KR100732563B1 - 자단향 추출물을 주요 활성성분으로 함유하는 피부외용제조성물 - Google Patents

Abstract

자단나무(Pterocarpus santalinus)의 심재를 건조한 생약, 자단향 추출물을 조성물 총 중량에 대하여 0.001∼30.0 중량%를 함유하는 것을 특징으로 하는 자단향(紫檀香) 추출물을 주요 활성성분으로 함유하는 피부외용제 조성물이 제공된다.

자단향 추출물을 주요 활성성분으로 함유하는 피부외용제 조성물은 tyrosinase 활성과, 멜라닌 생합성에 현저한 억제효과를 나타내어 피부 미백효과를 가지며 기질 금속단백질 분해효소, 특히 콜라게나제(MMP-1)와 젤라티나제(MMP-2)의 활성 억제에 효과적이어 피부탄력 저하를 방지하고 주름 생성을 억제하는 효과가 우수하다.

자단나무, 자단향, Pterocarpus santalinus, 티로시나제 저해, 피부미백, 기질금속단백질 분해효소, 항노화.

Description

자단향 추출물을 주요 활성성분으로 함유하는 피부외용제 조성물{COSMETIC COMPOSITION CONTAINING EXTRACT OF PTEROCARPUS SANTALINUS}

본 발명은 자단향(紫檀香) 추출물을 주요 활성성분으로 함유하는 피부외용제 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 자단나무(Pterocarpus santalinus)의 심재(heartwood)를 건조한 생약으로서, 자단향 추출물을 0.001∼30.0 중량% 함유하며 tyrosinase 활성과, 멜라닌 생합성에 현저한 억제효과를 나타내어 피부 미백효과를 가지며, 기질 금속단백질 분해효소(Matrix metalloproteinase, 이하 ‘MMP'라 명한다), 특히 콜라게나제(MMP-1)와 젤라티나제(MMP-2)의 활성과 발현을 효과적으로 억제하여 피부의 주름 생성을 억제하는 효과가 우수한 화장료 조성물에 관한 것이다.

사람의 피부색을 결정하는 인자에는 기본적으로 인종과 지역, 성별, 나이에 따른 차이를 배제하면 기미, 주근깨와 자외선 노출로 인한 태닝과 같은 부분, 또는 전체적인 색소침착, 그 외에 여드름 및 흉터, 각질의 분포 상태와 혈액 순환, 스트레스, 건강상태 등이 있다. 이상의 인자들 가운데에서도 가장 중요한 인자는 색소침착이다. 피부색에 영향을 주는 색소는 멜라닌으로서 이는 자외선과 체내 호르몬 분비 정도에 따라 달라진다. 멜라닌의 생합성은 아미노산의 일종인 티로신이 멜라 노사이트의 멜라노좀에서 티로시나제(tyrosinase)에 의해 산화되어 디하이드록시 페닐알라닌(dihydroxy phenylalanine)으로 전환되는 것을 시작으로 계속되는 일련의 산화과정을 거쳐 갈색(pheomelanin), 흑색(eumelanin)의 중합체로 형성된다. 이러한 생합성 과정은 멜라노좀이라는 특수한 세포내 소기관에서 진행되며 멜라닌 과립을 포함한 멜라노좀은 핵 주변 부위에서 수지상 돌기 끝부분으로 이동, 케라티노사이트의 식세포작용에 의해 세포질 내로 이동하여 핵 주변에 축적된다. 멜라닌의 합성과 멜라노좀의 수, 주위의 케라티노사이트로의 이동은 부분적으로 호르몬과 자외선 등에 영향을 받고 일차적으로는 유전적인 영향을 크게 받는다. 그 밖에 티로시나제의 발현 및 멜라닌의 합성, 전송에 관여하는 세포내 조절인자인 싸이토카인(cytokine), 구리, 아연, 철 등의 금속 이온 및 인터페론, 프로스타글란딘, 히스타민 등이 관여하는 것으로 알려져 있다(박수남:대한화장품학회지, 25: 77-127, 1999). 따라서 피부색을 결정짓는 멜라닌의 합성을 억제하고 이에 관여하는 효소인 티로시나제의 활성을 억제하여 피부의 미백효과를 기대할 수 있다.

다음으로, 피부의 노화로 인한 주름의 생성과 탄력의 저하이다. 사람의 피부는 노화 과정에서 다양한 물리 화학적인 변화가 일어나며 원인으로 크게 내적인 노화(intrinsic aging)와 함께 광노화(photoaging)로 구분되며 이에 관한 연구가 활발히 이루어져 왔다. 태양광으로부터 지표에 도달하는 자외선 중 UVC는 대기권의 상층부에 있는 오존층에서 흡수, 산란되어 여과되므로 자연적 광화학 반응에 많은 영향을 미치는 것은 아니다. 피부에 직접적으로 영향을 주는 자외선 중 UVB의 에너지는 UVA의 8% 정도이며 오존층에서 완벽하게 걸러지지 않으므로 생물학적인 중요 성도 크다. UVB는 sunburn에 의해 일어나는 cell damage에 많은 영향을 끼친다. 또한 UVA는 피부의 epidermis 와 dermis 층에 깊숙하게 투과하며, 일차적으로는 태양으로부터 방출되나 인공 램프 등에 의해서도 방출되어 진다.

생체내에서 콜라겐과 같은 세포외기질의 합성과 분해는 적절하게 조절되나 노화가 진행되면서 그 합성이 감소하며 콜라겐을 분해하는 효소인 기질 금속 단백질 분해효소(MMP)의 발현은 촉진되어 피부의 탄력이 저하되고 주름이 형성된다. 또한 자외선 조사에 의해 이러한 분해효소가 활성화되기도 한다.

기질 금속단백질 분해효소(MMP)는 다형핵성호중구(Polymorphonucelar neutrophil), 대식세포(Macrophage), 치은섬유아세포(Fibroblast), 골세포(Bone cell)과 같은 세포로부터 분비되는 칼슘 및 아연 의존성 엔도펩티다제(Endopeptidase)로 중성 pH에서 작용하며 기질로써 여러 가지 세포외기질을 이용한다. MMP는 그 기질 특이성에 따라 MMP-1, MMP-2, MMP-9 등으로 크게 분류되는데 MMP-1(콜라게네이즈)는 간질의 효소인 섬유아세포 타입 콜라게나제이며 기질로는 콜라겐 type Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅶ, Ⅷ, Ⅹ 및 젤라틴이 있으며 원래 콜라겐 길이의 3/4이나 1/4 길이의 펩타이드로 잘라 비특이적인 효소(gelatinase)의 작용이 용이하게 한다. MMP-2는 72-kD의 젤라티네이즈(A)가 속하며 기질로는 젤라틴, 콜라겐 type Ⅳ,Ⅴ,Ⅶ,Ⅹ,엘라스틴 및 파이브로넥틴을 분해한다. 또한 메탈로엘라스타아제(Metalloelastase)는 MMP-13으로 elastin을 분해한다. 특히 기질 금속단백질 분해효소(MMP) 중에서 타입Ⅳ 콜라제나제인 72-kD 및 92-kD 콜라제나제는 암전이의 첫 번째 장벽인 기저막의 주요 구조적인 성분인 타입Ⅳ 콜라겐을 분해하는 효소로 암 세포의 침윤과 전이에 있어서 가장 중요한 효소라 할 수 있다. 타입Ⅳ 콜라제나제에 대한 저해제의 탐색 및 개발은 암의 침윤과 전이 그리고 콜라겐성 결합조직의 분해가 원인이 되는 류마토이드, 치주질환, 각막궤양의 치료에 유용한 약제의 탐색 및 개발이라는 기능을 가지고 있다.

기질 금속단백질 분해효소(MMP)의 분자구조는 일반적으로 다섯 개의 지역인 신호펩타이드, 프로펩타이드, 촉매부위, 경첩부위, 펙신과 같은 부위로 특징화된다. 젤라티나제, MMP-2 및 MMP-9는 1개의 파이브로넥틴과 같은 콜라겐 부위를 가지고 있으며 MMP-9는 부가적으로 또 하나의 타입Ⅴ 콜라겐 부위를 가지고 있다. 이러한 효소는 세포에서 저장되지 않고 불활성화된 프로엔자임 및 자이모젠(Zymogen)으로 분비되며 신호펩타이드가 상실되면서 활성을 찾는다. 프로펩타이드의 기능은 효소의 불활성을 유지하는데 관련되며 여러 단계로 절단된다. 이러한 효소의 활성을 유발시키는데는 세정제, 산화제, 유기금속물질 및 트립신이나 프라스민과 같은 효소가 관여하여 효소촉매 부위의 아연을 시스테인으로부터 떨어져 나가게 하며 유리된 아연은 물과 상호작용을 하여 기질을 가수분해시킨다. 호중구 및 다형핵성 백혈구의 기질 금속단백질 분해효소(MMP)는 산화적 과정에 의하여 일차적으로 활성화되는데 그 과정은 먼저 세포내에서 과산화수소가 발생되면 염소이온의 존재하에서 미엘로페록시다제(Myeloperoxidase)에 의하여 차아염소산으로 전화되고 이것이 기질 금속단백질 분해효소(MMP)를 활성화시킨다. 섬유아세포의 기질 금속단백질 분해효소(MMP)는 트립신 및 플라스민과 같은 단백질 분해효소에 의하여 활성화된다. 이렇게 활성화된 효소는 불과 소량만이 정해진 생리학적 기능을 수행하는데 과량으로 분비되어 활성화되면 앞에서 언급한 각종 질환을 유발시킨다.

MMP는 성장인자 및 사이토카인에 의하여 유전자가 발현되어 효소가 분비되는 것으로 알려져 있다. 또한 혈관, 결합조직 및 림프관으로 발생되는 중배엽조직의 간엽세포와 각질세포에서는 성장인자 및 인터루킨-1β, 종양괴산인자-α, 혈소판유래성장인자, 표피성장인자와 같은 사이토카인이 기질 금속단백질 분해효소(MMP)의 유전자 발현을 촉진하는 반면, 인터페론-α와 글루티코르티코이드 및 변형성장인자-β는 기질 금속단백질 분해효소(MMP)의 유전자 발현을 억제시킨다. 그리고 골흡수와 관련하여 부갑상선 호르몬 및 세포내독소, 프로스타클란딘은 기질 금속단백질 분해효소(MMP)의 합성을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 이러한 유전적 조절기작을 살펴보면 원종양유전자인 c-fos와 c-jun과 같은 전사인자에 의하여 유전자에 대한 활성인자 단백질-1이 변형되고 부가적으로 PEA3와 NIP 단백질 결합부위가 상승작용으로 콜라게나제와 스트로멜리신(Stromelysin) 프로모터에서의 전사활성을 최대수준으로 유발시킨다. 호중구의 기질 금속단백질 분해효소(MMP)조절은 전사수준에서보다는 리소좀의 과립에 의하여 일차적으로 조절된다.

자외선에 의한 노화를 방지하기 위하여 자외선 차단제가 함유된 제품을 피부에 직접 도포하는 방법이 가장 일반화되어 있으나, 1988년 레티노인산이 노화된 피부의 피부거칠음 및 잔주름의 완화에 효과가 있다고 보고되었고(K.S. Weiss et al, JAMA, 259, 527-532, 1988), 전세계적으로 피부 노화를 억제 혹은 개선시키는 물질을 개발하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 이 중 비타민 A, C ,E 등 비타민류의 유도체 및 AHA(alpha-hydroxy acid)는 현재까지 알려진 노화피부 개선의 대표 적인 물질이다(Hermitte, Cosmetics & Toiletries, 107, 63-67, 1992, D.R. Rosenthal et al, J. Invest. Dermatol., 95, 510-515, 1990, T.D.Ditre et al, J. Invest. Dermatol, 34, 187-195, 1996). 하지만, 이들은 자연환경에서 매우 불안정하여 사용상 문제점이 있거나, 혹은 가시적 효과를 나타내기엔 다소 미흡하다는데 문제가 있다.

또한, 아스코르빈산(일본특개평 4-9320), 하이드로퀴논(일본특개평 6-192062), 코직산(일본특개소 56-7710), 알부틴(일본특개평 4-93150) 및 일부의 추출물 등이 티로시나제 저해 활성을 가지고 있어 미백 화장료로 이용되고 있으나 화장품 제형 중에서의 안정성이 나빠 분해되어 착색되거나, 이취의 발생, 생체 레벨에서의 효능, 효과의 불분명 및 안전성 문제 등으로 그 사용이 제한되고 있는 실정이다. 그리고 티로시나제의 억제 효과는 입증되었으나 실제 생체 레벨과 유사한 실험에서는 그 효과가 낮게 나타난다. 따라서 생체 레벨과 유사한 멜라노마 세포 배양에 의한 저해 효과가 요구되고 있는 실정이다. 또한 하이드로퀴논은 발암성 물질로 규정되어 사용이 금지되고 있다. 코직산과 아스크르빈산은 매우 불안정한 물질이다. 상기 성분들을 소량 함유한 화장료는 실온에서 수주일동안 보관하면 갈변 현상이 발생한다.

이러한 문제점을 해결하기 위하여, 최근 여러 화학물질 등이 갖는 한계를 극복하기 위해 천연물을 사용한 화장품이 많이 개발되고 있다. 천연 재료는 피부에 부작용이 적을 뿐 아니라, 최근 천연 재료를 이용한 화장품에 대한 소비자들의 호응이 높아짐에 따라 화장품 원료로서 개발가치가 한층 늘어나고 있다. 이에, 본 발 명자들은 여러 천연물들에 있어서 화장품으로의 응용 가능성을 연구한 결과, 자단나무의 심재인 생약, 자단향을 선정하고 이들로부터 추출물을 제조하여, tyrosinase 저해활성과, 멜라닌 형성세포의 멜라닌 생합성 억제활성이 우수하여 미백효과를 가지며, 기질 금속단백질 분해효소, 특히 콜라게나제(MMP-1)와 젤라티나제(MMP-2)의 활성 억제에 효과적이어서 피부탄력 저하를 방지하고 주름 생성을 억제하는 효과가 있으므로 화장품으로서의 효능을 기대할 수 있다는 것을 발견하게 되었다.

자단나무(Pterocarpus santalinus)는 쌍떡잎식물 장미목 콩과에 속하는 상록 소교목으로 자단나무의 심재는 자주빛으로 박달나무처럼 단단하기 때문에 자단(紫檀)이라 불린다. 목재는 가구재, 건축재로도 사용된다. 자단나무의 심재는 생약으로 사용되어 왔으며 생약명으로 자단향(紫檀香)으로 동의보감에 따르면, 지혈효과 있어 금창(金瘡), 창상(創傷) 등의. 예리한 금속으로 입은 상처에 가루내어 붙여 사용하는 것으로 기록되어 있다. 자단향의 성분에 관한 연구는 1973년부터 진행되었으며, santalin이라는 붉은 색소 성분 외에 isoflavonoid계(Krishnaveni, K. S. et al., Phytochemistry, 53, 605-606, 2000; Krishnaveni, K. S. et al., Chem. Pharm. Bull., 48, 1373-1374, 2000;Krishnaveni, K. S. et al., J. Asian Nat. Prod. Res. 2, 219-223, 2000), aurone계(Kesari, A. N. et al., Phytochemistry, 65, 3125-3129, 2004) 등의 다양한 종류의 flavonoid류 화합물과 triterpenoid류 화합물 (Kumar, N. et al., Phytochemistry, 13, 633-636, 1974; Kumar, N. et al., Phytochemistry, 14, 521-523, 1975;Kumar, N. et al., Phytochemistry, 15, 1417-1418, 1976; Krishnaveni, K. S. et al., Fitoterapia, 71, 10-13, 2000)이 분리, 보고된 바 있다. 2001년 자단나무의 껍질 추출물이 실험동물의 혈당을 낮추는 효과(Kameswara, B. et al., J. Ethnopharmacol. 74, 69-74, 2001)와 2004년 실험 동물의 상처와 화상에 대한 치료효과(Biswas, T. K. et al., Int. J. Low. Extrem. Wounds., 3, 143-150, 2004)에 관한 연구결과가 보고된 바 있다. 그러나 자단나무 추출물의 tyrosinase 저해활성 및 멜라닌 생합성 억제활성에 의한 피부 미백효과와 콜라게나제 및 젤라티나제의 저해활성에 의한 항노화 효과에 관한 연구는 보고된 바 없다.

자단향의 화장품에 관한 종래 기술로서 미국특허 제 6,875,426호와 제 6,696,417호, 제 6,635,239호, 제 6,616,918호는 피부와 모발의 태닝(tanning)을 목적으로 하는 화장료 조성물로서 자단향을 포함한 여러 식물의 추출물과 염색화합물을 함유하는 화장료 조성물로 청구하고 있다. 또한 미국특허 제 6,326,033호는 자단향의 색소성분인 santalin과 santarubin 성분을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로서 이 두 성분이 피부의 태닝에 사용될 수 있다는 점을 청구하고 있다. 또한 일본특허 09-104864호는 자단향의 목질부 추출물이 천연 항산화 물질을 다량 함유하여 식품과 의약품, 및 화장품에 적용할 수 있는 천연항산화제로 청구하고 있다. 즉, 본 발명의 목적인 자단향 추출물을 단독으로 피부외용제에 적용함으로써 피부의 미백과 주름개선, 탄력을 증진시키는 기능에 대하여서는 종래 기술에 기재되어 있지 않다.

본 발명은 여러 천연물들 중 콩과의 상록수인 자단나무(Pterocarpus santalinus)의 심재를 이용한 약재인 자단향 추출물이 화장품 원료로서의 효능을 확인하고, 그 사용 방법을 개발하고, 이 원료를 사용함으로써 소정의 기능성을 갖는 화장료를 제조할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

즉, 본 발명의 목적은 피부 화장료에 적용 가능하고 화장료에 함유시 tyrosinase 저해 효과, 멜라닌 형성세포에서 멜라닌 생합성 억제효과, 그리고 실제로 피부에 화장료를 도포하였을 때 칙칙해진 피부색을 옅게하고 색소의 침착을 방지하는 등 우수한 미백효과를 나타내는 천연 추출물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 피부화장료에 적용시 피부 진피층을 구성하는 결합단백질을 분해하는 효소인 콜라게나제(MMP-1)과 젤라티나제(MMP-2)를 억제하여 콜라겐을 보호, 생합성을 촉진하고 피부의 잔주름 완화와 같은 우수한 항노화 효과를 나타내는 천연 추출물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명자들은 여러 가지 생약들 중 자단향을 선택하여, 이의 피부외용제 원료로서의 효능을 확인하고 그 사용방법을 개발함으로써, 다양한 화장품 원료의 선택범위를 높이고, 피부자극이 없으면서 기능성 효과를 나타내는 피부외용제를 제공한다.

본 발명은 자단향 추출물을 주요 활성 성분으로 함유하는 피부외용제 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 사용된 자단향 추출물은 자단향으로부터 침출, 전출하여 얻은 침출액, 또는 그 침출액을 다시 일부 또는 전부 농축하여 얻은 농축물, 또 는 다시 그 농축물을 건조시켜 제조한 추출 엑기스 및 추출액 중에 함유되고 있는 주효과를 발휘하는 화학물질 그 자체를 포함한다.

또한 상기 피부외용제 조성물 총 중량에 대하여, 자단향 추출물 0.001∼30.0 중량%를 함유한다. 상기 추출물의 함량이 0.001중량% 미만인 경우에는 피부개선 효과가 거의 없으며, 30.0중량% 이상인 경우에는 함유량 증가에 대한 효과 증대 정도가 미미하여 경제적이지 못하다. 상기 조성물은 상기의 추출물 외에 본 발명이 목적으로 하는 주효과를 손상시키지 않는 범위내에서 바람직하게는 주효과에 상승효과를 줄 수 있는 다른 성분 등을 함유하는 것도 무방하다.

또한 상기 자단향 추출물은 추출용매를 사용하여 70∼85℃ 에서 추출하여 냉침하고, 상기 결과 현탁액을 여과하여 얻어진 액상물을 추가로 50℃ 이하에서 감압농축 또는 동결 건조하여 얻는다.

상기 추출용매는 정제수, 메탄올, 에탄올, 글리세린, 에틸아세테이트, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디클로로메탄 및 헥산으로 이루어진 군에서 선택된 1종을 단독으로 사용하거나 2종 또는 3종의 용매를 혼합하여 사용하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 보다 바람직하게 10∼95% 에탄올을 추출용매로 사용하여 추출하는 것을 특징으로 한다.

상기 피부외용제 조성물의 제형은 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 수중유(O/W)형 및 유중수(W/O)형의 에멀젼, 연고로 이루어진 기초화장료 제형과 수중유형 또는 유중수형 메이크업베이스, 파운데이션, 스킨커버, 립스틱, 립그 로스, 페이스파우더, 투웨이케익, 아이새도, 치크칼라 및 아이브로우펜슬류로 이루어진 색조화장료 제형 중에서 선택된다. 또한, 각 제형의 피부외용제 조성물에 있어서, 자단향 추출물을 포함하여 항노화와 미백 원료로서 이외의 성분들을 화장료의 제형 또는 사용목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 선정하여 배합할 수 있다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 좀더 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명의 예시적인 기재일 뿐이며 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.

실시예 1: 자단향 추출물 제조

세절하여 음건한 자단향을 주정 에탄올로 5시간씩 3회 환류추출하고 냉침한 후 와트만(Whatman) #5 여과지로 여과하였다. 여과된 추출물을 50℃ 이하에서 감압농축 또는 동결건조하여 자단향 에탄올 추출물을 제조하였다.

실시예 2: mushroom tyrosinase를 이용한 tyrosinase 억제효과 측정 실험

본 실시예는 실시예 1에서 수득한 자단향 추출물의 미백효과를 확인하기 위해 티로시나제(tyrosinase)라는 효소의 기능이 억제되는 정도를 보고 미백효과를 판단한 것이다.

티로시나제는 생체내에서 티로신(tyrosine)이라는 물질의 산화과정을 촉진하여 멜라닌이 생성되게 도와주는 효소이다. 본 실험예에서는 이 효소의 기능을 억제하여 티로신이 산화되어 멜라닌이라는 흑색의 고분자를 형성하는 것을 억제하는 정 도를 측정하는 방법(Pomerantz S. H.: J. Biochem., 24: 161 - 168, 1996)을 응용하여 미백효과를 판정하였다.

각 시료들의 티로시나제에 대한 저해활성은 시료 15㎕를 96 웰 플레이트에 넣고, 50 mM 인산 완충액(pH 6.5) 150 μl, 1.5 mM L-티로신 용액 25㎕를 넣은 후, 머쉬룸 티로시나제(1,500 units/ml, Sigma사) 10㎕를 첨가하여 37℃에서 20분간 반응시킨 후, 마이크로플레이트 판독기(microplate reader, ELx800, 미국)를 사용하여 490nm에서 흡광도를 측정하여 티로시나제에 대한 저해율을 측정하였다. 티로시나제에 대한 저해율(%)은 수학식 1에 의하여 계산하였으며, IC₅₀값은 티로시나제 효소 활성을 50% 저해하는 물질의 농도이다.

저해율(%) = [(D-C)-(B-A)]/(D-C)×100

A: 시료를 넣은 웰의 반응전 흡광도

B: 시료를 넣은 웰의 반응후 흡광도

C: 시료를 넣지 않은 웰의 반응전 흡광도

D: 시료를 넣지 않은 웰의 반응후 흡광도

머쉬룸 티로시나제 활성 저해효과

시료	mushroom tyronase 저해 효과 (IC50)
실시예 1	0.02%
kojic acid	0.02%
arbutin	0.39%
상백피 추출물	0.8%
유용성 감초 추출물	0.03%

티로시나제 활성 억제효과를 시험한 결과, 자단향 추출물의 IC₅₀값은 0.02%로 나타나 기존에 알려진 미백제인 코지산, 알부틴, 상백피 추출물 및 유용성 감초 추출물 등에 비해 우수한 효과를 나타내었다(표 1).

실시예 3: B16F1 melanocyte를 이용한 세포내 tyrosinase의 활성 억제효과 측정 실험

본 실시예는 실시예 1에서 수득한 자단향 추출물의 미백효과를 확인하기 위해 B16F1 멜라노싸이트 내 티로시나제의 활성억제 정도를 측정하여 판단한 것이다.

본 실시예에 사용된 B16F1 멜라노싸이트는 마우스에서 유래한 세포균주이며 티로시나제라는 효소를 합성하는 세포이다. 이 세포의 인공배양 중에 시료를 처리하고 세포에서 티로시나제를 분리하여 효소의 활성을 측정함으로써 티로시나제의 활성 억제 정도를 비교 평가하였다.

본 실시예에 사용된 B16F1 멜라노싸이트는 ATCC(American Type Culture Collection, 기탁번호 : 6323)로부터 분양받아 사용하였다. B16F1 멜라노싸이트의 티로시나제의 활성 억제효과 측정은 다음과 같이 행하였다.

B16F1 멜라노싸이트를 6 웰 플레이트에 각 웰당 2×10⁶ 농도로 분주하고 세포를 부착시킨 후 독성을 유발하지 않는 농도로 시료를 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 72시간 배양 후 세포를 Trypsin-EDTA로 떼어낸 후 세포수를 측정한 다음 원심 분리하여 세포를 회수하였다. 셀 펠릿을 PBS로 1회 세척한 후 균질화 버퍼(50mM 소듐 포스페이트, pH 6.8, 1% Triton X-100, 2 mM PMSF) 1 ml를 첨가하여 5분간 와류하여 세포를 파쇄하고, 원심분리(3,000 rpm, 10분)하여 상등액을 회수하였다. 50 mM 소듐 포스페이트 버퍼(pH 6.5)에 1.5 mM L-티로신, 0.06 mM L-DOPA, 세포 상등액을 각각 넣고, 37℃에서 30분간 배양한 후 마이크로플레이트 판독기로 490nm에서 흡광도를 측정하여 티로시나제 효소 활성 억제효과를 측정하였다. B16F1 멜라노싸이트의 티로시나제의 활성 억제율(%)은 수학식 2에 의하여 계산하였으며, IC₅₀값은 티로시나제 효소의 활성을 50% 저해하는 물질의 농도이다.

저해율(%) = [(A-B)/A]×100

A: 시료를 첨가하지 않은 웰의 티로시나제 효소 활성

B: 시료를 첨가한 웰의 티로시나제 효소 활성

B16F1 멜라노싸이트의 티로시나제의 활성 억제 효과

시료	멜라노싸이트의 티로시나제 활성저해 효과(IC50)
실시예 1	0.01%
kojic acid	0.03%
arbutin	0.18%
상백피 추출물	0.65%
유용성 감초 추출물	0.02%

B16F1 멜라노싸이트의 티로시나제 효소의 활성 억제효과를 측정한 결과, 자단향 추출물의 IC₅₀값은 0.01%로 나타나 기존의 미백제인 코지산, 알부틴, 유용성 감초 추출물, 상백피 추출물 등에 비해 낮은 농도에서도 티로시나제의 활성을 효과적으로 저해하는 것으로 나타났다(표 2).

실시예 4: B16F1 melanocyte를 이용한 melanin 생성 억제효과 측정 실험

본 실시예는 실시예 1에서 수득한 자단향 추출물의 미백효과를 확인하기 위해 B16F1 멜라노싸이트에 대한 멜라닌 생성 억제 정도를 보고 미백 효과를 판단한 것이다.

본 실시예에 사용된 B16F1 멜라노싸이트는 마우스에서 유래한 세포균주이며, 멜라닌이라는 흑색색소를 분비하는 세포이다. 이 세포의 인공배양중에 시료를 처리하여 멜라닌 흑색색소가 감소하는 정도를 비교 평가하였다. 본 실시예에 사용된 B16F1 멜라노싸이트는 ATCC(American Type Culture Collection, 기탁번호: 6323)로부터 분양받아 사용하였다. B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 생합성 억제효과 측정은 다음과 같이 행하였다.

B16F1 멜라노싸이트를 6 웰 플레이트에 각 웰당 2×10⁶ 농도로 분주하고 세포를 부착시킨 후 독성을 유발하지 않는 농도로 시료를 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 72시간 배양 후 세포를 trypsin-EDTA로 떼어낸 후 세포수를 측정한 다음 원심분리하여 세포를 회수하였다. 세포내 멜라닌의 정량은 로탄(Lotan : Cancer Res., 40: 3345-3350, 1980)의 방법을 약간 변형하여 실시하였다. 셀 펠릿을 PBS로 1회 세척한 후 균질화 버퍼액(50mM 소듐 포스페이트, pH 6.8, 1% Triton X-100, 2 mM PMSF) 1 ml를 첨가하여 5분간 와류하여 세포를 파쇄하였다. 원심분리(3,000 rpm, 10분)하여 얻은 세포 여액에 1 N NaOH(10% DMSO)를 첨가하여 추출된 멜라닌을 용해한 후 마이크로 플레이트 판독기로 405nm에서 멜라닌의 흡광도를 측정한 다음 멜라닌을 정량하여 시료의 멜라닌 생성 저해율(%)을 측정하였다. B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 생성 저해율(%)은 수학식 3에 의하여 계산하였으며, IC₅₀값은 멜라닌 생성을 50% 저해하는 물질의 농도이다.

저해율(%) = [(A-B)/A]×100

A : 시료를 첨가하지 않은 웰의 멜라닌 양

B : 시료를 첨가한 웰의 멜라닌 양

B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 생성 억제 효과를 시험한 결과 자단향 추출물의 IC₅₀값은 0.03%로 나타나 기존의 미백제인 하이드로퀴논, 알부틴, 유용성 감초 추출물, 상백피 추출물 등에 비해 유사하거나 우수한 효과를 나타내었다(표 3).

B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 생성 억제 효과

시료	멜라닌 합성 저해 효과(IC50)
실시예 1	0.03%
hydroquinone	0.02%
arbutin	0.40%
상백피 추출물	4.48%
유용성 감초 추출물	0.03%

실시예 5: in vitro MMP-1 inhibition assay

기질 금속단백질 분해효소(MMP-1) 저해 활성은 생화학적 모델에서 측정하였는데, 이는 정제된 콜라게나제 및 이의 기질인 플루오레세인에 접한된 콜라겐과 젤라틴의 이용을 기초로 한다(EnzChek(상표명) 젤라티나제/콜라게나제 키트, 몰큘라프루브). 클로스트리디움 히스토리티컴으로부터 정제된 콜라게나제를 상기 EnzChek(상표명)젤라티나제/콜라게나제 키트내에 공급하였다. 돼지 피부로부터 정제하고 플로오레세인에 접합된 DQ-콜라겐과 0.05M 트리스-HCl, 0.15M NaCl, 5mM CaCl₂ 및 0.2mM 나트륨 아지드(pH 7.6)로 이루어지는 반응 완충액은 EnzChek(상표명)젤라티나제/콜라게나제 키트(몰큘라 프로브스)를 이용하였다. 실시예 1의 추출물은 상기 반응 완충액 내에 용해시켰다. 이는 4; 2; 0.4; 0.2; 0.1%(w/v)에서 테스트하였다. 테스트 추출물의 희석액은 25㎍/ml의 DQ-콜라겐 및 0.1U/ml의 콜라게나제와 함께 실온에서 15분, 45분, 120분 동안 항온처리하였다.

각각의 실험조건에서 콜라게나제와 DQ-콜라겐 혼합물에 상응하는 대조용 혼합물(control)도 동일하게 항온처리하였다. 또한 각각의 실험 조건에서 Blank, 이하 '효소 비함유 blank'이라 칭하는 샘플은 DQ-콜라겐의 존재 및 콜라게나제의 부재하에서 항온처리하였다. 각각의 실험은 3회 수행하였다.

15분, 45분, 120분 경과 후 DQ-콜라겐의 분해에 상응하는 신호는 형광측정기(여기:485nm, 방출 505nm)로 측정하였다. '효소 비함유 blank' 형광값을 기준으로 하여 각각의 샘플의 형광값을 측정하였다. 결과는 샘플당 형광 단위 및 대조군에 대한 변이율(%)로 나타냈다.

실험샘플	저해율(%)
	처리농도 0.04%	처리농도 0.1%
실시예 1	62	91
retinol	28	64
녹차추출물	57	83

결론적으로 선택된 실험 조건하에서 0.04 내지 4%(v/v)에서 테스트된 실시예 1에서 수득한 자단향 추출물은 투여량 의존성으로 항콜라게나제/젤라티나제 활성을 보유하였다.

표 4에 나타낸 바와 같이 자단향 추출물은 0.1% 처리시 클로스트리디움 콜라게나제의 콜라겐 분해활성의 91%를 억제하였으며 이는 녹차추출물의 저해 효과보다 우수하게 나타났다.

실시예 6: in vitro MMP-2 inhibition assay

기질 금속 단백질분해효소(MMP-2), 젤라티나제 저해 활성은 테스트관내에서 스크리닝 타입의 생화학적 모델에서 측정하였는데 MMP-2 또는 젤라티나제 A는 세포외 매트릭스의 특이적 성분을 분해하는 메라로프로테아제로서 젤라틴(변성된 콜라겐), 콜라겐 Ⅰ,Ⅳ, Ⅶ, 및 ⅩI, 그리고 피브로넥틴, 라미닌 및 엘라스틴을 분해한다. 인간의 섬유종으로부터 정제된 MMP-2는 콜바이오켐에서 입수하였고 이의 기질인 플루오레세인에 접한된 젤라틴은 (EnzChek(상표명)젤라티나제/콜라게나제 키트, 몰큘라 프로브스)를 이용하였다.

자단향 추출물의 MMP-2 저해능은 MMP-1 실험과 동일하게 테스트하였다. 테스트 추출물의 희석액은 25ug/ml의 DQ-젤라틴 및 0.1U/ml의 젤라티나제와 함께 실온에서 15분, 45분, 120분 동안 항온처리하였다.

실험샘플	저해율(%)
	처리농도 0.04%	처리농도 0.1%
실시예 1	49	85
retinol	37	59
녹차추출물	50	83

실험 결과는 표 5에 나타낸 바와 같이 자단향 추출물은 0.1% 처리시 인간의 섬유종으로부터 정제된 젤라티나제의 젤라틴 분해활성의 85%를 억제하였으며 이는 녹차 추출물의 저해 효과와 유사한 결과를 보였다.

실시예 7: 자외선 조사에 의한 MMP-1과 MMP-2의 발현억제 평가

본 실시예는 실시예 1에서 수득한 자단향 추출물의 UV 조사 및 시료 첨가 후 MMP-1과 MMP-2의 농도를 측정하기 위해서 ELISA를 실시하였다.

UV chamber를 이용하여 인간 자단향 섬유아세포에 UVA를 5J/cm²의 에너지로 조사한다. 자외선 조사량과 배양시간은 예비 실험을 통하여 섬유아세포에서 MMP 발현량이 최대가 되는 조건을 확립하였다. 음성 대조군은 은박지로 싸서 UVA의 환경에 같은 시간 유지하였다. UVA radiation의 dose는 UV radiometer를 이용하여 측정하였다. UVA가 조사되는 동안의 세포는 이전에 분주된 배지 그대로이고 UVA를 조사 한 후 샘플이 들어간 배지로 교환하여 24시간 배양후 배지를 회수하여 96-well에 coating한다. 일차항체(MMP-1 (Ab-5) monoclonal antibodies와 MMP-2(Ab-3) monoclonal antibodies을 처리하고 37℃에서 60분 반응시킨다. 이차항체인 anti-mouse IgG(whole mouse, alkaline phosphatase conjugated)를 다시 60분 정도 반응시킨 후, Alkaline phosphatase substrate solution(1mg/ml ρ-nitrophenyl phosphate in diethanolamine buffer)을 상온에서 30분간 반응시키고 Microplate reader로 405nm 에서 흡광도를 측정한다. 대조군으로는 시료를 첨가하지 않은 것을 사용한다.

시험군	처리농도(%)	MMP-1 발현억제율(%)	MMP-2 발현억제율(%)
대조군	-	-	-
실시예 1	0.1	81	86
녹차 추출물	0.1	68	59
retinol	0.1	82	84

실험 결과 자외선 조사시에 발현이 유도되는 MMP-1과 MMP-2에 대하여 시료를 처리하지 않은 대조군에 비하여 자단향 추출물은 80% 이상 억제율을 보였으며 이는 대조군으로 사용한 레티놀의 억제율과 유사한 결과이다. (표 6)

실시예 8 내지 10 및 비교예 1

본 실시예는 실시예 1에서 수득한 자단향 추출물을 함유한 화장품를 제조하여 사람을 대상으로 피부 탄력 개선 효과와 피부색 개선효과를 비교예 1과 비교실험을 행하여 평가하였다.

비교실험에 사용된 화장료는 크림형태이고, 그 조성은 표 7에 나타낸 바와 같다. 우선 표 7에 기록되어 있는 나)상을 가열하여 70℃에 보존한다. 이것에 가)상을 가하여 예비유화 후 호모믹서로 균일하게 유화하고 다음에 서서히 냉각하여 크림(실시예 8 내지 10, 비교예 1)을 제조한다. 실험자(20세-35세의 여성) 35명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 실시예 10에서 제조된 크림을, 얼굴 왼쪽 부위에는 비교예 1에서 제조된 크림을 각각 1일 2회씩 연속 2개월간 도포하였다.

원료		실시예 8	실시예 9	실시예 10	비교예 1
가	스테아릴 알콜	8	8	8	8
	스테아린산	2	2	2	2
	스테아린산 콜레스테롤	2	2	2	2
	스쿠알란	4	4	4	4
	2-옥틸도데실알콜	6	6	6	6
	폴리옥시에틸렌 (25몰부가) 알콜에스테르	3	3	3	3
	글리세릴모노스테아린산 아세테르	2	2	2	2
나	실시예 1	0.1	0.5	1	-
	프로필렌글리콜	5	5	5	5
정제수	적량	적량	적량	적량	적량

주)단위: 중량%

실험완료 후 피부 잔주름 완화 효과는 제품 사용 전과 2개월간 사용 후에 안면 눈꼬리 주위의 주름을 실리콘 수지 복사물(레플리카)로 채취하고, 이것을 피부 미세 주름 장치와 피부 영상 분석기로 눈가 잔주름의 상태를 비교하였다. 표 8은 실시예 10에서 제조된 크림을 사용한 실험자의 눈가 평균 잔주름 깊이 및 주름 감소율을 비교예 1의 크림을 사용한 실험자와 비교한 것이다. 표 8에서 나타난 바와 같이 자단향 추출물을 함유한 크림을 도포한 실험자의 안면 눈주위 피부에서 피부 주름 개선 효과가 우수함을 알 수 있다.

시험군	기간	평균 잔주름 깊이	주름깊이 감소율(%)
실시예 10	사용 전	0.196
	2개월 후	0.183	7.08
비교예 1	사용 전	0.198
	2개월 후	0.191	3.67

n=35, p＜0.05

실험자(20세-35세의 여성) 40명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 실시예 10에서 제조된 크림을, 얼굴 왼쪽 부위에는 비교예 1에서 제조된 크림을 각각 1일 2회씩 연속 2개월간 도포하였다. 시험 완료 후 얼굴 좌우 양편의 도포 부위 피부를 화상분석기 및 색차계로 얼굴색을 비교하여 가장 어두운색을 5, 중간색을 3, 가장 환한 색을 1로 정하고 그 중간정도를 어림잡아 평가하였다.

표 9는 실시예 10에서 제조된 크림을 사용한 실험자의 안면 피부색을 비교예 1로 만든 크림을 사용한 실험자의 안면 피부색과 비교한 것이다. 시험 완료 후 얼굴 좌우 양편의 도포 부위 피부를 화상분석기 및 색차계로 얼굴색을 비교하여 가장 어두운색을 5, 중간색을 3, 가장 환한 색을 1로 정하고 그 중간정도를 어림잡아 평가하였다.

표 9에서 나타낸 바와 같이 자단향 추출물을 함유한 크림을 도포한 실험자의 안면 피부에서 미백효과가 우수함을 알 수 있다.

시험군	기간	평균 피부색	개선 정도
실시예 10	사용 전	3
	2개월 후	2.0	1.0
비교예 1	사용 전	2.75
	2개월 후	2.80	0.05

n=40, p＜0.05

실시예 11: 실시예 1에서 수득한 자단향 추출물을 함유한 화장수의 제조

95% 에탄올 8g에 폴리피로리돈 0.05g, 올레일알콜 0.1g, 폴리옥시에틸렌모노올레이트 0.2g, 향료 0.2g, 파라옥시안식향산메틸에스테르 0.1g, 소량의 산화방지제, 소량의 색소를 혼합용해 한다. 실시예 1에서 수득한 자단향 추출물 0.05g, 글리세린 5g을 정제수 85.33g에 용해한 것에 상기 혼합액을 첨가한 후 교반하여 피부개선 효과가 있는 화장수를 얻었다.

실시예 12: 실시예 1에서 수득한 자단향 추출물을 함유한 유액의 제조

세틸알콜 1.2g, 스쿠알란 10g, 바세린 2g, 파라옥시안식향산에틸에스테르 0.2g, 글리세린모노에스테아레이드 1g, 폴리옥시에틸렌(20몰부가)모노올레이트 1g 및 향료 0.1g을 70℃에서 가열혼합용해하고, 실시예 1에서 수득한 자단향 추출물 0.5g, 디프로필렌글리콜 5g, 폴리에틸렌글리콜-1500 2g, 트리에탄올아민 0.2g, 정제수 76.2g을 75℃로 가열해서 용해시킨다. 양자를 혼합하여 유화시킨 후 냉각하여 수중유(O/W)형의 피부개선효과가 있는 유액을 얻었다.

실시예 13: 실시예 1에서 수득한 자단향 추출물을 함유한 미용액의 제조

95% 에틸알콜 5g에 폴리옥시에틸렌솔비탄모노올레이트 1.2g, 키툴로오즈 0.3g, 히야론산나트륨 0.2g, 비타민 E-아세테이트 0.2g, 감초산 나트륨 0.2g, 파라옥시안식향산에틸에스테르 0.1g, 실시예 1에서 수득한 자단향 추출물 1g 및 적량의 색소를 혼합하여 피부개선 효과가 있는 미용액을 얻었다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 자단향 추출물을 주요 활성성분으로 사용함으로써 tyrosinase 저해효과, 항산화 효과, MMP-1과 MMP-2의 활성 저해 효 과, 자외선 조사에 의한 MMP-1과 MMP-2의 발현 조절효과, 잔주름 개선 효과 등 우수한 항노화 효과와 자외선 조사 후 야기되는 피부 자극을 완화시켜 주는 효과가 있다.

또한, 자단향 추출물은 기미, 주근깨 및 피부 색소 침착의 원인이 되는 물질인 멜라닌 생합성저해 효과 등을 통해 미백작용을 나타낸다.

따라서, 이러한 자단향 추출물을 함유하는 화장수, 크림, 유액, 팩, 파우더 등의 피보외용제 조성물은 항산화 효과와 콜라겐 분해효소 활성 조절 효과, 피부 잔주름 개선 효과, 미백, 피부자극 완화효과 등 우수한 피부외용제로서의 효능을 가진다.

이상에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 대해 설명하였으나 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본원 발명의 요지를 벗어남이 없이 다양한 변형실시가 가능할 것이며, 이러한 변형실시는 본원발명의 보호범위에 속하는 것으로서 본원발명의 보호범위는 특허청구범위에 기재된 바에 따라 해석되어야 할 것이다.

Claims (6)

1. 자단향 추출물 0.001 ~ 30.0 중량%를 함유하고, 콜라게나제(MMP-1)와 젤라티나제(MMP-2)의 활성 및 발현을 억제하며 피부 노화방지용으로 사용되는 것을 특징으로 하는 피부외용제 조성물.
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