KR100728810B1

KR100728810B1 - 참나물 추출물을 주요 활성성분으로 함유하는 피부외용제조성물

Info

Publication number: KR100728810B1
Application number: KR1020050075848A
Authority: KR
Inventors: 심관섭; 이범천; 김진화; 표형배
Original assignee: 한불화장품주식회사
Priority date: 2005-08-18
Filing date: 2005-08-18
Publication date: 2007-06-19
Also published as: KR20070022178A

Abstract

산형목 미나리과의 참나물 추출물을 주요 활성성분으로 함유하는 화장료 조성물로서, 조성물 총 중량에 대하여, 참나물 추출물 0.001∼30.0 중량%를 함유하는 것을 특징으로 하는 참나물 추출물을 주요 활성성분으로 함유하는 피부외용제 조성물이 제공된다.

참나물 추출물을 주요 활성성분으로 함유하는 피부외용제 조성물은 항산화효과, 주름방지효과, 미백효과, 육모효과, 여드름방지효과, 자극완화 효과가 우수하다. 또한 항산화능, 인간 섬유아세포 활성효과, 피부 잔주름 개선효과, 미백효과, 육모효과, 여드름방지효과, 피부 자극 완화 효과가 있다.

참나물 추출물, 항노화, 주름방지, 미백, 육모, 여드름방지, 피부자극완화.

Description

참나물 추출물을 주요 활성성분으로 함유하는 피부외용제 조성물{COSMETIC COMPOSITION CONTAINING EXTRACT OF PIMPINELLA BRACHYCARPA}

본 발명은 참나물 추출물을 주요 활성성분으로 함유하는 피부외용제 조성물에 관한 것으로서, 좀더 구체적으로는 산형목 미나리과의 참나물(Pimpinella brachycarpa)의 잎,줄기와 근부의 천연물로부터 제조된 추출물을 활성성분으로 0.001∼30.0중량%, 바람직하게는 0.01∼5중량%를 함유하는 것을 특징으로 하는 항산화효과, 주름방지효과, 미백효과, 육모효과, 여드름방지효과, 피부자극 완화 효과가 우수한 화장료 조성물에 관한 것으로 좀더 상세하게는 참나물 천연물로부터 제조된 추출물로 항노화 효과, 주름방지효과, 미백효과, 육모방지, 여드름방지효과 및 자극완화 효과가 우수한 피부외용제 조성물을 제공하는 것이다.

사람의 피부는 노화 과정에서 다양한 물리·화학적인 변화가 일어나며 그 원인으로는 크게 내적인 노화(intrinsic aging)와 광노화(photo-aging)로 구분되며 이에 관한 연구가 활발히 이루어져 왔다. 즉, 자외선, 스트레스, 질병상태, 환경인자, 상처 및 나이가 들어감에 따라 프리라디칼이 활성화되어 노화가 야기될 수 있으며, 이런 상태가 심화될 경우 생체 내에 존재하는 항산화 방어망을 파괴하고, 세 포 및 조직을 손상시켜 성인병 및 노화를 촉진하게 된다. 보다 구체적으로는, 피부의 주요 구성물질인 지질, 단백질, 다당류 및 핵산 등이 산화되어 피부세포 및 조직이 파괴되고, 결국 피부노화 현상이 생겨나는 것이다. 특히 단백질의 산화는 피부의 결합조직인 collagen, hyaluronic acid, elastin, proteoglycan, fibronectin 등이 절단되어 심한 과다 염증반응과 피부의 탄력에 지장을 주게 되고 이것이 더 심해질 경우 DNA의 변이에 의해 돌연변이, 암의 유발, 면역기능 저하의 사태에 이르게 된다.

그러므로 신체의 대사 과정 중 발생하는 프리라디칼이나 자외선 조사, 염증반응에 의해 매개되는 프리라디칼을 소거하여 세포막을 보호하고, 또 이미 손상받은 세포를 활발한 신진대사에 의해 재생화시켜서 증식시킴으로써 피부를 빠르게 회복시키고 건강한 피부를 유지할 수 있다. 한편, 노화에는 프리라디칼 뿐만 아니라 MMP라는 효소가 관여하는데 생체 내에서 콜라겐과 같은 세포외기질의 합성과 분해는 적절하게 조절되나 노화가 진행되면서 그 합성이 감소하며 콜라겐을 분해하는 효소인 기질 금속단백질 분해효소(MMP)의 발현이 촉진되어 피부의 탄력이 저하되고 주름이 형성된다. 또한 자외선 조사에 의해 이러한 분해효소가 활성화되기도 한다.따라서 세포내에서 활성화가 유도되는 MMP 발현을 조절하거나 그 활성을 억제할 수 있는 물질의 개발이 요구되고 있다. 그러나 이제까지 화장품의 소재로서 사용된 원료들은 단순히 효소 활성만을 억제하는 것이 대부분이었으므로, 이에 세포내 자연노화와 광노화에 의해 그 발현이 유도되는 MMP 발현양 및 활성을 조절하고자 하였다.

다음으로, 색소 침착에 의한 피부 변화이다. 피부색에 영향을 주는 색소로는 멜라닌, 멜라조이드, 카로틴, 헤모글로빈 등이 있는데 이중 가장 중요한 것은 멜라닌으로 생합성에 영향을 미치는 가장 큰 요인은 자외선과 체내 호르몬 분비 정도이다. 멜라닌은 자외선을 흡수 또는 산란시켜 자외선으로부터 피부가 손상되는 것을 방지하는데 큰 역할을 하는데, 특별한 최대흡수파장이 없으며 전 영역의 빛을 흡수한다. 또한 활성산소종을 제거하는 기능이 탁월하나, 때로는 멜라닌 자체가 활성산소를 발생시키기도 하며, 멜라닌 구조내의 카테콜이나 퀴논에 의하여 다른 물질을 환원시키거나 산화시키고, 멜라닌 자체가 자유라디칼의 성질을 나타내기도 한다.

멜라닌의 생합성은 아미노산의 일종인 티로신이 멜라노사이트의 멜라노좀에서 티로시나제에 의해 산화되어 디하이드록시 페닐알라닌(dihydroxy phenylalanine)으로 전환되는 것을 시작으로 계속되는 일련의 산화과정을 거쳐 갈색(pheomelanin), 흑색(eumelanin)의 중합체로 형성된다. 이러한 생합성 과정은 멜라노좀이라는 특수한 형태의 갈색 세포내 소기관에서 진행되며 멜라닌 과립을 포함한 멜라노좀은 핵 주변 부위에서 수지상 돌기 끝부분으로 이동, 케라티노사이트의 식세포작용에 의해 세포질 내로 이동하고 이들은 케라티노사이트의 핵 주변에 축적된다.

이미 아스코르빈산(일본특개평 4-9320), 하이드로퀴논(일본특개평 6-192062), 코직산(일본특개소 56-7710), 알부틴(일본특개평 4-93150) 및 일부의 추출물 등이 티로시나제 저해 활성을 가지고 있어 미백 화장료로 이용되고 있으나 화장품 제형 중에서의 안정성이 떨어지거나, 이취의 발생, 생체 레벨에서의 효능, 효 과의 불분명 및 발암성 물질이라고 판명되어 안전성 문제 등으로 그 사용이 제한되고 있는 실정이다.

또한 다음으로, 남성형 탈모증은 남성호르몬 의존적이어서 남성호르몬의 양에 직접적인 관계가 있으며, 이에 따라 최근 남성호르몬 활성억제를 통한 탈모의 예방 및 치료를 위한 많은 연구가 보고되고 있다. 한편, 남성호르몬의 분비상승에 의해 피지선의 기능이 상승되면 생성된 과잉의 피지가 모낭벽의 과각화로 인하여 모낭내에 정체되면서 생기는 면포가 여드름의 초기단계이다.

남성호르몬에 의한 탈모 및 여드름의 기전을 설명하면, 5알파-리덕타아제(5α-Reductase)는 피지선, 모낭, 전립선, 부고환 등의 남성 호르몬 반응성 조직에서 존재하며 남성 호르몬들 중 하나로서, 테스토스테론(testosterone)을 디하이드로테스토스테론(dihydrotestosterone)으로 대사시키는데 관여하는 효소이며, 그 전환에는 NADPH를 필요로 한다. 또한, 테스토스테론(testosterone)은 남성 성충동, 골격근 증가, 남성외부생식기, 음낭성장, 정자형성 등에 관여하고, 디하이드로테스토스테(dihydrotestosterone)은 여드름, 피지증가, 탈모 및 전립선비대증 등의 해당 조직에서 관여한다(Diane et al. J.I.D. 1995). 따라서, 이 효소의 억제제를 사용하여 피지분비 억제제 및 탈모방지제를 개발하려는 연구들이 활발히 진행되고 있다. 사춘기 이후에 남성 호르몬의 과량 분비는 여드름과 탈모를 유발하는데, 5알파-리덕타아제에 의하여 남성 호르몬의 활성형태인 디하이드로테스토스테론의 과량 생성을 막기 위해 5알파-리덕타아제 억제제를 사용하여 육모제 및 여드름방지제를 개발하려는 연구들이 활발이 진행되고 있다.

이러한 피부의 문제점을 해결하기 위하여, 최근 여러 화학물질 등에 의한 피부 자극을 줄이기 위해 천연물을 사용한 화장품이 많이 개발되고 있다. 천연 재료는 피부에 부작용이 적을 뿐 아니라, 최근 천연 재료를 이용한 화장품에 대한 소비자들의 호응이 높아짐에 따라 화장품 원료로서 개발가치가 한층 늘어나고 있다. 이에, 본 발명자들은 이제까지 알려지지 않은 여러 천연물들에 있어서 화장품으로의 응용 가능성을 연구한 결과, 백합과의 줄기와 근부의 참나물 천연물을 선정하고 이들로부터 추출물을 제조하여, 피부 항산화 효과, 콜라겐 합성효과, 피부 잔주름 완화효과, 미백효과, 육모효과, 여드름방지효과 및 피부자극완화 효과를 측정한 결과 우수하므로 화장품으로서의 효능을 기대할 수 있다는 것을 발견하게 되었다.

참나물(Pimpinella brachycarpa)은 산형목 미나리과의 여러해살이 쌍떡잎식물로서 해발 1,000m 이하의 숲 속에서 자라며, 줄기는 높이 50-80cm이고 털이 없으며 향기가 있다. 잎은 어긋나고 잎자루는 밑부분이 넓어져서 줄기를 감싼다. 잎자루는 밑에서는 길지만 위로 가면서 점점 짧아진다. 잎은 3개의 작은잎으로 되어 있다. 꽃은 6-8월에 피고 흰색이며 줄기 끝이나 가지 끝에 복산형 꽃차례로 달린다. 열매는 9월에 맺으며 편평하고 넓은 타원형이며 털이 없다. 주요성분은 Isopimpinellin , Pimpinelin , 5. 8 - Dioxypsoralen , Isobergapten ,Anethole 등이 있으며, 예로부터 藥用(野蜀葵 : 전초 말린것)으로 解熱 , 驚風 , 高血壓 , 中風 , 止血 , 帶下 , 神經痛 , 淨血 , 肺熱 , 養精 , 痙血 , 潤肺으로 사용되었다.

본 발명은 여러 천연물들 중 산형목 미나리과의 참나물 추출물을 주요 활성성분으로 포함하는 피부외용제 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명의 목적은 피부 화장료에 적용 가능하고 화장료에 함유시 항산화효과, 콜라겐 합성효과, 피부 잔주름 방지효과 등 우수한 항노화 효과를 나타내는 천연 추출물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 자외선 조사 등에 의한 미백 효과와 염증매개 물질에 의한 피부 자극 완화 효과를 나타내는 천연 추출물을 주요 활성성분으로 함유하는 피부외용제 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 우수한 탈모방지 효과 및 여드름방지 효과를 갖는 5알파-리덕타아제 억제 효과를 나타내는 천연 추출물을 주요 활성성분으로 함유하는 피부외용제 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 산형목 미나리과의 참나물 추출물을 주요 활성성분으로 함유하는 피부외용제 조성물을 제공한다.

또한 상기 피부외용제 조성물 총 중량에 대하여, 참나물 추출물 0.001∼30.0 중량%를 함유한다. 상기 추출물의 함량이 0.001중량% 미만인 경우에는 피부개선 효과가 거의 없으며, 30.0중량% 이상인 경우에는 함유량 증가에 대한 효과 증대 정도가 미미하여 경제적이지 못하다.

또한 상기 참나물 추출물은 추출용매를 사용하여 70∼85℃에서 추출하여 냉침하고, 상기 결과 현탁액을 여과하여 얻어진 액상물을 추가로 50℃ 이하에서 감압농축 또는 동결 건조하여 얻는다.

상기 피부외용제 조성물의 제형은 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 수중유(O/W)형 및 유중수(W/O)형의 에멀젼, 연고로 이루어진 기초화장료 제형과 수중유형 또는 유중수형 메이크업베이스, 파운데이션, 스킨커버, 립스틱, 립그로스, 페이스파우더, 투웨이케익, 아이새도, 치크칼라 및 아이브로우펜슬류로 이루어진 색조화장료 제형 중에서 선택된다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 좀더 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명의 예시적인 기재일 뿐이며 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.

실시예 1: 참나물 추출물 제조

세절하여 음건한 참나물을 95%(V/V) 에탄올 수용액으로 5시간씩 3회 환류추출하고 냉침한 후, 와트만(Whatman) #5 여과지로 여과하였다. 여과된 추출물을 50℃ 이하에서 감압농축 및 동결 건조하였다. 감압농축물 및 동결건조물이 0.001∼ 30.0중량% 함유되게 정제수, 에탄올, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 중에서 선택된 1종 이상의 용매를 사용하여 분산/용해하여 참나물 추출물을 제조하였다.

실시예 2: NBT법을 이용한 항산화 효과 측정 실험

본 실시예는 실시예 1에서 수득한 참나물 추출물의 항산화 효과를 확인하기 위해 실험실 조건에서 다른 항산화제 즉, 레티놀과 BHT를 비교샘플로 하여, NBT법을 이용하여 항산화 활성을 측정하였다.

항산화 효과를 측정하기 위해서 크산틴과 크산틴옥시다제에 의해 생성되는 활성산소를 NBT법에 의해 측정하고 피검물질이 활성산소를 제거하는 효과, 즉 활성산소 소거효과를 평가한다. 크산틴과 크산틴옥시다제에 의해 활성산소를 생성시키고 이 활성산소가 니트로블루테트라졸리움(Nitro Blue Tetrazolium;NBT)과 반응하여 이것에 의해 생성되는 청색을 파장 560nm에서 측정함으로써 활성산소 소거율을 측정한다.

측정방법으로서,

1. 0.05M Na₂CO₃ ------------------------------------ 2.4ml

2. 3mM 크산틴 용액---------------------------------- 0.1ml

3. 3mM EDTA 용액------------------------------------ 0.1ml

4. BSA 용액----------------------------------------- 0.1ml

5. 0.72mM NBT 용액---------------------------------- 0.1ml

6. 크산틴 옥시다제 용액----------------------------- 0.1ml

7. 6mM CuCl₂용액----------------------------------- 0.1ml

① 바이엘병에 1,2,3,4,5를 가하고 여기에 시료용액 0.1ml을 첨가하고 25℃에서 10분간 방치한다.

② 6을 가하여 빨리 교반하고 25℃에서 20분간의 배양을 개시한다.

③ 그 후 7을 가하여 반응을 정지시키고 560nm에서의 흡광도 St를 측정한다.

④ 공시험은 시료용액 대신에 증류수를 사용한 것을 상기와 똑같이 조작해 흡광도 Bt를 측정한다.

⑤ 역시, 시료용액의 블랭크(Blank)는 6대신에 증류수를 사용해 똑같이 조작하여 흡광도 Bo를 측정한다.

억제율(%) = [1-(St-So)/(Bt-Bo)]×100

St : 시료용액의 효소 반응 후의 560nm에서의 흡광도

Bt : 공시험용액의 효소 반응 후의 560nm에서의 흡광도

So : 시료용액의 효소 무첨가시 반응전의 560nm에서의 흡광도

Bo : 공시험용액의 효소 무첨가시 반응전의 560nm에서의 흡광도

항산화 효과는 수학식 1에 의하여 산출하였으며, 결과는 표 1과 같다.

시료명	처리 농도(%)	항산화효과(%)
참나물 추출물(실시예 1)	0.1	96
Retinol	0.1	93
BHT	0.1	90

0.1% 농도에서 시험한 시료 모두에서 우수한 항산화 효과를 나타내었고, 참나물 추출물은 retinol과 BHT와 유사한 우수한 항산화 효과를 가지는 것을 확인하였다.

실시예 3: DPPH법을 이용한 항산화 효과 측정 실험

본 실시예는 실시예 1에서 수득한 참나물 추출물의 항산화 효과를 측정하기 위해 실험실 조건에서 녹차추출물과 비타민 E와 같은 항산화제를 비교 샘플로 하여 DPPH법을 이용, 항산화 활성을 측정하였다.

DPPH법은 2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl free radical (DPPH)라는 유리기를 사용하여 환원력에 의한 항산화 활성을 측정한다. 피검물질에 의해 DPPH가 환원되어 흡광도가 감소하는 정도를 공시험액의 흡광도와 비교하여 파장 560nm에서 자유라디칼 소거율을 측정한다.

사용한 시약으로서는 2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl free radical (Aldrich Chem. Co., MW=618.76) 0.1mM 용액으로서 61.88mg을 메탄올에 용해하여 100ml로 한다.

측정방법으로서,

① 96-웰 플레이트에 0.1mM DPPH 용액 0.15ml에 시료용액 0.15ml를 가하여 빨리 교반하고 25℃에서 10분간의 배양을 개시한다.

② 그 후 560nm에서의 흡광도 St를 측정한다.

③ 공시험은 시료용액 대신에 증류수를 사용한 것을 상기와 똑같이 조작해 흡광도 Bt를 측정한다.

④ 역시, 시료용액의 블랭크(Blank)는 0.1mM DPPH 용액 대신에 메탄올을 사용해 똑같이 조작하여 흡광도 Bo를 측정한다.

효과의 결과는 수학식 2에 의하여 산출하였으며, 결과는 표 2와 같다.

억제율(%) = [1-(St-So)/(Bt-Bo)]×100

St : 시료용액의 자유라디칼 소거 후의 560nm에서의 흡광도

Bt : 공시험용액의 자유라디칼 소거 후의 560nm에서의 흡광도

So : 시료용액의 자유라디칼 무첨가시 반응 전의 560nm에서의 흡광도

Bo : 공시험용액의 자유라디칼 무첨가시 반응 전의 560nm에서의 흡광도

시료명	처리 농도(%)	항산화 효과(%)
참나물 추출물(실시예 1)	0.01	91
녹차추출물	0.01	45
비타민E	0.01	43

실험 결과 표 2에서와 같이 참나물 추출물은 0.01% 농도에서 녹차추출물과 비타민 E보다 더 우수한 항산화 효과를 가지고 있었다.

실시예 4: in vitro MMP-1 inhibition assay

기질 금속단백질분해효소(MMP-1) 저해 활성은 생화학적 모델에서 측정하였는데 이는 정제된 콜라게나제 및 이의 기질인 플루오레세인에 접합된 콜라겐과 젤라틴의 이용을 기초로 한다(EnzChek(상표명) 젤라티나제/콜라게나제 키트, 몰큘라프루브 사). 클로스트리디움 히스토리티컴으로부터 정제된 콜라게나제를 상기 EnzChek(상표명)젤라티나제/콜라게나제 키트내에 공급하였다.

돼지 피부로부터 정제하고 플로오레세인에 접합된 DQ-콜라겐과 0.05M 트리스-HCl, 0.15M NaCl, 5mM CaCl₂ 및 0.2mM 나트륨 아지드(pH 7.6)로 이루어지는 반응 완충액은 EnzChek(상표명)젤라티나제/콜라게나제 키트(몰큘라 프로브스)를 이용하였다. 참나물 추출물은 상기 반응 완충액 내에 용해시켰다. 이는 4; 2; 0.4; 0.2; 0.1%(w/v)에서 테스트하였다. 테스트 추출물의 희석액은 25ug/ml의 DQ-콜라겐 및 0.1U/ml의 콜라게나제와 함께 실온에서 15분, 45분, 120분 동안 항온처리하였다. 각각의 실험조건에서 콜라게나제와 DQ-콜라겐 혼합물에 상응하는 대조용 혼합물(control)도 동일하게 항온처리 하였다. 또한 각각의 실험 조건에서 Blank, 이하 '효소 비함유 blank'이라 칭하는 샘플은 DQ-콜라겐의 존재 및 콜라게나제의 부재하에서 항온처리 하였다. 각각의 실험은 3회 수행하였다.

15분, 45분, 120분 경과 후 DQ-콜라겐의 분해에 상응하는 신호는 형광측정기(여기:485nm, 방출 505nm)로 측정하였다. '효소 비함유 blank' 형광값을 기준으로 하여 각각의 샘플의 형광값을 측정하였다. 결과는 샘플당 형광 단위 및 대조군에 대한 변이율(%)로 나타내었다.

결론적으로 선택된 실험 조건하에서 0.04 내지 4%(v/v)에서 테스트된 참나물 추출물은 투여랑 의존성으로 항 콜라게나제/젤라티나제 활성을 보유하였다.

실험샘플	저해율
실험샘플	0.02(처리농도(%))	0.04(처리농도(%))
참나물 추출물(실시예 1)	48	75
레티놀	0	5
녹차추출물	52	58

실험결과 참나물 추출물은 0.04% 처리시 클로스트리디움 콜라게나제의 콜라겐 분해활성의 75%를 억제하였으며 이는 녹차추출물의 저해 효과 보다 우수하게 나타내었다.

실시예 5: 자외선 조사 후 참나물 추출물에 의한 MMP-1 발현억제 평가

본 실시예에서는 실시예 1에서 수득한 참나물 추출물의 UV 조사 및 시료 첨가 후 MMP-1 농도를 측정하기 위해서 ELISA를 실시하였다.

UV 챔버를 이용하여 인간 진피 섬유아세포에 UVA를 5J/㎠의 에너지로 조사한다. 자외선 조사량과 배양시간은 예비 실험을 통하여 섬유아세포에서 MMP 발현량이 최대가 되는 조건을 확립하였다. 음성 대조군은 은박지로 싸서 UVA의 환경에 같은 시간동안 유지하였다. UVA 방출량은 UV 라디오미터를 이용하여 측정하였다. UVA가 조사되는 동안의 세포는 이전에 분주된 배지 그대로이고 UVA를 조사 한 후 샘플이 들어간 배지로 교환하여 24시간 배양 후 배지를 회수하여 96-웰에 코팅한다.

일차 항체(MMP-1(Ab-5) 단일클론 항체와 MMP-2(Ab-3) 단일클론 항체)를 처리하고 37℃에서 60분간 반응시킨다. 이차항체인 안티마우스 IgG(whole mouse, alkaline phosphatase conjugated)를 다시 60분 정도 반응시킨 후, 알카린 포스파타제 기질 용액(1mg/mlρ-nitrophenyl phosphate in diethanolamine 완충용액)을 상온에서 30분간 반응시키고 마이크로플레이트 리더로 405nm에서 흡광도를 측정한다. 대조군으로는 시료를 첨가하지 않은 것을 사용한다.

자외선 조사시에 발현이 유도되는 MMP-1에 대하여 시료를 처리하지 않은 대조군에 비하여 참나물 추출물은 20% 이상의 억제율을 보였으며 이는 대조군으로 사용한 레티놀의 억제율보다 우수한 결과이다(표 4).

시험군	처리농도(%)	MMP-1 발현억제율(%)
대조군	-	-
참나물 추출물(실시예 1)	0.1	24
레티놀	0.1	18

실시예 6 : B16F1 멜라노싸이트를 이용한 멜라닌 생성 억제효과 측정 실험

본 실시예에서는 실시예 1에서 수득한 참나물 추출물의 미백효과를 확인하기 위해 B16F1 멜라노싸이트에 대한 멜라닌 생성 억제 정도를 실험하였다.

본 실시예에 사용된 B16F1 멜라노싸이트는 마우스에서 유래한 세포균주이며, 멜라닌이라는 흑색색소를 분비하는 세포이다. 이 세포의 인공배양중에 시료를 처리하여 멜라닌 흑색색소가 감소하는 정도를 비교 평가하였다. B16F1 멜라노싸이트는 ATCC(American Type Culture Collection, 기탁번호:6323)로부터 분양받아 사용하였다.B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 생합성 억제효과 측정은 다음과 같이 행하였다.

B16F1 멜라노싸이트를 6 웰 플레이트에 각 웰당 2×10⁶ 농도로 분주하고 세포를 부착시킨 후 독성을 유발하지 않는 농도로 시료를 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 72시간 배양 후 세포를 trypsin-EDTA로 떼어 낸 후 세포수를 측정한 다음 원심분리하여 세포를 회수하였다. 세포내 멜라닌의 정량은 로탄(Lotan: Cancer Res., 40: 3345-3350, 1980)의 방법을 약간 변형하여 실시하였다.

셀 펠릿을 PBS로 1회 세척한 후 균질화 버퍼액(50 mM 소듐 포스페이트, pH 6.8, 1% Triton X-100, 2 mM PMSF) 1ml를 첨가하여 5분간 와류하여 세포를 파쇄하였다. 원심분리(3,000 rpm, 10분)하여 얻은 세포 여액에 1N NaOH(10% DMSO)를 첨가하여 추출된 멜라닌을 용해한 후 마이크로 플레이트 판독기로 405nm 에서 멜라닌의 흡광도를 측정한 다음 멜라닌을 정량하여 시료의 멜라닌 생성 저해율(%)을 측정하였다. B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 생성 저해율(%)은 수학식 3에 의하여 계산하였으며, IC₅₀값은 멜라닌 생성을 50% 저해하는 물질의 농도이다.

저해율(%) = [(A-B)/A]×100

A : 시료를 첨가하지 않은 웰의 멜라닌 양

B : 시료를 첨가한 웰의 멜라닌 양

시료명	처리농도(%)	멜라닌 합성 저해효과(IC₅₀)
참나물 추출물(실시예 1)	0.1	0.06%
하이드로퀴논	0.1	0.03%
알부틴	0.1	0.2%
상백피 추출물	0.1	5%
유용성 감초 추출물	0.1	0.03%

실험 결과 참나물 추출물의 IC₅₀값은 0.06%로 기존의 미백제인 하이드로퀴논, 알부틴, 유용성 감초 추출물, 상백피 추출물 등에 비해 유사하거나 우수한 효과를 나타내었다.

실시예 7 : 자외선 조사에 의한 세포독성 완화 효과

본 실시예는 실시예 1에서 수득한 참나물 추출물의 자외선 조사에 의한 세포독성의 완화 효과를 평가하기 위하여 실시되었다. 섬유아세포(fibroblast)를 24-웰 시험 플레이트에 1×10⁵개씩 넣고 24시간 동안 부착시켰다. 각 웰을 PBS로 1회 세척하고 각 웰에 500ul의 PBS를 넣었다. 이 섬유아세포에 자외선 B(UVB) 램프(Model: F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki사, Japan)를 이용하여 자외선 10mJ/㎠를 조사한 후 PBS를 덜어내고 세포배양 배지(DMEM에 10% FBS가 첨가된 것) 1㎖를 첨가하였다. 여기에 평가하고자 하는 참나물 추출물을 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 24시간이 지나면 배지를 제거하고, 각 웰 당 세포배양 배지 500㎕ 배지와 MTT 용액(2.5㎎/㎖) 60㎕를 넣은 후 2시간동안 37℃ CO₂배양기에서 배양하였다. 배지를 제거하고 이소프로판올-HCl(0.04 N)을 500㎕씩 넣어주었다. 5분간 진탕하여 세포를 용해시키고 상등액 100㎕씩을 96-웰 시험 플레이트에 옮긴 후, 마이크로플레이트 판독기에서 565nm 흡광도를 측정하였다.

수학식 4에 의해 세포생존율(%)을 측정하고 자외선에 의한 세포독성 완화율은 수학식 5에 의하여 계산하였다.

세포생존율(%) = [(St-Bo)/(Bt-Bo)]×100

Bo : 세포배양배지 만을 발색 반응한 웰의 565 nm 흡광도

Bt : 시료를 처리하지 않은 웰을 발색 반응한 웰의 565 nm 흡광도

St : 시료를 처리한 웰을 발색 반응한 웰의 565 nm 흡광도

자외선에 의한 세포독성 완화율(%) = [1-(St-Bo)/(Bt-Bo)]×100

Bo : 자외선 조사하지 않고 시료 처리하지 않은 웰의 세포 생존율

Bt : 자외선 조사하고 시료를 처리하지 않은 웰의 세포생존율

St : 자외선 조사하고 시료를 처리한 웰의 세포생존율

시료명	처리농도(%)	세포독성 완화율(%)
참나물 추출물(실시예 1)	0.013	37
참나물 추출물(실시예 1)	0.025	62

실험결과 참나물 추출물은 자외선에 의한 세포 독성을 0.013% 농도에서 37% 완화하여 자외선에 의한 세포독성에 대해 효과적으로 방어함을 알 수 있었다. 그리고 자외선에 의한 세포손상을 낮은 농도에서도 효과적으로 방어함을 알 수 있다.

실시예 8 : 자외선 조사에 의한 염증성 사이토카인 발현 억제효과

본 실시예는 실시예 1에서 수득한 참나물 추출물의 자외선 조사에 의해 발현되는 염증성 사이토카인 발현 억제효과를 평가하기 위하여 사람의 표피 조직에서 분리한 섬유아세포(Fibroblast)를 24-웰 시험 플레이트에 5×10⁴개씩 넣고 24시간 동안 부착시켰다. 각 웰을 PBS로 1회 세척하고 각 웰에 500㎕의 PBS를 넣었다. 이 섬유아세포에 자외선B(UVB) 램프(Model: F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki사, Japan)를 이용하여 자외선 10mJ/㎠를 조사한 후 PBS를 덜어내고 세포배양 배지(DMEM에 FBS가 첨가되지 않은 배지) 350㎕를 첨가하였다. 여기에 평가하고자 하는 참나물 추출물을 처리한 후 5시간 동안 배양하였다. 배양 상층액을 150㎕ 취하여 IL-1α를 정량함으로서 참나물 추출물의 염증성 사이토카인 발현억제 효과를 판단하였다. IL-1α의 양은 효소면역분석법(Enzyme-linked Immunosorbent Assay)을 이용하여 정량화하였으며, IL-1α의 생성율은 수학식 6에 의해 계산하였다.

염증성 사이토카인 발현 억제율(%) = [1-(St-Bo)/(Bt-Bo)]×100

Bo : 자외선 조사하지 않고 시료 처리하지 않은 웰의 IL-1α 생성량

Bt : 자외선 조사하고 시료를 처리하지 않은 웰의 IL-1α 생성량

St : 자외선 조사하고 시료를 처리한 웰의 IL-1α 생성량

시료명	처리농도(%)	염증성 사이토카인 발현 억제율(%)
참나물 추출물(실시예 1)	0.013	35
참나물 추출물(실시예 1)	0.025	72

실험결과 참나물 추출물은 자외선에 의한 염증성 사이토카인인 IL-1α의 생성을 0.013% 농도에서 35% 억제하여, 자외선에 의한 염증 발생을 낮은 농도에서 효과적으로 방어함을 알 수 있다(표 7).

실시예 9: 항균력 시험(Paper Disc Test)

본 실시예는 실시예 1에서 수득한 참나물 추출물의 여드름균에 대한 항균력을 확인하기 위한 페이퍼 디스크 테스트(Paper Disc Test)를 실시하였다. 먼저, 여드름 발생원인의 피부 상재균인 프로피오니박테리움 아크네(Propionibacterium acnes)를 활성화시키기 위하여 BHI액체배지(Brain-Heart Infusion Broth;3.7%)에서 48시간 전배양하였다. 이렇게 준비한 균배양액을 BHI고체배지(Brain-Heart Infusion Broth;3.7%;agar1.5%)에 0.1㎖씩 도말한 후 건조시켰다.

실시예 1에서 수득한 참나물 추출물을 95% 에탄올 수용액에 12%(W/v)로 희석하여 직경 8㎜의 paper disc에 50㎕씩 점적한 후 앞서 준비한 고체배지 위에 올려놓은 후 이것을 35℃ 혐기 배양조에서 3일간 배양하였다. Paper disc 주변에 생긴 균 성장 저지 영역을 관찰하고 저지환의 크기를 측정함으로써 항균력을 평가하였다. 그 결과, 참나물 추출물의 균 성장 저지환의 크기는 21㎜인 것으로 나타났다.

실시예 10 : 참나물 추출물의 5알파-리덕타아제 활성 억제력 평가실험

5알파-리덕타아제 활성억제 실험에 사용된 5알파-리덕타아제는 포피 유래의 섬유아세포가 생성하는 효소를 사용하였다.

섬유아세포를 마이크로플레이트 홀(microplate hole)마다 10000개의 세포가 들어가도록 접종한 후 배양한다. 각 홀마다 3H(트리튬)으로 방사선표지(radio labelling)된 테스토스테론을 0.1.mμ.Ci 첨가한 후에 배양하므로 섬유아세포가 이를 이용하는지 측정한다. 대조군으로는 참나물 추출물이 들어가지 않은 것을 사용하였다. 24시간 배양 후 상등액을 얻고 에틸아세테이트(ethyl acetate)-사이클로헥산(cyclohexane)(1:1) 추출용매 1㎖로 스테로이드(steroids)를 얻는다. 이 얻어진 스테로이드를 박막크로마토그래피판에 올려놓고 클로로포름/메탄올 혼합액(98/2 (v/v))로 전개시킨다. 테스토스테론과 디하이드로테스토스테론에 해당하는 점의 방사활성을 덴시토미터를 이용하여 측정하여 전환율을 계산하고, 그 결과를 대조군(추출물을 첨가하지 않았을 때의 전환율)과 비교하여 하기 수학식 7에 의해 5알파-리덕타아제 저해능을 평가하였다.

저해능(%)=[A-B]/[A]×100

A = 테스토스테론에서 다이하이드로테스토스테론으로의 전환율(추출물 미첨가시)

B = 테스토스테론에서 다이하이드로테스토스테론으로의 전환율(추출물 첨가시)

참나물 추출물 농도(%)	1	0.1	0.05	0.01	0.005	0.001	0.0001
저해율(%)	100.0	97.0	92.0	78.5	71.5	42.9	34.0

실험 결과 참나물 추출물은 5알파-리덕타아제 저해효과가 있음을 확인하였다(표 8).

실시예 11: 모발성장 효과 시험

본 실시예는 실시예 1에서 수득한 참나물 추출물 건조 엑기스 2%를 함유하는 30% 함수 에탄올(ethanol) 용액을 제조하여 시험에 사용하였다.

모발성장효과 시험은 마우스(ICR), 생후 47∼53일 것을 사용하여 등 부위 털을 제거하고, 등 부위가 깨끗한 것을 골라 물질군마다 10마리를 사용하여 다음날부터 매일 실시예의 시험물질을 개체당 100㎖씩 도포하였다. 시간 경과에 따른 모발의 길이 및 모발 성장 정도를 모 제거 후 복원 정도에 따라 점수를 부가하여 각각 비교하였다. 모발성장 정도를 비교하기 위하여, 대조군으로는 30% 알코올 용액을 각 개체에 도포하여 성장 상태를 관찰하였다.

경과일수/시료	5	10	15
참나물 추출물	0.25	0.85	1.73±0.36
대조군	0.08	0.24	1.01±0.25

실험결과, 참나물 추출물은 우수한 모발성장촉진 효과가 있음을 알 수 있다.

실시예 12 및 비교예 1

본 실시예는 실시예 1에서 수득한 참나물 추출물을 함유한 화장료를 제조하여 사람을 대상으로 피부탄력 개선 효과를 비교예 1과 비교실험을 행하여 평가하였다.

비교실험에 사용된 화장료는 크림형태이고, 그 조성은 표 10에 나타낸 바와 같다. 우선 표 10에 기록되어 있는 나)상을 가열하여 70℃에 보존한다. 이것에 가)상을 가하여 예비유화 후 호모믹서로 균일하게 유화하고 다음에 서서히 냉각하여 크림(실시예 12, 비교예 1)을 제조한다. 실험자(20세-35세의 여성) 20명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 실시예 13에서 제조된 크림을 얼굴 왼쪽 부위에는 비교예 1에서 제조된 크림을 각각 1일 2회씩 연속 3개월간 도포하였다.

실험완료 후 피부 탄력 개선 효과는 제품 사용 전과 2개월간 사용 후에 피부탄력측정기(cutometer SEM 575, C+K Electronic Co., Germany)를 이용하여 측정하였다. 실험결과는 하기 표 11에 Cutometer SEM 575의 △R7값으로 기재하였는데 R7값은 피부의 점탄성(viscoelasticity)의 성질을 나타낸다.

실시예 12			비교예 1
가	스테아릴 알콜	8	8
	스테아린산	2	2
	스테아린산 콜레스테롤	2	2
	스쿠알란	4	4
	2-옥틸도데실알콜	6	6
	폴리옥시에틸렌(25몰부 가)알콜에스테르	3	3
	글리세릴모노스테아린산 아스테르	2	2
나	참나물 추출물	1	-
	프로필렌글리콜	5	5
	적량	적량	적량

주)단위: 중량%

실험제품	피부탄력효과(△R7)
실시예 12	0.26
비교예 1	0.11

n=20, p＜0.05

표 11에서 나타난 바와 같이 참나물 추출물을 함유한 크림을 도포한 실험자의 피부 탄력개선 효과가 우수함을 알 수 있다.

실시예 13 및 비교예 2

본 실시예는 실시예 1에서 수득한 참나물 추출물을 함유한 화장료를 제조하여 사람을 대상으로 피부 미백효과를 비교예 2과 비교실험을 행하여 평가하였다.

비교실험에 사용된 화장료는 크림형태이고, 그 조성은 표 12에 나타낸 바와 같다. 우선 표 12에 기록되어 있는 나)상을 가열하여 70℃에 보존한다. 이것에 가)상을 가하여 예비유화 후 호모믹서로 균일하게 유화하고 다음에 서서히 냉각하여 크림 (실시예 13, 비교예 2)을 제조한다. 실험자(20세-35세의 여성) 20명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 실시예 14에서 제조된 크림을, 얼굴 왼쪽 부위에는 비교예 2에서 제조된 크림을 각각 1일 2회씩 연속 2개월간 도포하였다. 시험 완료 후 얼굴 좌우 양편의 도포 부위 피부를 화상분석기 및 피부색의 변화를 크로마메타(Minolta CR300)를 이용하여 색의 밝기변화(ΔL)를 측정하고, 복수의 숙련자에 의한 객관적 육안관찰과 피검자에 의한 주관적 육안관찰을 실시하여 하기 등급 분류에 따라 효과를 측정하였다. 그 결과를 하기 표 13에 나타내었다. 이때 미백효능 정도를 다음의 7등급으로 분류하여 평가하였다.

* 미백효능 평가 기준

-3: 매우 악화 -2: 악화 -1: 약간 악화 0: 변화 없음

1: 약간 개선 2: 개선 3: 매우 개선

실시예 13			비교예 2
가	스테아릴 알콜	8	8
	스테아린산	2	2
	스테아린산 콜레스테롤	2	2
	스쿠알란	4	4
	2-옥틸도데실알콜	6	6
	폴리옥시에틸렌(25몰부 가)알콜에스테르	3	3
	글리세릴모노스테아린산 아스테르	2	2
나	참나물 추출물	1	-
	프로필렌글리콜	5	5
	적량	적량	적량

주)단위: 중량%

	피부색의 밝기 변화(ΔL)		숙련자의 객관적 평가		피검자의 주관적 평가
	실시예 13	비교예 2	실시예 13	비교예 2	실시예 13	비교예 2
평균값	7.12	3.52	2.5	1.7	3.1	2.3

표 13에서 나타낸 바와 같이 참나물 추출물을 함유한 크림을 도포한 실험자의 안면 피부에서 미백효과가 우수함을 알 수 있다.

이하에서는 그 외의 실시예로서 실시예 1에서 수득한 참나물 추출물을 함유한 화장수, 유액 및 미용액을 제조하였다. 참나물 추출물을 함유한 화장수, 유액 및 미용액은 항산화 효과, 콜라겐 합성 촉진 효과, 피부 잔주름 개선 효과, 육모효과, 여드름방지효과, 피부자극 완화효과 등 피부개선에 우수한 효과를 나타내었다.

실시예 14: 실시예 1에서 수득한 참나물 추출물을 함유한 화장수의 제조

95% 에탄올 8g에 폴리피로리돈 0.05g, 올레일알콜 0.1g, 폴리옥시에틸렌모노올레이트 0.2g, 향료 0.2g, 파라옥시안식향산메틸에스테르 0.1g, 소량의 산화방지제, 소량의 색소를 혼합 용해한다. 실시예 1에서 수득한 참나물 추출물 0.05g, 글리세린 5g을 정제수 85.33g에 용해한 것에 상기 혼합액을 첨가한 후 교반하여 피부개선효과가 있는 화장수를 얻었다.

실시예 15: 실시예 1에서 수득한 참나물 추출물을 함유한 유액의 제조

세틸알콜 1.2g, 스쿠알란 10g, 바세린 2g, 파라옥시안식향산에틸에스테르 0.2g, 글리세린모노에스테아레이드 1g, 폴리옥시에틸렌(20몰부가)모노올레이트 1g 및 향료 0.1g을 70℃에서 가열혼합 용해하고, 실시예 1에서 수득한 참나물 추출물 0.5g, 디프로필렌글리콜 5g, 폴리에틸렌글리콜-1500 2g, 트리에탄올아민 0.2g, 정제수 76.2g을 75℃로 가열해서 용해시킨다. 양자를 혼합하여 유화시킨 후 냉각하여 수중유(O/W)형의 피부개선 효과가 있는 유액을 얻었다.

실시예 16: 실시예 1에서 수득한 참나물 추출물을 함유한 미용액의 제조

95% 에틸알콜 5g에 폴리옥시에틸렌솔비탄모노올레이트 1.2g, 키툴로오즈 0.3g, 히야론산나트륨 0.2g, 비타민 E-아세테이트 0.2g, 감초산 나트륨 0.2g, 파라옥시안식향산에틸에스테르 0.1g, 실시예 1에서 수득한 참나물 추출물 1g 및 적량의 색소를 혼합하여 피부개선 효과가 있는 미용액을 얻었다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 참나물 추출물은 항산화 효과와 MMP 저해 효과와 자외선 조사에 의한 MMP 발현 조절효과, 잔주름 개선 효과 등 우수한 항노화 효과와 자외선 조사 후 야기되는 피부 자극을 완화시켜 주는 효과가 있다.

또한, 참나물 추출물은 기미, 주근깨 및 피부 색소 침착의 원인이 되는 물질인 멜라닌 생성억제 효과 등을 통해 미백작용을 나타낸다.

또한, 참나물 추출물은 우수한 탈모방지 효과와 여드름방지 효과를 갖는 여드름균 항균활성과 5알파-리덕타아제 억제 효과를 나타낸다.

따라서, 이러한 참나물 추출물을 함유하는 화장수, 크림, 유액, 팩, 파우더 등의 화장료 조성물은 항산화 효과와 콜라겐 분해효소 활성 조절 효과, 피부 잔주름 개선 효과, 미백, 육모, 여드름방지, 피부자극 완화효과 등 우수한 피부외용제로서의 효능을 가진다.

이상에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 대해 설명하였으나 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본원 발명의 요지를 벗어남이 없이 다양한 변형실시가 가능할 것이며, 이러한 변형실시는 본원발명의 보호범위에 속하는 것으로서 본원발명의 보호범위는 특허청구범위에 기재된 바에 따라 해석되어야 할 것이다.

Claims

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참나물 추출물 0.001∼30.0 중량%를 함유하고, 여드름 예방, 피부노화방지용으로 사용되는 것을 특징으로 하는 피부외용제 조성물.
참나물 추출물 0.001∼30.0 중량%를 함유하고, 미백용으로 사용되는 것을 특징으로 하는 피부외용제 조성물.
참나물 추출물 0.001∼30.0 중량%를 함유하고, 모발손상방지, 육모용으로 사용되는 것을 특징으로 하는 피부외용제 조성물.
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