KR101356535B1 - 글루쿠론산을 다량 함유하는 갈파래과 해조류 분해물 제조 방법 및 이를 함유하는 항노화 기능성 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 갈파래과(Ulvaceae) 해조류로부터 항노화 기능성 화장품 주성분 및 지표성분으로 활용 가능한 글루쿠론산을 1.0% 이상 함유하는 갈파래과 해조류 분해물을 제조하는 방법과 이를 유효성분으로 함유하는 항노화 기능성 화장료 조성물에 관한 것으로서, 좀 더 구체적으로는 갈파래과(Ulvaceae) 해조류로부터 다당체를 분리하는 공정, 이를 휘발성 유기산을 이용하여 분해하는 공정 및 불순물 및 휘발성 산을 제거하는 공정으로 이루어진 글루쿠론산을 1.0% 이상 함유하는 갈파래과(Ulvaceae) 해조류 분해물을 제조하는 방법 및 글루쿠론산을 1.0% 이상 함유하는 구멍갈파래 분해물을 유효성분으로 0.001 ~ 30.0중량%, 바람직하게는 0.01 ~ 5중량%를 함유하는 것을 특징으로 하며 활성산소 소거효과, 피부 잔주름 개선효과, 피부 탄력 개선효과, 광노화방지 효과가 우수한 항노화 기능성 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 의하면 글루쿠론산을 1.0% 이상 함유하는 갈파래과 해조류 분해물 제조 방법은 효과적으로 화장품 제형에 대한 상용성이 높고 항노화 활성이 우수한 갈파래과 해조류 분해물을 제조할 수 있고 이를 통해 제조된 갈파래과 해조류 분해물을 함유하는 본 발명의 화장료 조성물은 활성산소에 대한 방어 효과를 가지며, 자외선 등에 의한 자외선에 의한 피부세포 손상을 방어할 뿐만 아니라, 사람 섬유아세포에서 MMP-1 생합성 저해효과와 타입 1 프로콜라겐의 생합성 촉진 효과를 나타내며 이로 인해 피부 탄력 및 잔주름 개선효과를 나타낸다. 따라서 본 발명은 화장품 원료 상용성이 높은 글루쿠론산을 1.0% 이상 함유하는 갈파래과 해조류 분해물을 제조할 수 있는 제조방법에 관한 것이며, 또한 이를 통해 제조된 갈파래과 해조류 분해물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로 활성산소에 대한 방어 효과, 자외선 등에 의해 촉진되는 피부 광손상 방어, 피부 주름의 개선, 피부 탄력 개선효과가 우수한 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

글루쿠론산을 다량 함유하는 갈파래과 해조류 분해물 제조 방법 및 이를 함유하는 항노화 기능성 화장료 조성물{Ulva spp seaweed hydrolysates that have high glucuronic acid cotent, preparation method thereof and antiaging cosmetic composition containing the same}

본 발명은 갈파래과(Ulvaceae) 해조류로부터 항노화 기능성 화장료 조성물을 제조하는 방법과 이를 유효성분으로 함유하는 항노화 기능성 화장료 조성물에 관한 것으로서, 좀 더 구체적으로는 갈파래과(Ulvaceae) 해조류로부터 다당체를 분리하고, 이를 산 분해하여 글루쿠론산을 함유하는 갈파래과(Ulvaceae) 해조류 분해물을 제조하는 방법 및 글루쿠론산을 함유하는 갈파래과 해조류 분해물을 유효성분으로 함유하는 활성산소 소거효과, 피부 잔주름 개선효과, 피부 탄력 개선효과, 광노화 방지효과가 우수한 항노화 기능성 화장료 조성물에 관한 것이다.

광노화는 피부가 자외선 등의 광에 반복적으로 노출되어 피부의 외양 또는 기능이 변화되는 것을 의미한다 [Ridder GM등: J. Am. Acad. Dermatol., 25, 751-760(1991)]. 좀 더 구체적으로 말하자면, 광노화는 자외선에 의해 피부의 주요 구성물질인 지질, 단백질, 다당류 및 핵산 등이 손상되어 피부세포 및 조직이 파괴되고, 결국 피부노화 현상이 생겨나는 것이다. 특히 피부의 결합조직인 콜라겐, 히알루론산, 엘라스틴, 프로테오글라이칸, 피브로넥틴 등이 절단되어 피부 탄력에 지장을 주고 광노화의 주요 현상인 깊은 주름을 형성하게 되며, 더 심해질 경우 DNA 변이에 의해 돌연변이, 암 유발, 면역기능 저하의 사태에 이르게 된다.

생체 내에서 콜라겐과 같은 세포외 기질의 합성과 분해는 적절하게 조절되지만, 노화가 진행되면서 특히 자외선에 만성적으로 노출되는 부위에서는 그 합성이 감소하고 분해는 촉진되며, 자외선 등에 의해 콜라겐을 분해하는 효소인 기질금속단백질 분해효소(matrixmetalloproteinase, 이하 ‘MMP’라 칭함) 발현이 촉진되어 피부 탄력이 저하되고 주름이 형성된다.

MMP는 그 기질특이성에 따라 MMP-1, MMP-2, MMP-9로 크게 분류된다. MMP-1은 간질의 효소인 섬유아세포 타입 콜라게나제이며 기질로는 콜라겐타입 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅶ, Ⅷ, Ⅹ 및 젤라틴이 있으며 원래 콜라겐 길이의 3/4이나 1/4 길이의 펩타이드로 잘라 비특이적인 효소(젤라티네이즈 등)의 작용이 용이하도록 한다. 사람 피부의 진피층 대부분을 차지하는 콜라겐 타입 Ⅰ과 Ⅲ, 엘라스틴, 피브로넥틴 등은 피부에 강도와 장력을 부여하는데, 자외선과 자유 라디칼 등에 의해 비정상적으로 활성화된 MMP에 의해 단백질이 분해되면 주름과 탄력저하, 피부 처짐 등의 노화현상이 가속화된다. 결합단백질 중 가장 높은 비율을 차지하는 타입Ⅰ콜라겐을 분해하는 MMP-1의 활성과 생합성을 억제하면, 피부 결합단백질을 보호하여 주름생성과 탄력저하를 예방할 수 있다. 그러므로 자외선에 의해 세포 내에서 활성화가 유도되는 MMP 발현을 조절하거나 그 활성을 억제할 수 있는 물질의 개발이 요구되고 있다.

최근 여러 화학물질 등에 의한 피부 자극을 줄이기 위해 천연 추출물로부터 얻어진 주름완화, 미백 등의 기능을 가진 기능성 화장품(functional cosmetics)에 많은 관심이 집중되고 있다. 천연 재료는 피부에 부작용이 적을 뿐 아니라, 최근 천연 재료를 이용한 피부 외용제에 대한 소비자들의 호응이 높아짐에 따라 광노화 방지 화장료 조성물 원료로서 개발가치가 한층 커지고 있다.

갈파래과(Ulvaceae)는 청태과(靑苔科)라고도 하며 바닷가 조간대(潮間帶) 윗부분의 민물이 흘러들어 오는 곳에서 자라는 녹조류의 해조이다. 원통 모양의 엽상체(葉狀體)가 아래나 윗부분에서 여러 갈래로 갈라지며 속이 비어 있는 종류도 있으며, 빛깔은 파란빛을 띤 녹색이다. 구멍갈파래(Ulva pertusa), 갈파래(Ulva lactuca), 모란갈파래(Ulva conglobata Kjellman), 초록갈파래(Umbraulva japonica), 가시파래(Enteromorpha prolifera), 납작파래(Enteromorpha compressa), 창자파래(Enteromorpha intestinalis), 격자파래(Enteromorpha clathrata), 잎파래(Enteromorpha linza) 등이 여기에 속하며, 한국 전 연안에서 흔하게 볼 수 있다. 보통 식용하며 사료와 퇴비로도 쓴다. 한국을 비롯한 전세계에 분포한다.

이 중 특히 구멍 갈파래(Ulva pertusa)는 여름철 해수욕장의 경관을 해치고 양식 산업에 피해를 주는 대표적인 유해 해조류로 분류되고 있어, 이를 활용한 산업화 연구가 필요하다.

해양의 표면부 및 해양과 육상의 연결부인 조간부에 서식하는 갈파래과 해조류는 자외선 및 염수에 직접적으로 접촉 받는 열악한 환경에 서식하고 있다. 따라서, 갈파래과 해조류는 자외선과 건조한 환경에 의한 조직과 세포의 손상에 대응하기 위해 다양한 항산화 물질을 자체 생산하며, 또한 다당체 등의 보습 성분을 생성하는 등 다양한 방어 메카니즘을 구축하여 생명활동을 영위하고 있다.

즉, 이러한 해조류의 자체 방어 성분을 활용할 경우, 높은 부가 가치를 지닌 기능성 화장품 소재를 개발할 수 있을 것으로 예상된다.

일본특허공개 평9-672662는 히알우로니다제(Hyaluronidase)억제 효능을 가지는 해초류 추출물들에 관하여 기술하고 있다. 일본특허공개 평10-85905은 와카메(Wakame)로부터 추출된 푸코이단 (Fucoidan)의 피부감촉 개선효과에 관하여 기술하고 있다. 일본특허공개 평2-245087은 사르가숨(Sargassum)속 추출물의 항산화 효과에 관하여 기술하고 있다. 일본특허공개 평3-294384는 히지키아(Hizikia)속으로부터 추출된 항산화 조성물에 관하여 기술하고 있다. 일본특허공개 평7-10769는 수렴효과(astringent effect)가 있는 페오피시에강(Phaeophyceae) 추출물에 관하여 기술하고 있다. 특허공개 제2009-0020216호는 그물바탕말속(Dictyota) 갈조식물의 추출물을 포함하는 미백용 화장료 조성물에 관하여 기술하고 있다. 등록특허 제0786358호는 참그물바탕말(Dictyota dichotoma)을 추출물로서, NO 생성 억제활성, 초기 염증성 분자 생성 억제활성, iNOS 발현 억제활성, COX-2 발현 억제활성, 염증성 PGE2 생성 억제활성 중 1종 이상의 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 항염활성을 나타내는 참그물바탕말 추출물에 관하여 기술하고 있다. 특허공개 제2005-0095298호는 비만세포에서 히스타민 및 β-헥소사미니데이즈 등의 매개물질의 유리를 억제하며, IL-8 및 TNF-α(종양괴사인자; Tumor Necrosis Factor) 등과 같은 세포활성 물질의 유리를 억제함으로써, 아토피 피부염 등의 알레르기성 피부질환뿐만 아니라 건선, 습진, 여드름을 포함한 염증성 피부질환의 개선 및 치료 효과를 나타내는 가죽그물바탕말 추출물을 포함하는 피부 보호 및 피부질환 개선용 조성물을 개시한다. 등록특허 제0762181호는 감태(Ecklonia cava)의 추출물이 여드름의 주 원인균인 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)에 대해 특이적인 항균작용, 여드름 예방·치료용 수용성 스킨제, 점도와 경도 조절제, 자외선 흡수제, 안료, 보습, 세정제, 방부제 또는 전기물질의 혼합물 등을 제조하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물에 대하여 기술하고 있다. 등록특허 제0750870호 해조 추출물을 함유하는 피부 투명도 개선용 화장료 조성물은 듀날리엘라 살리나(Dunaliella Salina)로부터 추출한 해조추출물을 함유, 피부세포에 에너지를 공급하고 표피세포의 턴-오버(turn-over)를 촉진, 칙칙해진 피부를 맑고 투명하게 개선하는 화장료 조성물에 제0745023호 참보라색우무 추출물을 이용한 여드름 피부용 화장료에 대하여 기술하고 있다. 등록특허 제0745023호는 홍조류 참보라색우무(Symphyocladia latiuscula)의 추출물이 여드름의 주 원인균인 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)에 대해 특이적인 항균작용, 여드름의 예방 및 치료하는 수용성 스킨제, 점도와 경도 조절제, 자외선 흡수제, 안료, 보습, 세정제, 방부제 또는 전기물질의 혼합물 등을 제조하는 것을 특징으로 함에 대하여 기술하고 있다. 등록특허 제0728443호는 해조(Laminaria Saccharina) 추출물 함유 화장료 첨가제 조성물 및 이를 포함하는 화장료에 관한 것으로 해조 추출물, 피토스핑고신(Phytospingosine), 마치현 추출물을 함유하여 피부탄력증대 효과, 모공축소효과 및 피부상재균 억제 효과를 특징으로 하는 화장료 조성물에 대하여 기술하고 있다. 등록특허 제0542446호는 매생이 추출물을 주요 활성성분으로 함유하는 화장료 조성물로서, 멜라닌 생합성 억제효과와 티로시나제 활성 억제효과, 항산화 효과 및 피부 주름의 개선효과가 우수한 화장료 조성물에 대하여 기술하고 있다. 등록특허 제0429590호는 클라젠 감태 (ECKLONIA CAVA) 추출물을 함유하는 주름 개선용 화장료 조성물 및 이를 제조하는 방법, 피부의 주름을 완화시키는 방법, 콜라겐 합성 촉진용 조성물 및 이를 이용한 콜라겐 합성 촉진방법을 제공하며, 섬유 아세포의 세포활성과 콜라겐 합성을 촉진, 피부의 주름을 완화하고 피부에 탄력을 부여하는 조성물에 대하여 기술하고 있다. 하지만, 이러한 해조류 추출물은 주성분 및 활성 성분, 또는 지표성분으로 활용가능한 주성분에 대한 규명이 부족하거나, 주성분에 대한 정보가 확보 가능하더라도, 그 함량이 낮아 항노화 기능성 화장료 조성물 원료로는 경제성 및 그 기능성이 현저히 낮은 것이 현실이다.

본 발명은 여러 가지 천연물들 중 그 활용성이 낮거나 유해 해조류로 분류되는 갈파래과의 해조류를 선택하여 항노화 기능성 화장료를 제조하려는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명의 목적은 글루쿠론산을 1.0% 이상 함유하는 갈파래과 해조류 분해물을 원료로 사용하여 항노화 효과를 나타내는 기능성 화장료 조성물을 제공하려는 것이다.

이에 본 발명자들은 오랜 연구 끝에 갈파래과 해조류로부터 항노화 기능성 화장품 주성분 및 지표성분으로 활용 가능한 글루쿠론산 함량이 높은 분해물을 제조하여, 이 분해물에 대하여 MMP-1 생합성 저해효과와 타입 1 프로콜라겐의 생합성 촉진 효과에 의한 피부 탄력 및 잔주름 개선효과, 자외선 등에 의해 촉진되는 광노화 억제 효과를 실험한 결과 바람직한 결과를 얻고, 항노화 기능성 화장료 조성물로서의 효능을 기대할 수 있음을 알게 되었다.

본 발명은

1단계: 갈파래과 해조류를 추출용매로서 염기성 수용액과 산성 수용액, 염화나트륨 등의 중성 염을 첨가하여 pH 및 염농도를 조절한 후 20 내지 100℃로 가온 또는 냉각하여 여과하여 얻어진 액상물을 제조하는 수용성 추출물을 제조하는 공정,

2단계: 제조된 갈파래과 해조류 수용성 추출액에 추출액 중량 대비 50중량% 내지 500중량% 범위의 여에틸알코올을 가해 정치하여 고분자 다당체 및 단백질을 침전시킨 후, 여과 및 원심분리를 통해 침전을 회수하여 갈파래과 해조류 함유 고분자 다당체를 선별적으로 회수하는 공정,

3단계: 제조된 갈파래과 해조류 함유 고분자 다당체를 염산(hydrochloric acid), 아세트산(acetic acid), 개미산(formic acid), 낙산(butyric acid), 프로피온산(propionic aci1d), 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid, TFA), 펜타플루오로프로피온산(pentafluoropropionic acid, PFPA), 헵타플루오로부티르산(heptaflurobutyric acid, HFBA), 노나플루오로펜타논산(nonafluoro pentanoic acid, NFPA), 트리데카플루오로헵타논산(tridecafluoroheptanoic acid, TDFHA), 펜타데카플루오로옥타논산(pentadecafluorooctaonoic acid, PDFOA)으로부터 선택된 1종 이상의 휘발성 산 1 내지 6N 용액에 분산하여 밀폐된 용기에서 80 내지 125℃ 반응온도를 유지하며 산 분해를 진행한 후 여과하여 수용성 다당체 분해물을 제조하는 공정,

4단계: 제조된 갈파래과 해조류 다당체 분해물을 감압 농축하여 휘발성 산과 용매를 제거한 후 이를 다시 정제수에 용해하는 과정을 반복하여, 제조된 건고물을 정제수에 5% 농도로 용해하였을 때 pH 3.0 이상을 나타낼 수 있도록 휘발성 산과 불순물을 제거하는 공정,을 포함하는, 글루쿠론산을 1.0% 이상 함유하는 갈파래과 해조류 분해물 제조 방법에 관한 것이다.

다음에 제조된 분해물은 그대로 사용이 가능하며, 경우에 따라 한외여과(Utrafiltration) 장치와 겔크로마토그램을 이용하여 글루쿠론산 함량을 높인 갈파래과 해조류 분해물로 분획할 수 있으며, 다양한 목적에 사용할 수 있다.

다음에 제조된 분해물은 진공농축법으로 농축하여 사용할 수 있으며, 스프레이 드라이어를 이용하여 분말상의 갈파래과 해조류 분해물을 얻거나, 동결건조법을 이용하여 건조를 하고 적당한 크기로 분쇄를 하면 갈파래과 해조류 분해물 과립 및 세립을 얻을 수 있다.

또한, 본 발명의 저분자량 펙틴 분해물의 제조 방법에 있어서 산분해에 이용된 휘발성 산이 염산(hydrochloric acid), 아세트산(acetic acid), 개미산(formic acid), 낙산(butyric acid), 프로피온산(propionic aci1d), 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid, TFA), 펜타플루오로프로피온산(pentafluoropropionic acid, PFPA), 헵타플루오로부티르산(heptaflurobutyric acid, HFBA), 노나플루오로펜타논산(nonafluoro pentanoic acid, NFPA), 트리데카플루오로헵타논산(tridecafluoroheptanoic acid, TDFHA), 펜타데카플루오로옥타논산(pentadecafluorooctaonoic acid, PDFOA)으로부터 선택된 1종 이상의 휘발성 산인 것을 특징으로 하는데 이는 이외의 산은 감압 농축 등의 제조 과정 중 제거가 어려워, 제조가 완료된 원료 내에 불순물의 형태로 남으며, 중화 과정을 통해 이를 중화할 경우, 화장품 제형 중 유액과 겔 제형의 안정성에 심대한 영향을 미치는 염의 농도가 증가하는 단점이 있다.

또한, 본 발명의 갈파래과 해조류 다당체 분해물 제조방법에 있어서, 상기 갈파래과 해조류 함유 고분자 다당체를 분산하여 산분해 하는 휘발성산 용액의 농도가 1 내지 6N 인 것을 특징으로 하는데, 1N 이하에서 반응을 진행하는 경우, 분해 반응 속도와 다당체의 분해율이 낮아 제조된 갈파래과 해조류 다당체 분해물의 글루쿠론산 함량의 저하 및 분해 공정 소요 시간 증가로 인한 공정비용 증가를 일으킬 수 있으며, 6N 이상인 경우 반응 속도가 너무 빨라 원하는 산물을 얻기 위한 반응 속도의 조절이 힘들고, 탈수 축합반응 등의 불순물 생성 가능성이 있어 본 발명에서 요구하는 글루쿠론산을 1.0% 이상 함유하는 갈파래과 해조류 다당체 분해물의 생성이 어려우며, 경제성이 낮아지는 단점을 가지고 있다.

또한, 본 발명의 갈파래과 해조류 다당체 분해물 제조방법에 있어서, 상기 갈파래과 해조류 함유 고분자 다당체를 분산하여 산분해 하는 온도 조건이 80 내지 125℃ 인 것을 특징으로 하는데, 80℃ 미만에서는 분해 반응 속도와 다당체의 분해율이 낮아 제조된 갈파래과 해조류 다당체 분해물의 글루쿠론산 함량의 저하 및 분해 공정 소요 시간 증가로 인한 공정비용 증가를 일으킬 수 있으며, 125℃를 초과하는 온도는 가압 공정으로 추가적인 설비 사용으로 인한 공정 비용 증가와, 휘발 성 산의 휘발로 인한 원료 손실, 환경적 오염 요인 제거를 위한 비용 등이 발생하는 등 본 발명에서 요구하는 글루쿠론산을 1.0% 이상 함유하는 갈파래과 해조류 다당체 분해물의 생성이 어려우며, 경제성이 낮아진다.

또한, 본 발명의 갈파래과 해조류 다당체 분해물 제조방법에 있어서, 상기 갈파래과 해조류 함유 고분자 다당체를 분산하여 산분해 한 후 휘발성 산과 불순물을 제거하는 공정에서 산분해물을 감압농축하여 제조된 건고물을 5% 농도로 정제수에 용해하였을 때 pH 3.0 이상을 나타낼 수 있도록 휘발성산을 제거하는 것을 특징으로 하는데, 산분해물을 감압농축하여 제조된 건고물을 5% 농도로 정제수에 용해하였을 때 pH 3.0 이하인 경우, 원료 내에 휘발성 산이 다수 존재하여, 원료를 화장품에 적용하였을 때 화장품의 성상을 파괴할 뿐만 아니라, 특이취를 유발하여 화장품 원료로서 적합하지 않은 상태가 되며, 이를 추가적인 염기성분을 첨가하여 중화할 경우, 역시 화장품 제형 중 유액과 겔 제형의 안정성에 심대한 영향을 미치는 염의 농도가 증가하는 단점이 있다.

또한, 본 발명의 갈파래과 해조류 다당체 분해물 제조방법 중 2단계 갈파래과 해조류 함유 고분자 다당체를 선별적으로 회수하는 공정에 사용된 에틸알코올은 갈파래과 해조류 수용성 추출액 중량 대비 50중량% 내지 500중량%의 범위로 첨가하여 갈파래과 해조류 함유 고분자 다당체를 회수하는 것을 특징으로 하는 데, 에틸알코올의 첨가량이 반응액 중량 대비 50중량% 미만인 경우, 갈파래과 해조류 함유 고분자 다당체를 효율적으로 침전시키기 어려워, 갈파래과 해조류 함유 고분자 다당체를 선별적으로 분리하기 힘든 단점이 있으며, 반응액 중량 대비 500중량%를 초과하는 에틸알코올을 첨가할 경우, 반응용기의 크기가 너무 크고 반응액 량이 너무 많아, 공정 비용이 과다할 뿐만 아니라, 과량의 에틸알코올을 사용하여 경제적이지 못한 단점이 있다.

또한, 본 발명의 갈파래과 해조류 다당체 분해물 제조방법에 있어서, 제조된 갈파래과 해조류 함유 고분자 다당체 분해물에 함유되어 있는 글루쿠론산의 함량이 1.0% 이상인 것을 특징으로 하는 데, 글루쿠론산 함량이 중량 대비 1.0% 미만인 경우, 본 발명이 목적으로 하는 주름개선 기능성 화장품 활성 성분으로 활용하기 위해 함량이 낮은 단점이 있다.

또한, 본 발명은 갈파래과 해조류 다당체 분해물 제조방법을 통해 제조된 갈파래과 해조류 분해물의 함량이 화장료 조성물 전체에 대해서 동결건조중량 기준 0.001-30.0중량%인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다. 상기 추출물의 함량이 0.001중량% 미만인 경우에는 피부개선 효과가 거의 없으며, 30.0중량% 이상인 경우에는 함유량 증가에 대한 효과 증대 정도가 미미하여 경제적이지 못하다.

본 발명은 글루쿠론산 함량 1.0 중량% 이상인 갈파래과 해조류 분해물 제조 방법으로 제조된 갈파래과 해조류 분해물에 관한 것이다. 본 발명에 의한 갈파래과 해조류 분해물은 추출시간 등에 따라 통상 글루쿠론산 함량이 1.0~40중량% 범위 내이며, 최대값은 50 중량%를 넘지 않을 것으로 예측된다.

본 발명은 글루쿠론산 함량이 높은 갈파래과 해조류 분해물 제조 방법으로 제조된 갈파래과 해조류 분해물을 주요 활성성분으로 함유하는 광노화 방지 효능을 나타내는 화장료 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 글루쿠론산 함량이 높은 갈파래과 해조류 분해물 제조 방법으로 제조된 갈파래과 해조류 분해물을 주요 활성성분으로 함유하는 피부 주름개선 효과를 지니는 화장료 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 글루쿠론산 함량이 높은 갈파래과 해조류 분해물 제조 방법으로 제조된 갈파래과 해조류 분해물을 주요 활성성분으로 함유하는 피부 탄력개선 효과를 지니는 화장료 조성물에 관한 것이다

또한, 본 발명은 상기 화장료 조성물이 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 수중유(O/W)형 및 유중수(W/O)형의 제형 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 글루쿠론산을 1.0% 이상 함유하는 갈파래과 해조류 분해물을 주요 활성성분으로 함유하는 항노화 기능성 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 MMP-1 생합성 저해효과와 타입 1 프로콜라겐의 생합성 촉진 효과에 의한 피부 탄력 및 잔주름 개선효과를 나타낸다.

또한, 본 발명의 조성물은 자외선 등에 의해 촉진되는 피부세포의 광노화 손상을 억제하는 효과를 나타낸다.

MMP-1 생합성 저해효과와 타입 1 프로콜라겐의 생합성 촉진 효과에 의한 피부 탄력 및 잔주름 개선효과, 자외선 등에 의해 촉진되는 광노화 억제 효과를 실험한 결과 바람직한 결과를 얻고, 항노화 기능성 화장료 조성물로서의 효능을 확인 하였다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 좀 더 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명의 예시적인 기재일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.

실시예 1: 구멍갈파래 열수 추출물 제조

세절하여 음건한 구멍갈파래를 정제수에 5중량%로 분산한 후, 밀폐된 용기로 옮겨, 교반하면서 80℃로 3시간 추출한 후, 와트만(Whatman) #5 여과지로 여과하였다. 여과된 추출물은 50℃ 이하에서 감압농축 및 동결건조시켜 분말상의 열수 추출물을 제조하였다.

실시예 2: 구멍갈파래 열수 추출물 분해물 제조

실시예 1에서 수득한 구멍갈파래 열수 추출물 10g을 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid, TFA) 2N 용액 1 리터에 분산한 후, 밀폐된 용기에서 100℃ 반응온도를 유지하며 2시간 동안 산 분해를 진행하였다. 여과한 분해물을 50℃ 이하에서 감압농축하고 이를 다시 정제수에 용해하여 감압농축하는 과정을 3회 반복하여 휘발성 산과 용매를 제거하였다. 제조된 산분해물의 건고물을 정제수에 5% 농도로 용해하였을 때 pH 3.2를 나타내었으며, 제조된 구멍갈파래 열수 추출물 분해물은 2.4g이었다.

실시예 3: 구멍갈파래 고분자 다당체 제조

세절하여 음건한 구멍갈파래를 정제수에 5중량%로 분산한 후, 밀폐된 용기로 옮겨, 교반하면서 80℃ 3시간 추출한 후, 와트만(Whatman) #5 여과지로 여과하였다. 여과된 추출액 중량과 동일한 양의 에틸알코올을 첨가 교반한 후, 4℃ 저온 보관조에 정치, 원심분리 여과 등을 거쳐 고분자 다당체 및 단백질을 침전시킨 후, 여과 및 원심분리를 통해 침전을 회수하여 구멍갈파래 열수 추출물 함유 고분자 다당체를 선별적으로 회수하였다. 회수된 다당체는 정제수에 재용해하여 50℃ 이하에서 감압농축 및 동결건조시켜 분말상의 고분자 다당체를 제조하였다.

실시예 4: 구멍갈파래 고분자 다당체 분해물 제조

실시예 3에서 수득한 구멍갈파래 고분자 다당체 10g을 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid, TFA) 2N 용액 1 리터에 분산한 후, 밀폐된 용기에서 100℃ 반응온도를 유지하며 2시간 동안 산 분해를 진행하였다. 여과한 분해물을 50℃ 이하에서 감압농축하고 이를 다시 정제수에 용해하여 감압농축하는 과정을 3회 반복하여 휘발성 산과 용매를 제거하였다. 제조된 산분해물의 건고물을 정제수에 5% 농도로 용해하였을 때 pH 3.2를 나타내었으며, 제조된 구멍갈파래 열수 추출물 분해물은 3.6g이었다.

실험예 1: 시료의 세포독성

실시예 1 내지 실시예 4에서 수득한 구멍갈파래 분해물 또는 추출물 시료의 피부세포에 대한 세포독성을 평가하였다.

섬유아세포(fibroblast)를 24-웰 시험 플레이트에 1x10⁵개씩 넣고 24시간 동안 부착시켰다. 각 웰을 PBS(Phosphate buffered saline)로 1회 세척하고 각 웰에 세포배양 배지(DMEM에10% FBS가 첨가된 것) 1㎖와 적절한 농도로 희석한 실시예 1 내지 실시예 4에서 수득한 시료를 각각 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 24시간이 지나면 배지를 제거하고, 각 웰 당 세포배양 배지 500㎕ 배지와 MTT{3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide} 용액(2.5㎎/㎖) 60㎕를 넣은 후 2시간 동안 37℃ CO₂ 배양기에서 배양하였다. 배지를 제거하고 이소프로판올-HCl(0.04N)을 500㎕씩 넣어주었다. 5분간 진탕하여 세포를 용해시키고 상등액 100㎕씩을 96-웰 시험 플레이트에 옮긴 후, 마이크로플레이트 판독기에서 565㎚ 흡광도를 측정하였다. 수학식 1에 의해 세포생존율(%)을 정하였으며, 세포의 생존에 영향을 미치지 않는 시료의 농도를 결정하였다.

Bo : 세포배양배지만을 발색 반응한 웰의 565 ㎚ 흡광값

Bt : 시료를 처리하지 않고 발색 반응한 웰의 565 ㎚ 흡광값

St : 시료를 처리하고 발색 반응한 웰의 565 ㎚ 흡광값

표 1에서 확인할 수 있듯이 각 시료의 피부 섬유아세포의 100% 생존 처리농도는 실시예 1의 구멍갈파래 열수 추출물이 1.0%, 실시예 2의 구멍갈파래 열수 추출물 산분해물이 0.1%로 산분해 과정을 통해 약간의 세포 독성이 상승하는 효과를 확인할 수 있었다. 하지만 이는 일반적으로 화장품에 사용되는 농도를 고려하였을 때 피부 자극 유발 가능성이 작은 안전한 시료인 것을 말해준다. 또한, 구멍갈파래 고분자 다당체만을 분리한 실시예 3과 다당체를 산분해한 시료 실시예 4는 각각 열수 추출물인 실시예 1과 열수 추출물의 산분해물인 실시예 2에 비해 적은 세포 독성을 가지는 것으로 확인되었다. 따라서, 구멍갈파래 열수 추출물 및 이로부터 분리한 다당체 또한 이들을 산분해한 산분해물을 제조할 경우, 세포독성이 상대적으로 낮아 화장품에 사용되는 농도를 고려하였을 때 피부 자극 유발 가능성이 작고 안전한 것으로 확인되었다.

시료명	100% 세포 생존 농도
실시예 1의 구멍갈파래 열수 추출물	1.0%
실시예 2의 구멍갈파래 열수 추출물 분해물	0.1%
실시예 3의 구멍갈파래 고분자 다당체	2.5%
실시예 4의 구멍갈파래 고분자 다당체 분해물	0.5%

실험예 2: NBT 법을 이용한 항산화 효과 측정 실험

실시예 1 내지 4에서 수득한 구멍갈파래 분해물 및 추출물 시료의 항산화 효과를 확인하기 위해 실험실 조건에서 항산화제로 잘 알려진 BHT(Butylated hydroxytoluene)를 비교예로 하고 NBT(Nitro Blue Tetrazolium)법을 이용하여 항산화 활성을 측정하였다.

항산화 효과를 측정하기 위해서 잔틴과 잔틴옥시다제에 의해 생성되는 활성산소를 NBT법에 의해 측정하고 피검물질이 활성산소를 제거하는 효과, 즉 활성산소 소거효과를 평가한다. 잔틴과 잔틴옥시다제에 의해 활성산소를 생성시킨다. 이 활성산소가 니트로블루테트라졸리움(Nitro Blue Tetrazolium;NBT)과 반응하여 이것에 의해 생성되는 청색을 파장 560nm에서 측정하는 것으로 활성산소 소거율을 측정한다.

측정방법으로서 0.05M Na2CO3(2.4ml), 3mM 잔틴 용액(0.1ml), 3mM EDTA 용액(0.1ml), BSA 용액(0.1ml), 0.72mM NBT 용액(0.1ml)를 가하고 여기에 시료용액 0.1ml을 첨가하고 25℃에서 10분간 방치한다. 잔틴 옥시다제 용액(0.1ml)을 가하여 빨리 교반하고 25℃에서 20분간의 배양을 개시한다. 그 후 6mM CuCl₂ 용액(0.1ml)을 가하여 반응을 정지시키고 560nm에서의 흡광도 St를 측정한다. 공시험은 시료용액 대신에 증류수를 사용한 것을 상기와 똑같이 조작해 흡광도 Bt를 측정한다. 역시, 시료용액의 블랭크(Blank)는 6 대신에 증류수를 사용해 똑같이 조작하여 흡광도 Bo를 측정한다.

억제율은 수학식 2에 의하여 산출하였으며, 그 결과는 표 2에 나타내었다.

St : 시료용액의 효소 반응 후 560nm 흡광도

Bt : 공시험용액의 효소 반응 후 560nm 흡광도

So : 시료용액의 효소 무첨가시 반응전 560nm 흡광도

Bo : 공시험용액의 효소 무첨가시 반응전 560nm 흡광도

표 2에서 확인할 수 있듯이 모든 시료가 BHT에 비해 상대적으로 낮은 항산화 활성을 나타내었으나, 구멍갈파래 열수 추출물 및 다당체의 산분해 과정을 통해 항산화능이 상대적으로 증가하였음을 확인하였다. 특히 실시예 3의 구멍갈파래 고분자 다당체를 산분해한 실시예 4의 시료는 0.2중량% 처리시 약 76.1% 항산화능을 나타내어 본 발명의 갈파래과 해조류 다당체 분해물 제조과정을 통해 구멍갈파래 추출물의 항산화능이 현저히 개선되었음을 알 수 있다.

시료명	함 량	항산화 효과(%)
실시예 1의 구멍갈파래 열수 추출물	0.5중량%	41.3%
실시예 2의 구멍갈파래 열수 추출물 분해물	0.5중량%	66.4%
실시예 3의 구멍갈파래 고분자 다당체	0.5중량%	32.1%
실시예 4의 구멍갈파래 고분자 다당체 분해물	0.2중량%	76.1%
BHT	0.1중량%	89.3%

실험예 3: 자유라디칼 소거활성 측정 실험

실시예 1 내지 4에서 수득한 구멍갈파래 분해물 및 추출물 시료의 자유라디칼 소거활성을 측정하기 위해 실험실 조건에서 BHT와 같은 항산화제를 비교샘플로 하고 DPPH법을 이용하여 자유라디칼 소거활성을 측정하였다.

DPPH법은 DPPH(2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl free radical)라는 유리기를 사용하여 환원력에 의한 자유라디칼 소거활성을 측정하는 방법이다. 피검물질에 의해 DPPH가 환원되어 흡광도가 감소하는 정도를 공시험액의 흡광도와 비교하여 파장 560nm에서 자유라디칼 소거율을 측정한다.

시료를 96웰 플레이트에 각각 넣고, 여기에 100uM 메탄올용액으로 제조된 DPPH를 첨가하여 용액의 총 부피가 200㎕가 되도록 하였다. 이것을 37℃에서 30분간 방치한 후 560nm에서 흡광도를 측정하였다. 자유라디칼 소거활성(%)은 다음의 수학식 3으로 산출하였다.

A: 시료를 처리하지 않은 대조군 웰의 흡광도

B: 시료를 처리한 실험군 웰의 흡광도

표 3에서 확인할 수 있듯이 네 개의 시료 모두 BHT보다 상대적으로 낮은 자유라디칼 소거활성을 나타내었으나, 구멍갈파래 열수 추출물 및 다당체의 산분해 과정을 통해 자유라디칼 소거활성이 상대적으로 증가하였음을 확인하였다. 특히 실시예 3의 구멍갈파래 고분자 다당체를 산분해한 실시예 4의 시료는 0.2중량% 처리시 약 93.4%의 자유라디칼 소거활성을 나타내어 본 발명의 갈파래과 해조류 다당체 분해물 제조과정을 통해 구멍갈파래 추출물의 자유라디칼 소거활성이 현저히 개선되었음을 알 수 있다.

시료명	함 량	항산화 효과(%)
실시예 1의 구멍갈파래 열수 추출물	0.5중량%	9.9%
실시예 2의 구멍갈파래 열수 추출물 분해물	0.5중량%	59.1%
실시예 3의 구멍갈파래 고분자 다당체	0.2중량%	10.7%
실시예 4의 구멍갈파래 고분자 다당체 분해물	0.2중량%	93.4%
BHT	0.1중량%	81.0%

실험예 4: 자외선 조사 후 구멍갈파래 분해물에 의한 MMP -1 발현억제 평가

실시예 1 내지 4에서 수득한 구멍갈파래 분해물 및 추출물 시료의 UV 조사 및 시료 첨가 후 피부세포에서 발현되는 MMP-1 농도를 측정하기 위해서 효소면역 시험법(ELISA)을 실시하였다.

UV 챔버를 이용하여 인간 진피 섬유아세포에 UVA를 6.3J/㎠의 에너지로 조사하였다. 자외선 조사량과 배양시간은 예비실험을 통하여 섬유아세포에서 MMP 발현량이 최대가 되는 조건을 확립하였다. 음성 대조군은 은박지로 싸서 UVA 환경에 같은 시간을 유지시켰다. UVA 방출량은 UV 라디오미터를 이용하여 측정하였다. UVA가 조사되는 동안의 세포는 이전에 분주된 배지 그대로이고 UVA를 조사한 후 샘플이 들어간 배지로 교환하여 24시간 배양 후 배지를 회수하여 96웰에 코팅하였다. 일차항체(MMP-1 (Ab-5) 단일클론항체)를 처리하고 37℃에서 60분간 반응시켰다. 이차항체인 안티마우스 IgG(whole mouse, alkaline phosphatase conjugated)를 다시 60분 정도 반응시킨 후, 알칼린 포스파타제 기질용액(1㎎/㎖ ρ-나이트로페닐인산 in 다이에탄올아민 완충용액)을 상온에서 30분간 반응시키고 마이크로플레이트 판독기로 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 시료를 첨가하지 않은 것을 사용하였다.

결과는 표 4에 나타냈으며, 자외선 조사시 발현이 유도되는 MMP-1에 대하여 시료를 처리하지 않은 대조군에 비하여 실시예 2의 구멍갈파래 열수추출물 분해물과 실시예 4의 구멍갈파래 고분자 다당체 분해물은 0.01중량% 이상의 농도에서 39% 이상의 MMP-1 발현을 억제하는 것으로 나타났다. 특히 실시예 4의 구멍갈파래 고분자 다당체 분해물은 0.005중량% 농도에서 47% 이상의 억제율을 나타내 대조군으로 사용한 레티놀의 억제율과 유사한 결과를 나타내었다. 하지만, 실시예 1 및 실시예 3의 구멍갈파래 열수 추출물과 이로 부터 분리한 고분자 다당체는 상대적으로 낮은 MMP-1 발현 저해 활성을 나타내었다.

즉 본 발명의 갈파래과 해조류 다당체 분해물 제조과정을 통해 구멍갈파래 추출물의 자외선 조사에 의한 피부 세포 MMP-1 발현에 대한 저해활성이 현저히 개선되었음을 알 수 있다.

시료명	함 량	MMP-1 발현억제율
실시예 1의 구멍갈파래 열수 추출물	0.01중량%	12.3%
실시예 2의 구멍갈파래 열수 추출물 분해물	0.01중량%	39.1%
실시예 3의 구멍갈파래 고분자 다당체	0.01중량%	15.7%
실시예 4의 구멍갈파래 고분자 다당체 분해물	0.005중량%	47.4%
레티놀	0.005중량%	38.0%

실험예 5: 타입 1 프로콜라겐 생합성 촉진 효과

실시예 1 내지 4에서 수득한 구멍갈파래 분해물 및 추출물 시료를 피부세포 배양액에 각각 첨가한 후 피부 기질 성분인 타입 1 프로콜라겐의 생합성을 촉진시키는 효과를 알아보기 위하여 프로콜라겐 분석(procollagen assay)을 아래와 같은 방법으로 실시하였다.

신생아의 포피조직에서 분리한 사람진피섬유아세포(human dermal fibroblast)는 Modern Tissue Technology(MTT, Korea)로부터 분양받아 DMEM/F-12(3:1)배지에 10% 우태아혈청(FBS)을 첨가하여 1×10⁴cell/cm² 농도로 배양하였다. 70~80% 정도 자라면 1:3의 비율로 분주하여 계대 배양하였고, 3~4차 계대배양된 세포를 실험에 이용하였다. 프로콜라겐의 양을 측정하는 실험을 위해서 섬유아세포를 48 웰 플레이트(well plate)에 90% 이상 배양한 후 각각의 시료를 적절한 농도로 가하고, 24시간 후에 배지 중에 유리된 프로콜라겐의 양을 프로콜라겐타입-1C-펩타이드 EIA 키트(procollagen type-1 C-peptide EIA kit)(MK101,Takara, Japan)를 사용하여 측정하였다.

표 5와 같이, 실시예 1의 실시예 2의 구멍갈파래 열수추출물 분해물과 실시예 4의 구멍갈파래 고분자 다당체 분해물은 0.001중량%의 농도에서 프로콜라겐 생합성 촉진 효과를 보였다. 특히 실시예 4의 구멍갈파래 고분자 다당체 분해물은 0.001중량%의 농도에서 30% 정도의 프로콜라겐의 생합성 촉진 효과를 나타내어 양성대조군으로 사용한 세포신호전달 물질인 TGF-β에 비해 낮지만, 매우 우수한 활성을 나타내었다.

시료명	함 량	MMP-1 발현억제율
실시예 1의 구멍갈파래 열수 추출물	0.001중량%	-
실시예 2의 구멍갈파래 열수 추출물 분해물	0.001중량%	19.3%
실시예 3의 구멍갈파래 고분자 다당체	0.001중량%	-
실시예 4의 구멍갈파래 고분자 다당체 분해물	0.001중량%	29.6%
TGF-β	0.001중량%	33.4%

실험예 6: 피부 각질세포 활성화 효과 확인 실험

실시예 1 내지 4에서 수득한 구멍갈파래 분해물 및 추출물 시료 처리에 의한 피부세포 활성화 효과를 평가하였다.

인체 각질형성 세포주인 HaCaT 세포를 1x10⁴ /well 농도로 96 웰 플레이트에 100 ㎕씩 분주한 후 24시간 배양한 다음 각각의 시료를 무혈청 배지에 다양한 농도로 희석하여 처리한 후 48시간 배양하였다. 배지를 제거하고, 각 웰당 세포배양 배지 500 ㎕와 MTT {3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide} 용액 (2.5 ㎎/㎖) 60 ㎕를 넣은 후 2시간 동안 37 ℃ CO₂ 배양기에서 배양하였다. 배지를 제거하고 이소프로판올-HCl (0.04 N)을 500 ㎕씩 넣어주었다. 5분간 진탕하여 세포를 용해시키고 상등액 100 ㎕씩을 96-웰 시험 플레이트에 옮긴 후, 마이크로플레이트 판독기에서 565㎚ 흡광도를 측정하였으며, 수학식 1에 의해 세포생존율 (%)을 결정하였다.

시료명	0.05%처리시 생존율	0.1%처리시 생존율	0.5%처리시 생존율
대조군	100	100	100
실시예 1의 구멍갈파래 열수 추출물	99.8	106.8	110.7
실시예 2의 구멍갈파래 열수 추출물 분해물	102.4	103.8	110.2
실시예 3의 구멍갈파래 고분자 다당체	103.3	120.6	125.8
실시예 4의 구멍갈파래 고분자 다당체 분해물	111.1	126.7	145.9

표 6에서 확인할 수 있듯이, 대조군의 세포 생존율을 100%로 하였을 때 네 가지 시료 모두 0.05 내지 0.5% 처리농도 범위에서 농도의존적으로 증가하는 양상의 피부세포 활성화 효과를 나타내었다. 특히, 고분자 다당체를 분리한 실시예 3 및 이를 분해한 실시예 4의 경우, 0.5% 처리시 25% 이상의 피부 세포 성장 촉진 효과를 가지는 것으로 나타났으며, 고분자 다당체의 분해물인 실시예 4의 경우, 0.5%처리 시 45% 이상의 피부 세포 생존율을 나타내어 매우 우수한 피부 세포활성화 효과를 나타내었다.

위의 결과로부터 본 발명에 의한 갈파래 고분자 다당체 분해물이 안전성이 높으면서도 피부 세포 및 피부를 활성화시켜, 항노화 효과 등을 나타낼 수 있는 우수한 소재라는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 7: 자외선 조사에 의한 피부세포 광손상 방어효과 확인 실험

실시예 1 내지 4에서 수득한 구멍갈파래 분해물 및 추출물이 자외선 조사에 의한 피부세포 광독성 및 이로 인한 세포생존율에 미치는 영향을 평가하였다.

피부각질세포 (keratinocyte)를 24-웰 시험 플레이트에 1x10⁵개씩 넣고 24시간 동안 부착시켰다. 각 웰을 PBS (Phosphate buffered saline)로 1회 세척하고 각 웰에 500 ㎕의 PBS를 넣었다. 이 각질세포에 자외선 B (UVB) 램프 (Model : F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki사, Japan)를 이용하여 자외선 10 mJ/㎠를 조사한 후 PBS를 덜어내고 세포배양 배지 (DMEM에 10% FBS가 첨가된 것) 1 ㎖을 첨가하였다. 여기에 시료를 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 24시간이 지나면 배지를 제거하고, 각 웰 당 세포배양 배지 500 ㎕와 MTT {3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide} 용액 (2.5 ㎎/㎖) 60 ㎕를 넣은 후 2시간 동안 37 ℃ CO₂ 배양기에서 배양하였다. 배지를 제거하고 이소프로판올-HCl (0.04 N)을 500 ㎕씩 넣어주었다. 5분간 진탕하여 세포를 용해시키고 상등액 100㎕씩을 96-웰 시험 플레이트에 옮긴 후, 마이크로플레이트 판독기에서 565 ㎚ 흡광도를 측정하였으며, 수학식 2에 의해 세포생존율(%)을 측정하였다.

시료명	0.1% 처리시 대조군 대비 생존율	0.5% 처리시 대조군 대비 생존율	1.0% 처리시 대조군 대비 생존율
자외선 단독 처리군	49.2%
실시예 1의 구멍갈파래 열수 추출물	50.1	49.5	54.3
실시예 2의 구멍갈파래 열수 추출물 분해물	50.6	44.6	32.5
실시예 3의 구멍갈파래 고분자 다당체	49.8	54.7	70.9
실시예 4의 구멍갈파래 고분자 다당체 분해물	51.3	66.6	82.7

우선 자외선만을 조사한 세포의 경우 자외선을 조사하지 않은 세포에 비해 생존율이 49.2%로 감소하는 것으로 나타났다. 표 7에서 확인할 수 있듯이, 실시예 1의 구멍갈파래 열수 추출물의 경우, 0.1 내지 1.0% 처리농도 범위에서 농도의존적이거나 유의한 수준의 세포 생존율 증가 또는 감소 효과를 나타내지 않았다. 또한, 실시예 2의 구멍갈파래 열수 추출물 분해물은 동일농도 범위에서 자외선에 의한 피부세포 광손상 방어효과를 나타내지 않았으며, 1.0% 농도로 처리시 오히려 세포 생존율이 32.5%로 대조군에 비해 저하되는 결과를 확인하였다.

이에 반해, 실시예 3의 구멍갈파래 고분자 다당체 및 실시예 4의 구멍갈파래 고분자 다당체 분해물은 모두 0.1 내지 1.0% 처리농도 범위에서 대조군에 비해 세포 생존율이 증가하며 농도 의존적으로 세포 생존율이 증가하는 양상의 자외선에 의한 세포 손상 방어효과를 나타내었다. 특히 실시예 4의 고분자 다당체 분해물은 1.0% 처리시 세포 생존율이 82.7%까지 회복되어 자외선에 의한 피부세포의 사멸을 방어하는 피부세포 자외선 광손상 방어효과가 우수함을 알 수 있었다. 본 발명의 갈파래과 해조류 다당체 분해물 제조과정을 통해 제조된 구멍갈파래 다당체 분해물이 안전성이 높으면서도 피부세포의 자외선에 의한 광손상을 방어하여 피부의 광노화를 지연시킬 수 있는 노화 방지 기능을 나타내는 우수한 소재라는 것을 확인하였다.

실험예 8: 글루쿠론산 함량 확인 실험

본 실험예는 실시예 1 내지 4에서 수득한 구멍갈파래 분해물 및 추출물에 함유되어 있는 글루쿠론산의 함량을 확인하기 위한 것이다. 각각의 시료 1.0g을 정밀하게 달아 정제수를 넣어 100 ㎖가 되게 하고 30℃에서 초음파 분쇄기를 이용하여 20분간 처리한 후 0.45 ㎛ 필터로 여과하였다. 여액 10 ㎖를 취하여 정제수를 넣어 100 ㎖가 되게 희석하여 검액으로 하였다. 따로 글루쿠론산 표준 시약(C₆H₁₀O₇ ; 194.1) 100 ㎎을 검액과 동일한 방법으로 처리하여 표준액으로 하였다. 검액 및 표준액 25 ㎕를 각각 정확히 취해 안지름 약 4mm, 길이 약 250mm인 Peek 재질에 5 ㎛ 의 펠리큘라형 음이온 교환 수지를 충전한 컬럼에 주사하여, 30 mM 수산화나트륨 용액을 이동상으로 하며, 헬륨 25 psi를 이동상 가스로 가해, 유속 1.0 ml/min의 속도로 전개하여 전기화학 검출기(전도도 검출기) 검출하여 글루쿠론산을 확인하였으며, 액체크로마토그래피법에 따라 시험하여 수학식 4를 이용하여 글루쿠론산의 피크면적 A_T와A_S를 측정하였다.

A_T : 검체의 글루쿠론산 피크 면적

A_S : 표준품의 글루쿠론산 피크 면적

그 결과, 표 8에서 확인할 수 있듯이 본 발명의 갈파래과 해조류 분해물 제조 방법을 통해 제조된 실시예 4의 구멍갈파래 고분자 다당체 분해물은 15.1%의 글루쿠론산 함량을 나타내었으며, 이외의 시료들은 모두 검출기기의 검출한도 이하의 함량을 나타내거나, 1.0% 미만의 글루쿠론산 함량을 나타내었다.

시료명	글루쿠론산의 함량(%)
실시예 1의 구멍갈파래 열수 추출물	불검출
실시예 2의 구멍갈파래 열수 추출물 분해물	0.12%
실시예 3의 구멍갈파래 고분자 다당체	불검출
실시예 4의 구멍갈파래 고분자 다당체 분해물	15.1%

실험예 9: 피부 탄력 개선 및 주름 개선 효과 시험

실시예 4에서 수득한 구멍갈파래 고분자 다당체 분해물을 함유한 화장료를 제조하여 사람을 대상으로 피부 탄력 개선 효과 및 주름 개선 효과를 비교예 1과 비교실험을 행하여 평가하였다.

비교실험에 사용된 화장료는 크림형태이고, 그 조성은 표 9에 나타낸 바와 같다. 우선 표 9에 기록되어 있는 나)상을 가열하여 70℃에 보존하였다. 이것에 가)상을 가하여 예비유화 후 호모믹서로 균일하게 유화하고 다음에 서서히 냉각하여 크림(실시예 5, 비교예 1)을 제조한다. 실험자(20세-35세의 여성) 15명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 실시예 13에서 제조된 크림을, 얼굴 왼쪽 부위에는 비교예 1에서 제조된 크림을 각각 1일 2회씩 연속 2개월간 도포하였다. 실험 완료 후 피부 탄력 개선 효과는 제품 사용 전과 2개월간 사용 후에 피부탄력측정기(cutometer SEM 575, C+K Electronic Co., Germany)를 이용하여 측정하였다. 실험결과는 하기 표 9에 Cutometer SEM 575의 △R7값으로 기재하였는데 R7값은 피부의 점탄성(viscoelasticity) 성질을 나타낸다.

표 10과 같이 실시예 4의 구멍갈파래 고분자 다당체 분해물을 함유한 크림은 피부 탄력개선 효과가 우수함을 알 수 있다.

구 분		실시예 5	비교예 1
가	스테아릴 알콜	7.5	7.5
	스테아린산	2	2
	스테아린산 콜레스테롤	2.5	2.5
	스쿠알란	5	5
	2-옥틸도데실알콜	5	5
	폴리옥시에틸렌(25몰부가)알콜에스테르	3	3
	글리세릴모노스테아린산아스테르	2	2
나	실시예 4의 구멍갈파래 고분자 다당체 분해물	0.5	-
	프로필렌글리콜	5	5
	방부제	적량	적량
	정제수	잔량	잔량

주)단위: 중량%

실험제품	피부탄력효과(△R7)
실시예 5( 실시예 4 구멍갈파래 고분자 다당체 분해물 함유)	0.36
비교예 1	0.14

n=20, p＜0.05

실험자(20세~35세의 여성) 15명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 실시예 5에서 제조된 크림을 얼굴 왼쪽 부위에는 비교예 1에서 제조된 크림을 각각 1일 2회씩 연속 2개월간 도포하였다. 실험 완료 후 피부 주름 개선 효과는 제품 사용 전과 2개월간 사용 후에 피부의 주름개선효과를 알아보기 위하여 실리콘 재질의 모사판(replica)을 제작하여 지정 부위의 주름의 상태를 화상분석기인 비지오미터(visiometer: SV60, C+K Electronic Co., Germany)로 측정하였다. 그 결과를 표 8에 나타내었으며, 이 결과는 2개월 후의 각각의 파라미터 값에서 2개월 전 파라미터 값을 뺀 것의 평균을 나타낸 것이다. 즉, 이 값이 음수로 나올수록 주름 개선 효과가 높다는 것을 의미한다. 표 10과 같이, 실시예 4의 구멍갈파래 고분자 다당체 분해물을 함유한 실시예 5의 크림은 피부 주름을 현저히 개선시켰음을 확인할 수 있었다.

실험제품	R1	R2	R3
실시예 5	-0.30	-0.24	-0.12
비교예 1	-0.11	-0.12	-0.04

R1: 주름 등고선의 최고치와 최저치의 차이값

R2: 주름 등고선을 임의로 5칸씩 나눈 후 그 중 R1값들의 평균

R3: 5개씩 나눈 R1값 중 최고치

이하에 그 외의 실시예를 나타내었다. 즉, 실시예 4에서 수득한 구멍갈파래 고분자 다당체 분해물을 함유한 화장수, 유액 및 미용액을 실시예 6 내지 8에서 제조하였다. 이들 구멍갈파래 고분자 다당체 분해물을 함유한 화장수, 유액 및 미용액은 활성산소 소거효과,피부 탄력 개선 효과 및 주름 개선 효과 등 피부개선에 우수한 효과를 나타내었다.

실시예 6: 구멍갈파래 분해물을 함유한 화장수 제조

95% 에탄올 8g에 폴리피로리돈 0.05g, 올레일알콜 0.1g, 폴리옥시에틸렌모노올레이트 0.2g, 향료 0.2g, 파라옥시안식향산메틸에스테르 0.1g, 소량의 산화방지제, 소량의 색소를 혼합, 용해하였다. 실시예 4에서 수득한 구멍갈파래 고분자 다당체 분해물 0.05g, 글리세린 5g을 정제수 85.33g에 용해한 것에 상기 혼합액을 첨가한 후 교반하여 피부개선효과가 있는 화장수를 얻었다.

실시예 7: 구멍갈파래 분해물을 함유한 유액 제조

세틸알콜 1.2g, 스쿠알란 10g, 바세린 2g, 파라옥시안식향산에틸에스테르 0.2g, 글리세린모노에스테아레이드 1g, 폴리옥시에틸렌(20몰 부가)모노올레이트 1g 및 향료 0.1g을 70℃에서 가열, 혼합, 용해하고, 실시예 4에서 수득한 구멍갈파래 고분자 다당체 분해물 0.5g, 디프로필렌글리콜 5g, 폴리에틸렌글리콜-1500 2g, 트리에탄올아민 0.2g, 정제수 76.2g을 75℃로 가열해서 용해하였다. 양자를 혼합하여 유화시킨 후 냉각하여 수중유(O/W)형의 피부개선효과가 있는 유액을 얻었다.

실시예 8: 구멍갈파래 분해물을 함유한 미용액 제조

95% 에틸알콜 5g에 폴리옥시에틸렌솔비탄모노올레이트 1.2g, 키툴로오즈 0.3g, 히아루론산나트륨 0.2g, 비타민 E-아세테이트 0.2g, 감초산 나트륨 0.2g, 파라옥시안식향산에틸에스테르 0.1g, 실시예 1에서 수득한 구멍갈파래 고분자 다당체 분해물 0.5g과 적량의 색소를 혼합하여 피부개선효과가 있는 미용액을 얻었다.

Claims (13)

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8. 1단계: 건조 마쇄된 구멍갈파래를 열수 추출하여 수용성 추출물을 제조하는 공정,
   2단계: 제조된 구멍갈파래 수용성 추출물에 에틸알코올을 가해 정치하여 고분자 다당체 및 단백질을 침전시킨 후, 여과 및 원심분리를 통해 침전을 회수하여 구멍갈파래 함유 고분자 다당체를 선별적으로 회수하는 공정,
   3단계: 제조된 구멍갈파래 함유 고분자 다당체를 휘발성 산 용액에 분산하여 산 분해를 진행한 후 여과하여 수용성 다당체 분해물을 제조하는 공정, 및
   4단계: 제조된 구멍갈파래 수용성 다당체 분해물에서 산과 용매를 제거하는 공정에 의하여 제조되는 글루쿠론산을 1.0% 이상 함유하는 구멍갈파래 분해물을 조성물 전체에 대해서 0.001 내지 30.0중량% 함유하는 것을 특징으로 하는 구멍갈파래 분해물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물.
   
9. 청구항 8에 있어서,
   상기 화장료 조성물은 광노화 방지 효능을 나타내는 것을 특징으로 하는 구멍갈파래 분해물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물.
   
10. 청구항 8에 있어서,
    상기 화장료 조성물은 피부 주름개선 효과를 지니는 것을 특징으로 하는 구멍갈파래 분해물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물.
    
11. 청구항 8에 있어서,
    상기 화장료 조성물은 피부 탄력 개선 기능을 지니는 것을 특징으로 하는 구멍갈파래 분해물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물.
    
12. 청구항 8에 있어서,
    상기 화장료 조성물은 피부 노화 방지 기능을 지니는 것을 특징으로 하는 구멍갈파래 분해물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물.
    
13. 청구항 8에 있어서,
    상기 화장료 조성물은 활성산소에 대한 방어 효능을 나타내는 것을 특징으로 하는 구멍갈파래 분해물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물.