KR20060012805A

KR20060012805A - 산마늘 추출물을 함유하는 피부외용제 조성물

Info

Publication number: KR20060012805A
Application number: KR1020040061450A
Authority: KR
Inventors: 안성관
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2004-08-04
Filing date: 2004-08-04
Publication date: 2006-02-09

Abstract

본 발명은 산마늘 추출물을 함유하는 피부외용제 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세히는 백합과의 산마늘의 줄기와 근부 추출물을 활성성분으로 0.001 ~ 30.0중량%, 바람직하게는 0.01 ~ 5중량%를 함유하는 것을 특징으로 하는 노화방지효과, 미백효과, 육모효과, 여드름방지효과 및 피부자극완화 효과가 우수한 피부외용제 조성물에 관한 것이다.

산마늘 추출물, 항노화용 화장료, 주름방지효과, 미백효과, 육모효과, 여드름방지효과, 피부자극 완화 효과, 피부외용제

Description

산마늘 추출물을 함유하는 피부외용제 조성물{A skin agent containing Allium victorialis var. platyphyllum extract}

본 발명은 산마늘 추출물을 주요 활성성분으로 함유하는 피부외용제 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세히는 백합과의 산마늘(Allium victorialis var. platyphyllum)의 잎, 줄기와 근부의 천연물로부터 제조된 추출물을 활성성분으로 0.001 - 30.0중량%, 바람직하게는 0.01 - 5중량%를 함유하는 것을 특징으로 하는 항산화효과, 주름방지효과, 미백효과, 육모효과, 여드름방지효과, 피부자극 완화 효과가 우수한 피부외용제 조성물에 관한 것이다.

사람의 피부는 노화 과정에서 다양한 물리·화학적인 변화가 일어나며 그 원인으로는 크게 내적인 노화(intrinsic aging)와 광노화(photo-aging)로 구분되며 이에 관한 연구가 활발히 이루어져 왔다[Ridder GM등: J. Am. Acad. Dermatol., 25, 751-760(1991)]. 즉, 자외선, 스트레스, 질병상태, 환경인자, 상처, 나이가 들어감에 따라 프리라디칼이 활성화되어 야기될 수 있으며, 이런 상태가 심화될 경우 생체 내에 존재하는 항산화 방어망을 파괴하고, 세포 및 조직을 손상시켜 성인병 및 노화를 촉진하게 된다. 좀 더 구체적으로 말하자면, 피부의 주요 구성물질인 지질, 단백질, 다당류 및 핵산 등이 산화되어 피부세포 및 조직이 파괴되고, 결국 피부노화 현상이 생겨나는 것이다. 특히 단백질의 산화는 피부의 결합조직인 콜라겐, 히야루론산, 엘라스틴, 프로테오글리칸, 피브로넥틴(fibronectin) 등이 절단되어 심한 과다 염증반응과 피부의 탄력에 지장을 주게 되고 이것이 더 심해질 경우 DNA의 변이에 의해 돌연변이, 암의 유발, 면역기능 저하의 사태에 이르게 된다.

그러므로 신체의 대사과정 중 발생하는 프리라디칼이나 자외선 조사, 염증반응에 의해 매개되는 프리라디칼을 소거하여 세포막을 보호하고, 또 이미 손상받은 세포는 활발한 신진대사에 의해 재생시켜서 세포를 증식시켜야 피부는 빠르게 회복되고 건강한 피부를 유지할 수 있다. 노화에는 프리라디칼뿐만 아니라 MMP라는 효소가 관여하는 것으로 알려져 있으며 생체 내에서 콜라겐과 같은 세포외 기질의 합성과 분해는 적절하게 조절되나 노화가 진행되면서 그 합성이 감소하며 콜라겐을 분해하는 효소인 기질 금속단백질 분해효소(MMP)의 발현이 촉진되어 피부의 탄력이 저하되고 주름이 형성된다. 또한 자외선 조사에 의해 이러한 분해효소가 활성화되기도 한다. 그러므로 세포 내에서 활성화가 유도되는 MMP 발현을 조절하거나 그 활성을 억제할 수 있는 물질의 개발이 요구되고 있다. 이제까지 화장품의 소재로서 사용된 원료들은 단순히 효소 활성만을 억제하는 것이 대부분이었다. 이에 세포내 자연노화와 광노화에 의해 그 발현이 유도되는 MMP 발현양 및 활성을 조절하고자 하였다.

다음으로, 색소 침착에 의한 피부 변화이다. 피부색에 영향을 주는 색소로는 멜라닌, 멜라노이드, 카로틴, 헤모글로빈 등이 있는데 이중 가장 중요한 것은 멜라닌으로 생합성에 영향을 미치는 가장 큰 요인은 자외선과 체내 호르몬 분비정도이다. 멜라닌은 자외선을 흡수 또는 산란시켜 자외선으로부터 피부가 손상되는 것을 방지하는데 큰 역할을 하는데, 특별한 최대흡수파장이 없으며 전 영역의 빛을 흡수한다. 또한 활성산소종을 제거하는 기능이 탁월하나, 때로는 멜라닌 자체가 활성산소를 발생시키기도 하며, 멜라닌 구조내의 카테콜이나 퀴논에 의하여 다른 물질을 환원시키거나 산화시키고, 멜라닌 자체가 자유라디칼의 성질을 나타내기도 한다.

멜라닌의 생합성은 아미노산의 일종인 티로신이 멜라노사이트의 멜라노좀에서 티로시나제에 의해 산화되어 디하이드록시 페닐알라닌 (dihydroxy phenylalanine)으로 전환되는 것을 시작으로 계속되는 일련의 산화과정을 거쳐 갈색(pheomelanin), 흑색(eumelanin)의 중합체로 형성된다. 이러한 생합성 과정은 멜라노좀이라는 특수한 형태의 갈색 세포내 소기관에서 진행되며 멜라닌 과립을 포함한 멜라노좀은 핵 주변 부위에서 수지상 돌기 끝부분으로 이동, 케라티노사이트의 식세포작용에 의해 세포질 내로 이동하고 이들은 케라티노사이트의 핵 주변에 축적된다. 이미 아스코르빈산(일본특개평 4-9320), 하이드로퀴논(일본특개평 6-192062), 코직산(일본특개소 56-7710), 알부틴(일본특개평 4-93150) 및 유용성 감초추출물 등이 티로시나제 저해 활성을 가지고 있어 미백 화장료로 이용되고 있으나 화장품 제형 중에서의 안정성이 떨어지는 것으로 나타났으며, 생체 레벨에서의 효능, 효과의 불분명 및 안전성 문제 등으로 사용이 제한되고 있는 실정이다.

또한, 남성형 탈모증은 남성호르몬 의존적이어서 남성호르몬의 양에 직접적인 관계가 있으며, 이에 따라 최근 남성호르몬 활성억제를 통한 탈모의 예방 및 치료를 위한 많은 연구가 보고되고 있다. 한편, 남성호르몬의 분비상승에 의해 피지선의 기능이 상승되면 생성된 과잉의 피지가 모낭벽의 과각화로 인하여 모낭내에 정체되면서 생기는 면포가 여드름의 초기단계이다. 남성호르몬에 의한 탈모 및 여드름의 기전을 설명하면, 5알파-리덕타아제(5α-Reductase)는 피지선, 모낭, 전립선, 부고환 등의 남성 호르몬 반응성 조직에서 존재하며 남성 호르몬들 중 하나로서, 테스토스테론(testosterone)을 디하이드로테스토스테론(dihydrotestosterone)으로 대사시키는데 관여하는 효소이며, 그 전환에는 NADPH를 필요로 한다. 또한, 테스토스테론(testosterone)은 남성 성충동, 골격근 증가, 남성외부생식기, 음낭성장, 정자형성 등에 관여하고, 디하이드로테스토스테론(dihydrotestosterone)은 여드름, 피지증가, 탈모 및 전립선비대증 등의 해당 조직에서 관여한다(Diane et al. J.I.D. 1995). 따라서, 이 효소의 억제제를 사용하여 피지분비 억제제 및 탈모 방지제를 개발하려는 연구들이 활발히 진행되고 있다. 사춘기 이후에 남성 호르몬의 과량 분비는 여드름과 탈모를 유발하는데, 5알파-리덕타아제에 의하여 남성 호르몬의 활성형태인 디하이드로테스토스테론의 과량 생성을 막기 위해 5알파-리덕타아제 억제제를 사용하여 육모제 및 여드름방지제를 개발하려는 연구들이 활발히 진행되고 있다.

이러한 다양한 피부의 문제를 해결하기 위하여 최근에는 화학물질 등에 의한 피부자극을 줄이고자 식물성 추출물 등의 천연물을 첨가한 조성물이 다양하게 개발 되고 있다. 천연재료는 피부에 부작용이 적을 뿐만 아니라, 이를 이용한 화장품에 대한 소비자들의 호응 또한 높아짐에 따라 화장품 원료로서 개발가치가 한층 높아지고 있다.

이러한 천연물 중에 산마늘(Allium victorialis var. platyphyllum)은 백합과의 Allium속 식물로서 아시아의 중북부인 한국, 일본, 중국 북부, 시베리아 동부, 캄차카반도 등지에 자생하는 다년초 식물이다. 또한 재배하여 식용하는 식용 마늘(Allium savitum)과는 유전학적 측면과 분류학적 측면 모두에서 다르며 이의 생리활성 기능도 다른 것이 발견되었다. 산마늘은 우리 나라에서 울릉도, 지리산, 설악산 등에 자생하고 있으며 이른봄에 먹는 중요한 산나물의 하나로 멩이, 맹이, 명이 라고도 하며 오래전부터 구황식물로 식용으로 이용하고 있다. 산지에서 자라며 비늘줄기는 바소꼴이고 길이 4~7cm이며 그물 같은 섬유로 싸여 있다. 잎은 넓고 크며 2~3개씩 달린다. 잎몸은 타원형이거나 달걀 모양이고 길이 20~30cm, 너비 3~10cm이다. 가장자리는 밋밋하고 밑부분은 통으로 되어 서로 얼싸안는다. 꽃은 5~7월에 피고 꽃줄기 끝에 산형꽃차례로 달린다. 포(苞)는 달걀 모양이고 2개로 갈라진다. 화피는 긴 타원형으로서 길이 5~6mm이며 6장이고 보통 흰빛이다. 한방에서는 산마늘이 몸을 따뜻하게 해주고 위를 보호해 주고 독을 없애주는 역할을 한다고 알려져 있다.

이러한 산마늘을 이용한 종래 기술로 대한민국 특허 제387279호는 산마늘( Allium victorialis ) 추출물을 유효 성분으로 하는 동맥경화증의 예방 및 치료용 조성물에 관하여 기재하고 있으며, 대한민국 특허 제435229호는 산마늘 추출물이 5~85중량% 함유되는 기능성 음료에 대하여 기재하고 있다.

본 발명은 여러 천연물들 중 백합과의 산마늘 추출물을 이용하여 피부외용제의 원료로서의 효능을 확인하고, 이 추출물을 함유하는 피부외용제 조성물로 제공하려는 것이다.

즉, 본 발명의 목적은 항산화효과, 콜라게나제 분해억제 효과, 피부잔주름 방지효과 등 우수한 항노화 효과와 미백효과, 염증매개 물질에 의한 피부자극 완화 효과 및 탈모방지, 여드름방지 효과를 갖는 5알파-리덕타아제 억제효과가 있는 산마늘 추출물을 함유하는 피부외용제 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자는 여러 식물에 있어서 피부외용제로서의 응용 가능성을 연구하던 중 백합과의 산마늘의 줄기와 근부로부터 추출물을 제조하여 피부 항산화 효과, 콜라겐 합성효과, 피부 잔주름 완화효과, 미백효과, 육모효과, 여드름방지효과 및 피부자극완화 효과를 측정한 결과 매우 우수한 효능을 확인하고 이를 이용하여 피부외용제 조성물을 제조하였다.

본 발명은 산마늘 추출물을 함유하는 피부외용제 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 산마늘 추출물이 전체 조성물 총 중량을 기준으로 0.001~30.0중량%로 함유되는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 0.01~5중량%를 함유하도록 하며, 산마늘 추출물의 함량이 0.001중량% 미만이면 효능이 미약하며, 30.0중량%를 초과하면 함유량 증가에 따른 뚜렷한 효능의 증가가 나타나지 않아 경제적이지 못하다.

또한, 본 발명은 상기 산마늘 추출물이 정제수, 메탄올, 에탄올, 글리세린, 에틸아세테이트, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디클로로메탄 및 헥산으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 1종 이상을 용매로 사용하여 상온에서 냉침, 가열 여과하여 얻어진 액상물, 추가로 용매를 감압농축 또는 동결건조하여 얻는 것을 특징으로 한다.

뿐만 아니라, 본 발명은 상기 피부외용제 조성물이 화장료 조성물 또는 약학 조성물인 것을 특징으로 한다.

나아가, 본 발명은 상기 화장료 조성물이 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 수중유(O/W)형 또는 유중수(W/O)형으로 제형화되는 것을 특징으로 한다.

더욱이, 본 발명은 상기 화장료 조성물 또는 약학 조성물이 항산화, 주름완화, 미백, 육모, 여드름 예방, 자외선에 의한 피부손상 억제 또는 자극완화 기능을 지니는 것을 특징으로 한다.

산마늘 추출물은 캡슐제, 액상제, 연고제, 첩부제 또는 약학적으로 허용되는 담체를 이용한 서방화제제 등의 약학 조성물로 제제화할 수 있으며, 약리학적으로 허용되는 기제, 운반제, 부형제, 결합제(예: 전분, 트래거캔스 고무, 젤라틴, 당 밀, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐에테르, 폴리비닐 피롤리돈, 히드록시프로필 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스 및 카르복시메틸 셀룰로오스), 분쇄제(예: 한천, 전분, 젤라틴 가루, 카르복시메틸 셀룰로오스 나트륨, 카르복시메틸 셀룰로오스 칼슘, 결정 셀룰로오스, 탄산칼슘, 탄산수소나트륨 및 알긴산 나트륨), 윤활제(예: 스테아린산 마그네슘, 활석, 수첨 식물유) 및 착색제 등을 포함한다. 상기 운반제 및 부형제로는 젖당, 글루코오스, 수크로오스, 만니톨, 감자녹말, 옥수수녹말, 탄산칼슘, 인산칼슘 및 셀룰로오스 등을 사용한다.

상기 외에도 안정화제, 용해보조제, 경피흡수 촉진제 등의 보조제, 방향제, 방부제 등의 첨가제가 더 첨가될 수 있다.

이와 같이 제조되는 약학 조성물은 증상에 따라 적량을 일일 1회 내지 수회 피부에 적용할 수 있으며 증상의 호전정도에 따라 적용량이나 횟수를 조절할 수 있다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 좀더 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명의 예시적인 기재일 뿐이며 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.

실시예 1: 산마늘 추출물 제조

세절하여 음건한 산마늘을 95%(V/V) 에탄올 수용액으로 5시간씩 3회 환류추출하고 냉침한 후, 와트만(Whatman) #5 여과지로 여과하였다. 여과된 추출물을 50 ℃ 이하에서 감압농축 및 동결건조하였다. 감압농축물 및 동결건조물이 0.001 - 30.0중량% 함유되게 정제수, 에탄올, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 중에서 선택된 1종 이상의 용매를 사용하여 분산/용해하여 산마늘 추출물을 제조하였다.

실시예 2: NBT법을 이용한 항산화 효과 측정 실험

본 실시예는 산마늘 추출물의 항산화 효과를 확인하기 위해 실험실 조건에서 실시예 1에서 제조된 산마늘 추출물과 항산화제로 잘 알려진 레티놀, BHT를 비교샘플로 하여 NBT법으로 항산화 활성을 측정하였다.

항산화 효과 측정은 크산틴과 크산틴옥시다제에 의해 생성되는 활성산소를 NBT법에 의해 측정하고 피검물질이 활성산소를 제거하는 효과로 평가하였다. 즉, 크산틴과 크산틴옥시다제에 의해 활성산소를 생성시키고 이 활성산소가 니트로블루테트라졸리움(Nitro Blue Tetrazolium;NBT)과 반응하여 생성되는 청색을 파장 560nm에서 측정하는 것으로 활성산소 소거율을 측정하였다.

측정방법으로서

1. 0.05M Na₂CO₃ ------------------------------------- 2.4ml

2. 3mM 크산틴 용액---------------------------------- 0.1ml

3. 3mM EDTA 용액------------------------------------ 0.1ml

4. BSA 용액----------------------------------------- 0.1ml

5. 0.72mM NBT 용액---------------------------------- 0.1ml

6. 크산틴 옥시다제 용액----------------------------- 0.1ml

7. 6mM CuCl₂ 용액----------------------------------- 0.1ml

① 바이엘병에 상기 1,2,3,4,5를 가하고, 여기에 시료용액 0.1ml을 첨가하고 25℃에서 10분간 방치한다.

② 6을 가하여 빨리 교반하고 25℃에서 20분간의 배양을 개시한다.

③ 그 후 7을 가하여 반응을 정지시키고 560nm에서의 흡광도 St를 측정한다.

④ 공시험은 시료용액 대신에 증류수를 첨가하고 상기와 같이 조작하여 흡광도 Bt를 측정한다.

⑤ 역시, 시료용액의 블랭크(Blank)는 6 대신에 증류수를 사용해 조작하여 흡광도 Bo를 측정한다.

상기 측정된 흡광도로 수학식 1을 이용하여 활성산소 소거율을 산출하고, 그결과는 표 1에 나타냈다.

소거율(%) = [1-(St-So)/(Bt-Bo)] X 100

St: 시료용액의 효소 반응 후의 560nm에서의 흡광도

Bt: 공시험용액의 효소 반응 후의 560nm에서의 흡광도

So: 시료용액의 효소 무첨가시 반응 후의 560nm에서의 흡광도

Bo: 공시험용액의 효소 무첨가시 반응 후의 560nm에서의 흡광도

표 1과 같이 0.1% 농도에서 시험한 모든 시료에서 우수한 항산화 효과를 확 인할 수 있으며, 산마늘 추출물은 레티놀과 BHT와 유사한 항산화 효과를 나타내었다.

시료명	처리농도 (%)	항산화 효과(%)
산마늘 추출물(실시예 1)	0.1	93
레티놀	0.1	93
BHT	0.1	90

실시예 3: DPPH법을 이용한 항산화 효과 측정

본 실시예는 실험실 조건에서 녹차추출물과 비타민 E를 비교샘플로 하여 DPPH법을 이용하여 산마늘 추출물 항산화 활성을 측정하였다.

DPPH법은 2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl 자유라디칼(DPPH)이라는 유리기를 이용하여 환원력에 의한 항산화 활성을 측정하는 방법이다. 피검물질에 의해 DPPH가 환원되어 흡광도가 감소하는 정도를 공시험액의 흡광도와 비교하여 파장 560nm에서 자유라디칼 소거율을 측정하였다.

0.1mM DPPH(2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl free radical; Aldrich Chem. Co., M.W.=618.76)용액 61.88mg을 메탄올에 용해하여 100ml를 제조하였다..

측정방법으로서

① 96-웰 플레이트에 0.1mM DPPH용액 0.15ml에 시료용액 0.15ml를 가하여 빨리 교반하고 25℃에서 10분간의 배양을 개시한다.

② 그 후 560nm에서의 흡광도 St를 측정한다.

③ 공시험은 시료용액 대신 증류수를 이용하여 상기와 같은 방법으로 흡광도 Bt를 측정한다.

④ 시료용액의 블랭크(Blank)는 0.1mM DPPH 용액 대신 메탄올을 이용하여 똑같이 조작하여 흡광도 Bo를 측정한다.

상기 방법에 의해 측정된 흡광도를 수학식 2에 의하여 항산화 활성을 산출하였고, 표 2에 나타내었다.

억제율(%) = 〔1-(St-So)/(Bt-Bo)〕X 100

St: 시료용액의 자유라디칼 소거 후의 560nm에서의 흡광도

Bt: 공시험용액의 자유라디칼 소거 후의 560nm에서의 흡광도

So: 시료용액의 자유라디칼 무첨가시 반응 전의 560nm에서의 흡광도

Bo: 공시험용액의 자유라디칼 무첨가시 반응 전의 560nm에서의 흡광도

결과는 표 2와 같이 산마늘 추출물은 0.01% 농도에서 녹차추출물과 비타민E 보다 우수한 항산화 효과를 가지고 있었다.

시료명	처리농도(%)	항산화효과(%)
산마늘 추출물(실시예 1)	0.01	82
녹차추출물	0.01	50
비타민E	0.01	53

실시예 4: MMP-1 inhibition assay

기질금속단백질분해효소(MMP-1) 저해활성은 생화학적 모델에서 측정하였는데 이는 정제된 콜라게나제 및 이의 기질인 플루오레세인에 접합된 콜라겐과 젤라틴의 이용을 기초로 한다(EnzChek(상표명) 젤라티나제/콜라게나제 키트, 몰레큘라 프루브 사). 클로스트리디움 히스토리티컴으로부터 정제된 콜라게나제를 상기 EnzChek(상표명)젤라티나제/콜라게나제 키트 내에 공급하였다. 돼지 피부로부터 정제되고 플로오레세인에 접합된 DQ-콜라겐과 0.05M 트리스-HCl, 0.15M NaCl, 5mM CaCl2 및 0.2mM 나트륨아지드(pH 7.6)로 이루어지는 반응완충액은 EnzChek(상표명)젤라티나제/콜라게나제 키트(몰레큘라 프로브스사)를 이용하였다. 산마늘 추출물은 상기 반응완충액 내에 용해시켰으며 희석농도에서 실험하였다. 테스트 추출물의 희석액은 25ug/ml의 DQ-콜라겐 및 0.1U/ml의 콜라게나제와 함께 실온에서 15분, 45분, 120분동안 항온처리하였다. 각각의 실험조건에서 콜라게나제와 DQ-콜라겐 혼합물에 상응하는 대조용 혼합물(control)도 동일하게 항온처리하였다. 또한 각각의 실험조건에서 Blank, 이하 '효소 비함유 blank'이라 칭하는 샘플은 DQ-콜라겐의 존재 및 콜라게나제의 부재 하에서 항온처리하였다. 각각의 실험은 3회 수행하였다.

15분, 45분, 120분 경과 후 DQ-콜라겐의 분해에 상응하는 신호는 형광측정기(흡수:485nm, 방출 505nm)로 측정하였다. '효소 비함유 blank' 형광값을 기준으로 하여 각각의 샘플의 형광값을 측정하였다. 결과는 샘플당 형광단위 및 대조군에 대한 변이율(%)로 나타냈다.

표 3에 그 결과를 나타내었다. 산마늘 추출물은 0.04% 처리시 클로스트리디움 콜라게나제의 콜라겐 분해활성의 80%를 억제하였으며 이는 녹차추출물의 저해효과 보다 우수하게 나타내었다. 결론적으로 선택된 실험조건하에서 산마늘 추출물은 투여량(농도) 의존성으로 콜라게나제 억제활성을 나타내었다.

	저해율(%)
	처리농도 0.02%	처리농도 0.04%
산마늘 추출물(실시예 1)	55	80
레티놀	0	5
녹차추출물	52	76

실시예5: 자외선 조사 후 산마늘 추출물에 의한 MMP-1 발현억제 평가

본 실시예는 실시예 1에서 수득한 산마늘 추출물의 UV 조사 및 시료 첨가 후 MMP-1 농도를 측정하기 위해서 ELISA를 실시하였다.

자외선 조사량과 배양시간은 예비실험을 통하여 섬유아세포에서 MMP 발현량이 최대가 되는 조건으로 정하였다. UV챔버를 이용하여 사람의 진피 섬유아세포에 UVA를 5J/㎠의 에너지로 조사하였다. 음성대조군으로 사람의 진피 섬유아세포를 은박지에 싸서 UVA의 환경에 같은 시간동안 유지시켰다. UVA 방출량은 UV 라디오미터를 이용하여 측정하였다. UVA가 조사되는 동안 세포는 이전에 분주된 배지 그대로이고 UVA가 조사된 후 산마늘 추출물과 레티놀이 각각 첨가된 배지로 교환하여 24시간 배양 후 배지를 회수하여 96-웰에 코팅하였다. 일차항체(MMP-1 (Ab-5) 단일클론항체와 MMP-2(Ab-3) 단일클론항체)를 처리하고 37℃에서 60분간 반응시켰다. 이차항체인 안티마우스 IgG(whole mouse, alkaline phosphatase conjugated)를 다시 60분정도 반응시킨 후, 알카린 포스파타제 기질용액(1mg/ml ρ-nitrophenyl phosphate in diethanolamine 완충용액)을 상온에서 30분간 반응시키고 마이크로플 레이트 리더로 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 시료를 첨가하지 않은 것을 사용하였다.

자외선 조사시에 발현이 유도되는 MMP-1에 대하여 시료를 처리하지 않은 대조군에 비하여 산마늘 추출물은 20% 이상의 억제율을 보였으며 이는 레티놀의 억제율보다 우수한 결과를 나타내었다(표 4).

시험군	처리농도(%)	MMP-1 발현억제율(%)
대조군	-	-
산마늘 추출물(실시예 1)	0.1	25
레티놀	0.1	18

실시예 6: B16F1 멜라노싸이트를 이용한 멜라닌 생성 억제효과 측정 실험

본 실시예는 산마늘 추출물의 미백효과를 확인하기 위해 B16F1 멜라노싸이트에 대한 멜라닌 생성억제 정도를 보고 미백효과를 조사하였다. 본 실시예에 사용된 B16F1 멜라노싸이트는 마우스에서 유래한 세포균주이며, 멜라닌이라는 흑색색소를 분비하는 세포이다. 세포배양 중에 시료를 처리하여 멜라닌 흑색색소가 감소하는 정도를 비교평가하였다. 본 실시예에 사용된 B16F1 멜라노싸이트는 ATCC(American Type Culture Collection, 기탁번호 : 6323)로부터 분양받아 사용하였다.

B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 생합성 억제효과 측정은 다음과 같이 행하였다. B16F1 멜라노싸이트를 6웰 플레이트에 각 웰당 2 x 10⁶ 농도로 분주하고 세포를 부착시킨 후 독성을 유발하지 않는 농도로 시료를 처리하여 72시간동안 배양하였다. 72시간 배양 후 세포를 트립신(trypsin)-EDTA로 떼어 낸 후 세포수를 측정한 다음 원심분리하여 세포를 회수하였다. 세포내 멜라닌의 정량은 로탄(Lotan : Cancer Res., 40: 3345-3350, 1980)의 방법을 약간 변형하여 실시하였다. 셀 펠릿을 PBS로 1회 세척한 후 균질화 버퍼액(50mM 소듐 포스페이트, pH 6.8, 1% Triton X-100, 2 mM PMSF) 1ml를 첨가하여 5분간 와류하여 세포를 파쇄하였다. 원심분리 (3,000rpm, 10분)하여 얻은 세포여액에 1N NaOH(10% DMSO)를 첨가하여 추출된 멜라닌을 용해한 후 마이크로 플레이트 판독기로 405nm에서 멜라닌의 흡광도를 측정한 다음 멜라닌을 정량하여 시료의 멜라닌 생성 저해율(%)을 측정하였다. B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 생성 저해율(%)은 수학식 3에 의하여 계산하였으며, IC₅₀값은 멜라닌 생성을 50% 저해할 때의 시료의 농도를 말하는 것이다.

저해율(%) = [(A-B)/A]x 100

A : 시료를 첨가하지 않은 웰의 멜라닌 양

B : 시료를 첨가한 웰의 멜라닌 양

B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 생성 억제효과를 시험한 결과 산마늘 추출물의 IC₅₀ 값은 0.08%로 기존의 미백제인 하이드로퀴논, 알부틴, 유용성 감초 추출물, 상백피 추출물 등에 비해 유사하거나 우수한 효과를 나타내었다(표 5).

시료명	처리농도(%)	멜라닌 합성 저해효과(IC₅₀)
산마늘 추출물(실시예 1)	0.1	0.08%
하이드로퀴논	0.1	0.03%
알부틴	0.1	0.2%
상백피 추출물	0.1	5%
유용성 감초 추출물	0.1	0.03%

실시예 7: 자외선조사에 의한 세포독성 완화 효과

본 실시예는 실시예 1에서 수득한 산마늘 추출물의 자외선 조사에 의한 세포독성의 완화 효과를 평가하기 위하여 실시되었다. 섬유아세포(fibroblast)를 24-웰 시험 플레이트에 1x10⁵개씩 넣고 24시간 동안 부착시켰다. 각 웰을 PBS로 1회 세척하고 각 웰에 500㎕의 PBS를 넣었다. 이 섬유아세포에 자외선 B(UVB) 램프(Model : F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki사, Japan)를 이용하여 자외선 10mJ/㎠를 조사한 후 PBS를 덜어내고 세포배양 배지(DMEM에 10% FBS가 첨가된 것) 1㎖을 첨가하였다. 여기에 평가하고자 하는 산마늘 추출물을 처리한 후 24시간동안 배양하였다. 24시간이 지나면 배지를 제거하고, 각 웰 당 세포배양 배지 500㎕ 배지와 MTT 용액(2.5㎎/㎖) 60㎕를 넣은 후 2시간동안 37℃ CO₂ 배양기에서 배양하였다. 배지를 제거하고 이소프로판올-HCl(0.04 N)을 500㎕씩 넣어주었다. 5분간 진탕하여 세포를 용해시키고 상등액 100㎕씩을 96-웰 시험 플레이트에 옮긴 후, 마이크로플레이트 판독기에서 565nm 흡광도를 측정하였다. 수학식 4에 의해 세포생존율(%)을 측정하고 자외선에 의한 세포독성 완화율은 수학식 5에 의하여 계산하였다.

세포생존율(%)=〔(St-Bo)/(Bt-Bo)〕X 100

Bo : 세포배양배지 만을 발색 반응한 웰의 565nm 흡광도

Bt : 시료를 처리하지 않은 웰을 발색 반응한 웰의 565nm 흡광도

St : 시료를 처리한 웰을 발색 반응한 웰의 565nm 흡광도

자외선에 의한 세포독성 완화율(%)=〔1-(St-Bo)/(Bt-Bo)〕X 100

Bo : 자외선 조사하지 않고 시료 처리하지 않은 웰의 세포 생존율

Bt : 자외선 조사하고 시료를 처리하지 않은 웰의 세포생존율

St : 자외선 조사하고 시료를 처리한 웰의 세포생존율

실험결과 산마늘 추출물은 자외선에 의한 세포독성을 0.01% 농도에서 55%의 세포독성을 완화하여 자외선에 의한 세포독성을 효과적으로 방어함을 알 수 있었다. 상기 실험을 통해 낮은 농도에서도 자외선에 의한 세포손상을 효과적으로 방어할 수 있음을 확인하였다(표 6).

시료명	처리농도(%)	세포독성 완화율(%)
산마늘 추출물(실시예 1)	0.01	55
산마늘 추출물(실시예 1)	0.02	75

실시예 8: 자외선 조사에 의한 염증성 사이토카인 발현 억제효과

본 실시예는 실시예 1에서 수득한 산마늘 추출물의 자외선 조사에 의해 발현되는 염증성 사이토카인 발현 억제효과를 평가하기 위하여 사람의 표피조직에서 분 리한 섬유아세포(Fibroblast)를 24-웰 시험 플레이트에 5X10⁴개씩 넣고 24시간동안 부착시켰다. 각 웰을 PBS로 1회 세척하고 각 웰에 500㎕의 PBS를 넣었다. 이 섬유아세포에 자외선B(UVB) 램프(Model : F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki사, Japan)를 이용하여 자외선 10mJ/㎠를 조사한 후 PBS를 덜어내고 세포배양 배지(DMEM에 FBS가 첨가되지 않은 배지) 350㎕를 첨가하였다. 여기에 산마늘 추출물을 처리한 후 5시간동안 배양하였다. 배양 상층액을 150㎕ 취하여 IL-1α를 정량함으로서 산마늘 추출물의 염증성 사이토카인 발현억제효과를 판단하였다. IL-1α의 양은 효소면역분석법(Enzyme-linked Immunosorbent Assay)을 이용하여 정량화하였으며, IL-1α의 생성율은 수학식 6에 의해 계산하였다.

염증성 사이토카인 발현 억제율(%)=〔1-(St-Bo)/(Bt-Bo)〕X 100

Bo: 자외선 조사하지 않고 시료 처리하지 않은 웰의 IL-1α생성량

Bt: 자외선 조사하고 시료를 처리하지 않은 웰의 IL-1α생성량

St: 자외선 조사하고 시료를 처리한 웰의 IL-1α생성량

실험결과 산마늘 추출물은 자외선에 의한 염증성 사이토카인인 IL-1α의 생성을 0.01% 농도에서 58% 억제하여, 자외선에 의한 염증발생을 낮은 농도에서 효과적으로 방어함을 알 수 있었다(표 7).

시료명	처리농도(%)	염증성 사이토카인 발현 억제율(%)
산마늘 추출물(실시예 1)	0.01	58
산마늘 추출물(실시예 1)	0.02	80

실시예 9: 항균력 시험(Paper Disc Test)

본 실시예는 실시예 1에서 수득한 산마늘 추출물의 여드름균에 대한 항균력을 확인하기 위한 페이퍼 디스크 테스트(Paper Disc Test)를 실시하였다. 먼저, 여드름 발생원인의 피부 상재균인 프로피오니박테리움 아크네(Propionibacterium acnes)를 활성화시키기 위하여 BHI액체배지(Brain-Heart Infusion Broth;3.7%)에서 48시간 전배양하였다. 이렇게 준비한 균배양액을 BHI고체배지(Brain-Heart Infusion Broth;3.7%;agar1.5%)에 0.1㎖씩 도말한 후 건조시켰다. 실시예 1에서 수득한 산마늘 추출물을 95% 에탄올 수용액에 12%(W/v)로 희석하여 직경 8㎜의 페이퍼 디스크에 50㎕씩 점적한 후 앞서 준비한 고체배지 위에 올려 놓은 후 이것을 35℃ 혐기 배양조에서 3일간 배양하였다. 페이퍼 디스크 주변에 생긴 균 성장저지 영역을 관찰하고 저지환의 크기를 측정함으로써 항균력을 평가하였다. 그 결과, 산마늘 추출물의 균 성장 저지환의 크기는 22㎜인 것으로 나타났다.

실시예 10: 산마늘 추출물의 5알파-리덕타아제 활성 억제력 평가실험

5알파-리덕타아제 활성억제 실험에 사용된 5알파-리덕타아제는 섬유아세포가 생성하는 효소를 사용하였다.

섬유아세포를 마이크로플레이트 홀(microplate hole)마다 10000개의 세포가 들어가도록 접종한 후 배양한다. 각 홀마다 ³H(트리튬)으로 방사선표지(radio labelling)된 테스토스테론을 0.1.mμ.Ci 첨가한 후에 배양하므로 섬유아세포가 이를 이용하는지 측정하였다. 산마늘 추출물이 들어가지 않은 것을 대조군으로 삼는다. 24시간 배양 후 상등액을 얻고 에틸아세테이트(ethyl acetate)-사이크로헥산(cyclohexane)(1:1) 추출용매 1㎖로 스테로이드(steroids)를 얻었다. 이렇게 얻은 스테로이드를 박막크로마토그래피판에 올려놓고 클로로포름/메탄올 혼합액(98/2 (v/v))으로 전개시킨다. 테스토스테론과 디하이드로테스토스테론에 해당하는 점의 방사활성을 덴시토미터를 이용하여 측정하여 전환율을 계산하고, 그 결과를 대조군(추출물을 첨가하지 않았을 때의 전환율)과 비교하여 하기 수학식 7에 의해 5알파-리덕타아제 저해능을 평가하였다.

저해능(%)=[A-B]/[A] X 100

A:테스토스테론에서 다이하이드로테스토스테론으로의 전환율(추출물 미첨가)

B:테스토스테론에서 다이하이드로테스토스테론으로의 전환율(추출물 첨가)

실험결과 산마늘 추출물의 5알파-리덕타아제 저해효과를 확인하였다.(표 8).

산마늘 추출물 농도(%)	1	0.1	0.05	0.01	0.005	0.001	0.0001
저해율(%)	100.0	100.0	95.0	82.5	73.8	52.6	41.5

실시예 11: 모발성장 효과 시험

본 실시예는 실시예 1에서 수득한 산마늘 추출물 건조 엑스 2%를 함유하는 30% 함수 에탄올(ethanol) 용액을 제조하여 시험에 사용하였다. 모발성장 효과 시험은 생후 47~53일의 마우스(ICR)를 사용하여 등부위 털을 제거하고, 등부위가 깨끗한 것을 골라 물질군마다 10마리를 사용하여 다음날부터 매일 실시예의 시험물질을 개체당 100㎖씩 도포하였다. 시간 경과에 따른 모발의 길이 및 모발 성장 정도를 모 제거 후 복원 정도에 따라 점수를 부가하여 각각 비교하였다. 모발성장 정도를 비교하기 위하여, 대조군으로는 30% 알코올 용액을 각 개체에 도포하여 성장 상태를 관찰하였다. 실험결과, 산마늘 추출물이 우수한 모발성장 촉진효과를 확인하였다(표 9).

시료	경과일수
시료	5	10	15
산마늘 추출물	0.25	0.94	1.88±0.44
대조군	0.08	0.26	1.01±0.23

시험예 1: 피부탄력개선 효과

산마늘 추출물을 함유한 화장료를 제조하여 사람을 대상으로 피부탄력 개선효과를 비교실험하여 평가하였다. 비교실험에 사용된 화장료는 크림형태이고, 그 조성은 표 10에 나타낸 바와 같다. 우선 표 10의 나)의 성분을 가열하여 70℃에 보존한다. 이것에 가)상을 가하여 예비유화 후 호모믹서로 균일하게 유화하고 다음에 서서히 냉각하여 크림(실시예 12, 비교예 1)을 제조한다. 실험자(20세-35세의 여 성) 20명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 실시예 12에서 제조된 크림을 얼굴 왼쪽 부위에는 비교예 1에서 제조된 크림을 각각 1일 2회씩 연속 3개월간 도포하였다.

실험완료 후 피부탄력 개선효과는 제품 사용 전과 2개월간 사용 후에 피부탄력측정기(cutometer SEM 575, C+K Electronic Co., Germany)를 이용하여 측정하였다. 실험결과는 하기 표 11에 Cutometer SEM 575의 △R8값으로 기재하였는데 R8값은 피부의 점탄성(viscoelasticity)의 성질을 나타낸다. 표 11에서 나타난 바와 같이 산마늘 추출물을 함유한 크림을 도포한 실험자의 피부 탄력개선 효과가 우수함을 확인하였다.

원료		실시예 12	비교예1
가	스테아릴 알콜	8	8
	스테아린산	2	2
	스테아린산 콜레스테롤	2	2
	스쿠알란	4	4
	2-옥틸도데실알콜	6	6
	폴리옥시에틸렌(25몰부가) 알콜에스테르	3	3
	글리세릴모노스테아린산 아스테르	2	2
나	산마늘 추출물	1	-
	프로필렌글리콜	5	5
	정제수	적량	적량

주)단위: 중량%

실험제품	피부탄력효과(△R8)
실시예 12	0.24
비교예 1	0.12

n=20, p0.05

시험예 2: 피부미백효과 측정

산마늘 추출물을 함유한 화장료를 제조하여 사람을 대상으로 피부 미백효과를 비교실험을 행하여 평가하였다. 상기 실시예 12와 비교예 1에서 제조된 크림을이용하여 실험자 (20세-35세의 여성) 20명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 실시예 12의 크림을, 얼굴 왼쪽 부위에는 비교예 1의 크림을 각각 1일 2회씩 연속 2개월간 도포하였다. 시험완료 후 얼굴 좌우 양편의 도포 부위 피부를 화상분석기 및 피부색의 변화를 크로마메타(Minolta CR300, Japan)를 이용하여 색의 밝기변화(△L)를 측정하고, 복수의 숙련자에 의한 객관적 육안관찰과 피검자에 의한 주관적 육안관찰을 실시하여 하기 등급분류에 따라 효과를 측정하여 표 12에 나타내었다.

이때 미백효능 정도를 7등급으로 분류하여 평가하였다(-3: 매우 악화, -2: 악화, -1: 약간 악화, 0: 변화 없음, 1: 약간 개선, 2: 개선, 3: 매우 개선).

표 12에서 나타낸 바와 같이 산마늘 추출물을 함유한 크림을 도포한 실험자의 안면 피부에서 미백효과가 우수함을 알 수 있다.

	피부색의 밝기변화의 평균값
	실시예 12	비교예 1
색의 밝기변화(△L)	5.03	2.03
숙련자의 육안관찰	2.7	1.9
피검자의 육안관찰	2.5	1.7

이하에 실시예 1에서 수득한 산마늘 추출물을 함유한 화장수, 유액 및 미용액을 실시예 13 내지 15에서 제조하였다.

실시예 13: 산마늘 추출물을 함유한 화장수의 제조

95% 에탄올 8g에 폴리피롤리돈 0.05g, 올레일알콜 0.1g, 폴리옥시에틸렌모노올레이트 0.2g, 향료 0.2g, 파라옥시안식향산메틸에스테르 0.1g, 소량의 산화방지제, 소량의 색소를 혼합용해하고, 실시예 1에서 수득한 산마늘 추출물 0.05g, 글리세린 5g을 정제수 85.33g에 용해한 것을 첨가한 후 교반하여 피부개선효과가 있는 화장수를 제조하였다.

실시예 14: 산마늘 추출물을 함유한 유액의 제조

세틸알콜 1.2g, 스쿠알란 10g, 바세린 2g, 파라옥시안식향산에틸에스테르 0.2g, 글리세린모노에스테아레이드 1g, 폴리옥시에틸렌(20몰부가)모노올레이트 1g 및 향료 0.1g을 70℃에서 가열혼합용해하고, 실시예 1에서 수득한 산마늘 추출물 0.5g, 디프로필렌글리콜 5g, 폴리에틸렌글리콜-1500 2g, 트리에탄올아민 0.2g, 정제수 76.2g을 75℃로 가열용해하여 이를 혼합하여 유화시킨 후 냉각하여 수중유(O/W)형의 피부개선효과가 있는 유액을 제조하였다.

실시예 15: 산마늘 추출물을 함유한 미용액의 제조

95% 에틸알콜 5g에 폴리옥시에틸렌솔비탄모노올레이트 1.2g, 키툴로오즈 0.3g, 히야론산나트륨 0.2g, 비타민 E-아세테이트 0.2g, 감초산 나트륨 0.2g, 파라옥시안식향산에틸에스테르 0.1g, 실시예 1에서 수득한 산마늘 추출물 1g 및 적량의 색소를 혼합하여 피부개선효과가 있는 미용액을 제조하였다.

이상에서 살펴 본 바와 같이 산마늘 추출물은 항산화 효과와 MMP 저해효과와 자외선 조사에 의한 MMP 발현 조절효과, 탄력개선 효과 등 우수한 항노화 효과와 자외선 조사 후 야기되는 피부자극을 완화시키는 효과를 나타내었다.

따라서, 본 발명의 산마늘 추출물을 함유하는 피부외용제 조성물, 즉, 화장수, 크림, 유액, 팩, 파우더 등의 화장료 조성물 및 약학 조성물은 항산화 효과와 콜라겐 분해효소 활성조절 효과, 피부 잔주름개선 효과, 미백, 육모, 여드름방지, 피부자극완화 효과 등에 대하여 우수한 제품으로 제공할 수 있다.

Claims

산마늘 추출물을 함유하는 피부외용제 조성물.
제1항에 있어서, 상기 산마늘 추출물은 전체 조성물 총 중량에 대해서 0.001 ~ 30.0중량%를 함유하는 것을 특징으로 하는, 산마늘 추출물을 함유하는 피부외용제 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 산마늘 추출물은 정제수, 메탄올, 에탄올, 글리세린, 에틸아세테이트, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디클로로메탄 및 헥산으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 1종 이상을 용매로 하여 상온에서 냉침, 가열 여과하여 얻어진 액상물, 추가로 용매를 감압농축 또는 동결건조하여 얻는 것을 특징으로 하는, 산마늘 추출물을 함유하는 피부외용제 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 피부외용제 조성물이 화장료 조성물 또는 약학 조성물인 것을 특징으로 하는 산마늘 추출물을 함유하는 피부외용제 조성물.
제4항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 수중유(O/W)형 또는 유중수(W/O)형으로 제형화되는 것을 특징으로 하는, 산마늘 추출물을 함유하는 피부외용제 조성물.
제4항에 있어서, 상기 화장료 조성물 또는 약학 조성물은 항산화, 주름완화, 미백, 육모, 여드름 예방, 자외선에 의한 피부손상 억제 또는 자극완화 기능을 지니는 것을 특징으로 하는, 산마늘 추출물을 함유하는 피부외용제 조성물.