KR101865207B1

KR101865207B1 - 녹차 종자 유래의 ２１-ｏ-안젤로일데아사포젠올 ｅ３ 성분을 함유하는 항노화용 피부 외용제 조성물

Info

Publication number: KR101865207B1
Application number: KR1020120041429A
Authority: KR
Inventors: 박준성; 심진섭; 황경환; 강영규; 박준호; 염명훈; 조준철
Original assignee: (주)아모레퍼시픽
Priority date: 2012-04-20
Filing date: 2012-04-20
Publication date: 2018-06-08
Also published as: KR20130118507A

Abstract

본 발명은 녹차 종자 유래의 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3 성분을 유효성분으로 함유하는 항노화용 피부 외용제 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 산, 염기, 효소, 또는 상기 효소를 생산하는 미생물을 이용한 분해 반응을 통해 종차 종자 추출물로부터 얻어진 녹차 종자 유래의 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3 성분을 유효성분으로 함유함으로써 주름 개선 및 피부 탄력 향상 효과가 우수한 항노화용 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.

Description

녹차 종자 유래의 ２１-Ｏ-안젤로일데아사포젠올 Ｅ３ 성분을 함유하는 항노화용 피부 외용제 조성물{Skin external composition for anti-aging comprising 21-O-angeloyltheasapogenol E3 from green tea seed}

피부의 노화는 그 요인에 따라 크게 두 가지로 구분할 수 있다. 그 중 하나인 자연적인 노화(Intrinsic aging)는 피부의 구조와 생리적인 기능이 나이를 먹으면서 계속적인 감퇴를 일으키는 것이고, 다른 하나인 외적 노화(Extrinsic aging)는 태양광선 등 누적된 외부 스트레스로 인해 발생하는 것이다. 특히 태양광의 자외선(ultraviolet rays; UV)은 잘 알려진 노화 원인의 하나로 장시간 자외선에 노출된 피부는 각질층이 두꺼워지고 피부의 주요 구성요소인 콜라겐과 엘라스틴이 변성되어 피부의 탄력성을 잃어가게 된다.

한편, 피부의 탄력은 진피 조직의 세포외 기질(ECM; extracelluar matrix) 성분이 담당하게 되는데, ECM은 크게 두 가지 성분으로 구성되어 있다. 하나는 ECM 전체의 약 2～4%를 차지하는 탄력섬유(elastic fiber)이며, 또 다른 하나는 ECM 전체의 약 70～80%를 차지하고 있는 콜라겐이다. 탄력섬유는 엘라스틴(elastin)이라는 무정형의 기질에 미원섬유(microfibrils)들이 박혀 있는 형태를 띠고 있으며, 엘라스틴은 라이신에서 유래한 데스모신(desmosine)과 아이소데스모신(isodesmosine)이라는 탄력섬유에서만 발견되는 아주 톡특한 아미노산으로 구성된 단백질이다. 이러한 데스모신과 아이소데스모신 등은 긴 펩타이드 사슬 안에서 가교(cross-links)를 형성하고 있는데, 이러한 구조가 엘라스틴으로 하여금 고무와 같은 성질을 갖게 한다.

또한, 엘라스틴으로 구성된 탄력섬유는 콜라겐(collagen)이라고 하는 교원섬유와 함께 존재하는데, 엘라스틴과 콜라겐이 충분히 존재하는 상태에서 피부 탄력유지가 가능하다.

피부 탄력의 저하는 노화나 자외선 등에 의해 유발되는 콜라겐과 엘라스틴의 생성 저하 또는 파괴에 기인한다. 특히, 콜라게나아제(collagenase)와 엘라스타아제(elastase)와 같은 매트릭스 메탈로 프로테아제(matrix metallo protease)의 발현으로 인하여 피부 내에서 정상적으로 생성된 콜라겐과 엘라스틴이 분해되어 피부 탄력이 저하된다.

이러한 탄력감소의 원인이 되는 콜라겐 및 엘라스틴의 감소를 억제하려는 목적으로 여러 가지 물질들이 개발되어 사용되고 있는데, 그 중 레티놀과 레티노익산 등의 레티노이드 등이 탄력개선 효과를 나타내고(Dermatology therapy, 1998, 16, 357～364), 레구미노사 종자(Leguminosae Seeds)에서 얻어진 단백질분획도 탄력증대 효과를 나타내며(미국특허 제5,322,839호), 맥아추출물(malt extract) 등을 포함하는 조성물은 콜라게나제(collagenase)를 억제하는데 응용되고 있다(일본특제 제5,105,693호).

그러나, 이들 레티노이드들은 소량만을 피부에 적용하여도 자극이 나타난다는 단점을 가지며 대부분의 천연물 유래의 원료들은 단순추출물의 형태로 사용되어 왔고, 그 추출물들이 보이는 효능이 정확하게 어떤 물질에 의한 것인지 밝혀지지 않아 그 추출물의 활성을 지속적으로 유지, 제어하기가 어려운 것이 현실이다.

이에, 본 발명자들은 항노화 효과를 나타내며 우수한 피부 탄력 향상 효과도 나타내는 물질을 찾고자 연구한 결과, 녹차 종자 추출물로부터 산, 염기, 효소 또는 상기 효소를 생성하는 미생물을 이용한 분해반응을 통해 얻어진 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3 성분이 우수한 피부 주름 개선 및 피부 탄력 향상 효과가 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 녹차 종자 추출물로 얻은 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3 성분을 함유하는 항노화용 피부 외용제 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기한 목적을 해결하기 위하여, 본 발명은 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3을 유효성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용된 녹차 종자 유래의 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3은 콜라겐 생합성은 촉진시키면, 엘라스타아제 및 콜라게나아제의 발현은 억제함으로써, 효과적으로 피부 주름은 개선시키고 피부 탄력은 향상시켜 우수한 항노화 효과를 제공할 수 있다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표현되는 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3(21-O-angeloyltheasaponenol E3)을 유효 성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물을 제공한다.

상기 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3은 바람직하게는 녹차 종자로부터 유래한 것이다.

본 발명에서 사용하는 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3은 식물로부터 물 또는 유기용매를 이용하여 사포닌 조 추출물을 수득하는 제1 단계; 및 상기 추출물을 산, 염기, 효소 또는 상기 효소를 생산하는 미생물을 이용하여 가수분해하여 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3을 분리하는 제2 단계;를 포함하는 방법으로 제조할 수 있다.

제1 단계: 사포닌 조 추출물의 수득

식물, 특히 녹차 종자로부터 사포닌 조 추출물을 얻는다. 이 때, 추출용매로서는 물 또는 유기용매를 사용할 수 있으며, 유기용매로서는 에탄올, 메탄올, 부탄올, 에테르, 에틸아세테이트 및 클로로포름을 포함하는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유기용매 또는 이들과 물의 혼합물, 바람직하게는 50% 에탄올을 사용할 수 있다.

식물로부터 물 또는 유기용매를 이용하여 사포닌 조 추출물을 수득하기 위하여, 식물에 약 1 내지 6 배, 바람직하게는 약 3 배의 물 또는 유기용매를 넣고, 상온에서 1 내지 5회 교반하면서 추출하여 탈지시킨다. 탈지된 식물에 약 1 내지 8배, 바람직하게는 약 4배의 물 또는 유기용매를 넣고, 1 내지 5회 환류 추출한 후, 10 내지 20℃에서 1 내지 3일간 침적시킨다. 그 다음, 여과와 원심분리를 통하여 잔사와 여액을 분리하고, 분리된 여액을 감압농축하여 얻은 엑기스를 물에 현탁한 후, 에테르 등을 이용하여 색소를 제거한다. 수층을 유기용매를 사용하여 1 내지 5회 추출한 후, 수득한 유기용매층을 감압농축하여 유기용매 엑기스를 얻은 다음, 이를 소량의 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등에 녹인다. 그 다음, 대량의 에틸아세테이트, 아세토니트릴(acetonitrile) 등을 추가하여 생성된 침전물을 건조시켜, 본 발명의 사포닌 조 추출물을 수득할 수 있다.

제2 단계: 21-O- 안젤로일데아사포젠올 E3 의 분리

상기 제1 단계에서 수득한 사포닌 조 추출물을 가수분해하여 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3을 분리할 수 있으며, 가수분해는 산, 염기, 효소 또는 상기 효소를 생산하는 미생물을 이용하여 행할 수 있다.

상기 산으로는 염산, 황산 및 질산으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 산, 또는 이들 산과 에탄올, 메탄올 및 부탄올로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 알코올과의 혼합용매, 바람직하게는 50% 에탄올과의 혼합용매를 사용할 수 있다.

산을 이용하여 가수분해를 행할 경우, 사포닌 조 추출물에 0.1~2N, 바람직하게는 1N 농도의 산, 또는 산과 알코올의 혼합용매를 1~10%의 양으로 가한 후, 50~100℃, 바람직하게는 80℃ 수욕조에서 0.5~8시간, 바람직하게는 1시간 동안 가열 환류시킨다.

상기 염기는 수산화나트륨 및 수산화칼륨으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 염기, 또는 이들 염기와 에탄올, 메탄올 및 부탄올로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 알코올과의 혼합용매, 바람직하게는 50% 부탄올과의 혼합용매를 사용할 수 있다.

염기를 이용하여 가수분해를 행할 경우, 사포닌 조 추출물을 물 또는 물과 에탄올 혼합용매에 녹인 후, 0.1~2N, 바람직하게는 1N 농도의 염기, 또는 염기와 알코올의 혼합용매를 1~10%의 양으로 가한 후, 50~100℃, 바람직하게는 100℃ 수욕조에서 0.5~24시간, 바람직하게는 12시간 동안 가열 환류시킨다.

상기 효소는 당 결합을 분해하는 효소로서 녹차 사포닌의 당부분을 제거하여 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3을 생성하는 것을 특징으로 한다. 이 효소는 상업적으로 시판되는 것을 사용하거나 필요에 따라 제조하여 사용할 수 있으며, 특히 상기 효소를 생산하는 미생물로부터 얻을 수 있다.

또한, 상기 효소로는 더욱 바람직하게는 글루코시다제(glucosidase), 아라비노시다제(arabinosidase), 람노시다제(rhamnosidase), 자일로시다제(xylosidase), 셀룰라제(cellulase), 헤스페리디나제(hesperidinase), 나린지나제(naringinase), 글루쿠로니다아제(glucuronidase), 펙티나제(pectinase), 갈락토시다제(galactosidase) 및 아밀로글루코시다제(amyloglucosidase)로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상을 사용할 수 있다.

또한, 상기 효소를 생산하는 미생물로는 아스퍼질러스(aspergillus)속, 바실러스(bacillus)속, 페니실리움(penicillium)속, 리조푸스(rhizopus)속, 리조무코르(rhizomucor)속, 탈라로마이세스(talaromyces)속, 비피도박테리움(bifidobacterium)속, 모르티에렐라(mortierella)속, 크립토코커스(cryptococcus)속 및 마이크로박테리움(microbacterium)속으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상을 사용할 수 있다.

효소를 이용하여 가수분해를 행할 경우, 사포닌 조 추출물을 5 내지 20배, 바람직하게는 약 10배의 산성완충용액에 용해시킨 다음, 효소를 0.001~10%의 양으로 첨가한다. 이를 약 25~37℃ 수욕상에서 약 40 내지 55시간, 바람직하게는 약 48시간 동안 교반하면서, 박층크로마토그래피로 기질의 소거율을 확인하여 기질이 완전히 소실되면 열수(80~100℃) 중에서 5 내지 15분 동안 가열하여 반응을 종료시킨다.

미생물을 이용하여 가수분해를 행할 경우, 사포닌 조 추출물을 5 내지 10배, 바람직하게는 약 10배의 이온수에 용해시킨 다음, 121℃에서 30분간 멸균하여 30℃로 냉각한다. 그 다음, 미리 배양된 미생물을 액체량 대비 5~10중량%로 접종하고, 20~30℃에서 2 내지 5일, 바람직하게는 5일 동안 배양 시킨 후, 박층크로마토그래피로 기질의 소거율을 확인하여 기질이 완전히 소실되면 배양액을 5,000~10,000rpm 으로 원심분리하여 회수한 침전물을 증류수로 3회 세척 후 원심분리하여 침전물을 얻는다.

상기와 같이 산, 염기, 효소, 또는 상기 효소를 생산하는 미생물을 이용하여 가수분해 한 후, 반응액을 감압농축하여 용매를 제거하고, 잔사에 알코올을 가하여 1~5회 교반시킨다. 그 다음, 침전된 염들을 여과를 통하여 제거하고, 여과된 여액을 감압농축하여 조 생성물을 수득하며, 수득된 조 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름:메탄올=8:1~4:1)로 분리하여 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3을 수득할 수 있다.

본 발명의 조성물은 상기와 같은 방법으로 제조할 수 있는 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3을 조성물 총 중량에 대하여 0.000001~5중량%의 양으로 함유한다. 함량이 0.000001중량% 미만이면 상기 성분에 의한 주름 개선 및 피부 탄력 효과를 얻을 수 없고, 함량이 5중량%를 초과하더라도 함량 증가에 비해 효과의 증가가 크지 않다.

본 발명의 조성물은 항노화용 조성물로서 사용될 수 있으며, 콜라겐 생합성은 촉진시키고 엘라스타아제 및 콜라게나아제의 발현은 억제하며, 이 두 가지 활성의 복합 상승 작용으로 보다 우수한 피부 탄력 향상 효과 및 피부 주름을 개선 효과를 제공할 수 있다.

본 발명의 조성물은 화장품학 또는 피부과학적으로 허용 가능한 매질 또는 기제를 함유하여 제형화 될 수 있다. 이는 국소적용에 적합한 모든 제형으로서, 예를 들면, 용액, 겔, 고체, 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀) 및 비이온형의 소낭 분산제의 형태로, 또는 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 또한 포말(foam)의 형태로 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 사용될 수 있다. 이들 조성물은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다.

또한 본 발명의 조성물은 지방 물질, 유기용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 상기 보조제는 화장품학 또는 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입된다.

또한, 본 발명의 조성물은 피부 노화 개선 효과를 증가시키기 위하여 피부 흡수 촉진 물질을 함유할 수 있다.

이하, 실시예 및 시험예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명이 이들 예로만 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] 녹차 종자 추출물의 제조

녹차 종자 2㎏에 헥산 6ℓ를 넣고, 상온에서 3회 교반 추출하여 탈지시킨 다음, 탈지된 녹차 종자 1kg에 50% 에탄올 4ℓ를 넣고, 3회 환류 추출한 후, 15℃에서 1일간 침적시켰다. 그 후, 여과포 여과와 원심분리를 통해 잔사와 여액을 분리하고, 분리된 여액을 감압농축하여 얻은 엑기스를 물에 현탁한 후, 에테르 1ℓ로 5회 추출하여 색소를 제거하고, 수층을 1-부탄올 500㎖로 3회 추출하였다. 이로부터 얻은 전체 1-부탄올층을 감압농축하여 1-부탄올 엑기스를 얻고, 이를 소량의 메탄올에 녹인 다음, 대량의 에틸아세테이트에 추가하여, 생성된 침전물을 건조함으로써, 녹차 종자 추출물(사포닌 조 추출물) 300g을 수득하였다.

[실시예 2] 산 가수분해 방법에 의한 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3 의 제조

상기 실시예 1에서 수득한 녹차 종자 추출물 10g에 20배(v/w)의 1N HCl-50% 메탄올 용액(v/v)을 가하여, 80℃ 수욕조에서 8시간 동안 가열 환류시켜, 녹차 종자 조 사포닌에 결합된 당들을 가수분해시켰다. 반응액을 감압농축하여 용매를 제거하고, 잔사에 에탄올(200㎖)을 가해 3회 교반시킨 후, 침전된 염들을 여과를 통해 제거하였다. 여과된 여액을 감압농축하여 조 생성물을 수득한 후, 수득한 조 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름:메탄올=7:1~3:1)로 분리하여 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3 0.55g을 수득하였다.

[실시예 3] 염기 가수분해 방법에 의한 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3 제조

상기 실시예 1에서 수득한 녹차 종자 추출물 10g을 건조피리딘(500㎖)에 녹이고, 여기에 소디움 메톡사이드(sodium methoxide)(powder, 10g)를 가해 유욕상에서 8시간 동안 환류 반응시켜, 녹차 종자 사포닌에 결합된 당들을 가수분해시켰다. 반응액을 감압농축하여 용매를 제거하고, 잔사에 에탄올(200㎖)을 가해 3회 교반시킨 후, 침전된 염들을 여과를 통해 제거하였다. 여과된 여액을 감압농축하여 조 생성물을 수득한 후, 수득한 조 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름:메탄올=8:1~4:1)로 분리하여 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3 0.35g을 수득하였다.

[실시예 4] 효소분해 방법에 의한 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3 제조

상기 실시예 1에서 수득한 녹차 씨 추출물 10g을 100㎖의 0.1M 초산완충용액(pH 4.5)에 용해시키고, 여기에 효소 2.5g(헤스페리디나제 0.5g, 나린지나제 0.5g, 셀룰라제 0.5g, β-글루쿠로니다제 0.2g, β-갈락토시다제 0.5g, 아밀로글루코시다제 0.3g; Sigma사 제조)을 첨가하여 37℃ 수욕상에서 48시간 동안 교반시키면서, 박층크로마토그래피에 의해 주기적으로 확인하여, 녹차 사포닌이 소실되면 열수(80~100℃) 중에서 10분간 가열하여 반응을 종료시켰다. 반응액을 감압농축하여 용매를 제거하고, 잔사에 에탄올(200㎖)을 가해 3회 교반시킨 후, 침전물을 여과를 통해 제거하였다. 여과된 여액을 감압농축하여 조 생성물을 수득한 후, 수득한 조 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름:메탄올= 8:1~4:1)로 분리하여 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3 1.02g을 얻었다.

[실시예 5] 미생물을 활용한 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3 제조

상기 실시예 1에서 수득한 녹차 종자 추출물 10g을 100㎖의 이온수에 용해 시키고, 121℃에서 30분간 멸균하여 30℃로 냉각한 후 미리 배양된 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger) KCCM 11885를 액체량 대비 5~10%로 접종하여 30℃에서 5일 동안 배양 시킨 후 박층 크로마토그래피로 기질의 소거율을 확인하여 기질이 완전히 소실된 것을 확인하고 배양액을 5,000 내지 10,000rpm으로 원심분리하여 회수한 침전물을 증류수로 3회 세척 후 원심분리하여 침전물을 얻었다. 이 침전물에 에탄올(200㎖)을 가해 3회 교반시킨 후, 침전물을 여과를 통해 제거하였다. 여과된 여액을 감압농축하여 조 생성물을 수득한 후, 수득한 조 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름:메탄올=8:1~4:1)로 분리하여 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3 0.72g을 얻었다.

[시험예 1] 콜라겐 생합성 촉진 효과의 측정

상기 실시예 2 내지 5로부터 얻은 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3의 콜라겐 생합성 촉진 효과를 토코페롤 및 EGCG와 비교하여 측정하였다.

먼저, 인간섬유아세포(fibroblast)(PromoCell, Germany)를 24공(well)에 1 공 당 10⁵개씩 파종(seeding)하여 90% 정도 자랄 때까지 배양하였다. 이를 24시간 동안 무혈청 DMEM 배지로 배양한 후 무혈청 배지에 녹여진 실시예 2내지 5의 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3, 토코페롤 및 EGCG를 각각 10^-4 몰농도로 처리하고 24시간 동안 CO² 배양기에서 배양하였다. 이들의 상층액을 떠내어 프로콜라겐 형(I) 엘라이자(ELISA) 키트(procollagen type(I))를 이용하여 프로콜라겐(procollagen)의 증감여부를 보았다. 그 결과는 하기 표 1에 나타내었으며, 여기서 합성능은 비처리군을 100으로 하여 대비한 것이다.

시험물질	합성능(%)
실시예 2	121
실시예 3	120
실시예 4	121
실시예 5	121
비처리군	100
토코페롤	113
EGCG	120

상기 표 1에서 보여지는 것처럼, 상기 실시예 2 내지 5에서 얻어진 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3이 콜라겐 생합성을 효과적으로 증가시키는 것을 확인할 수 있다.

[시험예 2] 콜라게나아제 발현 억제 효능 측정

상기 실시예 2 내지 5로부터 얻은 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3의 콜라게나아제 발현 억제 효능(생성 저해능)을 토코페롤 및 EGCG와 비교하여 하기와 같이 콜라게나아제 발현 정도로 측정하였다.

먼저, 2.5%의 우태아 혈청이 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Media) 배지가 들어있는 96공 평판배양기(96-well microtiter plate)에 인간의 섬유아세포를 5,000 세포/공(well)이 되도록 넣고, 90% 정도 자랄 때까지 배양하였다. 그 후 무혈청 DMEM 배지에서 24시간 배양한 다음, 시험물질로 무혈청 DMEM 배지에 녹여진 상기 실시예 2 내지 5의 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3, 토코페롤 및 EGCG(양성대조군)를 10^-4 몰농도로 24시간 동안 처리한 후, 세포배양액을 채취하였다.

이 후, 채취한 세포배양액을 상업적으로 이용 가능한 콜라게나아제 측정기구(미국 아머샴파마샤 사)를 이용하여 콜라게나아제 생성 정도를 측정하였다.

먼저 1차 콜라게나아제 항체가 균일하게 도포된 96-공 평판(96-well plate)에 채취한 세포 배양액을 넣고 3시간 동안 항원-항체 반응을 항온조에서 실시하였다. 3시간 후 발색단이 결합된 2차 콜라겐 항체를 96-공 평판(96-well plate)에 넣고 다시 15분간 반응시켰다. 15분 후 발색유발물질을 넣어 실온에서 15분간 발색을 유발시키고, 다시 1M 황산을 넣어 반응(발색)을 중지시키면 반응액의 색깔은 노란색을 띄며 반응 진행의 정도에 따라 노란색의 정도가 다르게 나타났다.

노란색을 띠는 96-공 평판(96-well plate)의 흡광도를 흡광계를 이용하여 405nm에서 측정하였고, 하기 수학식 1에 의해 콜라게나아제의 발현 정도를 계산하였다. 이때 상기 시험물질을 처리하지 않은 군의 채취한 세포배양액의 반응 흡광도를 대조군의 흡광도로 하였다. 콜라게나아제 발현 정도는 하기 표 2에 나타내었으며, 이는 비처리군의 콜라게나아제 발현 정도를 100으로 하여 대비한 것이다.

A: 상기 시험물질 처리 세포군의 흡광도

B: 대조군의 흡광도

시험물질	콜라게나아제 발현 정도(%)
비처리군	100
토코페롤(양성대조군)	75
EGCG(양성대조군)	60
실시예 2	59
실시예 3	59
실시예 4	60
실시예 5	60

상기 표 2에 보여지는 것처럼, 상기 실시예 2 내지 5에서 얻어진 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3을 처리한 경우 콜라게나아제 발현 정도가 콜라게나아제 발현을 억제한다고 알려진 토코페롤이나 EGCG보다도 낮게 나왔으며, 이로부터 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3은 콜라게나아제 발현을 효과적으로 억제함을 알 수 있다.

[시험예 3] 엘라스타아제 발현 억제 효능 측정

상기 실시예 2 내지 5로부터 얻은 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3의 엘라스타아제 발현 억제 효능(생성 저해능)을 토코페롤 및 EGCG와 비교하여 하기와 같이 엘라스트아제 발현 정도로 측정하였다.

먼저, 시험은 2.5%의 우태아 혈청이 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Media) 배지가 들어있는 96공 평판배양기(96-well microtiter plate)에 인간의 섬유아세포를 5,000 세포/공(well)이 되도록 넣고, 90% 정도 자랄 때까지 배양하였다. 그 후 무혈청 배지로 24시간 배양하고, 시험물질로 무혈청 배지에 녹여진 상기 실시예 2 내지 5의 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3, 토코페롤 및 EGCG(양성 대조군)를 10^-4 몰농도로 24시간 동안 처리한 후, 세포배양액을 채취하였다.

이 후, 채취한 세포배양액을 상업적으로 이용 가능한 엘라스타아제 측정기구(미국 아머샴파마샤 사)를 이용하여 엘라스타아제 생성 정도를 측정하였다.

먼저 1차 엘라스타아제 항체가 균일하게 도포된 96-공 평판(96-well plate)에 채취한 세포 배양액을 넣고 3시간 동안 항원-항체 반응을 항온조에서 실시하였다. 3시간 후 발색단이 결합된 2차 엘라스틴 항체를 96-공 평판(96-well plate)에 넣고 다시 15분간 반응시켰다. 15분 후 발색유발물질을 넣어 실온에서 15분간 발색을 유발시키고, 다시 1M 황산을 넣어 반응(발색)을 중지시키면 반응액의 색깔은 노란색을 띄며 반응 진행의 정도에 따라 노란색의 정도가 다르게 나타났다.

노란색을 띠는 96-공 평판(96-well plate)의 흡광도를 흡광계를 이용하여 405nm에서 측정하고, 하기 수학식 2에 의해 엘라스타아제의 발현 정도를 계산하였다. 이때 상기 시험물질을 처리하지 않은 군의 채취한 세포배양액의 반응 흡광도를 대조군의 흡광도로 하였다. 엘라스타아제 발현 정도는 하기 표 3에 나타내었으며, 이는 비처리군의 엘라스타아제 발현 정도를 100으로 하여 대비한 것이다.

A: 상기 시험물질 처리 세포군의 흡광도

B: 대조군의 흡광도

물질	엘라스테아제 발현 정도(%)
비처리군	100
토코페롤(양성 대조군)	88
EGCG(양성 대조군)	68
실시예 2	64
실시예 3	64
실시예 4	65
실시예 5	64

상기 표 3에 보여지는 것처럼, 상기 실시예 2 내지 5에서 얻어진 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3을 처리한 경우 엘라스타아제 발현 정도가 엘라스타아제 발현을 억제한다고 알려진 토코페롤이나 EGCG보다도 낮게 나왔으며, 이로부터 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3은 엘라스타아제 발현을 효과적으로 억제함을 알 수 있다.

[시험예 4] 피부 탄력 향상 효능 확인

상기 실시예 2 내지 5에서 얻은 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3의 피부 탄력 향상 효능 확인을 위하여 하기 표 4의 성분 및 함량으로 화장료 조성물로서 제형예 1 및 비교예 1의 화장수를 제조하였다.

성 분	함량
성 분	제형예 1	비교예 1
세테아릴글루코사이드	1.5	1.5
세틸옥타노에이트	3.0	3.0
메칠파라벤	0.15	0.15
에칠렌디아민테트라초산디나트륨	0.02	0.02
실시예 4의 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3	10	-
정제수	To 100	To 100

상기 제형예 1 및 비교예 1에서 제조된 화장수에 대하여 피부 탄력 향상 효과를 비교하기 위하여, 30~40대 여성 20명을 대상으로 하여 피부 탄력 향상 정도를 측정하였다. 실험 방법은 다음과 같다.

먼저, 각 군에 제형예 1 및 비교예 1에서 제조된 화장수를 주고 매일 1회 12주간 눈가에 일정량을 도포하게 하였다. 이때, 피검자의 눈가의 왼쪽에는 상기 제형예 1의 화장수를, 오른쪽에는 비교예 1의 화장수를 도포하게 하였다. 상기 화장수의 도포를 시작 하긴 전 및 도포 후 12주 뒤 피부탄력을 측정할 수 있는 큐토미터(cutometer; SEM474, Courage+Khazaka electronic GmbH. Germany)를 이용하여 각 군의 피부 탄력을 측정하고 그 평균을 구하였다. 그 실험 결과는 표 5에 나타내었다.

구 분	피부탄력향상도(%)
비교예 1	13
제형예 1	45

상기 표 5에서 보여진 바와 같이, 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3을 포함하는 제형예 1의 화장료 조성물의 피부 탄력 향상도가 비교예 1에 비해 3배 이상 높은 것으로 확인되었다. 따라서, 본 발명의 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3을 포함하는 화장료 조성물은 피부 탄력 향상에 매우 효과적임을 확인할 수 있다.

Claims

하기 화학식 1로 표현되는 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물.
[화학식 1]
제1항에 있어서, 상기 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3은 조성물 총 중량에 대하여 0.000001~5중량%의 양으로 함유되는 피부 주름 개선용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3은 녹차 종자 유래의 것인 피부 주름 개선용 화장료 조성물.
제3항에 있어서, 상기 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3은 녹차 종자 추출물을 산, 염기, 효소, 또는 상기 효소를 생산하는 미생물을 이용하여 분해시켜 얻어진 것인 피부 주름 개선용 화장료 조성물.
제4항에 있어서, 상기 산은 염산, 황산 및 질산으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 산, 또는 이들 산과 에탄올, 메탄올 및 부탄올로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 알코올과의 혼합용매인 피부 주름 개선용 화장료 조성물.
제4항에 있어서, 상기 염기는 수산화나트륨 및 수산화칼륨으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 염기, 또는 이들 염기와 에탄올, 메탄올 및 부탄올로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 알코올과의 혼합용매인 피부 주름 개선용 화장료 조성물.
제4항에 있어서, 상기 효소는 글루코시다제(glucosidase), 아라비노시다제(arabinosidase), 람노시다제(rhamnosidase), 자일로시다제(xylosidase), 셀룰라제(cellulase), 헤스페리디나제(hesperidinase), 나린지나제(naringinase), 글루쿠로니다아제(glucuronidase), 펙티나제(pectinase), 갈락토시다제(galactosidase) 및 아밀로글루코시다제(amyloglucosidase)로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상인 피부 주름 개선용 화장료 조성물.
제4항에 있어서, 상기 미생물은 아스퍼질러스(Aspergillus)속, 바실러스(Bacillus)속, 페니실리움(Penicillium)속, 리조푸스(Rhizopus)속, 리조무코르(Rhizomucor)속, 탈라로마이세스(Talaromyces)속, 비피도박테리움(Bifidobacterium)속, 모르티에렐라(Mortierella)속, 크립토코커스(Cryptococcus)속 및 마이크로박테리움(Microbacterium)속으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상인 피부 주름 개선용 화장료 조성물.
하기 화학식 1로 표현되는 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3을 유효성분으로 함유하는 피부 탄력 향상용 화장료 조성물.
[화학식 1]
제9항에 있어서, 상기 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3은 조성물 총 중량에 대하여 0.000001~5중량%의 양으로 함유되는 피부 탄력 향상용 화장료 조성물.
제9항에 있어서, 상기 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3은 녹차 종자 유래의 것인 피부 탄력 향상용 화장료 조성물.
제11항에 있어서, 상기 21-O-안젤로일데아사포젠올 E3은 녹차 종자 추출물을 산, 염기, 효소, 또는 상기 효소를 생산하는 미생물을 이용하여 분해시켜 얻어진 것인 피부 탄력 향상용 화장료 조성물.
제12항에 있어서, 상기 산은 염산, 황산 및 질산으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 산, 또는 이들 산과 에탄올, 메탄올 및 부탄올로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 알코올과의 혼합용매인 피부 탄력 향상용 화장료 조성물.
제12항에 있어서, 상기 염기는 수산화나트륨 및 수산화칼륨으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 염기, 또는 이들 염기와 에탄올, 메탄올 및 부탄올로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 알코올과의 혼합용매인 피부 탄력 향상용 화장료 조성물.
제12항에 있어서, 상기 효소는 글루코시다제(glucosidase), 아라비노시다제(arabinosidase), 람노시다제(rhamnosidase), 자일로시다제(xylosidase), 셀룰라제(cellulase), 헤스페리디나제(hesperidinase), 나린지나제(naringinase), 글루쿠로니다아제(glucuronidase), 펙티나제(pectinase), 갈락토시다제(galactosidase) 및 아밀로글루코시다제(amyloglucosidase)로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상인 피부 탄력 향상용 화장료 조성물.
제12항에 있어서, 상기 미생물은 아스퍼질러스(Aspergillus)속, 바실러스(Bacillus)속, 페니실리움(Penicillium)속, 리조푸스(Rhizopus)속, 리조무코르(Rhizomucor)속, 탈라로마이세스(Talaromyces)속, 비피도박테리움(Bifidobacterium)속, 모르티에렐라(Mortierella)속, 크립토코커스(Cryptococcus)속 및 마이크로박테리움(Microbacterium)속으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상인 피부 탄력 향상용 화장료 조성물.