KR100542446B1 - 매생이 추출물을 주요 활성성분으로 하는 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 매생이 추출물을 주요 활성성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로서, 좀더 구체적으로는 매생이 추출물 0.001 - 30.0 중량%를 함유하는 것을 특징으로 하는 멜라닌 생합성 억제효과와 티로시나제 활성 억제효과, 항산화 효과 및 피부 주름의 개선효과가 우수한 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 의하면 매생이로부터 얻은 추출물이 탁월한 미백효과와 자극완화효과, 주름 개선 효과를 가져 이 물질을 이용하여 기능성 화장료를 제조할 수 있다.

매생이, CAPSOSIPHON FULVESCENS, 추출물, 미백, 항노화, 화장료

Description

매생이 추출물을 주요 활성성분으로 하는 화장료 조성물{A COSMETIC COMPOSITION CONTAINING AN EXTRACT OF CAPSOSIPHON FULVESCENS}

본 발명은 피부색을 희게 하거나 칙칙한 피부색을 개선시켜 주고, 주름개선 효과와 자극완화효과를 가져 피부노화를 완화시키는 화장료 조성물에 관한 것으로서, 좀더 상세하게는 매생이 추출물 0.001 - 30.0중량%를 함유하는 것을 특징으로 하는 미백효과와 항노화 효과, 자극완화효과가 우수한 화장료 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 해양천연물 추출물을 함유한 화장료 조성물은 사람에게 사용하였을 경우, 효과뿐만 아니라 안전성 면에서도 우수한 피부화장료의 성분으로서 적용이 가능하다.

최근 피부 자극을 줄이기 위해 천연물을 사용한 화장품이 많이 개발되고 있다. 각종 천연 원료를 소정의 방법으로 추출하고, 그 추출물의 기능을 확인하여 각종 기능성 화장품을 개발하는 사례도 늘고 있다. 예를 들면 녹두는 피부를 청결하게 하는 기능이 알려져 있고, 그 외 인삼추출물, 상황버섯 추출물 등에 대해서도 그 특유의 노화방지 또는 미백 등의 효과가 밝혀져 각종 화장품에 응용되고 있다. 이러한 천연 재료는 피부에 부작용이 적을 뿐 아니라, 최근 천연 재료를 이용한 화장품에 대한 소비자들의 호응이 높아짐에 따라 화장품 원료로서 개발가치가 한층 늘어나고 있다. 이에, 본 발명자들은 이제까지 알려지지 않은 천연 재료들에 있어서 화장품으로서의 응용가능성을 연구한 결과, 매생이의 추출물이 추출 방법에 따라 미백효과와 항노화 효과 등과 같은 화장품으로서의 효능이 기대 이상으로 커질 수 있다는 것을 발견하게 되었다.

피부색을 결정하는 인자에는 기본적으로 인종과 지역, 성별, 나이에 따른 차이를 배제하면 기미, 주근깨와 자외선 노출로 인한 태닝과 같은 부분, 또는 전체적인 색소침착, 그 외에 여드름 및 흉터, 각질의 분포 상태와 혈액 순환, 스트레스, 건강상태 등이 있다. 이상의 인자들 가운데에서도 가장 중요한 인자는 색소침착이다.

피부색에 영향을 주는 색소로는 멜라닌, 카로틴, 헤모글로빈 등이 있는데 이중 가장 중요한 것은 멜라닌으로 생합성에 영향을 미치는 가장 큰 요인은 자외선과 체내 호르몬 분비 정도이다. 멜라닌의 생합성은 아미노산의 일종인 티로신이 멜라노사이트의 멜라노좀에서 티로시나제 (tyrosinase)에 의해 산화되어 디하이드록시 페닐알라닌 (dihydroxy phenylalanine)으로 전환되는 것을 시작으로 계속되는 일련의 산화과정을 거쳐 갈색 (pheomelanin), 흑색 (eumelanin)의 중합체로 형성된다. 이러한 생합성 과정은 멜라노좀이라는 특수한 형태의 갈색 세포내 소기관에서 진행되며 멜라닌 과립을 포함한 멜라노좀은 핵 주변 부위에서 수지상 돌기 끝부분으로 이동, 케라티노사이트의 식세포작용에 의해 세포질 내로 이동하고 이들은 케라티노 사이트의 핵 주변에 축적된다. 멜라닌의 합성과 멜라노좀의 수, 주위의 케라티노사이트로의 이동은 부분적으로 호르몬과 자외선 등에 영향을 받고 일차적으로는 유전적인 영향을 크게 받는다. 그 밖에 티로시나제의 발현 및 멜라닌의 합성, 전송에 관여하는 세포내 조절인자인 싸이토카인 (cytokine), 구리, 아연, 철 등의 금속 이온 및 인터페론, 프로스타글란딘, 히스타민 등이 관여하는 것으로 알려져 있다(박수남 : 대한화장품학회지, 25: 77-127, 1999). 따라서 피부색을 결정짓는 멜라닌의 합성을 억제하고 이에 관여하는 효소인 티로시나제의 활성을 억제하여 피부의 미백효과를 기대할 수 있다.

다음으로, 피부의 노화로 인한 주름의 생성과 탄력의 저하 문제가 있다. 사람의 피부는 나이를 먹으면서 피부 노화와 색소 침착에 의해 끈임없이 변한다. 피부 노화는 크게 자연 노화(혹은 내인성 노화)와 외적 노화로 구분되며 (E.B. Doris, Cosmetics & Toiletories, 111, 31-37, 1996), 자연 노화(내인성 노화)는 유전적인 요소에 영향을 받기 때문에 인위적인 조절이 어려운 반면 외적 노화는 환경적인 요소에 영향을 받기 때문에 인위적인 조절이 비교적 용이하다. 대표적인 외적 노화인자로는 자외선을 들 수 있으며, 가장 두드러진 외적인 노화현상이 바로 주름 형성이다 (H.M. Daniel, Ann Intern Med, 75, 873-880, 1971, M.J. Grove, J Am Acad Dermatol, 21, 631-637, 1989, T.S. Griffiths et al, Hrch Dermatol, 128, 347-351, 1992).

자외선에 의해 야기되는 광노화 메카니즘 중의 하나는 자유 라디칼 경로를 경유하는 것이다 (D. Harman, J. Gerontol, 11, 298-301, 1956). 자유 라디칼들은 피부 콜라겐 등의 결합조직형성 파괴, 세포막 기능 저해, DNA 변이 촉진, 단백질 작용 변형, 세포간 에너지 전이, 신진대사와 관련된 분자들의 변형 등을 유발하는 것으로 알려져 있다 (A.F. Kligman and R.M. Lavker, J. Cutan. Aging Cosmet. Dermatol. 1, 5-12, 1988). 노화에 자유 라디칼이 관여한다는 사실은 자유 라디칼을 불활성화시키는 항산화제 또는 여러 가지 화학적 소거제들을 사용하여 노화과정을 지연시킬 수 있다는 것을 의미한다.

자외선에 의한 노화를 방지하기 위하여 자외선 차단제가 함유된 제품을 피부에 직접 도포하는 방법이 가장 일반화되어 있으나, 1988년 레티노인산이 노화된 피부의 피부거칠음 및 잔주름의 완화에 효과가 있다고 보고되었고(K.S. Weiss et al, JAMA, 259, 527-532, 1988), 전세계적으로 피부 노화를 억제 혹은 개선시키는 물질을 개발하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 이 중 비타민 A, C ,E 등 비타민류의 유도체 및 AHA (alpha -hydroxy acid)는 현재까지 알려진 노화피부 개선의 대표적인 물질이다 (Hermitte, Cosmetics & Toiletries, 107, 63-67, 1992, D.R. Rosenthal et al, J. Invest. Dermatol., 95, 510-515, 1990, T.D.Ditre et al, J. Invest. Dermatol, 34, 187-195, 1996). 하지만, 이들은 자연환경에서 매우 불안정하여 사용상 문제점이 있거나, 혹은 가시적 효과를 나타내기엔 다소 미흡하다는데 문제가 있다.

매생이(CAPSOSIPHON FULVESCENS)는 일어명 KAPUSA-AONORI의 울로드럭스 목, 갈파래 과에 속하는 해조류로서 전 세계에 널리 분포되고, 우리나라에는 남해안 각지에 분포한다. 몸은 관상, 또는 편압상이며 짙은 녹색이다. 길이 15 cm, 굵기 2 - 5 mm 에 달하는 단조체로서 질이 매우 연약하고 표면에서 보면 사각형의 세포가 2 - 4개씩 짝을 지어 종렬하며 이 열은 커버글라스로 누르면 1열 또는 2열의 세로줄로 분리할 만큼 질은 연약하다. 생장함에 따라 이 열은 흐트러지며 매우 미끌미끌하다. 조간대 상부의 바위 위에 또는 김 양식장의 발에 밀생하여 김 생육에 해를 준다. 최근에는 식용으로 사용되고 있다(두산세계대백과, 두산동아, 1999).

본 발명자들은 여러 가지 천연물들 중 매생이를 선택하여, 이의 화장품 원료로서의 효능을 확인하고 그 사용방법을 개발함으로써, 다양한 화장품의 원료의 선택범위를 높이고, 또 이 원료를 사용하여 좀더 자극이 없으면서도 소정의 기능성 효과를 나타내는 화장품을 제조할 수 있는 방법을 제공하고자 하였다.

즉, 본 발명의 목적은 피부화장료에 적용 가능하고 화장료에 함유시 멜라닌의 생성 및 이와 관련된 효소의 활성을 억제하여 우수한 미백 효과를 나타내는 천연 추출물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 피부화장료에 적용 가능하고 화장료에 함유시 항산화효과, 콜라겐 합성효과, 피부 잔주름 방지효과 등 우수한 항노화 효과를 나타내는 천연추출물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 매생이의 추출물 제조시 특정 추출용매 선택시 목표로 하는 효능이 더욱 크게 나타난 점으로부터 화장품 원료로서 이 물질을 이용하여 화장료를 제조하는 방법 및 그 화장료를 제공하고자 하였다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 매생이를 정제수, 메탄올, 에탄올, 글리세린, 에틸아세테이트, 부틸렌글리콜, 프로필렌 글리콜, 디클로로메탄 및 헥산 중에서 선택된 1종 이상의 용매를 사용하여 추출한 것임을 특징으로 하는 매생이 추출물을 주요 활성성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명은 매생이 추출물을 주요 활성성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 매생이 추출의 추출용매로서 정제수, 메탄올, 에탄올, 글리세린, 에틸아세테이트, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디클로로메탄 및 헥산 중에서 선택된 1종 이상의 용매를 사용하여 추출한 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 매생이 추출물을 피막 형성제와 혼합하여 스프레이 드라이로 파우더화한 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 매생이 추출물이 상온에서 냉침, 가열 여과하여 얻어진 액상물, 추가로 용매를 감압농축 또는 건조하여 얻은 것임을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 매생이 추출물의 함량이 화장료 조성물 전체에 대하여 동결건조 중량 기준 0.001∼30.0중량%인 것을 특징으로 한다. 함량이 0.001% 미만인 경우 항노화 효과, 미백 효과, 피부자극 완화효과가 미미하며, 30.0중량%를 초과하는 경우 함량의 증가 대비 효과 향상정도가 미미하다.

나아가, 본 발명은 상기 화장료 조성물이 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 기타 수중유 (O/W)형 및 유중수 (W/O)형의 기초화장료 제형과 수중유형 또는 유중수형 메이크업베이스, 파운데이션, 스킨커버, 립스틱, 립그로스, 페이스파우더, 투웨이케익, 아이새도, 치크칼라 및 아이브로우펜슬 중에서 선택되는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 매생이를 40 - 95중량% 에탄올을 추출용매로 사용하여 추출한 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.

상기 화장료 조성물은 항노화 효과, 미백작용 및 피부 자극완화 효과를 제공할 수 있다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 좀더 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명의 예시적인 기재일 뿐이며 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.

<실시예 1> 매생이 추출물 제조

증류수로 세척한 매생이를 뜨거운 (hot) 95% (V/V) 에탄올 수용액으로 3시간 동안 환류추출하고 냉침한 후, 와트만(Whatman) #10 여과지로 여과하였다. 여과된 추출물을 50℃ 이하에서 감압농축 및 동결건조하였다. 감압농축물 또는 동결건조물이 0.001 ~ 30.0중량% 함유되게 정제수, 에탄올, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 중에서 선택된 1종 이상의 용매를 사용하여 매생이 추출물을 제조하였다.

<실시예 2> 매생이 추출물 파우더 제조

증류수로 세척한 매생이를 뜨거운 (hot) 95% (v/v) 에탄올 수용액으로 3시간 동안 환류추출하고 냉침한 후, 와트만 (Whatman) #10 여과지로 여과하였다. 여과된 추출물을 50℃ 이하에서 감압농축하여 에탄올 추출물을 얻었다. 감압농축물을 피막형성제인 소듐카르복시메틸셀룰로스, 결정성 셀룰로스, 히드록시프로필셀룰로스, 폴리비닐알콜, 폴리비닐피롤리돈, 수크로스, 락토오스, 글루코스, 갈락토스, HP-β-시클로덱스트린 등과 혼합하여 스프레이 드라이어로 파우더화하였다.

<실시예 3> 머쉬룸 티로시나제를 이용한 티로시나제 억제효과 측정 실험

본 실시예는 실시예 2에서 수득한 매생이 추출물 파우더의 미백효과를 확인하기 위해 티로시나제(tyrosinase)라는 효소의 기능이 억제되는 정도를 보고 미백효과를 판단한 것이다.

티로시나제는 생체내에서 티로신(tyrosine)이라는 물질의 산화과정을 촉진하여 멜라닌이 생성되게 도와주는 효소이다. 본 실시예에서는 이 효소의 기능을 억제하여 티로신이 산화되어 멜라닌이라는 흑색의 고분자를 형성하는 것을 억제하는 정도를 측정하는 방법(Pomerantz S. H.: J. Biochem., 24: 161 - 168, 1996)을 응용해 미백효과를 판정하였다.

코지산, 알부틴, 상백피추출물, 유용성 감초추출물, 매생이 추출물 파우더를 시료로 사용하여 티로시나제 활성 억제효과를 조사하였다.

각 시료들의 티로시나제에 대한 저해활성은 시료 15㎕를 96 웰 플레이트에 넣고, 50 mM 인산 완충액 (pH 6.5) 150 l, 1.5 mM L-티로신 용액 25㎕를 넣은 후, 머쉬룸 티로시나제(1,500 units/ml, Sigma사) 10㎕를 첨가하여 37℃에서 20분간 반응시킨 후 마이크로플레이트 판독기 (microplate reader, ELx800, 미국)를 사용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하여 티로시나제에 대한 저해율을 측정하였다. 티로시나제에 대한 저해율(%)은 수학식 1에 의하여 계산하였으며, IC₅₀값은 티로시나제 효소 활성을 50% 저해하는 물질의 농도이다.

저해율 (%) = [(D-C)-(B-A)]/(D-C)x 100

A : 시료를 넣은 웰의 반응전 흡광도

B : 시료를 넣은 웰의 반응후 흡광도

C : 시료를 넣지 않은 웰의 반응전 흡광도

D : 시료를 넣지 않은 웰의 반응후 흡광도

티로시나제 활성 억제효과를 시험한 결과 매생이 추출물 파우더의 IC₅₀값은 0.02%로 나타나 티로시나제 저해효과가 뛰어나다고 알려진 기존의 미백제인 코지산, 알부틴, 상백피 추출물 등에 비해 우수한 효과를 나타내었다(표 1).

시료	머쉬룸 티로시나제 저해 효과 (IC50)
코지산	0.037%
알부틴	0.4%
매생이 추출물	0.02%
상백피 추출물	10%
유용성 감초 추출물	0.02%

<실시예 4> B16F1 멜라노싸이트를 이용한 세포내 티로시나제 효소 합성 억제효과 측정 실험

본 실시예는 실시예 2에서 수득한 매생이 추출물 파우더의 미백효과를 확인하기 위해 B16F1 멜라노싸이트내 티로시나제 효소 합성 억제 정도를 세포 내 티로시나제 효소합성량을 측정하여 판단한 것이다.

본 실시예에 사용된 B16F1 멜라노싸이트는 마우스에서 유래한 세포균주이며 티로시나제라는 효소를 합성하는 세포이다. 이 세포의 인공배양 중에 시료를 처리하고 세포에서 티로시나제를 분리하여 효소합성량을 측정하므로서 티로시나제 효소합성 억제 정도를 비교평가하였다.

본 실시예에 사용된 B16F1 멜라노싸이트는 ATCC(American Type Culture Collection, 기탁번호 : 6323)로부터 분양받아 사용하였다. B16F1 멜라노싸이트의 티로시나제 효소 합성억제효과 측정은 다음과 같이 행하였다.

B16F1 멜라노싸이트를 6웰 플레이트에 각 웰당 2x10⁶ 농도로 분주하고 세포를 부착시킨 후 독성을 유발하지 않는 농도로 시료를 처리하여 72시간동안 배양하 였다. 72시간 배양후 세포를 Trypsin-EDTA로 떼어내고 세포수를 측정한 다음 원심 분리하여 세포를 회수하였다. 셀 펠릿(cell pellet)을 PBS로 1회 세척한 후 균질화 완충용액(50mM 소듐 포스페이트, pH 6.8, 1% Triton X-100, 2 mM PMSF) 1 ml를 첨가하여 5분간 와류하여 세포를 파쇄하고, 원심분리 (3,000 rpm, 10분)하여 상등액을 회수하였다. 50 mM 소듐 포스페이트 완충액(pH 6.5)에 1.5 mM L-티로신, 0.06 mM L-DOPA, 세포 상등액을 각각 넣고, 37℃에서 30분간 배양한 후 마이크로플레이트 판독기로 490 nm에서 흡광도를 측정하여 티로시나제 효소 합성 억제효과를 측정하였다. B16F1 멜라노싸이트의 티로시나제 효소 합성 억제율 (%)은 수학식 2에 의하여 계산하였으며, IC₅₀값은 티로시나제 효소 합성을 50% 저해하는 물질의 농도이다.

저해율(%) = [(A-B)/A]x 100

A: 시료를 첨가하지 않은 웰의 티로시나제 효소 합성량

B: 시료를 첨가한 웰의 티로시나제 효소 합성량

B16F1 멜라노싸이트의 티로시나제 효소 합성 억제효과를 측정한 결과, 매생이 추출물의 IC₅₀값은 0.06%로 나타나 기존의 미백제인 코지산, 알부틴, 유용성 감초 추출물, 상백피 추출물 등에 비해 우수한 효과를 나타내었다(표 2). 이와 같은 결과로 볼 때 본 발명의 매생이 추출물의 경우에는 기존의 미백제가 단순히 티로시나제 효소의 활성만을 저해하는 것과는 달리 티로시나제 효소의 합성을 저해하여 미백효과를 나타내는 것을 알 수 있다.

[표 2]

시료	멜라닌 합성 저해 효과 (IC50)
코지산	0
알부틴	0
매생이 추출물	0.06%
상백피 추출물	0
유용성 감초 추출물	0

<실시예 5> B16F1 멜라노싸이트를 이용한 멜라닌 생성 억제효과 측정 실험

본 실시예는 실시예 2에서 수득한 매생이 추출물 파우더의 미백효과를 확인하기 위해 B16F1 멜라노싸이트에 대한 멜라닌 생성 억제 정도를 보고 미백 효과를 판단한 것이다.

본 실시예에 사용된 B16F1 멜라노싸이트는 마우스에서 유래한 세포균주이며, 멜라닌이라는 흑색색소를 분비하는 세포이다. 이 세포의 인공배양중에 시료를 처리하여 멜라닌 흑색색소가 감소하는 정도를 비교 평가하였다. 본 실시예에 사용된 B16F1 멜라노싸이트는 ATCC(American Type Culture Collection, 기탁번호 : 6323)로부터 분양받아 사용하였다.

B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 생합성 억제효과 측정은 다음과 같이 행하였다. B16F1 멜라노싸이트를 6웰 플레이트에 각 웰당 2 x 10⁶ 농도로 분주하고 세포를 부착시킨 후 독성을 유발하지 않는 농도로 시료를 처리하여 72시간동안 배양하였 다. 72시간 배양 후 세포를 trypsin-EDTA로 떼어 낸 후 세포수를 측정한 다음 원심분리하여 세포를 회수하였다. 세포내 멜라닌의 정량은 로탄(Lotan : Cancer Res., 40: 3345-3350, 1980)의 방법을 약간 변형하여 실시하였다. 셀 펠릿을 PBS로 1회 세척한 후 균질화 완충용액(50 mM 소듐 포스페이트, pH 6.8, 1% Triton X-100, 2 mM PMSF) 1 ml를 첨가하여 5분간 와류하여 세포를 파쇄하였다. 원심분리(3,000 rpm, 10분)하여 얻은 세포 여액에 1 N NaOH(10% DMSO)를 첨가하여 추출된 멜라닌을 용해한 후 마이크로 플레이트 판독기로 405nm에서 멜라닌의 흡광도를 측정한 다음 멜라닌을 정량하여 시료의 멜라닌 생성 저해율(%)을 측정하였다. B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 생성 저해율(%)은 수학식 3에 의하여 계산하였으며, IC₅₀값은 멜라닌 생성을 50% 저해하는 물질의 농도이다.

저해율 (%) = [(A-B)/A]x 100

A :　시료를 첨가하지 않은 웰의 멜라닌 양

B : 시료를 첨가한 웰의 멜라닌 양

B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 생성 억제 효과를 시험한 결과 매생이 추출물 파우더의 IC₅₀값은 0.03%로 나타나 기존의 미백제인 하이드로퀴논, 알부틴, 유용성 감초 추출물, 상백피 추출물 등에 비해 유사하거나 우수한 효과를 나타내었다(표 3).

시료	멜라닌 합성 저해 효과 (IC50)
하이트로퀴논	0.03%
알부틴	0.5%
매생이 추출물	0.03%
상백피 추출물	5%
유용성 감초 추출물	0.04%

<실시예 6> NBT법을 이용한 항산화 효과 측정 실험

본 실시예는 실시예 2에서 수득한 매생이 추출물 파우더의 항산화 효과를 확인하기 위해 실험실 조건에서 다른 항산화제 즉, 녹차추출물과 비타민 E를 비교 샘플로 하였으며, NBT법을 이용하여 항산화 활성을 측정하였다.

인간에게 분자상태의 산소는 생명을 유지하는데 필수적이지만, 산소의 소비로 인해 생체 내에서는 소량의 활성산소가 생성되며, 이것의 강한 산화작용으로 세포막이나 세포구성물을 파괴하게 된다. 이러한 활성산소는 피부세포의 손상과 노화에 큰 영향을 미치므로, 활성산소 소거 작용을 가지는 항산화 활성 물질들이 생체에 중요한 작용을 하게 되는 것이다.

항산화 효과를 측정하기 위해서 크산틴과 크산틴옥시다제에 의해 생성되는 활성산소를 NBT법에 의해 측정하고 피검물질이 활성산소를 제거하는 효과, 즉 활성산소 소거효과를 평가한다. 크산틴과 크산틴옥시다제에 의해 활성산소를 생성시킨다. 이 활성산소가 니트로블루테트라졸리움(Nitro Blue Tetrazolium;NBT)과 반응하여 이것에 의해 생성되는 청색을 파장 560nm에서 측정하는 것으로 활성산소 소거율을 측정한다.

사용한 시약으로서는

1) 0.05M Na₂CO₃ 완충액(MW=105.99) : 탄산나트륨 (화광순약) 5.25g (50mM)을 정제수에 용해한 용액과 50mM NaHCO₃(MW=84.01)용액을 혼합하여 pH 10.2로 한다.

2) 3mM 크산틴 용액 : 크산틴 (半井化學, MW=152.11) 45.6mg을 물에 용해하여 10ml로 한다.

3) 3mM EDTA용액 : 에틸렌디아민4초산나트륨 (同仁化學, MW=60.1)을 증류수에 용해하여 3mM로 한다.

4) 0.15% BSA용액 : BSA (Fraction V, powder,Sigma) 15mg을 증류수에 용해하여 10ml로 한다.

5) 0.75mM NBT용액 : 니트로블루 테트라졸리움(MW=817.65, 東京化學) 61.32mg을 증류수에 용해하여 100ml로 한다.

6) 크산틴 옥시다제(xanthine oxidase) 용액: 크산틴 옥시다제(Boehringer)를 증류수로 약 100배로 희석하고 측정조작에서 공시험의 흡광도가 0.2-0.23의 범위에 들도록 한다. 다시 말해 흡광도의 변화가 A₅₆₀=0.3/20분이 되게 정제수로 희석한다.

7) 6mM CuCl₂ 용액 : 염화동(CuCl₂-2H2O, MW=134.45)을 102.29mg을 증류수에 용해하여 100ml로 한다.

측정방법으로서

1. 0.05M Na₂CO₃ ---------- -------------------------- 2.4ml

2. 3mM 크산틴 용액---------------------------------- 0.1ml

3. 3mM EDTA 용액------------------------------------ 0.1ml

4. BSA 용액----------------------------------------- 0.1ml

5. 0.72mM NBT 용액---------------------------------- 0.1ml

6. 크산틴 옥시다제 용액----------------------------- 0.1ml

7. 6mM CuCl₂ 용액----------------------------------- 0.1ml

① 바이엘병에 1, 2, 3, 4, 5를 가하고 여기에 시료용액 0.1ml을 첨가하고 25℃에서 10분간 방치한다.

② 6을 가하여 빨리 교반하고 25℃에서 20분간의 배양을 개시한다.

③ 그 후 7을 가하여 반응을 정지시키고 560nm에서의 흡광도 St를 측정한다.

④ 공시험은 시료용액 대신에 증류수를 사용한 것을 상기와 똑같이 조작해 흡광도 Bt를 측정한다.

⑤ 역시, 시료용액의 블랭크 (Blank)는 6대신에 증류수를 사용해 똑같이 조작하여 흡광도 Bo를 측정한다.

효과의 결과는 수학식 4에 의하여 산출하였으며, 결과는 표 4와 같다.

[수학식 4]

억제율(%) = 〔1-(St-So)/(Bt-Bo)〕X 100

St : 시료용액의 효소 반응 후의 560nm에서의 흡광도

Bt : 공시험용액의 효소 반응 후의 560nm에서의 흡광도

So : 시료용액의 효소 무첨가시 반응 전의 560nm에서의 흡광도

Bo : 공시험용액의 효소 무첨가시 반응 전의 560nm에서의 흡광도

결과는 표 4와 같이 시험한 모든 시료에서 우수한 항산화 효과를 나타내었고, 매생이 추출물도 항산화제로 많이 이용되고 있는 녹차추출물과 비타민 E와 비슷한 항산화력을 갖고 있음이 확인되었다.

[표 4]

시료명	항산화효과(%)
매생이 추출물	89
녹차추출물	95
비타민 E	88

<실시예 7> DPPH법을 이용한 항산화 효과 측정 실험

본 실시예는 실시예 2에서 수득한 매생이 추출물 파우더의 항산화 효과를 측정하기 위해 실험실 조건에서 녹차추출물과 비타민 E와 같은 항산화제를 비교 샘플로 하여 DPPH법을 이용, 항산화 활성을 측정하였다.

DPPH법은 2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl free radical (DPPH)라는 유리기를 사용하여 환원력에 의한 항산화 활성을 측정한다. 피검물질에 의해 DPPH가 환원되어 흡광도가 감소하는 정도를 공시험액의 흡광도와 비교하여 파 장 560nm에서 자유라디칼 소거율을 측정한다.

사용한 시약으로서는 2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl free radical (Aldrich Chem. Co., MW=618.76) 0.1mM 용액으로서 61.88mg을 메탄올에 용해하여 100ml로 한다.

측정방법으로서

① 96-웰 플레이트에 0.1mM DPPH 용액 0.15ml에 시료용액 0.15ml를 가하여 빨리 교반하고 25℃에서 10분간의 배양을 개시한다.

② 그 후 560nm에서의 흡광도 St를 측정한다.

③ 공시험은 시료용액 대신에 증류수를 사용한 것을 상기와 똑같이 조작해 흡광도 Bt를 측정한다.

④ 역시, 시료용액의 블랭크 (Blank)는 0.1mM DPPH 용액 대신에 메탄올을 사용해 똑같이 조작하여 흡광도 Bo를 측정한다.

효과의 결과는 수학식 5에 의하여 산출하였으며, 결과는 표 5와 같다.

[수학식 5]

억제율(%) = 〔1-(St-So)/(Bt-Bo)〕X 100

St: 시료용액의 자유라디칼 소거 후의 560nm에서의 흡광도

Bt: 공시험용액의 자유라디칼 소거 후의 560nm에서의 흡광도

So: 시료용액의 자유라디칼 무첨가시 반응 전의 560nm에서의 흡광도

Bo: 공시험용액의 자유라디칼 무첨가시 반응 전의 560nm에서의 흡광도

결과는 표 5와 같이 시험한 모든 시료에서 우수한 항산화 효과를 나타내었고, 매생이 추출물도 항산화제로 많이 이용되고 있는 녹차추출물과 비타민 E와 비슷한 항산화력을 갖고 있음이 확인되었다.

[표 5]

시료명	항산화효과(%)
매생이 추출물	91
녹차추출물	95
비타민 E	90

<실시예 8> 콜라겐 합성 효과 측정 실험

본 실시예는 실시예 2에서 수득한 매생이 추출물 파우더의 콜라겐 합성 효과를 관찰하기 위해 인간으로부터 직접 채취하거나 상업적으로 구입한 인간의 섬유아세포에 처리하여 실험을 실시하였다.

96웰 평판배양기(96-well plate)에 2.5% 우태아 혈청이 함유된 DMEM배지 (Dulbecco's Modified Eagle's Media)와 인간의 섬유아세포 (5000세포/well)를 넣고, 70-80%정도 자랄 때까지 배양하였다. 그다음 매생이 추출물을 각각 0.01% 및 0.001%의 농도로 1일 처리후 세포배양액을 채취하였다. 채취한 세포배양액을 콜라겐 단백질 측정기구(Catalog No. : MK 101, Takara Shuzo Co. Ltd, 일본)를 이용하여 콜라겐 합성량을 측정하였다.

측정 방법은 우선 1차 콜라겐 항체가 균일하게 도포된 96웰 평판배양기에 채취된 세포 배양액을 넣고 3시간 동안 항원-항체 반응을 실시하였다. 3시간 후 발색단이 결합된 2차 콜라겐 항체를 96웰 평판배양기에 넣고 15분간 반응시켰다. 15분 후 발색유발물질을 넣어 실온에서 발색시키고, 1M 황산을 넣어 발색을 중지시켰다. 반응색의 색깔은 노란색을 띠며, 반응의 정도에 따라 진하기가 달라진다. 노란색을 띤 96웰 평판배양기를 흡광광도계를 이용하여 450nm에서 측정하고, 아래 수학식 6에 의해 콜라겐 합성 정도를 계산하였다. 이때 상기 추출물을 처리하지 않은 세포배양액의 반응 흡광도를 대조군으로 하였다.

콜라겐 합성 효과는 수학식 6에 의하여 산출하였으며, 결과는 표 6과 같다.

[수학식 6]

콜라겐 합성효과(%) = (추출물의 세포배양액의 반응 흡광도/대조군의 반응 흡광도)×100

결과는 표 6에 나타난 바와 같이 본 발명에 따르는 매생이 추출물은 콜라겐 생성 촉진효과가 있음을 알 수 있다.

[표 6]

시료		콜라겐 합성효과(%)
매생이 추출물	0.01%	82
	0.001%	51
대조군		0

<실시예 9> 염증유발관련 효소(hyaluronidase) 활성 억제효과 측정 실험

본 실시예는 실시예 2에서 수득한 매생이 추출물 파우더의 항염증 효과를 확인하기 위해 염증유발관련 효소인 히아루로니다아제의 효소 활성을 측정하여 판단한 것이다.

히아루로니다아제(hyaluronidase)는 히아루론산을 가수분해하는 효소로 염증을 유발하는 기능을 가지고 있다. 본 실시예에서는 이 효소의 활성을 억제하여 항염증효과를 측정하는 방법(Kakegawa Y., Japanese J. of Inflammantion, 4:437-438, 1984)을 응용해 항염증효과를 판정하였다.

컴프리, 시소, 삼백초, 유용성 감초 추출물, 매생이 추출물 파우더를 시료로 사용하여 히아루로니다아제 활성 억제 효과를 조사하였다.

각 시료들의 히아루로니다아제에 대한 저해활성은 다음과 같이 행하였다. 시료 100㎕와 히아루로니다아제 용액 (type Ⅳ-S, Sigma사, 400 U/ml) 50㎕를 넣고 37℃에서 20분간 반응시킨 후, 효소활성화용액(compound 48/80 CaCl₂·2H₂O, Sigma 사, 0.1 mg/ml)을 100㎕를 첨가하고 다시 37℃에서 20분간 반응시킨다. 히아루론산 (hyaluronic acid) 용액 (0.4 mg/ml)을 250 l 넣고 37℃에서 40분간 반응시키고, 0.4 N NaOH 100㎕를 넣어 반응을 종결시킨다. 포타슘보레이트 용액을 100㎕를 첨가하여 95℃에서 3분간 반응시키고 냉각시킨 다음 ρ-디메틸아미노벤즈알데히드 용액을 3 ml 넣고 다시 20분간 37℃에서 반응시켜 발색시킨다. 585nm에서 흡광도를 측정하여 히아루로니디아제에 대한 저해율을 측정하였다. 히아루로니디아제에 대한 저해율(%)은 수학식 7에 의하여 계산하였으며, IC₅₀값은 히아루로니디아제 효소 활성을 50% 저해하는 물질의 농도이다.

[수학식 7]

저해율(%) = [(A-B)/A] x 100

A : 시료를 첨가하지 않은 웰의 효소활성

B : 시료를 첨가한 웰의 효소 활성

히아루로니다아제 효소 활성 억제 효과를 시험한 결과 매생이 추출물 파우더의 IC₅₀값은 0.07%로 나타나 히아루로니다아제 저해효과가 뛰어나다고 알려진 기존의 항염증제인 유용성 감초 추출물, 컴프리 추출물, 삼백초 추출물, 시소 추출물 등에 비해 우수한 효과를 나타내었다(표 7).

시료	멜라닌 합성 저해 효과 (IC50)
컴프리 추출물	0.22%
시소 추출물	0.58%
유용성 감초 추출물	0.08%
삼백초 추출물	0.3%
매생이 추출물	0.07%

<실시예 10> 세포 배양기술을 이용한 자극완화 효과 평가

본 실시예는 실시에 2에서 수득한 매생이 추출물 파우더의 자극완화 효과를 평가하기 위하여 세포 배양 기술을 이용하여 피부 자극을 유발하는 물질인 소듐라 우릴썰페이트(Sodium Lauryl Sulfate:SLS)에 의한 세포 사멸을 저해시키는 정도로 자극완화 효과를 평가한 것이다.

SLS는 화장품 기재의 피부 자극 평가의 기준이 되는 물질로 세포막에 결합되어 세포대사 억제와 세포막을 파괴하여 피부자극을 유발하는 물질이다.

본 실시예는 사람 섬유아세포에 SLS와 매생이 추출물 파우더를 동시에 첨가하였을 때 SLS에 의한 세포 사멸을 감소시키는 효과를 평가한 것이다.

본 실시예에 사용된 Hs68 섬유아세포는 사람의 피부 진피세포로 ATCC (American Type Culture Collection, 기탁번호 1635)에서 분양받아 사용하였다.

세포배양기술을 이용한 자극완화 평가 실험은 다음과 같이 행하였다.

사람 유래의 섬유아세포를 96웰 플레이트에 각 웰당 1x 10⁵농도로 분주하고, 24시간 동안 배양한 후 0.01% SLS 단독, 0.01% SLS와 매생이 추출물 파우더(0.01%)를 동시에 처리하고 24시간동안 추가배양하였다. 배양 후 MTT(Sigma 사) 시약을 첨가하고 4시간동안 배양한 후, 배양액을 제거하고 1 N NaOH/이소프로판올용액을 첨가하여 20분간 교반한 후 마이크로플레이트 판독기로 565nm에서 흡광도를 측정하여 매생이 추출물 파우더가 SLS에 의한 세포사멸을 저해하는 효과를 측정하였다.

실험결과 매생이 추출물 파우더는 SLS에 의해서 유발되는 세포사멸을 억제시키므로써 화장료 기재와 함께 처방하였을 때 화장료 기재로 일어날 수 있는 피부 자극을 감소시키는 자극완화 물질임이 밝혀졌다 (표 8).

시 료	섬유아세포 생존율(%)
0.01% SLS	25
0.01% SLS + 0.01% 매생이 추출물	57

<실시예 11 내지 13 및 비교예 1>

본 실시예는 실시예 2에서 수득한 매생이 추출물 파우더를 함유한 화장료를 제조하여 사람을 대상으로 피부 미백효과를 비교예 1과 비교실험을 행하여 평가하였다.

비교실험에 사용된 화장료는 크림형태이고, 그 조성은 표 9에 나타낸 바와 같다. 우선 표 9에 기록되어 있는 나)상을 가열하여 70℃에 보존한다. 이것에 가)상을 가하여 예비유화 후 호모믹서로 균일하게 유화하고 다음에 서서히 냉각하여 크림(실시예 11 내지 13, 비교예 1)을 제조한다.

<실험예 1>

실험자 (20세-35세의 여성) 20명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 실시예 11 내지 13에서 제조된 크림을, 얼굴 왼쪽 부위에는 비교예 1에서 제조된 크림을 각각 1일 2회씩 연속 2개월간 도포하였다. 시험 완료 후 얼굴 좌우 양편의 도포 부위 피부를 화상분석기 및 색차계로 얼굴색을 비교하여 가장 어두운색을 5, 중간색을 3, 가장 환한 색을 1로 정하고 그 중간정도를 어림잡아 평가하였다. 표 10은 실시예 13에서 제조된 크림을 사용한 실험자의 안면 피부색을 비교예 1로 만든 크림 을 사용한 실험자의 안면 피부색과 비교한 것이다.

표 10에서 나타낸 바와 같이 매생이 추출물을 함유한 크림을 도포한 실험자의 안면 피부에서 미백효과가 우수함을 알 수 있다.

원료		실시예			비교예 1
		11	12	13
가	스테아릴알콜	8	8	8	8
	스테아린산	2	2	2	2
	스테아린산 콜레스테롤	2	2	2	2
	스쿠알란	4	4	4	4
	2-옥틸도데실알콜	6	6	6	6
	폴리옥시에틸렌(25M 부가)알콜에스테르	3	3	3	3
	글리세릴모노스테아린산 에스테르	2	2	2	2
나	매생이 추출물	10	1	0.1	-
	프로필렌 글리콜	5	5	5	5
	정제수	적량	적량	적량	적량

주) 단위 : 중량%

사용제품	실시예 10	비교예 1
실험 인원 번호	오른쪽 피부색	왼쪽 피부색
1	2	2.5
2	2	3
3	1.5	2
4	1.5	2.5
5	3	3.5
6	1.5	2
7	3	4
8	2.5	2.5
9	2	2
10	1.5	2
11	2.5	3.5
12	3	3.5
13	1.5	2.5
14	2	3
15	2	2.5
16	2.5	3.5
17	3	4
18	3	3.5
19	1.5	2.5
20	1.5	2.5

<실험예 2>

본 실험예는 실시예 11-13, 비교예 1에서 제조된 크림형태 화장료를 사람을 대상으로 적용하여 피부 잔주름 개선 효과를 평가하였다.

비교실험에 사용된 화장료는 크림형태이고, 그 조성은 표 9에 나타낸 바와 같다. 우선 표 9에 기록되어 있는 나)상을 가열하여 70℃에 보존한다. 이것에 가)상을 가하여 예비유화 후 호모믹서로 균일하게 유화하고 다음에 서서히 냉각하여 크림(실시예 11 내지 13 및 비교예 1)을 제조한다. 실험자(20세-35세의 여성) 20명 을 대상으로 얼굴 오른쪽부위에는 실시예 11 내지 13에서 제조된 크림을 얼굴 왼쪽부위에는 비교예 1에서 제조된 크림을 각각 1일 2회씩 연속 2개월간 도포하였다.

실험완료 후 피부 잔주름 완화 효과는 제품 사용 전과 2개월간 사용 후에 안면 눈꼬리 주위의 주름을 실리콘 수지 복사물(레플리카)로 채취하고, 이것을 피부 미세 주름 장치와 피부 영상 분석기로 눈가 잔주름의 상태를 비교한다.

표 11는 실시예 11 내지 13에서 제조된 크림을 사용한 실험자의 눈가 평균 잔주름 깊이 및 주름 감소율을 비교예 1의 크림을 사용한 실험자와 비교한 것이다. 표 11에서 나타난 바와 같이 매생이 추출물 파우더를 함유한 크림을 도포한 실험자의 안면 눈주위 피부에서 피부 잔주름 개선 효과가 우수함을 알 수 있다.

[표 11]

	실시예 12		비교예 1
	사용전	2개월 후	사용전	2개월 후
평균 잔주름 깊이	0.199	0.179	0.195	0.192
사용전 대비 주름감소율(%)	10.05%		1.54%

n=20, p＜0.01

<실시예 14>

본 실시예는 실시예 2에서 수득한 매생이 추출물 파우더를 함유한 화장료의 자극 완화 효과를 인체 첩포 실험으로 평가한 것이다.

본 평가는 실시예 10에서 얻어진 결과를 인체에 직접 적용하여 얻어진 평가의 결과이다. 일반적 화장품 처방 (크림, 로션, 스킨, 에센스)에 자극을 일으키는 SLS(sodium lauryl sulfate)와 실시예 11 내지 13에서 제조된 제품을 혼용하여 24 시간, 48시간, 72시간 동안 첩포하여 자극 유발지수를 바탕으로 자극완화 효과를 평가한 것이다.

20-50세의 건강한 남녀 50명의 팔 상박부위에 FINN CHAMBER(FINLAND)를 이용하여 각각의 제품을 0.2mg씩 첩포하고, 24시간 후 급성 자극 지수를 평가하였다. 평가 후 재차 동일한 부위에 동량의 제품을 첩포하고 48시간 및 72시간 후의 지연성 자극 지수를 평가하였다.

시험 결과 매생이 추출물 파우더를 함유하는 제품을 첩포하고 24시간, 48시간, 72시간 경과 후에도 아무런 피부 발적을 일으키지 않았다. 이 평가의 결과는 매생이 추출물 파우더가 화장료에 혼용되었을 때 자극을 유발시키는 기재(계면 활성제, 향, 알콜)에 의한 피부 자극을 감소시킬 수 있는 유의한 효과가 있음을 나타낸다.

이하에 그 외의 실시예를 나타내었다. 즉, 본 발명의 매생이 추출물 및 이를 함유하는 조성물은 앞에서와 같이 미백효과, 자극완화효과 등 피부개선에 우수한 효과를 나타내었다.

<실시예 15> 실시예 2에서 수득한 매생이 추출물 파우더를 함유한 화장수 제조

95% 에탄올 8g에 폴리피로리돈 0.05g, 올리엘알콜 0.1g, 폴리옥시에틸렌모노올레이트 0.2g, 향료 0.2g, 파라옥시안식향산메틸에스테르 0.1g, 소량의 산화방지제, 소량의 색소를 혼합용해한다. 실시예 2에서 수득한 매생이 추출물 파우더 0.05g, 글리세린 5g을 정제수 85.33g에 용해한 것에 상기 혼합액을 첨가한 후 교반하여 피부개선 효과가 있는 화장수를 얻었다.

<실시예 16> 실시예 2에서 수득한 매생이 추출물 파우더를 함유한 유액의 제조

세틸 알콜(setyl alcohol) 1.2g, 스쿠알란 10g, 바세린 2g, 파라옥시안식향산에틸에스테르 0.2g, 글리세린모노에스테아리에드 1g, 폴리옥시에틸렌 (20몰 부가)모노올레이트 1g 및 향료 0.1g을 70℃에서 가열혼합 용해하고, 실시예 2에서 수득한 매생이 추출물 파우더 0.05g, 디프로필렌글리콜 5g, 폴리에틸렌글리콜1500 2g, 트리에탄올아민 0.2g, 정제수 76.2g을 75℃로 가열하여 가열용해시킨다. 양자를 혼합하여 유화시킨 후 냉각하여 수/유중계형의 피부개선효과가 있는 유액을 얻었다.

<실시예 17> 실시예 2에서 수득한 매생이 추출물 파우더를 함유한 미용액의 제조

95% 에틸알콜 5g에 폴리옥시에틸렌솔비탄모노올레이트 1.2g, 키툴로오즈 0.3g, 히알루론산나트륨 0.2g, 비타민 E-아세테이트 0.2g, 감초산 나트륨 0.2g, 파라옥시안식향산에스텔에스테르 0.1g, 실시예 2에서 수득한 매생이 추출물 파우더 각 1g 및 적량의 색소를 혼합하여 피부개선효과가 있는 미용액을 얻었다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 매생이 추출물 파우더는 기미, 주근깨 및 피부 색소 침착의 원인이 되는 물질인 멜라닌 생성을 막아주는 티로시나제 활성 억제 효과, 멜라닌 합성 억제 효과 등의 미백효과와 화장품 기재에 의해 야기되는 피부 자극을 감소시키는 피부세포 사멸 억제 효과, 염증 유발관련 효소 활성억제 효과 등의 피부자극 완화효과가 우수함이 밝혀졌다. 따라서 이러한 매생이 추출물 파우더를 함유하는 화장수, 크림, 유액, 팩 등의 화장료 조성물은 피부 미백효과와 자극 완화효과가 있음을 알 수 있다.

Claims (6)

1. 매생이 추출물을 주요 활성성분으로 함유하는 화장료 조성물
2. 제 1항에 있어서, 추출용매로서 정제수, 메탄올, 에탄올, 글리세린, 에틸아세테이트, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디클로로메탄 및 헥산 중에서 선택된 1종 이상의 용매를 사용하여 추출한 것을 특징으로 하는, 매생이 추출물을 주요 활성성분으로 함유하는 화장료 조성물
3. 제 1항에 있어서 상기 매생이 추출물은 소듐카르복시메틸셀룰로스, 결정성 셀룰로스, 히드록시프로필셀룰로스, 폴리비닐알콜, 폴리비닐피롤리돈, 수크로스, 락토오스, 글루코스, 갈락토스 및 HP-β-시클로덱스트린 중에서 선택된 1종 이상의 피막 형성제와 혼합하여 스프레이 드라이로 파우더화한 것을 특징으로 하는, 매생이 추출물을 주요 활성성분으로 함유하는 화장료 조성물
4. 제 1항에 있어서, 추출물은 상온에서 냉침, 가열 여과하여 얻어진 액상물, 추가로 용매를 감압농축 또는 건조하여 얻은 것임을 특징으로 하는, 매생이 추출물을 주요 활성성분으로 함유하는 화장료 조성물
5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 매생이 추출물의 함량은 화장료 조성물 전체에 대하여 동결건조 중량 기준 0.001∼30.0중량%인 것을 특징으로 하는 매생이 추출물을 주요 활성성분으로 함유하는 화장료 조성물
6. 제 1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 기타 수중유 (O/W)형 및 유중수 (W/O)형의 기초화장료 제형과 수중유형 또는 유중수형 메이크업베이스, 파운데이션, 스킨커버, 립스틱, 립그로스, 페이스파우더, 투웨이케익, 아이새도, 치크칼라 및 아이브로우펜슬 중에서 선택되는 것을 특징으로하는 매생이 추출물을 주요 활성성분으로 함유하는 화장료 조성물