions were prepared using the freeze-dried sample prepared in Example 1. Lyophilized samples were dissolved in distilled water and separated using a column packed with Sepadex LH20. As the elution solvent, the elution was carried out using an elution solvent having a different volume ratio between methanol and distilled water or methanol and acetone, followed by thin layer chromatography (TLC) to confirm each fraction, followed by decompression and concentration. To Fr 1 to 8. The preparation process of the fermented persimmon extract fractions is shown in FIG. 3.
  • the fermented persimmon extract fractions were dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) at a concentration of 5 mg / mL, and then diluted by B16F10 cells using a culture medium.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • MTT [3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide] assay was performed to determine the cytotoxicity of the fermented persimmon extract fractions against B16F10 cells.
  • the MTT assay is a spectrophotometric method that measures the mitochondria's ability to reduce MTT, a yellow water-soluble substrate, to purple water-insoluble formazan crystals by the action of mitochondrial dehydrogenase in living cells.
  • B16F10 cells were attached to a 96 well plate, and the fermented persimmon extract fractions were treated for each concentration, followed by incubation for 72 hours. Then, MTT reagent was added and reacted for 2 hours, and then the medium was removed, and 100 ⁇ L of dimethyl sulfoxide was added to dissolve the cells, and the absorbance was measured at 570 nm.
  • Fr. Fractions 1 to 7 were not toxic to B16F10 cells, whereas Fr. Eight fractions were found to be toxic. Therefore, the experiment was conducted by selecting a concentration that inhibits the tyrosinase activity produced by the cells without affecting the survival of the cells.
  • the yield in the fermented persimmon extract fractions (Fr. 1 to 8) is good, and Fr.
  • the antioxidant capacity of the fractions was evaluated using 4 to 8.
  • Total polyphenol contents were measured using the Folin-Denis method. 1 mL of 1N Folin- Ciocalteu's Regent (Sigma, USA) was added to 0.2 mL of the fermented persimmon extract fraction (1 mg / mL) and allowed to react at room temperature for 3 minutes. 0.8 mL of 10% Na 2 CO 3 was added to the reaction solution, reacted at room temperature for 1 hour, and the absorbance was measured at 765 nm. The total polyphenol content was calculated from the standard curve using gallic acid (Sigma, USA).
  • DPPH radical scavenging activity was measured using the Blois method.
  • Free radical is a substance that causes skin aging
  • DPPH (1,1-dyphenyl-2-picrylhydrazyl) radical scavenging activity is one of the simple and widely used methods to measure antioxidant activity. to be.
  • Antioxidant capacity can be measured quantitatively through the antioxidant substance which has a scavenging activity of DPPH radical, which is a stable radical, and uses the principle that the free radical is reduced by aromatic amines and the color is discolored from purple to yellow.
  • DPPH radical scavenging activity of the fermented persimmon extract fractions was expressed as a percentage compared to the control.
  • Fr. 4 is 94% (1 mg / mL), 93.5% (0.5 mg / mL), Fr. 5 is 94.7% (1 mg / mL), 88.2% (0.5 mg / mL), Fr. 6 is 92.5% (1 mg / mL), 90.7% (0.5 mg / mL), Fr. 7 is 101.4% (1mg mL), 99.3% (0.5m g / mL), Fr. 8 was 102.8% (1mg mL), 98.7% (0.5m g / mL) was confirmed to exhibit excellent DPPH radical scavenging ability.
  • Tyrosinase activity was measured by colorimetric quantitation of the amount of dopachrome produced by L-DOPA and tyrosinase reaction to determine the change in activity of tyrosinase according to the sample.
  • B16F10 cells were attached by incubating in 96 well plates for 24 hours.
  • the cells were treated with each fermented persimmon extract fraction (Fr. 4 to 8) by concentration and incubated for 3 hours, and then treated with melanin-producing melanocyte stimulating hormone ( ⁇ -melanocyte-stimulating hormon ( ⁇ -MSH)). Incubated for 72 hours.
  • ⁇ -melanocyte-stimulating hormon ⁇ -MSH
  • a substrate solution containing L-DOPA (2% NN-dimethylformamide in 100 mM sodium phosphate, pH 7.1), 5 mM L -DOPA in 100 mM sodium phosphate (pH 7.1), 20 mM MBTH in H 2 O) was added and reacted at 37 ° C, and then absorbance was measured at 505 nm.
  • Fr. 4 and Fr. 7 tyrosinase activity of B16F10 cells induced by ⁇ -MSH was increased in Fr. 4 and Fr. It was confirmed that it is suppressed at 7. Thus, Fr. 4 and Fr. The concentration of 7 was further subdivided to analyze tyrosinase activity. Referring to FIG. 8, Fr. 4 and Fr. 7 was found to significantly inhibit tyrosinase activity in a concentration-dependent manner. Fr. 8 also showed a high inhibitory effect on tyrosinase activity, but this may be due to cytotoxicity. Fr. 4 and Fr.
  • the amount of melanin production was measured.
  • the fermented persimmon fraction extracts Fr. 4 and Fr. 7 were treated by concentration and incubated for 3 hours. Thereafter, the ⁇ -MSH stimulant was treated and incubated for 72 hours. After the culture solution was removed and washed with phosphated buffered saline (PBS), 150 ⁇ L of RIPA buffer was added and scraped and dissolved for 30 minutes on ice. After centrifugation at 4 ° C.
  • PBS phosphated buffered saline
  • the melanin content of B16F10 cells induced by ⁇ -MSH was Fr. 4 and Fr. It was confirmed that it was suppressed in a concentration-dependent manner by 7. This may be due to the decrease in the total activity of tyrosinase enzyme due to the inhibition of tyrosinase production of the fermented persimmon extract fraction.
  • the fractions with the highest inhibitory activity for tyrosinase activity and melanin production were analyzed using high-performance liquid chromatography (HPLC, Waters 1525).
  • HPLC high-performance liquid chromatography
  • tannin tannin
  • catechin catechin
  • the fermented persimmon extract significantly inhibited tyrosinase activity
  • the fermented persimmon extract fraction significantly inhibited tyrosinase activity and melanin production in melanoma cells.
  • the whitening action of the fermented persimmon extract fraction was found to be an inhibitory effect on the expression stage of tyrosinase overexpressed by stimulation such as ultraviolet light, rather than direct enzymatic activity inhibition on tyrosinase.
  • the fermented persimmon fraction extract which showed excellent effects, was fractionated with different solvents and the whitening activity was confirmed for each fraction. 4 and Fr.
  • the fermented persimmon extract fraction developed in the present invention may be utilized as a tyrosinase indirect inhibitory material.
  • Polysorbate 60 was 1.0 parts by weight, sorbitan. 0.5 parts by weight of sesquioleate, 10.0 parts by weight of paraffin, 1.0 parts by weight of sorbitan stearate, 0.5 parts by weight of lipophilic monostearic acid, 1.5 parts by weight of stearic acid, 1.0 parts by weight of glyceryl stearate / PEG-400 stearate, triethanol 0.2 parts by weight of amine was heated to 80 to 85 ° C.
  • 0.3 parts by weight of carboxypolymer, 5.0 parts by weight of butylene glycol, 3.0 parts by weight of glycerin and the remaining amount of purified water were heated to 80 to 85 ° C. while stirring, and then added to the production part to act on an emulsifier, 2.0 parts by weight of stearic acid, cetyl alcohol 2.0 parts by weight, glyceryl monostearate 2.0 parts by weight, polyoxyethylene sorbitan monostearate 0.5 parts by weight, sorbitan sesquioleate 0.5 parts by weight, glyceryl monostearate / glyceryl stearate / polyoxyethylene stearate 1.0 part by weight, 1.0 part by weight of wax, 4.0 parts by weight of liquid paraffin, 4.0 parts by weight of squalane, 4.0 parts by weight of caprylic / capric triglycerides were heated to 80 to 85 ° C., and 0.5 parts by weight of triethanolamine was added thereto to emulsify.
  • Example 1 After stirring, a portion of purified water was added and mixed for 30 minutes, and then, a portion of purified water was slowly added thereto, stirred for 30 minutes, cooled to 35 ° C, and the fermented sludge extract fraction and flavor prepared in Example 1 were mixed. After the addition was cooled to 25 °C and aged.

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Abstract

본 발명은 미생물로 발효시킨 감 추출물 분획물을 유효성분으로 포함하는 미백용 화장료 조성물에 관한 것으로, 상기 발효 감 추출 분획물은 티로시나아제 활성 및 멜라닌 생성을 억제하고, 폴리페놀 증가 및 라디칼 소거능 억제를 통해 항산화능을 증가시킬 수 있다. 따라서, 상기와 같은 효과를 갖는 발효 감 추출 분획물은 미백용 화장료 조성물로 활용하여 감 슬러지 폐기처분에 사용되는 처리비용 절감 및 부가적인 이익 창출에 기여할 수 있으며, 티로시나아제 활성을 직접 억제하지 않으면서 티로시나아제 생성을 억제할 수 있는 티로시나아제 간접 억제 소재로 활용될 수 있다.

Description

감 추출 분획물을 유효성분으로 포함하는 미백용 화장료 조성물
본 발명은 발효된 감 추출 분획물을 유효성분으로 포함하는 미백용 화장료 조성물에 관한 것이다.
감은 비타민A, 비타민 C, 무기질 또는 식이섬유가 풍부하고 독특한 천연색소와 향기 성분을 가지고 있으며, 포도당, 과당 등의 당류가 풍부하여 유산균 등의 에너지원으로 작용하는 것으로 알려져 있다. 또한, 감은 인체 내에서 장 수축작용 및 장액 분비를 촉진하고, 항산화, 항동맥경화, 항암, 알코올 대사촉진, 항혈액응고, 항알레르기 등의 다양한 생리활성을 가지는 것으로 알려져 있다.
이러한 효능을 가진 감은 2011년 기준, 국내 생산량이 390,820 M/T으로 국내에서 두 번째로 많이 생산되는 과실이며, 그 중 떫은 감의 생산량은 219,124 M/T으로 지속적으로 증가하고 있다.
떫은 감은 동결연시, 반건시, 세절반건시, 와인 제조, 감물 염색 등 다양한 형태로 가공되어 소비되며, 특히 이 중 감물 염색이 주목을 받고 있다. 감물 염색은 기존 천연 염재에 비해 견뢰도가 우수하고, 별도의 가공 없이도 자외선 및 광 차단성과 통기성이 좋으며, 염색 후 내구력이 증가하는 등의 많은 실용적 특징을 가지고 있다. 때문에 현재 청도군에서만도 감물 염색 관련 업체가 30여 곳으로 증가했으며, 감물 염색을 위해 연간 600 M/T의 감이 가공되고 있다. 하지만 이러한 감물 염색 사업이 발전함에 따라 약 240 M/T에 달하는 다량의 착즙 슬러지가 발생하고 있으며, 이는 사료 및 비료로 일부 이용되거나 산업 폐기물로 버려지고 있다. 착즙 슬러지에는 감의 영양성분과 유효성분들이 잔류하고 있어 그대로 버려질 경우 이용가능한 자원이 손실될 뿐만 아니라 수분 및 유기물질의 함량이 높아 부패로 인한 환경오염을 야기하며, 산업폐기물로 처리 시 톤(t)당 30 내지 50 만원의 비용이 발생한다는 많은 문제점들이 있다.
상기의 문제를 해결하기 위하여 버려지는 감 슬러지에서 기능성 물질을 추출하여 재활용하거나, 추출물을 이용한 상품화에 대한 연구가 요구되고 있다. 특히 화장품 시장에서 천연 원료가 각광을 받으면서, 감의 가공 공정에서 생산되는 부산물을 이용한 화장료 조성물이 주목을 받고 있다.
사람의 피부색을 결정하는 색소는 멜라닌, 헤모글로빈, 카로티노이드 등이 있으며, 피부, 모발 및 눈의 다양한 색깔이 이러한 색소에 의해 결정된다. 피부색을 결정하는 가장 중요한 색소는 멜라닌으로 멜라닌의 양, 성질 및 분포 정도는 유전적 요인에 의해 결정되며, 멜라닌 생성은 태양 자외선과 같은 환경적 요인, 피로 및 스트레스와 같은 생리적 요인에 의해서도 영향을 받는다. 멜라닌은 색소 세포 내에 존재하는 멜라닌 합성 효소인 티로시나아제(tyrosinase) 작용에 의해 티로신(tyrosin)에서 도파(DOPA), 도파퀴논(Dopaquinone)으로 전환된 후, 비효소적 산화 반응을 통해 생성된다.
동양권 여성들은 희고 고운 피부를 선호하고 이를 미의 기준으로 삼아 왔으며, 따라서 미용적 욕구를 충족시키기 위한 미백제에 대한 개발이 활발히 이루어지고 있다. 구체적인 예로 코직산, 알부틴 등과 같은 티로시나아제의 활성을 저해하는 억제제들이 있으나, 이들은 피부에 대한 안전성, 제형 내에서의 안정성 및 미백 효과의 불충분으로 인해 그 사용이 제한되고 있다. 따라서, 미백은 상기 멜라닌 생성 과정 중의 일부 반응을 저해함으로써 멜라닌의 생성을 감소시켜 주는 방법이 일반적으로 사용되고 있다.
이상적인 미백 작용은 피부 세포가 자외선과 같은 자극에 의해 티로시나아제가 과발현되는 것을 억제하고 개선하는 것이다. 현재, 시판되고 있는 여러 미백 소재들의 부작용 사례는 발현된 티로시나아제의 효소 활성을 직접 저해하는 것에 기인한다. 본 발명에서는 발효력이 우수한 젖산균과 효모를 이용하여 발효한 감 추출물의 분획물을 얻고, 특정 분획물에서 외부 자극에 의한 티로시나아제의 과발현 억제(티로시나아제 간접 저해)를 확인하고자 한다.
국내공개특허 10-1998-0055293(특허문헌 1)에는 감잎 추출물을 포함하는 미백 화장료가 개시되어 있지만, 감의 과육, 과피, 잎, 꼭지, 씨 등을 모두 포함하는 감 슬러지를 이용한 화장료 조성물에 대해서는 아직까지 보고된 바가 없다.
본 발명의 목적은 미생물로 발효시킨 감 슬러지 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하는 미백용 화장료 조성물을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 미생물로 발효시킨 감 슬러지 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하는 미백용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 발효 감 추출 분획물은 티로시나아제 활성 및 멜라닌 생성을 억제하고, 폴리페놀 증가 및 라디칼 소거능 억제를 통해 항산화능을 증가시킬 수 있다. 또한, 상기 발효 감 추출 분획물의 주요 활성 물질은 탄닌 유래 저분자 분해산물인 것을 규명하였다.
따라서, 상기와 같은 효과를 갖는 발효 감 추출 분획물은 미백용 화장료 조성물로 활용하여 감 슬러지 폐기처분에 사용되는 처리비용 절감 및 부가적인 이익 창출에 기여할 수 있으며, 티로시나아제 활성을 직접 억제하지 않으면서 티로시나아제 생성을 억제할 수 있는 티로시나아제 간접 억제 소재로 활용될 수 있다.
도 1은 인간 흑색종 HMV-Ⅱ 세포에서 발효 감 추출물에 의한 티로시나아제 활성 억제를 확인한 결과이며,
도 2는 HMV-Ⅱ 세포에서 발효 감 추출물에 의한 티로시나아제 활성의 간접 억제를 확인한 결과이며,
도 3은 발효 감 추출물(FPSM, 이사첸키아 오리엔탈리스 MFST(Issatchenkia orientalis MFST)로 발효시킨 감 슬러지)의 분획물 제조 과정을 모식도로 나타낸 것이며,
도 4는 마우스 흑색종 B16F10 세포에서 발효 감 추출 분획물의 세포 독성을 확인한 결과이며,
도 5는 발효 감 추출 분획물의 총 폴리페놀 함량을 확인한 결과이며,
도 6은 발효 감 추출 분획물의 DPPH 라디칼 소거능을 확인한 결과이며,
도 7은 B16F10 세포에서 발효 감 추출 분획물(Fr 4 내지 8)에 의한 티로시나아제 활성 억제를 확인한 결과이며,
도 8은 B16F10 세포에서 발효 감 추출 분획물(Fr 4 및 7)에 의한 티로시나아제 활성 억제를 확인한 결과이며,
도 9는 B16F10 세포에서 발효 감 추출 분획물(Fr 4 및 7)에 의한 멜라닌 생성 억제를 확인한 결과이며,
도 10은 고성능 액체 크로마토그래피를 이용한 발효 감 추출 분획물의 성분 분석 결과이며,
도 11은 B16F10 세포에서 탄닌에 의한 티로시나아제 활성 억제 및 세포 독성을 확인한 결과이다.
본 발명은 감 슬러지 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하는 미백용 화장료 조성물을 제공한다.
사람의 피부색을 결정하는 색소는 멜라닌, 헤모글로빈, 카로티노이드 등이 있으며, 피부, 모발 및 눈의 다양한 색깔이 이러한 색소에 의해 결정된다. 피부색을 결정하는 가장 중요한 색소는 멜라닌으로 멜라닌의 양, 성질 및 분포 정도는 유전적 요인에 의해 결정되며, 멜라닌 생성은 태양 자외선과 같은 환경적 요인, 피로 및 스트레스와 같은 생리적 요인에 의해서도 영향을 받는다. 멜라닌은 색소 세포 내에 존재하는 멜라닌 합성 효소인 티로시나아제(tyrosinase) 작용에 의해 티로신(tyrosin)에서 도파(DOPA), 도파퀴논(Dopaquinone)으로 전환된 후, 비효소적 산화 반응을 통해 생성된다.
본 발명은 미생물로 발효시킨 감 슬러지 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하는 미백용 화장료 조성물을 제공한다.
상기 감 슬러지 추출물의 분획물은 감 슬러지를 미생물로 발효시킨 후 이를 에탄올로 추출하고 C1 내지 C4 알코올, 물, 아세톤 또는 이의 혼합 용매로 이루어진 군에서 선택된 하나의 용출 용매로 분획하여 수득될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
보다 상세하게는 상기 감 슬러지 추출물의 분획물은 건조한 감 슬러지를 분쇄하는 제 1단계, 상기 분쇄된 감 슬러지에 증류수를 가하고, 미생물을 2 내지 5 부피%로 접종하여 발효시키는 제 2단계, 상기 발효시킨 발효물에 에탄올을 가하여 추출하는 제 3단계, 상기 추출한 발효물을 C1 내지 C4 알코올, 물, 아세톤 또는 이의 혼합 용매로 이루어진 군에서 선택된 하나의 용출 용매와 컬럼으로 분리하여 분획물을 수득하는 제 4단계 및 상기 수득한 분획물을 감압 농축하는 제 5단계를 포함하여 수득될 수 있다.
상기 미생물은 웨이셀라 키바리아 MFST(Weissella cibaria MFST, FPSK) 및 이사첸키아 오리엔탈리스 MFST(Issatchenkia orientalis MFST, FPSM)로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 상기 발효는 30℃ 내지 40℃에서 50 내지 80시간 동안 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
상기 용출 용매는 C1 내지 C4 알코올, 물, 아세톤 또는 이의 혼합 용매로 이루어진 군에서 선택된 하나일 수 있으며, 보다 바람직하게는 3:7, 5:5, 7:3 및 10:0으로 이루어진 군에서 선택된 하나의 부피 비율의 메탄올:증류수이거나, 1:1 부피 비율의 메탄올:아세톤일 수 있으나. 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
보다 바람직하게는 상기 감 슬러지 추출물의 분획물은 감 슬러지를 분쇄하는 제 1단계, 상기 분쇄된 감 슬러지에 증류수를 가하고, 총 100 부피부에 대하여 웨이셀라 키바리아 MFST(Weissella cibaria MFST, FPSK) 및 이사첸키아 오리엔탈리스 MFST(Issatchenkia orientalis MFST, FPSM)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 미생물을 2 내지 5 부피부로 접종하여 30℃ 내지 40℃에서 50 내지 80시간 동안 발효시키는 제 2단계; 상기 발효시킨 발효물 총 100 중량부에 대하여 에탄올 2 내지 8 중량배를 가하여 추출하는 제 3단계 및 상기 추출한 발효물을 C1 내지 C4 알코올, 물, 아세톤 또는 이의 혼합 용매로 이루어진 군에서 선택된 하나의 용출 용매와 컬럼으로 분리하여 분획물을 수득하는 제 4단계를 포함하여 수득될 수 있다.
상기 화장료 조성물은 유효성분인 감 슬러지 추출 분획물 또는 발효된 감 슬러지 추출 분획물 외에 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.
상기 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 썬 크림, 유연 화장수, 수렴 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
상기 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
상기 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
상기 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해 화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
상기 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
이하, 일 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 하기 실시예들은 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 발명의 범위가 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
<참조예> 감 슬러지의 준비
감을 분쇄하고 이를 착즙하여 감 착즙액을 추출한 후, 생성된 잔여물인 감 슬러지 또는 건조 감 제조 과정에서 발생되는 감 껍질을 건조하고 분쇄하여 냉동 보관하여 본 실험에 사용하였다.
< 실시예 1> 감 슬러지 발효 및 발효 감 슬러지 추출물 제조
건조 및 분쇄한 감 슬러지에 대하여 증류수 10 중량배를 가한 후, 총 부피의 3%에 해당하는 웨이셀라 키바리아 MFST(Weissella cibaria MFST) (FPSK) 이사첸키아 오리엔탈리스 MFST(Issatchenkia orientalis MFST) (FPSM)를 접종하고 35℃에서 3일 동안 배양하였다. 발효된 감 슬러지에 에탄올 5 중량배를 가한 후, 실온에서 24시간 동안 추출하고, 추출물을 여과 후 감압·농축하여 동결건조한 다음 냉동 보관하여 시료로 사용하였다.
< 실시예 2> 세포 배양
마우스 흑색종(mouse melanoma) B16F10 세포는 한국 세포주은행(Korean cell line bank, KCLB)에서 분양받았으며, 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS, gibco, USA), 탄산수소나트륨(sodium bicarbonate, Sigma, USA), 1% 페니실린(penicilin)이 첨가된 DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium, gibco, USA) 배지를 이용하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 인간 흑색종 세포인 HMV-Ⅱ 세포는 일본의 RIKEN Bio Resource Center에서 구매하였고, 10% 우태아혈청 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 Ham’s F-12 배지를 이용하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
< 실시예 3> 발효 감 추출물( FPSK 및 FPSM )의 티로시나아제 활성 억제 확인
발효 감 추출물에 의한 티로시나아제 활성은 인간 흑색종 세포를 이용하여 분석하였다. 티로시나아제 활성은 도파(L-DOPA)와 티로시나아제 반응에 의해 생성되는 도파크롬(dopachrome)의 양을 비색 정량하여 시료에 따른 티로시나아제의 활성 변화를 측정하였다.
인간 흑색종 HMV-Ⅱ 세포는 96 웰 플레이트(96 well plate)에 24시간 동안 배양하여 부착시킨 후, 감 추출물(PS) 또는 발효 감 추출물(FPSK 및 FPSM)을 농도 별로 처리하여 3시간 동안 배양하였다. 그 후, 멜라닌 생성 촉진물질인 포스콜린(forskolin) 자극제를 5 μM 처리하고 72시간 동안 배양하였다. 그 다음 용해 버퍼를 첨가한 후, L-DOPA를 포함한 기질액(2% NN-디메틸포름아마이드(NN-dimethylformamide) in 100 mM 인산 나트륨(sodium phosphate, pH 7.1), 5 mM L-DOPA in 100 mM 인산 나트륨(pH 7.1), 20 mM MBTH in H2O)을 가하여 37℃에서 반응시킨 후, 505 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 1을 참조하여 보면, 세포 독성 결과를 바탕으로 각 추출물을 최고농도인 50 μg/mL까지 처리한 결과, 포스콜린 자극제에 의해 증가된 티로시나아제 활성이 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 발효하지 않은 감 추출물(PS) 보다 발효 감 추출물(FPSK 및 FPSM)이 티로시나아제 활성을 더욱 효과적으로 억제하였으며, 농도 의존적으로 활성을 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 이는 특정 균주를 이용한 발효를 통해 발효 전 보다 티로시나아제 활성 억제능이 증가한 것으로 사료된다.
< 실시예 4> 발효 감 추출물( FPSK 및 FPSM )의 티로시나아제 활성에 대한 간접 억제 확인
발효 감 추출물이 인간 흑색종 세포로부터 생성된 티로시나아제 활성에 있어서 직접 억제 효과를 가지는지를 확인하기 위해, 멜라닌 생성 촉진 물질인 포스콜린 자극에 의해 과발현된 티로시나아제를 세포 추출액으로부터 얻고, 감 추출물(PS) 또는 발효 감 추출물(FPSK 및 FPSM)을 농도 별로 처리하여 37℃에서 반응시킨 후, 기질액을 넣어 티로시나아제 활성을 측정하였다.
이상적인 미백작용은 자외선과 같은 자극에 의해 티로시나아제가 과발현되는 것을 억제하고 개선하는 것이다. 현재, 시판되고 있는 여러 미백 소재들의 부작용 사례는 이러한 티로시나아제의 활성을 직접 억제하는 것에 기인한다. 티로시나아제의 활성을 직접 억제할 경우, 백반증 등 여러 부작용을 야기할 가능성이 높으므로 감 추출물(PS)과 발효 감 추출물(FPSK 및 FPSM)이 포스콜린 자극에 의해 과발현된 티로시나아제에 직접적인 영향을 주는지에 대해 확인하였다.
그 결과, 도 2를 참조하여 보면, 감 추출물(PS)과 발효 감 추출물(FPSK 및 FPSM) 모두 티로시나아제 활성에 대한 직접 억제 효과는 관찰되지 않았다. 이로써, 도 1에서 보여진 각 추출물의 탁월한 티로시나아제 활성 억제 효과는 직접적인 효소 활성 억제가 아닌 발현 억제임을 확인할 수 있었다. 발효 감 추출물의 티로시나아제 활성 억제능은 티로시나아제 본연에 대한 직접적인 억제 효과가 아닌, 자외선 등의 자극에 의해 과발현되는 티로시나아제 발현 억제 효과로서, 부작용이 거의 없는 안전한 미백 소재로서 그 이용가치가 매우 크다.
< 실시예 5> 발효 감 추출물( FPSM )의 분획물 제조
발효 감 추출 분획물 제조는 상기 실시예 1에서 제조된 동결 건조 시료를 이용하여 실시하였다. 동결건조 시료를 증류수에 녹이고 세파덱스(sepadex) LH20로 충진시킨 컬럼을 이용하여 분리하였다. 용출 용매로는 메탄올과 증류수 또는 메탄올과 아세톤(acetone)의 부피 비율을 달리한 용출 용매를 이용하여 용출한 후, 박막 크로마토그래피(thin layer chromatography, TLC)에 전개하여 각 분획물을 확인한 다음 감압·농축하여 Fr 1 내지 8을 얻었다. 발효 감 추출 분획물의 제조 과정은 도 3에 나타내었다.
각 분획물에 대한 메탄올과 증류수의 부피 비율은 다음과 같다: Fr. 1: 0:10, Fr. 2: 1.:9, Fr. 3: 2:8, Fr. 4: 3:7, Fr. 5: 5:5, Fr. 6: 7:3, Fr. 7: 10:0.
분획물에 대한 메탄올과 아세톤의 부피 비율은 다음과 같다: Fr. 8: 1:1.
< 실시예 6> 발효 감 추출 분획물(FPSM)의 세포 독성 확인
1. 시료 준비
발효 감 추출 분획물을 5 mg/mL 농도로 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO)에 녹인 후, 배양 배지를 이용하여 B16F10 세포에 농도 별로 희석하여 처리하였다.
2. 세포 독성 측정
B16F10 세포에 대한 발효 감 추출 분획물의 세포 독성을 측정하기 위해 MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] 분석을 수행하였다. MTT 분석은 살아있는 세포의 미토콘드리아 탈수소효소 작용에 의하여 노란색의 수용성 기질인 MTT를 보라색의 비수용성 포르마잔(formazan) 결정으로 환원시키는 미토콘드리아의 능력을 분광 광도법으로 측정하는 검사법이다.
96 웰 플레이트(96 well plate)에 B16F10 세포를 부착시키고, 발효 감 추출 분획물을 각각 농도 별로 처리한 다음 72시간 동안 배양하였다. 그 후, MTT 시약을 첨가하고 2시간 동안 반응시킨 후 배지를 모두 제거하고, 디메틸 설폭사이드 100 μL를 첨가하여 세포를 녹인 다음 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 4를 참조하여 보면, 발효 감 추출 분획물 중 Fr. 1 내지 7 분획물은 B16F10 세포에 독성을 나타내지 않은 반면, Fr. 8 분획물은 독성을 나타내는 것을 확인하였다. 따라서, 세포의 생존에 영향을 주지 않으면서 세포가 생성해 내는 티로시나아제(tyrsinase) 활성을 억제하는 농도를 선택하여 실험을 진행하였다.
< 실시예 7> 발효 감 추출 분획물(FPSM)의 총 폴레페놀 함량 확인
발효 감 추출 분획물(Fr. 1 내지 8) 중 수율이 좋으며, 효과가 있을 것으로 예상되는 Fr. 4 내지 8을 이용하여 분획물의 항산화능을 평가하였다. 총 폴리페놀 함량(total polyphenol contents)은 Folin-Denis 방법을 이용하여 측정하였다. 발효 감 추출 분획물(1 mg/mL) 0.2 mL에 1N Folin- Ciocalteu’s Regent(Sigma, USA) 1 mL를 넣은 후, 실온에서 3분 동안 반응시켰다. 반응액에 10% Na2CO3 0.8 mL을 넣고 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후, 765 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 폴리페놀의 함량은 갈산(gallic acid, Sigma, USA)를 이용한 표준곡선으로부터 산출하였다.
그 결과, 도 5를 참조하여 보면, Fr, 4 내지 8의 폴리페놀 함량이 모두 20 μg GAE/mL 이상이었으며, 각각 Fr. 5(113.75 μg GAE/mL) > Fr.6(68.98 μg GAE/mL) > Fr. 4(61.1 μg GAE/mL) > Fr. 8(48.61 μg GAE/mL) > Fr.7(20.45 μg GAE/mL) 순으로 폴리페놀을 함유하는 것을 확인하였다.
< 실시예 8> 발효 감 추출 분획물(FPSM)의 DPPH 라디칼 소거능 확인
DPPH 라디칼 소거능은 Blois 방법을 이용하여 측정하였다. 자유 라디칼(free radical)은 피부 노화의 원인이 되는 물질로 DPPH(1,1-dyphenyl-2-picrylhydrazyl) 라디칼 소거능(radical scavenging activity)은 항산화 활성을 측정하는 방법 중 하나로 매우 간단하면서도 널리 이용되는 방법이다. 안정한 라디칼인 DPPH 라디칼을 소거활성이 있는 항산화 물질을 통해 정량적으로 항산화능을 측정할 수 있으며, 자유 라디칼이 방향족 아민류 등에 의해 환원되어 색이 보라색에서 노란색으로 탈색되는 원리를 이용한다.
농도 별로 준비된 발효 감 추출 분획물 0.1 mL에 0.15 mM의 DPPH 용액 0.1 mL를 가하고 실온에서 30분간 반응시킨 후, 518 nm에서 흡광도를 측정하였다. 발효 감 추출 분획물의 DPPH 라디칼 소거능은 대조구와 비교하여 백분율로 나타내었다.
그 결과, 도 6을 참조하여 보면, Fr. 4는 94%(1mg/mL), 93.5%(0.5mg/mL), Fr. 5는 94.7%(1mg/mL), 88.2%(0.5m g/mL), Fr. 6은 92.5%(1mg/mL), 90.7%(0.5m g/mL), Fr. 7은 101.4%(1mg mL), 99.3%(0.5m g/mL), Fr. 8은 102.8%(1mg mL), 98.7%(0.5m g/mL)로 모두 우수한 DPPH 라디칼 소거능을 보이는 것을 확인하였다.
< 실시예 9> 발효 감 추출 분획물(FPSM)의 티로시나아제 활성 억제 확인
티로시나아제 활성은 도파(L-DOPA)와 티로시나아제 반응에 의해 생성되는 도파크롬(dopachrome)의 양을 비색 정량하여 시료에 따른 티로시나아제의 활성 변화를 측정하였다.
기존에 보고된 방법(Eur J Biochem. 1: 317-326(1991))을 참고하여, B16F10 세포를 96 웰 플레이트에 24시간 배양하여 부착시켰다. 세포에 각각의 발효 감 추출 분획물(Fr. 4 내지 8)을 농도 별로 처리하고 3시간 배양한 후, 멜라닌 생성 촉진물질인 멜라닌 세포 자극 호르몬(α-melanocyte-stimulating hormon, α-MSH)을 처리하고 72시간 동안 배양하였다. 그 후, 용해 버퍼(lysis buffer)를 첨가한 후, L-DOPA를 포함한 기질액(2% NN-디메틸포름아마이드(NN-dimethylformamide) in 100 mM 인산 나트륨(sodium phosphate, pH 7.1), 5 mM L-DOPA in 100 mM 인산 나트륨(pH 7.1), 20 mM MBTH in H2O)을 가하여 37℃에서 반응시킨 후, 505 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 7을 참조하여 보면, α-MSH에 의해 유도된 B16F10 세포의 티로시나아제 활성이 Fr. 4 및 Fr. 7에서 억제되는 것을 확인하였다. 따라서, Fr. 4 및 Fr. 7의 농도를 더욱 세분화하여 티로시나아제 활성을 분석한 결과, 도 8을 참조하여 보면, Fr. 4 및 Fr. 7은 농도 의존적으로 티로시나아제 활성을 현저하게 억제하는 것을 확인할 수 있었다. Fr. 8에서도 높은 티로시나아제 활성 억제 효과를 보였으나, 이는 세포 독성에 기인한 것으로 보여진다. Fr. 4 및 Fr. 7은 최대 농도 50 μg/mL에서 각각 170%, 102%의 억제 활성을 보였으며, 이는 일반적인 미백제로 알려진 L-아스코르브산(ascorbic acid)이 200%의 억제 활성을 보인 것에 비해 훨씬 낮은 수치이며, Fr. 7의 경우 2배 이상의 억제 활성을 보이는 것을 확인할 수 있었다. Fr.7은 티로시나아제 활성 억제능이 가장 뛰어났으며, α-MSH를 처리하지 않은 대조구와 거의 유사한 수준으로 티로시나아제 활성 억제 효과를 보였다.
< 실시예 10> 발효 감 추출 분획물(FPSM)의 멜라닌 생성 억제 확인
티로시나아제의 활성화는 결국 멜라닌 생성 증가로 이어진다. 따라서, 발효 감 추출 분획물의 미백효과를 확인하기 위해 세포 내 멜라닌 생성량을 측정하였다. 35 mm 디쉬(dish)에 B16F10 세포를 부착시킨 후, 발효 감 분획 추출물(Fr. 4 및 Fr. 7)을 농도 별로 처리하고 3시간 동안 배양하였다. 그 후, α-MSH 자극제를 처리하고 72시간 동안 배양하였다. 배양액을 제거하고 인산완충식염수(phosphated buffered saline, PBS)로 세척한 후, RIPA 버퍼를 150 μL씩 넣고 스크래핑(scrapping)하여 얼음 위에서 30분 동안 용해시켰다. 4℃, 14000 rpm에서 20분 동안 원심분리한 후, 상층액을 제거하고 펠렛(pellet)에 1N 수산화나트륨(NaOH) 용액 1 mL를 첨가하였다. 세포 내에 존재하는 멜라닌은 1N 수산화나트륨을 가해 녹여내어 수집하고, 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 9를 참조하여 보면, α-MSH에 의해 유도된 B16F10 세포의 멜라닌 함량은 Fr. 4 및 Fr. 7에 의해 농도 의존적으로 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 이는 발효 감 추출 분획물의 티로시나아제 생성 억제에 따른 티로시나아제 효소의 전체 활성이 줄어든 결과에 따른 것으로 사료된다.
< 실시예 11> HPLC를 이용한 발효 감 추출 분획물(FPSM)의 성분 분석
발효 감 추출 분획물 중 티로시나아제 활성 저해능과 멜라닌 생성 억제능이 가장 뛰어난 분획물(Fr. 4 및 Fr. 7)을 고성능 액체 크로마토그래피(high-performance liquid chromatography, HPLC, Waters 1525)를 이용하여 분석하였다. 표준물질(standard)로는 히페린(hyperin, Quercetin 3-D-galactoside, Sigma, USA) 탄닌(tannin, Sigma,USA), 카테킨(catechin, Sigma,USA)등을 이용하였다.
그 결과, 도 10을 참조하여 보면, Fr. 4 (2.74 분)의 경우 탄닌의 피크와 일부 일치하며, 히페린 또한 함유하고 있는 것을 확인하였다. Fr. 4와 Fr. 7의 탄닌과 일치하는 부분의 함유량을 피크의 면적 비로 확인한 결과, 각각 67239.94 mg/kg, 2612.8042 mg/kg인 것을 확인하였다. 이전 감 관련 연구에서는 히페린이 티로시나아제 활성 억제능이 높은 것으로 보고된 바 있다. 그러나, 본 발효 감 추출 분획물에서는 주요 피크가 탄닌과 일부 일치하지만 그보다 앞서 나타나는 것으로 보아 주요 물질이 발효에 의한 탄닌 유래 분해 산물들일 것으로 사료된다. 또한, Fr. 4 보다 Fr. 7의 미백효과가 더 뛰어난 것으로 보아, 발효 감 추출 분획물의 주요 미백 활성 물질은 탄닌 유래의 저분자 분자들(oligo tannin)일 것으로 사료된다.
< 실시예 12> 탄닌의 티로시나아제 활성 억제 및 세포 독성 확인
상기 가설을 증명하기 위하여 순수(pure) 탄닌에 의한 티로시나아제 활성 억제 및 세포 독성 실험을 수행하였다.
그 결과, 도 11을 참조하여 보면, 순수 탄닌 자체는 고농도에서 세포 독성을 나타내는 것을 확인하였고, 세포 독성을 보이지 않는 탄닌 농도에서 티로시나아제 활성 억제능이 거의 보이지 않는 것을 확인하였다. 이러한 결과로부터 분획물의 미백 효과는 탄닌에서 유래된 저분자 분해 산물들인 것으로 사료된다.
상기 결과들을 종합해 보면, 발효 전과 비교하여 볼 때, 발효 감 추출물은 티로시나아제 활성을 크게 억제하였으며, 발효 감 추출 분획물은 흑색종 세포에서 티로시나아제 활성 및 멜라닌 생성을 크게 억제하였다. 발효 감 추출 분획물의 미백 작용은 티로시나아제에 대한 직접적인 효소 활성 억제가 아닌, 자외선 등의 자극에 의해 과발현되는 티로시나아제의 발현 단계에 대한 억제 효과인 것으로 확인되었다. 우수한 효과를 보인 발효 감 분획 추출물을 용매를 달리하여 분획하고 각 분획물에 대해 미백 활성을 확인한 결과, FPSM의 Fr. 4 및 Fr. 7에서 티로시나아제 활성 및 멜라닌 생성이 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다. 분획물의 총 폴리페놀 함량은 FPSM의 Fr. 5가 가장 높았고 Fr. 7이 가장 낮은 함량을 보여, 미백 활성은 총 폴리페놀 함량과 큰 상관관계가 없는 것으로 보여진다. 고성능 액체 크로마토그래피를 이용하여 두 분획물의 성분을 분석 결과, 주요 활성 물질은 탄닌 유래의 저분자 분해 산물인 것으로 추측되나, 정확한 활성물질의 동정을 위해서는 추가적인 분석이 필요할 것으로 보여진다. 지금까지 감 탄닌 유래 저분자 물질의 미백효과에 대해서는 보고된 바가 없으므로, 상기 발명은 발효 감 추출 분획물의 미백 활성 규명에 대한 유용한 정보를 제공해 줄 것으로 사료된다. 지금까지의 미백 화장품 소재는 티로시나아제 직접 억제에 의한 효과로 백반증 등 그 부작용이 보고되어, 티로시나아제의 활성을 직접 억제하지 않으면서 그 생성을 억제할 수 있는 소재가 지속적으로 요구되어 왔다. 이러한 측면에서 본 발명에서 개발된 발효 감 추출 분획물은 티로시나아제 간접 억제 소재로 활용이 가능할 것이다.
하기에 본 발명에 따른 발효 감 추출 분획물을 포함하는 화장료 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
<처방예 1> 화장료 조성물의 처방예
1. 영양 로션의 제조
프로필렌글리콜 3.0 중량부, 카르복시폴리머 0.1 중량부, 방부제 미량과 잔량의 정제수를 혼합교반하면서 80 내지 85℃로 가열하여 제조부에 투입한 후 유화기를 작용시키고, 폴리솔베이트60 1.0 중량부, 솔비탄 세스퀴올레이트 0.5 중량부, 유동 파라핀 10.0 중량부, 솔비탄 스테아레이트 1.0 중량부, 친유형 모노스테아린산 글리세린 0.5 중량부, 스테아린산 1.5 중량부, 글리세릴스테아레이트/PEG-400 스테아레이트 1.0 중량부, 트리에탄올아민 0.2 중량부를 80 내지 85℃로 가열하여 투입한 뒤 유화하였다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 50℃까지 열 냉각한 뒤 향료 미량을 투입하고, 45℃까지 냉각한 뒤 색소 미량을 투입하고, 35℃에서 상기 실시예 1을 통해 제조된 발효 감 슬러지 추출 분획물을 투입하여 25℃까지 냉각한 뒤 숙성시켰다.
2. 영양 크림의 제조
카르복시폴리머 0.3 중량부, 부틸렌글리콜 5.0 중량부, 글리세린 3.0 중량부 및 잔량의 정제수를 혼합교반하면서 80 내지 85℃로 가열하여 제조부에 투입한 후 유화기를 작용시키고, 스테아린산 2.0 중량부, 세틸알콜 2.0 중량부, 글리세릴모노스테아레이트 2.0 중량부, 폴리옥시에틸렌솔비탄모노스테아레이트 0.5 중량부, 솔비탄세스퀴올레이트 0.5 중량부, 글리세릴모노스테아레이트/글리세릴스테아레이트/폴리옥시에틸렌스테아레이트 1.0 중량부, 왁스 1.0 중량부, 유동파라핀 4.0 중량부, 스쿠알란 4.0 중량부, 카프릴릭/카프릭트리글리세라이드 4.0 중량부를 80 내지 85℃로 가열하여 투입한 뒤 트리에탄올아민 0.5 중량부를 투입하여 유화하였다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 35℃까지 냉각한 뒤 상기 실시예 1을 통해 제조된 발효 감 슬러지 추출 분획물을 투입하여 25℃까지 냉각한 뒤 숙성시켰다.
3. 워시폼의 제조
TEA-코코일 글루타메이트 30.0 중량부, 디소듐 라우레스 설포숙시네이트글리세린 10.0 중량부, 글리세린 10.0 중량부, 코카마이드 DEA 2.0 중량부, PEG-120 메칠글루코오스 디올리에이트 1.0 중량부, 메칠글루세스-20 0.5 중량부, PEG-150 펜타에리트리틸 테트라 스테아레이트 0.5 중량부, 테트라소듐 EDTA 0.05 중량부 및 방부제 미량을 순차적으로 제조부에 투입하고 60 내지 65℃로 가열한 후 15분 동안 교반하였다. 교반이 끝나면 정제수의 일부를 투입하여 30분 동안 교분한 후, 다시 정제수의 일부를 천천히 투입하고 30분 동안 교반한 후 35℃까지 냉각하고, 실시예 1을 통해 제조된 발효 감 슬러지 추출 분획물과 향료를 투입하여 25℃까지 냉각한 뒤 숙성시켰다.
이상과 같이, 본 발명은 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 본 발명은 이것에 의해 한정되지 않으며 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 본 발명의 기술 사상과 아래에 기재될 청구범위의 균등 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능함은 물론이다.

Claims (6)

  1. 미생물로 발효시킨 감 슬러지 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하는 미백용 화장료 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 감 슬러지 추출물의 분획물은 감 슬러지를 미생물로 발효시킨 후 이를 에탄올로 추출하고 C1 내지 C4 알코올, 물, 아세톤 또는 이의 혼합 용매로 이루어진 군에서 선택된 하나의 용출 용매로 분획하여 수득한 것을 특징으로 하는 미백용 화장료 조성물.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 감 슬러지 추출물의 분획물은 건조한 감 슬러지를 분쇄하는 제 1단계;
    상기 분쇄된 감 슬러지에 증류수를 가하고, 미생물을 2 내지 5 부피%로 접종하여 발효시키는 제 2단계;
    상기 발효시킨 발효물에 에탄올을 가하여 추출하는 제 3단계;
    상기 추출한 발효물을 C1 내지 C4 알코올, 물, 아세톤 또는 이의 혼합 용매로 이루어진 군에서 선택된 하나의 용출 용매와 컬럼으로 분리하여 분획물을 수득하는 제 4단계; 및
    상기 수득한 분획물을 감압 농축하는 제 5단계;를 포함하여 수득되는 것을 특징으로 하는 미백용 화장료 조성물.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 미생물은 웨이셀라 키바리아 MFST(Weissella cibaria MFST, FPSK) 및 이사첸키아 오리엔탈리스 MFST(Issatchenkia orientalis MFST, FPSM)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 미백용 화장료 조성물.
  5. 제 3항에 있어서,
    상기 제 2단계의 발효는 30℃ 내지 40℃에서 50 내지 80시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 미백용 화장료 조성물.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 감 슬러지 추출물의 분획물은 감 슬러지를 분쇄하는 제 1단계;
    상기 분쇄된 감 슬러지에 증류수를 가하고, 총 100 부피부에 대하여 웨이셀라 키바리아 MFST(Weissella cibaria MFST, FPSK) 및 이사첸키아 오리엔탈리스 MFST(Issatchenkia orientalis MFST, FPSM)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 미생물을 2 내지 5 부피부로 접종하여 30℃ 내지 40℃에서 50 내지 80시간 동안 발효시키는 제 2단계;
    상기 발효시킨 발효물 총 100 중량부에 대하여 에탄올 2 내지 8 중량배를 가하여 추출하는 제 3단계; 및
    상기 추출한 발효물을 C1 내지 C4 알코올, 물, 아세톤 또는 이의 혼합 용매로 이루어진 군에서 선택된 하나의 용출 용매와 컬럼으로 분리하여 분획물을 수득하는 제 4단계;를 포함하여 수득되는 것을 특징으로 하는 미백용 화장료 조성물.
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