KR101035858B1 - 광독성이 낮은 모자반 추출물 제조방법 및 이를 함유하는 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 자외선에 의한 광독성이 낮은 모자반 추출물의 제조방법 및 이를 주요 활성성분으로 함유하는 광노화 방지 화장료 조성물에 관한 것으로서, 좀 더 구체적으로는 용매를 이용한 추출물의 제조, 고극성 용매와 저극성 용매를 이용한 용매 분획, 농축 및 동결건조를 포함하는 광독성 유발물질을 배제한 모자반 추출물 제조방법 및 이를 통해 제조된 추출물 0.001 ~ 30.0중량%를 함유하며 티로시나제 활성 억제효과와 멜라닌 생합성 억제효과, 피부 주름의 개선효과가 우수한 화장료 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 의하면 광독성 유발물질 배제 추출물 제조방법은 효과적으로 모자반에 함유되어 있는 광독성 유발물질을 제거할 수 있고 이를 통해 제조된 모자반 추출물을 함유하는 본 발명의 화장료 조성물은 자외선 등에 의한 광독성 및 염증유발 가능성이 매우 낮을 뿐만 아니라, 미백효과, 사람섬유아세포에서 MMP-1 생합성 저해효과와 타입 1 프로콜라겐의 생합성 촉진 효과를 나타내며 이로 인해 피부 탄력 및 잔주름 개선효과를 나타낸다. 따라서 본 발명은 안전성이 높은 모자반 추출물을 제조할 수 있는 제조방법에 관한 것이며, 또한 이를 통해 제조된 광독성 유발물질 배제 모자반 추출물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로 자외선 등에 의해 촉진되는 광노화 현상을 효과적으로 저해하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

모자반, 경단구슬모자반, Sargassum 속, 광노화, 항노화 화장료 조성물, 주름 개선, 미백, 광독성

Description

광독성이 낮은 모자반 추출물 제조방법 및 이를 함유하는 화장료 조성물{Sargassum sp. extract that have low photo-induced cytotoxicity, preparation method thereof and cosmetic composition containing the same}

본 발명은 자외선에 의한 광독성이 낮은 모자반 추출물의 제조방법 및 이를 주요 활성성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로서, 좀 더 구체적으로는 용매를 이용한 추출물의 제조, 고극성 용매와 저극성 용매를 이용한 용매 분획, 농축 및 동결건조를 포함하는 광독성 유발 물질 배제 모자반 추출물 제조방법 및 이를 통해 제조된 추출물 0.001 ~ 30.0중량%를 함유하며 티로시나제 활성 억제효과와 멜라닌 생합성 억제효과, 피부 주름의 개선효과가 우수한 화장료 조성물에 관한 것이다.

사람의 피부는 나이를 먹으면서 피부 노화와 색소 침착에 의해 끊임없이 변한다. 이러한 피부색을 결정하는 인자에는 기본적으로 인종과 지역, 성별, 나이에 따른 차이를 배제하면 기미, 주근깨와 자외선 노출로 인한 태닝과 같은 부분적 또는 전체적인 색소침착, 그 외에 여드름 및 흉터, 각질의 분포 상태와 혈액 순환, 스트레스, 건강상태 등이 있다. 이상의 인자들 가운데에서도 가장 중요한 인자는 색소침착이다.

피부색에 영향을 주는 색소로는 멜라닌, 카로틴, 헤모글로빈 등이 있는데 이중 가장 중요한 것은 멜라닌으로서 멜라닌 생합성에 영향을 미치는 가장 큰 요인은 자외선이다. 멜라닌 생합성은 아미노산의 일종인 티로신이 멜라노사이트의 멜라노좀에서 티로시나제(tyrosinase)에 의해 디하이드록시 페닐알라닌(dihydroxy phenylalanine)으로 전환되는 것을 시작으로 계속되는 일련의 과정을 거쳐 갈색(pheomelanin), 흑색(eumelanin)의 중합체로 형성된다. 이러한 생합성 과정은 멜라노좀이라는 특수한 형태의 갈색 세포내 소기관에서 진행되며 멜라닌 과립을 포함한 멜라노좀은 핵 주변 부위에서 수지상 돌기 끝부분으로 이동한 다음 케라티노사이트의 식세포작용에 의해 세포질 내로 이동하고 이들은 케라티노사이트의 핵 주변에 축적된다. 멜라닌 합성과 멜라노좀 수, 주위의 케라티노사이트로의 이동은 일차적으로는 유전적 영향을 크게 받으며 부분적으로는 호르몬과 자외선 등에 영향을 받는다. 그밖에 티로시나제 발현 및 멜라닌 합성, 전송에 관여하는 세포내 조절인자인 싸이토카인(cytokine), 구리, 아연, 철 등의 금속 이온 및 인터페론, 프로스타글란딘, 히스타민 등이 관여하는 것으로 알려져 있다(박수남 : 대한화장품학회지, 25: 77-127, 1999). 따라서 피부색을 결정짓는 멜라닌 합성을 억제하고 이에 관여하는 효소인 티로시나제 활성을 억제하여 피부 미백효과를 기대할 수 있다.

다음으로 피부색과 함께의 노화의 특징을 나타내는 인자는 주름 생성과 탄력 저하이다. 피부노화는 내인성 노화(intrinsic, chronological aging)와 광노 화(phtoaging) 두 가지로 나눌 수 있다[Gilchrest BA: J. Am. Acad. Dermatol.,21, 610-613(1989)]. 내인성 노화는 연령이 증가함에 따라 생체의 생리적인 기능이 저하되어 자연적으로 유발되는 노화현상이다[Braverman IM 등: J. Invest. Dermatol., 78, 434-443(1982)]. 광노화는 피부가 자외선 등의 광에 반복적으로 노출되어 피부의 외양 또는 기능이 변화되는 것을 의미한다[Ridder GM등: J. Am. Acad. Dermatol., 25, 751-760(1991)]. 좀 더 구체적으로 말하자면, 광노화는 자외선에 의해 피부의 주요 구성물질인 지질, 단백질, 다당류 및 핵산 등이 손상되어 피부세포 및 조직이 파괴되고, 결국 피부노화 현상이 생겨나는 것이다. 특히 피부의 결합조직인 콜라겐, 히알루론산, 엘라스틴, 프로테오글라이칸, 피브로넥틴 등이 절단되어 피부 탄력에 지장을 주고 광노화의 주요 현상인 깊은 주름을 형성하게 되고 이것이 더 심해질 경우 DNA 변이에 의해 돌연변이, 암 유발, 면역기능 저하의 사태에 이르게 된다.

생체 내에서 콜라겐과 같은 세포외기질의 합성과 분해는 적절하게 조절되지만 노화가 진행되면서 특히 자외선에 만성적으로 노출되는 부위에서는 그 합성이 감소하고 분해는 촉진되는데, 자외선 등에 의해 콜라겐을 분해하는 효소인 기질금속단백질 분해효소(matrixmetalloproteinase, 이하 ‘MMP’라 칭함) 발현이 촉진되어 피부 탄력이 저하되고 주름이 형성된다.

기질 금속단백질 분해효소(MMP)는 사람 피부의 각질형성세포(keratinocyte)와 섬유아세포(fibroblast)를 비롯한 체내 다양한 세포로부터 분비되는데, 칼슘 및 아연 의존성 엔도펩티다제(Endopeptidase)로 중성 pH에서 작용하며 기질로써 여러 가지 세포외기질을 이용한다. MMP는 그 기질특이성에 따라 MMP-1, MMP-2, MMP-9로 크게 분류된다. MMP-1은 간질의 효소인 섬유아세포 타입 콜라게나제이며 기질로는 콜라겐타입 Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅶ,Ⅷ,Ⅹ 및 젤라틴이 있으며 원래 콜라겐 길이의 3/4이나 1/4 길이의 펩타이드로 잘라 비특이적인 효소(젤라티네이즈 등)의 작용이 용이하도록 한다. MMP-2는 72kD의 젤라티네이즈(A)가 이에 속하며 젤라틴, 콜라겐 타입 Ⅳ,Ⅴ,Ⅶ,Ⅹ, 엘라스틴 및 피브로넥틴을 분해한다. 또한 MMP-13은 메탈로엘라스타아제(Metalloelastase)로서 엘라스틴을 분해한다. 사람 피부의 진피층 대부분을 차지하는 콜라겐 타입 Ⅰ과 Ⅲ, 엘라스틴, 피브로넥틴 등은 피부에 강도와 장력을 부여하는데 자외선과 자유라디칼 등에 의해 비정상적으로 활성화된 MMP에 의해 단백질이 분해되면 주름과 탄력저하, 피부 처짐 등의 노화현상이 가속화된다. 특히 결합단백질 중 가장 많은 비율을 차지하는 타입Ⅰ콜라겐을 분해하는 MMP-1의 활성과 생합성을 억제함으로써 피부 결합단백질을 보호하여 주름생성과 탄력저하를 예방할 수 있다. 그러므로 자외선에 의해 세포 내에서 활성화가 유도되는 MMP 발현을 조절하거나 그 활성을 억제할 수 있는 물질의 개발이 요구되고 있다. 지금까지 피부 외용제의 소재로서 사용된 원료들은 단순히 MMP 효소 활성만을 억제하는 것이 대부분이었다.

자외선에 의한 노화를 방지하기 위하여 자외선 차단제가 함유된 제품을 피부에 직접 도포하는 방법이 가장 일반화되어 있으나, 1988년 레티노인산이 노화된 피부의 거칠음 및 잔주름 완화에 효과가 있다고 보고되었고(K.S. Weiss et al, JAMA, 259, 527-532, 1988), 전세계적으로 피부 노화를 억제 혹은 개선시키는 물질을 개 발하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 이 중 비타민 A, C ,E 등 비타민류의 유도체 및 AHA(alpha -hydroxy acid)는 현재까지 알려진 대표적인 노화피부 개선 물질이다(Hermitte, Cosmetics & Toiletries, 107, 63-67, 1992, D.R. Rosenthal et al, J. Invest. Dermatol., 95, 510-515, 1990, T.D.Ditre et al, J. Invest. Dermatol, 34, 187-195, 1996). 하지만, 이들은 매우 불안정하여 사용상 문제점이 있거나, 또는 가시적 효과를 나타내기엔 다소 미흡하다는 문제점이 있다.

최근 여러 화학물질 등에 의한 피부 자극을 줄이기 위해 천연 추출물로부터 얻어진 주름완화, 미백 등의 기능을 가진 기능성 화장품(functional cosmetics)에 많은 관심이 집중되고 있다. 천연 재료는 피부에 부작용이 적을 뿐 아니라, 최근 천연 재료를 이용한 피부 외용제에 대한 소비자들의 호응이 높아짐에 따라 광노화 방지 화장료 조성물 원료로서 개발가치가 한층 늘어나고 있다. 예를 들어 일본특허공개 평9-672662 는 히알우로니다제(Hyaluronidase)억제 효능을 가지는 해초류 추출물들에 관하여 기술하고 있다. 일본특허공개 평10-85905은 와카메(Wakame)로부터 추출된 푸코이단 (Fucoidan)의 피부감촉 개선효과에 관하여 기술하고 있다. 일본특허공개 평2-245087은 사르가숨(Sargassum)속 추출물의 항산화 효과에 관하여 기술하고 있다. 일본특허공개 평3-294384는 히지키아(Hizikia)속으로부터 추출된 항산화 조성물에 관하여 기술하고 있다. 일본특허공개 평7-10769는 수렴효과(astringent effect)가 있는 페오피시에강(Phaeophyceae) 추출물에 관하여 기술하고 있다. 미국특허 제5,508,033호는 모자반류를 포함하는 항라디칼 활성이 있는 화장료에 관하여 기술하고 있고, 일본 공개특허 2008-056643호는 항산화활성, 세포 대사활성, 피부노화방지 등의 기능을 갖는 모자반(Sargassum fulvellum) 추출물 함유 화장료가 개시되어 있으며, 일본 공개특허 1998-330280호에는 콜라겐 생산 촉진, 주름 또는 탄력성 저하를 억제하는 모자반 추출물 함유 화장료가 개시되어 있다. 국내 특허 제810134호에는 모자반 또는 톳을 수세 및 탈염하는 단계; 엔도-β1,4-글루카나제, 알긴산 리아제(Alginic acid lyase) 및 엑소셀룰로즈(exocellulose)로 이루어진 1차 효소분해하는 단계; 및 아라바나제(Arabanase), 셀루라제 및 β1,4-글루카나제로 이루어진 2차 효소로 분해하는 일련의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 모자반 또는 톳의 효소분해물 및 이의 제조방법이 개시되어 있고, 이를 화장료 등으로 이용할 수 있다고 개시되어 있다. 국내공개특허 2009-27387호는 피부 주름 및 탄력 개선용 화장료로 사용 가능한 괭생이 모자반 추출물을 개시한다.

이에, 본 발명자들은 이제까지 알려지지 않은 여러 천연물들에 있어서 광노화 방지 화장료 조성물로의 응용 가능성을 연구한 결과, 모자반목에 속하는 모자반을 선정하고 추출물을 제조하였다. 하지만, 제조된 모자반 추출물은 피부 세포에 대해 높은 독성을 나타내었으며, 자외선 조사에 의한 광독성을 높게 유발하는 것으로 확인되었다. 또한 허 등은(Seulgi Hur et al., 2008, Eur J Pharmacol. 582: 1-11) 모자반속 해조류인 비틀대모자반(Sargassum sagamianum) 추출물에 자외선에 의한 피부 각질세포의 자기사멸을 촉진하는 효과가 있는 것을 밝히고 있어, 피부 표면에 도포하는 화장료의 성분으로 적절하지 않음을 알게 되었다.

본 발명은 여러 천연물 중 모자반을 선택하여 광독성 유발 물질을 배제할 수 있는 추출물의 제조 공정을 제공함으로써, 광독성이 낮고 다양한 생리활성을 가진 모자반 추출물을 제공하려는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 광독성 유발 물질 배제공정을 통해 제조된 모자반 추출물을 이용하여, 이의 피부 외용제로서의 효능을 확인하고 그 사용방법을 개발함으로써, 다양한 화장료 조성물 원료의 선택범위를 높이려는 것을 목적으로 한다.

즉, 본 발명의 목적은 광독성 유발 물질 배제공정을 통해 제조된 모자반 추출물을 함유하여 자외선에 의한 피부세포 손상 및 광노화를 방지하는 화장료 조성물을 제공하려는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 광독성 유발 물질 배제공정을 통해 제조된 모자반 추출물을 함유하여 멜라닌의 생성 및 이와 관련된 효소의 활성을 억제하여 우수한 미백효과를 나타내는 화장료 조성물을 제공하려는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 광독성 유발 물질 배제공정을 통해 제조된 모자반 추출물을 함유하여 MMP-1 생합성 감소 및 타입 1 프로콜라겐 생합성 촉진효과, 피부 주름 개선효과 등 우수한 항노화 효과를 나타내는 화장료 조성물을 제공하려는 것이다.

이에 본 발명자들은 오랜 연구 끝에 경단구슬모자반을 비롯한 모자반 추출물로부터 광독성 유발물질을 배제하는 방법을 발명하였으며 이를 통해 광독성 위험이 낮은 모자반 추출물 제조하여, 이 추출물에 대하여 티로시나제 활성 억제효과와 멜라닌 생합성 억제효과로 인한 미백 효과, 피부 주름 개선효과를 실험한 결과 바람직한 결과를 얻고, 광노화 방지 화장료를 비롯한 화장료 조성물로서의 효능을 기대할 수 있다는 것을 발견하게 되었다.

본 발명은 모자반으로부터 광독성 유발 물질만을 효과적으로 배제할 수 있는 추출물 제조 공정에 관한 것이다.

좀 더 구체적으로 본 발명은 1단계: 건조 마쇄된 모자반을 추출용매로서 정제수, 메탄올, 에탄올, 부탄올, 에틸아세테이트, 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 중에서 선택된 1종 이상의 용매를 사용하여 상온에서 냉침 또는 가열 여과하여 얻어진 액상물 또는 이에 추가로 용매를 감압농축 또는 동결건조하여 얻어지는 추출물 제조 공정, 2단계: 제조된 추출물을 정제수, 메탄올, 에탄올, 부탄올 중에서 선택된 1종 이상의 용매로 구성된 고극성 용매에 고르게 분산한 후, 헥산, 디클로로메탄, 클로로포름 중에서 선택된 1종 이상의 용매로 구성된 저극성 용매와 부피비 1:5 내지 3:1의 비율로 혼합 분산, 정치한 후 상기한 저극성 용매 층을 제거하는 용매 분획 공정, 3단계: 얻어진 액상물을 추가로 용매를 감압농축 또는 동결건조하는 제조 공정인 것을 특징으로 하는 광독성 유발물질 배제 모자반 추출물 제조 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명의 광독성 유발물질 배제 모자반 추출물의 제조 방법에 사용된 고극성 용매는 정제수의 함량이 5.0-90.0중량% 범위인 것을 특징으로 하는데 정제수의 함량이 5.0중량% 미만인 경우에는 저극성 용매와 분리된 상을 유지할 수 없어 광독성 유발물질을 효과적으로 분리할 수 없으며, 정제수의 함량이 90.0중량%을 초과하는 경우에는 모자반 추출물에 함유되어 있는 활성성분을 고극성 용매에 충분히 용해할 수 없어 저극성 용매 층으로 활성성분이 분배되기 때문에 제조된 광독성 유발물질 배제 모자반 추출물의 생리활성이 낮고, 제조수율이 낮아 경제적이지 못하다.

또한, 본 발명의 광독성 유발물질 배제 모자반 추출물 제조 방법에 사용된 고극성 용매와 저극성 용매의 부피비는 1:5 내지 3:1의 비율인 것을 특징으로 하는데 고극성 용매의 부피비가 1:5 미만인 경우에는 저극성 용매와 분리된 상을 유지할 수 없거나, 한정된 제조용기 조건에서 충분한 양의 모자반 추출물을 사용할 수 없어 추출물의 제조 수율이 낮아 효과적이지 못하며, 고극성 용매의 부피비가 3:1을 초과하는 경우에는 모자반 추출물에 함유되어 있는 광독성 유발 물질을 저극성 용매에 충분히 분배 용해시킬 수 없어 제조된 광독성 유발물질 배제 모자반 추출물의 광독성이 높아 효과적이지 못하다.

또한, 본 발명은 광독성 유발물질 배제공정을 통해 제조된 모자반 추출물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 광독성 유발물질 배제공정을 통해 제조된 모자반 추출물 함량이 화장료 조성물 전체에 대해서 동결건조중량 기준 0.001-30.0중량%인 것을 특 징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다. 상기 추출물 함량이 0.001중량% 미만인 경우에는 피부개선 효과가 거의 없으며, 30.0중량% 이상인 경우에는 함유량 증가에 대한 효과 증대 정도가 미미하여 경제적이지 못하다.

또한, 본 발명은 상기 화장료 조성물이 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 수중유(O/W)형 및 유중수(W/O)형의 제형 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 광독성 유발물질 배제공정을 통해 제조된 모자반 추출물을 주요 활성성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에서 "모자반"이라 함은 모자반(Sargassum Sp.) 속에 속하는 다양한 종류의 모자반을 통칭하는 것으로서, 알쏭이모자반, 큰잎모자반, 고사리모자반, 모자반, 큰톱니모자반, 짝잎모자반, 괭생이모자반, 주름잎모자반, 큰열매모자반, 잔가시모자반, 미끌말, 셀만모자반(미야베모자반), 검둥모자반, 꼬마모자반, 쌍발이모자반, 구슬모자반, 갈래잎모자반, 비틀대모자반, 톱니모자반, 꽈배기모자반, 엷은잎모자반, 지충이, 비틀대모자반(왜모자반) 및 경단구슬모자반 등을 일컫는다.

본 발명은 여러 천연물들 중 모자반을 선택하여 광독성 유발물질만을 배제하는 추출물의 제조 공정을 제공함으로써, 광독성이 낮고 피부에 대한 안전성이 높으며 다양한 생리활성을 가진 모자반 추출물을 제공하며, 이를 피부자극이 적으면서도 소정의 기능성 효과를 나타내는 피부 외용제나 화장료로 이용할 수 있다.

또한, 본 발명은 멜라닌 생성 및 이와 관련된 효소의 활성을 억제하여 우수한 미백효과를 나타내는 광노화 방지 화장료 조성물로 이용할 수 있다.

또한, 본 발명은 함유시 MMP-1 생합성 감소 및 타입 1 프로콜라겐 생합성 촉진효과, 피부 주름 개선효과 등 우수한 항노화 효과를 나타내는 천연 추출물을 함유한 화장료 조성물로 이용할 수 있다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 좀 더 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명의 예시적인 기재일 뿐이며 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다. 또한, 본 실시예에서는 모자반 중 경단구슬모자반을 선택하여 추출물을 제조하였으나, 본 발명의 범위가 경단구슬모자반으로 한정되는 것이 아님을 분명히 밝힌다.

실시예 1: 모자반 추출물 제조

세절하여 음건한 경단구슬모자반을 80%(V/V) 에탄올 수용액으로 5시간씩 3회 환류추출하고 냉침한 후, 와트만(Whatman) #5 여과지로 여과하였다. 여과된 추출물은 50℃ 이하에서 감압농축 및 동결건조시켜 모자반 추출물을 제조하였다.

실시예 2: 광독성 유발 물질 배제 모자반 추출물 제조

실시예 1에서 제조과정 중 수득한 모자반 추출물의 동결건조물 10g을 정제수, 메탄올 및 에탄올을 3:4:3의 부피비로 혼합한 고극성 혼합용매 1ℓ에 고르게 분산 용해한 후, 헥산, 디클로로메탄, 클로로포름을 7:2:1의 부피비로 혼합한 저극성 혼합용매 1ℓ와 혼합 교반하였다. 교반한 혼합액을 실온에서 밀봉상태로 8시간 정치한 후 저극성 혼합용매층과 고극성 혼합용매층을 조심스럽게 분리하였다. 회수된 고극성 혼합용매층은 와트만(Whatman) #5 여과지로 여과한 후 50℃ 이하에서 감압농축 및 동결건조시켜 광독성 유발물질을 배제한 모자반 추출물을 제조하였다.

실시예 3: 광독성 유발 물질 고함유 모자반 추출물 제조

실시예 2의 제조과성에서 분리된 저극성 혼합용매층을 와트만(Whatman) #5 여과지로 여과한 후 30℃ 이하에서 감압농축 및 동결건조시켜 광독성 유발물질 고함유 모자반 추출물을 제조하였다.

실시예 4: 시료의 세포독성 확인 실험

본 실시예는 실시예 1 내지 3에서 수득한 모자반 추출물, 광독성 유발물질 배제 모자반 추출물 및 광독성 유발물질 고함유 모자반 추출물 시료 처리에 의한 피부세포의 세포독성을 평가하기 위하여 실시되었다.

섬유아세포(fibroblast)를 24-웰 시험 플레이트에 1x10⁵개씩 넣고 24시간 동안 부착시켰다. 각 웰을 PBS(Phosphate buffered saline)로 1회 세척하고 각 웰에 세포배양 배지(DMEM에10% FBS가 첨가된 것) 1㎖와 적절한 농도로 희석한 실시예 1 내지 3에서 수득한 시료를 각각 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 24시간이 지나면 배지를 제거하고, 각 웰 당 세포배양 배지 500㎕ 배지와 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) 용액(2.5㎎/㎖) 60㎕를 넣은 후 2시간 동안 37℃ CO₂ 배양기에서 배양하였다. 배지를 제거하고 이소프로판올-HCl(0.04N)을 500㎕씩 넣어주었다. 5분간 진탕하여 세포를 용해시키고 상등액 100㎕씩을 96-웰 시험 플레이트에 옮긴 후, 마이크로플레이트 판독기에서 565㎚ 흡광도를 측정하였다. 수학식 1에 의해 세포생존율(%)을 측정하였으며, 세포의 생존에 영향을 미치지 않는 시료의 농도를 결정하였다.

세포생존율(%) =〔(St-Bo)/(Bt-Bo)〕X 100

Bo : 세포배양배지만을 발색 반응한 웰의 565㎚ 흡광도

Bt : 시료를 처리하지 않고 발색 반응한 웰의 565㎚ 흡광도

St : 시료를 처리하고 발색 반응한 웰의 565㎚ 흡광도

표 1에서 확인할 수 있듯이 실시예 1의 모자반 추출물의 100% 세포생존 농도는 0.05%로 높은 세포 독성을 가지는 것으로 확인되었다. 또한 실시예 3의 광독성 유발물질 고함유 모자반 추출물은 100% 세포생존농도가 0.005%로 세포 독성이 크게 증가한 것을 확인하였다. 이에 비해 실시예 2의 광독성 유발물질 배제 모자반 추출물은 100% 세포생존농도가 0.5%로 세포독성이 크게 개선되어 상대적으로 피부 자극 유발 가능성이 낮고 안전한 것으로 확인되었다.

시료명	100% 세포 생존 농도
실시예 1의 추출물	0.05%
실시예 2의 추출물	0.5%
실시예 3의 추출물	0.005%

실시예 5: 자외선 조사에 의한 시료의 광독성 확인 실험

본 실시예는 실시예 1 내지 3에서 수득한 시료의 자외선 조사후 시료 처리에 의한 광독성을 평가하기 위하여 실시하였다.

피부각질세포(keratinocyte)를 24-웰 시험 플레이트에 1x10⁵개씩 넣고 24시간 동안 부착시켰다. 각 웰을 PBS(Phosphate buffered saline)로 1회 세척하고 각 웰에 500㎕의 PBS(Phosphate buffered saline)를 넣었다. 이 각질세포에 자외선 B(UVB) 램프(Model : F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki사, Japan)를 이용하여 자외선 10mJ/㎠를 조사한 후 PBS(Phosphate buffered saline)를 덜어내고 세포배양 배지(DMEM에10% FBS가 첨가된 것) 1㎖을 첨가하였다. 여기에 실시예 1 내지 3에서 수득한 시료를 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 24시간이 지나면 배지를 제거하고, 0.4% 트리판 블루(trypan blue) 용액 (Sigma, St Louis, MO, USA)으로 10분간 염색하고 도립현미경 하에서 관찰하였다. 트리판 블루로 염색하면 생존하고 있는 세포는 염색이 되지 않고, 자외선 및 추출물의 독성에 의해 사멸한 세포만이 염색이 되어 자외선 조사 및 시료의 처리로 인한 광독성을 확인할 수 있다.

실험 결과, 실시예 1의 모자반 추출물을 0.05%로 단독 처리시 세포 생존율 변화는 없었으며, 또한 자외선 단독 처리에 의해 상당수의 세포가 사멸되는 것을 확인하였다. 이에 비해 실시예 1의 모자반 추출물 0.05%와 자외선 조사를 병행할 경우, 거의 모든 세포가 사멸하여 실시예 1의 모자반 추출물이 높은 광독성을 가지는 것으로 확인되었다(도 1 참조).

실시예 2의 광독성 유발물질 배제 모자반 추출물을 0.5%로 단독 처리시 세포의 생존율의 변화는 없었다. 또한 실시예 2의 광독성 유발물질 배제 모자반 추출물 0.5%와 자외선 조사를 병행할 경우에도 대부분의 세포가 생존하는 것으로 확인되어 자외선 단독 처리에 의해 상당수의 세포가 사멸된 것에 비해 세포 생존율이 오히려 증가하는 것으로 확인되었으며, 실시예 2의 모자반 추출물이 고농도로 처리되었음에도 광독성이 크게 완화되었음을 알 수 있다(도 2 참조).

실시예 3의 광독성 유발물질 고함유 모자반 추출물을 0.005%로 단독 처리한 경우 세포의 생존율의 변화는 없었으나 세포의 형태가 미약하게 변형되어 높은 세포 독성을 가지고 있음을 알 수 있었다. 또한 실시예 3의 광독성 유발물질 고함유 모자반 추출물 0.005% 처리와 자외선 조사를 병행할 경우에도 자외선 단독 처리군에 비해 세포 사멸율이 크게 증가하여 거의 모든 세포가 사멸하였다. 따라서, 실시예 3의 광독성 유발물질 고함유 모자반 추출물이 매우 낮은 농도로 처리되었음에도 매우 높은 광독성을 가지는 것으로 확인되었다(도 3 참조).

실시예 6: NBT법을 이용한 항산화 효과 측정 실험

실시예 1 내지 3에서 수득한 모자반 추출물, 광독성 유발물질 배제 모자반 추출물 및 광독성 유발물질 고함유 모자반 추출물의 항산화 효과를 확인하기 위해 실험실 조건에서 항산화제로 잘 알려진 BHT(Butylated hydroxytoluene)를 비교샘플로 하고 NBT(Nitro Blue Tetrazolium)법을 이용하여 항산화 활성을 측정하였다.

항산화 효과를 측정하기 위해서 크산틴과 크산틴옥시다제에 의해 생성되는 활성산소를 NBT법에 의해 측정하고 피검물질이 활성산소를 제거하는 효과, 즉 활성산소 소거효과를 평가한다. 크산틴과 크산틴옥시다제에 의해 활성산소를 생성시킨다. 이 활성산소가 니트로블루테트라졸리움(Nitro Blue Tetrazolium;NBT)과 반응하여 이것에 의해 생성되는 청색을 파장 560nm에서 측정하는 것으로 활성산소 소거율을 측정한다.

측정방법으로서 0.05M Na2CO3(2.4ml), 3mM 크산틴 용액(0.1ml), 3mM EDTA 용액(0.1ml), BSA 용액(0.1ml), 0.72mM NBT 용액(0.1ml)를 가하고 여기에 시료용액 0.1ml을 첨가하고 25℃에서 10분간 방치한다. 크산틴 옥시다제 용액(0.1ml)을 가하여 빨리 교반하고 25℃에서 20분간의 배양을 개시한다. 그 후 6mM CuCl₂ 용액(0.1ml)을 가하여 반응을 정지시키고 560nm에서의 흡광도 St를 측정한다. 공시험은 시료용액 대신에 증류수를 사용한 것을 상기와 똑같이 조작해 흡광도 Bt를 측정한다. 역시, 시료용액의 블랭크(Blank)는 6 대신에 증류수를 사용해 똑같이 조작하여 흡광도 Bo를 측정한다.

효과는 수학식 2에 의하여 산출하였으며, 그 결과는 표 2에 나타내었다.

억제율(%) = 〔1-(St-So)/(Bt-Bo)〕X 100

St : 시료용액의 효소 반응 후의 560nm에서의 흡광도

Bt : 공시험용액의 효소 반응 후의 560nm에서의 흡광도

So : 시료용액의 효소 무첨가시 반응전의 560nm에서의 흡광도

Bo : 공시험용액의 효소 무첨가시 반응전의 560nm에서의 흡광도

표 2에서 확인할 수 있듯이 실시예 1의 모자반 추출물 및 실시예 2의 광독성 유발물질 배제 모자반 추출물은 유사한 항산화력을 갖고 있으며, 모두 BHT보다 우수한 항산화력을 갖고 있음이 확인되었다. 하지만, 실시예 3의 광독성 유발물질 고함유 모자반 추출물은 BHT보다 낮은 미약한 항산화력을 갖고 있음이 확인되었다. 즉 실시예 2의 광독성 유발물질 배제 모자반 추출물은 항산화 활성의 손상 없이 광독성 및 세포 독성만 현저히 개선되었음을 알 수 있다.

시료명	함량	항산화 효과(%)
실시예 1의 추출물	0.1중량%	92.7%
실시예 1의 추출물	0.02중량%	74.7%
실시예 2의 추출물	0.1중량%	91.8%
실시예 2의 추출물	0.02중량%	78.9%
실시예 3의 추출물	0.5중량%	21.7%
실시예 3의 추출물	0.1중량%	8.9%
BHT	0.1중량%	89.3%

실시예 7: 자유라디칼 소거활성 측정 실험

실시예 1 내지 3에서 수득한 모자반 추출물, 광독성 유발물질 배제 모자반 추출물 및 광독성 유발물질 고함유 모자반 추출물의 자유라디칼 소거활성을 측정하기 위해 실험실 조건에서 BHT와 같은 항산화제를 비교샘플로 하고 DPPH법을 이용하여 자유라디칼 소거활성을 측정하였다.

DPPH법은 DPPH(2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl free radical)라는 유리기를 사용하여 환원력에 의한 자유라디칼 소거활성을 측정한다. 피검물질에 의해 DPPH가 환원되어 흡광도가 감소하는 정도를 공시험액의 흡광도와 비교하여 파장 560nm에서 자유라디칼 소거율을 측정한다.

DPPH 자유라디칼 소거활성 측정을 위하여 0.1%, 0.01%, 0.001% 농도의 모자반 추출물을 준비하였다. 상기 농도의 추출물을 96웰 플레이트에 각각 넣고, 여기에 100uM 메탄올용액으로 제조된 DPPH를 첨가하여 용액의 총 부피가 200㎕가 되도록 하였다. 이것을 37℃에서 30분간 방치한 후 560nm에서 흡광도를 측정하였다. 자유라디칼 소거활성(%)은 다음의 수학식 3으로 산출하였다.

자유라디칼 소거활성(%)= 100-(B/A)X100

A: 본 발명의 모자반 추출물을 처리하지 않은 대조군 웰의 흡광도

B: 본 발명의 모자반 추출물을 처리한 실험군 웰의 흡광도

표 3에서 확인할 수 있듯이 실시예 1의 모자반 추출물 및 실시예 2의 광독성 유발물질 배제 모자반 추출물은 유사한 자유라디칼 소거활성을 나타내며, 모두 항산화제로 많이 이용되고 있는 BHT보다 우수한 항산화 효과를 나타냄을 알 수 있었다. 하지만, 실시예 3의 광독성 유발물질 고함유 모자반 추출물은 BHT보다 낮은 미약한 항산화력을 갖고 있음이 확인되었다.

즉 실시예 2의 광독성 유발물질 배제 모자반 추출물은 항산화 활성의 손상 없이 광독성 및 세포 독성만 현저히 개선되었음을 알 수 있다.

시료명	함량	항산화 효과(%)
실시예 1의 추출물	0.1중량%	94.4%
실시예 1의 추출물	0.05중량%	86.9%
실시예 2의 추출물	0.1중량%	91.5%
실시예 2의 추출물	0.05중량%	84.1%
실시예 3의 추출물	0.5중량%	26.8%
실시예 3의 추출물	0.1중량%	7.3%
BHT	0.1중량%	81.0%

실시예 8: 티로시나제 억제효과 측정 실험

본 실시예는 실시예 1 내지 3에서 수득한 시료의 미백효과를 확인하기 위해 티로시나제(tyrosinase)라는 효소의 기능이 억제되는 정도를 보고 미백효과를 판단한 것이다.

티로시나제는 생체내에서 티로신(tyrosine)이라는 물질의 산화과정을 촉진하여 멜라닌이 생성되게 도와주는 효소이다. 본 실시예에서는 이 효소의 기능을 억제하여 티로신이 산화되어 멜라닌이라는 흑색의 고분자를 형성하는 것을 억제하는 정도를 측정하는 방법(Pomerantz S. H.: J. Biochem., 24: 161 - 168, 1996)을 응용하여 미백효과를 판정하였다.

각 시료들의 티로시나제에 대한 저해활성은 시료 15㎕를 96 웰 플레이트에 넣고, 50mM 인산 완충액(pH 6.5) 150㎕, 1.5mM L-티로신 용액 25㎕를 넣은 후, 머쉬룸 티로시나제(1,500units/㎖, Sigma사) 10㎕를 첨가하여 37℃에서 20분간 반응시킨 후, 마이크로플레이트 판독기(microplate reader, ELx800, 미국)를 사용하여 490nm에서 흡광도를 측정하여 티로시나제에 대한 저해율을 측정하였다. 티로시나제에 대한 저해율(%)은 수학식4에 따라 계산하였으며, IC₅₀값은 티로시나제 효소 활성을 50% 저해하는 물질의 농도이다.

저해율 (%) = [(D-C)-(B-A)]/(D-C)× 100

A : 시료를 넣은 웰의 반응 전 흡광도

B : 시료를 넣은 웰의 반응 후 흡광도

C : 시료를 넣지 않은 웰의 반응 전 흡광도

D : 시료를 넣지 않은 웰의 반응 후 흡광도

티로시나제 활성 억제효과를 시험한 결과, 표 4에서 확인할 수 있듯이 실시예 1 시료의 IC₅₀값은 0.11%, 실시예 2 시료의 IC₅₀값은 0.18%로 나타나 기존에 알려진 미백제인 유용성 감초추출물에 비해 낮지만 알부틴보다 우수한 티로시나제 활성 억제 효과를 나타내었다. 하지만, 실시예 3의 광독성 유발물질 고함유 모자반 추출물의 IC₅₀값은 0.54%로 나타나 알부틴과 유사한 정도의 티로시나제 활성 억제 효과를 나타내었다.

즉 실시예 2의 광독성 유발물질 배제 모자반 추출물은 미백 활성의 손상 없이 광독성 및 세포 독성만 현저히 개선되었음을 알 수 있다.

시료명	티로시나제 저해 효과(IC50)
실시예 1의 추출물	0.11%
실시예 2의 추출물	0.18%
실시예 3의 추출물	0.54%
알부틴	0.47%
유용성 감초 추출물	0.08%

실시예 9: B16F1 멜라노싸이트를 이용한 멜라닌 생성 억제효과 측정 실험

본 실시예는 실시예 1 내지 3에서 수득한 시료의 미백효과를 확인하기 위해 B16F1 멜라노싸이트에 대한 멜라닌 생성 억제 정도를 확인하려는 것이다.

본 실시예에 사용된 B16F1 멜라노싸이트는 마우스에서 유래한 세포균주이며, 멜라닌이라는 흑색색소를 분비하는 세포이다. 이 세포의 인공배양중에 시료를 처리하여 멜라닌색소가 감소하는 정도를 비교, 평가하였다. 본 실시예에 사용된 B16F1 멜라노싸이트는 ATCC(American Type Culture Collection, 기탁번호: 6323)로부터 분양받아 사용하였다.

B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 생합성 억제효과 측정은 다음과 같이 행하였다. B16F1 멜라노싸이트를 6 웰 플레이트에 각 웰당 2×10⁶ 농도로 분주하고 세포를 부착시킨 후 독성을 유발하지 않는 농도로 시료를 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 72시간 배양 후 세포를 트립신-EDTA로 떼어낸 후 세포수를 측정한 다음 원심분리하여 세포를 회수하였다. 세포내 멜라닌의 정량은 로탄(Lotan : Cancer Res., 40: 3345-3350, 1980)의 방법을 약간 변형하여 실시하였다. 셀 펠릿을 PBS로 1회 세척한 후 균질화 완충액(50mM 소듐 포스페이트, pH 6.8, 1% Triton X-100, 2 mM PMSF) 1㎖를 첨가하여 5분간 와류하여 세포를 파쇄하였다. 원심분리(3,000rpm, 10분)하여 얻은 세포 여액에 1N NaOH(10% DMSO)를 첨가하여 추출된 멜라닌을 용해한 후 마이크로 플레이트 판독기로 405nm에서 멜라닌의 흡광도를 측정한 다음 멜라닌을 정량하여 시료의 멜라닌 생성 저해율(%)을 측정하였다. B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 생성 저해율(%)은 수학식 5에 의하여 계산하였으며, IC₅₀값은 멜라닌 생성을 50% 저해하는 물질의 농도이다.

저해율 (%) = [(A-B)/A]×100

A : 시료를 첨가하지 않은 웰의 멜라닌 양

B : 시료를 첨가한 웰의 멜라닌 양

B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 생성 억제 효과를 시험한 결과, 표 5에서 확인할 수 있듯이 실시예 1 추출물의 IC₅₀값은 0.20%, 실시예 2 추출물의 IC₅₀값은 0.31%로 나타나 기존에 알려진 미백제인 유용성 감초 추출물보다는 미약하지만, 알부틴보다 우수한 효과를 나타내었다. 하지만, 실시예 3의 광독성 유발물질 고함유 모자반 추출물의 IC₅₀값은 0.82%로 나타나 알부틴보다 낮은 멜라닌 생성 억제 효과를 나타내었다.

즉 실시예 2의 광독성 유발물질 배제 모자반 추출물은 미백 활성의 손상 없이 광독성 및 세포 독성만 현저히 개선되었음을 알 수 있다.

시료명	멜라닌 합성 저해 효과 (IC50)
실시예 1의 추출물	0.20%
실시예 2의 추출물	0.31%
실시예 3의 추출물	0.46%
알부틴	0.46%
유용성 감초 추출물	0.04%

실시예 10: 자외선 조사 후 모자반 추출물에 의한 MMP-1 발현억제 평가

본 실시예는 실시예 1 내지 3에서 수득한 시료의 UV 조사 및 시료 첨가 후 MMP-1 농도를 측정하기 위해서 효소면역 시험법(ELISA)을 실시하였다.

UV 챔버를 이용하여 인간 진피 섬유아세포에 UVA를 6.3J/㎠의 에너지로 조사하였다. 자외선 조사량과 배양시간은 예비실험을 통하여 섬유아세포에서 MMP 발현량이 최대가 되는 조건을 확립하였다. 음성 대조군은 은박지로 싸서 UVA 환경에 같은 시간을 유지시켰다. UVA 방출량은 UV 라디오미터를 이용하여 측정하였다. UVA가 조사되는 동안의 세포는 이전에 분주된 배지 그대로이고 UVA를 조사한 후 샘플이 들어간 배지로 교환하여 24시간 배양 후 배지를 회수하여 96웰에 코팅하였다. 일차항체(MMP-1 (Ab-5) 단일클론항체)를 처리하고 37℃에서 60분간 반응시켰다. 이차항체인 안티마우스 IgG(whole mouse, alkaline phosphatase conjugated)를 다시 60분 정도 반응시킨 후, 알칼린 포스파타제 기질용액(1㎎/㎖ ρ-나이트로페닐인산 in 다이에탄올아민 완충용액)을 상온에서 30분간 반응시키고 마이크로플레이트 판독기로 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 시료를 첨가하지 않은 것을 사용하였다.

결과는 표 6에 나타냈으며 자외선 조사시 발현이 유도되는 MMP-1에 대하여 시료를 처리하지 않은 대조군에 비하여 실시예 1의 추출물과 실시예 2의 광독성 유발물질 배제 모자반 추출물은 0.005중량% 농도에서 27% 이상의 억제율을 보였으며 이는 대조군으로 사용한 레티놀의 억제율과 유사한 결과를 나타내었다. 하지만, 실시예 3의 광독성 유발물질 고함유 모자반 추출물은 높은 세포 독성으로 인해 0.005중량% 이하의 농도에서 실험이 가능하였으며, 저해 활성도 매우 낮은 것으로 확인되었다.

즉 실시예 2의 광독성 유발물질 배제 모자반 추출물은 자외선 조서에 의한 MMP-1 발현 저해 효과의 손상 없이 광독성 및 세포 독성만 현저히 개선되었음을 알 수 있다.

시료명	함량	MMP-1 발현억제율
대조군	-	-
실시예 1의 추출물	0.01중량%	73.6%
실시예 1의 추출물	0.005중량%	34.6%
실시예 2의 추출물	0.01중량%	68.4%
실시예 2의 추출물	0.005중량%	27.1%
실시예 3의 추출물	0.005중량%	3.4%
레티놀	0.005중량%	38%

실시예 11: 타입 1 프로콜라겐 생합성 촉진 효과

본 실시예는 실시예 1 내지 3에서 수득한 추출물을 각각 첨가한 후 피부 기질 성분인 타입 1 프로콜라겐의 생합성을 촉진시키는 효과를 알아보기 위하여 프로콜라겐 분석(procollagen assay)을 아래와 같은 방법으로 실시하였다.

신생아의 포피조직에서 분리한 사람진피섬유아세포(human dermal fibroblast)는 Modern Tissue Technology(MTT, Korea)로부터 분양받아 DMEM/F-12(3:1)배지에 10% 우태아혈청(FBS)을 첨가하여 1× 10⁴cell/cm²농도로 배양하였다. 70~80% 정도 자라면 1:3의 비율로 분주하여 계대 배양하였고, 3~4차 계대배양된 세포를 실험에 이용하였다. 프로콜라겐의 양을 측정하는 실험을 위해서 섬유아세포를 48 웰 플레이트(well plate)에 90% 이상 배양한 후 각각의 시료를 적절한 농도로 가하고, 24시간 후에 배지 중에 유리된 프로콜라겐의 양을 프로콜라겐타입-1C-펩타이드 EIA 키트(procollagen type-1 C-peptide EIA kit)(MK101,Takara, Japan)를 사용하여 측정하였다.

표 7과 같이, 실시예 1의 추출물과 실시예 2의 광독성 유발물질 배제 모자반 추출물은 0.005 중량%의 농도에서 34% 이상의 프로콜라겐의 생합성 촉진 효과를 보였으며 이는 양성대조군으로 사용한 세포신호전달 물질인 TGF-β에 비해 낮지만, 매우 우수한 활성을 나타내었다. 하지만, 실시예 3의 광독성 유발물질 고함유 모자반 추출물은 0.005중량%의 농도에서 15% 정도의 프로콜라겐의 생합성 촉진 효과를 나타내었다.

즉 실시예 2의 광독성 유발물질 배제 모자반 추출물은 피부기질 성분인 타입 1 프로콜라겐의 생합성을 촉진 효과의 손상 없이 광독성 및 세포 독성만 현저히 개선되었음을 알 수 있다.

시료명	함량	MMP-1 발현억제율
실시예 1의 추출물	0.005중량%	34.5%
실시예 1의 추출물	0.001중량%	12.4%
실시예 2의 추출물	0.005중량%	41.6%
실시예 2의 추출물	0.001중량%	19.2%
실시예 3의 추출물	0.005중량%	15.2%
TGF-β	0.001중량%	35.2%

실시예 12 및 비교예 1

본 실시예는 실시예 2에서 수득한 모자반 추출물을 함유한 화장료를 제조하여 사람을 대상으로 피부 탄력 개선 효과 및 주름 개선 효과를 비교예 1과 비교실험을 행하여 평가하였다.

비교실험에 사용된 화장료는 크림형태이고, 그 조성은 표 8에 나타낸 바와 같다. 우선 표 8에 기록되어 있는 나)상을 가열하여 70℃에 보존한다. 이것에 가)상을 가하여 예비유화 후 호모믹서로 균일하게 유화하고 다음에 서서히 냉각하여 크림(실시예 12 , 비교예 1)을 제조한다. 실험자(20세-35세의 여성) 20명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 실시예 12에서 제조된 크림을, 얼굴 왼쪽 부위에는 비교예 1에서 제조된 크림을 각각 1일 2회씩 연속 2개월간 도포하였다. 실험 완료 후 피부 탄력 개선 효과는 제품 사용 전과 2개월간 사용 후에 피부탄력측정기(cutometer SEM 575, C+K Electronic Co., Germany)를 이용하여 측정하였다. 실험결과는 하기 표 9에 Cutometer SEM 575의 △R7값으로 기재하였는데 R7값은 피부의 점탄성(viscoelasticity) 성질을 나타낸다.

표 9와 같이 실시예 2의 광독성 유발물질 배제 모자반 추출물을 함유한 크림은 도포한 실험자의 피부 탄력개선 효과가 우수함을 알 수 있다.

실시예 12			비교예 1
가	스테아릴 알콜	8	8
	스테아린산	2	2
	스테아린산 콜레스테롤	2	2
	스쿠알란	4	4
	2-옥틸도데실알콜	6	6
	폴리옥시에틸렌(25몰부가)알콜에스테르	3	3
	글리세릴모노스테아린산아스테르	2	2
나	실시예 2의 추출물	1	-
	프로필렌글리콜	5	5
	적량	적량	적량

주)단위: 중량%

실험제품	피부탄력효과(△R7)
실시예 12	0.31
비교예 1	0.14

n=20, p＜0.05

실험자(20세~35세의 여성) 20명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 실시예 12에서 제조된 크림을 얼굴 왼쪽 부위에는 비교예 1에서 제조된 크림을 각각 1일 2회씩 연속 2개월간 도포하였다. 실험 완료 후 피부 주름 개선 효과는 제품 사용 전과 2개월간 사용 후에 피부의 주름개선효과를 알아보기 위하여 실리콘 재질의 모사판(replica)을 제작하여 지정 부위의 주름의 상태를 화상분석기인 비지오미터(visiometer: SV60, C+K Electronic Co., Germany)로 측정하였다. 그 결과를 표 10에 나타내었으며, 이 결과는 2개월 후의 각각의 파라미터 값에서 2개월 전 파라미터 값을 뺀 것의 평균을 나타낸 것이다. 즉, 이 값이 음수가 나올수록 주름 개선 효과가 높다는 것을 의미한다. 표 10과 같이, 실시예 2의 광독성 유발물질 배제 모자반 추출물을 함유한 실시예 12의 크림은 피부 주름 개선 효과가 크게 증진되었음을 확인할 수 있었다.

실험제품	R1	R2	R3
실시예 12	-0.27	-0.21	-0.10
비교예 1	-0.12	-0.10	-0.03

R1: 주름 등고선의 최고치와 최저치의 차이값

R2: 주름 등고선을 임의로 5칸씩 나눈 후 그 중 R1값들의 평균

R3: 5개씩 나눈 R1값 중 최고치

이하에 그 외의 실시예를 나타내었다. 즉, 실시예 2에서 수득한 모자반 추출물을 함유한 화장수, 유액 및 미용액을 실시예 13 내지 15에서 제조하였다. 이들 모자반 추출물을 함유한 화장수, 유액 및 미용액은 활성산소 소거효과, 티로시나제 활성 억제효과와 멜라닌 생합성 억제효과로 인한 미백 효과, 피부 주름의 개선효과, 5알파-리덕타아제 억제효과로 인한 여드름방지효과 및 탈모방지 및 육모 효과 등 피부개선에 우수한 효과를 나타내었다.

실시예 13: 광독성 유발물질 배제 모자반 추출물을 함유한 화장수 제조

95% 에탄올 8g에 폴리피로리돈 0.05g, 올레일알콜 0.1g, 폴리옥시에틸렌모노올레이트 0.2g, 향료 0.2g, 파라옥시안식향산메틸에스테르 0.1g, 소량의 산화방지제, 소량의 색소를 혼합용해 한다. 실시예 2서 수득한 광독성 유발물질 배제 모자반 추출물 0.05g, 글리세린 5g을 정제수 85.33g에 용해한 것에 상기 혼합액을 첨가한 후 교반하여 피부개선효과가 있는 화장수를 얻었다.

실시예 14: 광독성 유발물질 배제 모자반 추출물을 함유한 유액 제조

세틸알콜 1.2g, 스쿠알란 10g, 바세린 2g, 파라옥시안식향산에틸에스테르 0.2g, 글리세린모노에스테아레이드 1g, 폴리옥시에틸렌(20몰 부가)모노올레이트 1g 및 향료 0.1g을 70℃에서 가열혼합용해하고, 실시예 2서 수득한 광독성 유발물질 배제 모자반 추출물 0.5g, 디프로필렌글리콜 5g, 폴리에틸렌글리콜-1500 2g, 트리에탄올아민 0.2g, 정제수 76.2g을 75℃로 가열해서 용해시킨다. 양자를 혼합하여 유화시킨 후 냉각하여 수중유(O/W)형의 피부개선효과가 있는 유액을 얻었다.

실시예 15: 광독성 유발물질 배제 모자반 추출물을 함유한 미용액 제조

95% 에틸알콜 5g에 폴리옥시에틸렌솔비탄모노올레이트 1.2g, 키툴로오즈 0.3g, 히아루론산나트륨 0.2g, 비타민 E-아세테이트 0.2g, 감초산 나트륨 0.2g, 파라옥시안식향산에틸에스테르 0.1g, 실시예 2서 수득한 광독성 유발물질 배제 모자반 추출물 1g 및 적량의 색소를 혼합하여 피부개선효과가 있는 미용액을 얻었다.

도 1은 본 발명의 실시예 1의 슬모자반 추출물의 자외선 조사에 의한 광독성 확인을 위해 시료와 자외선을 처리한 후 트리판블루로 염색한 현미경 사진이다.

도 2는 본 발명의 실시예 2의 광독성 유발물질 배제 모자반 추출물의 자외선 조사에 의한 광독성 확인을 위해 시료와 자외선을 처리한 후 트리판블루로 염색한 현미경 사진이다.

도 3는 본 발명의 실시예 3의 광독성 유발물질 고함유 모자반 추출물의 자외선 조사에 의한 광독성 확인을 위해 시료와 자외선을 처리한 후 트리판블루로 염색한 현미경 사진이다.

Claims (13)

1. 추출용매를 이용하여 모자반 추출물을 제조하는 공정;

   상기 공정에서 제조된 추출물에 고극성 용매와 저극성 용매를 가한 후 혼합·분산, 정치한 후 상기한 저극성 용매 층을 제거하는 용매 분획 공정;을 포함하는 광독성 유발물질 배제 모자반 추출물 제조방법.
2. 청구항 1에 있어서,

   상기 추출물 제조 공정 이후 감압농축 공정 및 동결건조 공정 중 1 이상을 부가하는 것을 특징으로 하는 광독성 유발물질 배제 모자반 추출물 제조방법.
3. 청구항 1에 있어서,

   상기 용매 분획 공정 이후 감압농축 공정 및 동결건조 공정 중 1 이상을 부가하는 것을 특징으로 하는 광독성 유발물질 배제 모자반 추출물 제조방법.
4. 청구항 1에 있어서,

   상기 용매 분획 공정은 상기 제조된 모자반 추출물에 고극성 용매를 먼저 가 하여 혼합한 후 저극성 용매를 가하여 혼합·분산, 정치한 후 상기한 저극성 용매 층을 제거하는 것을 특징으로 하는 광독성 유발물질 배제 모자반 추출물 제조방법.
5. 청구항 1에 있어서,

   상기 추출용매는 정제수, 메탄올, 에탄올, 부탄올, 에틸아세테이트, 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 중에서 선택된 1종 이상의 용매인 것을 특징으로 하는 광독성 유발물질 배제 모자반 추출물 제조방법.
6. 청구항 1에 있어서,

   상기 고극성 용매는 정제수, 메탄올, 에탄올, 부탄올 중에서 선택된 1종 이상의 용매로 구성된 것임을 특징으로 하는 광독성 유발물질 배제 모자반 추출물 제조방법.
7. 청구항 1에 있어서,

   상기 저극성 용매는 헥산, 디클로로메탄, 클로로포름 중에서 선택된 1종 이상의 용매로 구성된 것임을 특징으로 하는 광독성 유발물질 배제 모자반 추출물 제조방법.
8. 청구항 1에 있어서,

   상기 고극성 용매와 저극성 용매의 혼합·분산시 고극성 용매: 저극성 용매는 부피비 1:5 내지 3:1의 비율인 것을 특징으로 하는 광독성 유발물질 배제 모자반 추출물 제조방법.
9. 청구항 1에 있어서,

   상기 모자반은 경단구슬모자반인 것을 특징으로 하는 광독성 유발물질 배제 모자반 추출물 제조방법.
10. 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항의 방법에 의하여 제조되는 광독성 유발 물질 배제 모자반 추출물을 0.001 - 30.0중량% 함유하는 것을 특징으로 하는, 광독성 유발물질 배제 모자반 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물.
11. 청구항 10에 있어서,

    상기 화장료 조성물은 노화 방지 효능을 나타내는 것을 특징으로 하는 화장 료 조성물.
12. 청구항 10에 있어서,

    상기 화장료 조성물은 피부 주름개선 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
13. 청구항 10에 있어서,

    상기 화장료 조성물은 피부 미백 기능을 나타내는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.

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