KR101026879B1 - 피부주름개선용 화장료 조성물의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 오미자(Schizandra chinensis Baillon)를 70%(V/V) 에탄올 수용액으로 초음파 추출하고 냉침한 후, 이를 여과하고 50℃ 이하에서 감압농축한 후, 얻어진 감압농축물을 정제수, 에탄올, 부틸렌글리콜 및 프로필렌글리콜로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 용매에 혼합시킴으로써, 슈잔드린을 함유하는 오미자 추출물을 제조하는 단계; 및 상기 슈잔드린을 함유하는 오미자 추출물을 조성물 전체에 대하여 10ppm 내지 10000ppm 함유시키는 단계를 포함하고, 상기 슈잔드린을 함유하는 오미자 추출물은 기질 금속단백질 분해효소의 활성을 저해하여 피부주름개선효과를 가지는 것을 특징으로 하는 피부주름개선용 화장료 조성물의 제조방법을 개시한다.

Description

피부주름개선용 화장료 조성물의 제조방법{Producing method of cosmetic composition for improving skin wrinkle}

본 발명은 피부주름개선용 화장료 조성물의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 슈잔드린을 함유하는 오미자 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부주름개선용 화장료 조성물의 제조방법에 관한 것이다.

인간의 피부는 노화 과정에서 다양한 물리·화학적인 변화가 일어나며 그 원인으로는 크게 내적인 노화(intrinsic aging)와 광노화(photo-aging)로 구분되며 이에 관한 연구가 활발히 이루어져 왔다. 즉, 자외선, 스트레스, 질병상태, 환경인자, 상처, 나이가 들어감에 따른 프리라디칼의 활성화 등으로부터 야기될 수 있으며, 이런 상태가 심화될 경우 생체 내에 존재하는 항산화 방어망을 파괴하고, 세포 및 조직을 손상시켜 성인병 및 노화를 촉진하게 된다. 보다 구체적으로는 피부의 주요 구성물질인 지질, 단백질, 다당류 및 핵산 등이 산화되어 피부세포 및 조직이 파괴되고, 결국 피부노화 현상이 생겨나는 것이다. 특히 단백질의 산화는 피부의 결합조직인 콜라겐, 히아루론산, 엘라스틴, 프로테오글리칸, 피브로넥틴등이 절단되어 심한 과다 염증반응과 피부의 탄력에 지장을 주게 되고 이것이 더 심해질 경우 DNA의 변이에 의해 돌연변이, 암의 유발, 면역기능 저하의 사태에 이르게 된다.

그러므로 신체의 대사 과정 중 발생하는 프리라디칼이나 자외선 조사, 염증반응에 의해 매개되는 프리라디칼을 소거하여 세포막을 보호하고, 또 이미 손상받은 세포는 활발한 신진대사에 의해 재생화시켜서 세포를 증식시켜야 피부는 빠르게 회복되고 건강한 피부를 유지할 수 있다. 한편, 노화에는 프리라디칼 뿐만 아니라 MMP(matrix metalloprotease, 기질금속단백질 분해효소)라는 효소가 관여하는데, 생체 내에서 콜라겐과 같은 세포외기질의 합성과 분해는 적절하게 조절되나 노화가 진행되면서 그 합성이 감소하며 콜라겐을 분해하는 효소인 기질 금속단백질 분해효소(MMP)의 발현이 촉진되어 피부의 탄력이 저하되고 주름이 형성된다. 또한 이러한 분해효소는 자외선 조사에 의해 활성화되기도 한다. 그러므로 세포 내에서 활성화가 유도되는 MMP 발현을 조절하거나 그 활성을 억제할 수 있는 물질의 개발이 요구되고 있다.

다음으로, 색소 침착에 의한 피부노화를 들 수 있는데 피부색에 영향을 주는 색소로는 멜라닌, 멜라조이드, 카로틴, 헤모글로빈 등이 있다. 이중 가장 중요한 것은 멜라닌으로 생합성에 영향을 미치는 가장 큰 요인은 자외선과 체내 호르몬 분비 정도이다. 멜라닌은 자외선을 흡수 또는 산란시켜 자외선으로부터 피부가 손상되는 것을 방지하는데 큰 역할을 하는데, 특별한 최대흡수파장이 없으며 전 영역의 빛을 흡수한다. 또한 활성산소종을 제거하는 기능이 탁월하나, 때로는 멜라닌 자체가 활성산소를 발생시키기도 하며, 멜라닌 구조 내의 카테콜이나 퀴논에 의하여 다른 물질을 환원시키거나 산화시키고, 멜라닌 자체가 자유라디칼의 성질을 나타내기도 한다.

멜라닌의 생합성은 아미노산의 일종인 티로신이 멜라노사이트의 멜라노좀에서 티로시나제에 의해 산화되어 디하이드록시 페닐알라닌(dihydroxy phenyl- alanine)로 전환되는 것을 시작으로 계속되는 일련의 산화과정을 거쳐 갈색(pheomelanin), 흑색(eumelanin)의 중합체로 형성된다. 이러한 생합성 과정은 멜라노좀이라는 특수한 형태의 갈색 세포내 소기관에서 진행되며 멜라닌 과립을 포함한 멜라노좀은 핵 주변 부위에서 수지상 돌기 끝부분으로 이동, 케라티노사이트의 식세포작용에 의해 세포질 내로 이동하고 이들은 케라티노사이트의 핵 주변에 축적된다. 이미 아스코르빈산(일본특개평 4-9320), 하이드로퀴논(일본특개평 6-192062), 코직산(일본특개소 56-7710), 알부틴(일본특개평 4-93150) 및 일부의 추출물 등이 티로시나제 저해 활성을 가지고 있어 미백 화장료로 이용되고 있으나 화장품 제형 중에서의 안정성이 나빠 분해되어 착색되거나, 이취의 발생, 생체 레벨에서의 효능, 효과의 불분명 및 안전성 문제 등으로 그 사용이 제한되고 있는 실정이다.

이제까지 화장품의 소재로서 사용된 원료들은 단순히 효소 활성만을 억제하는 것이 대부분이었으며 효소의 발현양은 조절하지 못하는 문제점이 있었다. 또한 최근 소비자들은 점차 특수한 조성에 따른 고품질의 기능적 특성을 가짐과 동시에 피부보호, 자극억제, 염증억제, 일광차단 등의 최소한의 부작용을 갖는 화장품의 사용을 요구하고 있고, 피부자극을 최소화하기 위해 종래의 화학물질 원료를 사용하는 대신에 천연재료를 이용한 화장품에 대한 소비자의 호응이 높아짐에 따라 천연재료를 화장품의 원료로써 개발할 필요성이 한층 제기되고 있다.

이와 같이 최근 여러 화학물질 등에 의한 피부 자극을 줄이기 위해 천연물을 사용한 화장품이 많이 개발되고 있다. 천연 재료는 피부에 부작용이 적을 뿐 아니라, 최근 천연 재료를 이용한 화장품에 대한 소비자들의 호응이 높아짐에 따라 화장품 원료로서 개발가치가 한층 늘어나고 있다. 이에 본 발명자들은 이제까지 알려지지 않은 여러 천연물 중에 있어서 화장품으로의 응용 가능성을 연구한 결과, 목련과의 낙엽성 덩굴관목인 오미자 천연물을 선정하고 이들로부터 슈잔드린을 추출하여 추출물을 제조하여, 피부 항산화 효과, 콜라겐 합성효과, 피부 잔주름 완화효과, 미백효과 및 피부자극완화 효과를 측정한 결과 우수하므로 화장품으로서의 효능을 기대할 수 있다는 것을 발견하게 되어 본 발명을 완성하기게 이른 것이다.

본 발명은 이상과 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 여러 천연물 중 목련과의 낙엽성 덩굴관목인 오미자로부터, 슈잔드린을 함유하는 오미자 추출물을 제조하여, 화장료의 원료로서의 효능을 확인하고, 그 사용 방법을 개발하여, 이 원료를 사용함으로써 소정의 기능성을 갖는 화장료를 제조할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

즉, 본 발명의 목적은 피부 화장료에 적용 가능하고 화장료에 함유시 항산화효과, 콜라겐 합성 효과, 피부 잔주름 방지효과 등 우수한 항노화 효과를 나타내는 천연 추출물을 제조할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 화장료에 적용 시 자외선 조사 등에 의한 미백 효과와 염증매개 물질에 의한 피부 자극 완화 효과를 나타내는 천연 추출물을 제조할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 화장료 조성물은 슈잔드린을 함유하는 오미자 추출물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 한다.

여기서, 오미자의 학명은 Schizandra chinensis Baillon이며 낙엽 활엽 덩굴나무로 잎은 어긋나고 난형(卵形) 또는 도란형(倒卵形)이며 끝은 급히 뾰족하고 톱니가 있으며 뒷면 맥상에 다소 털이 있다. 꽃은 홍백색으로 6∼7월에 피며 자웅이주이다. 과실은 식용으로 쓰이고 가지 끝에 이삭모양으로 늘어지며 8∼9월에 붉게 익는다. 과실을 오미자(오매자),북오미자 Schizandrae Fructus라 한다. 표고 200∼1,600m 지리산, 전북, 강원도가 주산지이며 충남, 충북을 제외한 전국에 야생하고, 지리적으로 일본, 사할린, 만주, 중국에 분포한다. 과실에 슈잔드롤(Schizandrol), 슈잔드린(Schizandrin) A, B, C, 안질로일고미(angeloylgomisin) O, P, 에피고미신(epigomisin), 프레고모이신(pregomoisin), 데옥시슈잔드린 (Deoxyschizandrin) 등을 함유한다. 오미자에 함유되어 있는 슈잔드린은 분자량이 432.52 이고 구조식은 C₂₄H₃₂O₇이다. 오미자는 오래전부터 수렴, 자양, 강장, 진해약, 해주독, 목마름, 수렴고삽, 익기생진, 보신염심 등의 약효를 가져 생약원료로 한방에서 사용해오던 재료이며, 오미자주의 원료로 오래전부터 사용하여 체내 섭취에 따른 인체 안정성이 이미 확인되어 있다.

한편, 본 발명에 따른 슈잔드린을 함유하는 오미자 추출물은 오미자로부터 침출, 전출하여 얻은 침출액, 또는 그 침출액을 다시 일부 또는 전부 농축하여 얻은 농축물, 또는 다시 그 농축물을 건조시켜 제조한 추출 엑기스 및 추출액 중에 함유되고 있는 주효과를 발휘하는 화학물질 그 자체를 포함한다.

또한, 본 발명에 따른 슈잔드린을 함유하는 오미자 추출물은 건조된 오미자를 상온에서 10-95%(V/V) 에탄올 수용액으로 추출하고 냉침하고 상기 결과 현탁액을 여과하여 얻어진 여액을 50℃이하에서 감압농축하고 감압농축물을 부틸렌글리콜과 같은 용매에 혼합하여 제조된다.

또한, 본 발명인 화장료 조성물은 추출용매로서 정제수, 메탄올, 에탄올, 글리세린, 에틸아세테이트, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디클로로메탄, 헥산 및 그의 혼합물로부터 선택된 것을 사용한다.

한편, 본 발명에 따른 슈잔드린을 함유하는 오미자 추출물의 함량은 화장료 조성물 전체에 대하여 10 내지 10000ppm인 것이 바람직하다. 상기 추출물의 함량이 10ppm 미만인 경우에는 피부개선효과가 거의 없으며, 10000ppm 이상인 경우에는 함유량 증가에 대한 효과 증대 정도가 미미하여 경제적이지 못하기 때문이다.

또한, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 상기의 추출물 외에 본 발명이 목적으로 하는 주효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 바람직하게는 주효과에 상승효과를 줄 수 있는 다른 성분 등을 함유하는 것도 무방하다.

또한, 본 발명의 조성물은 수성, 수성-알콜성 또는 오일성 용액, 수중유 또는 유증수 또는 다중 에멀전, 수성 또는 오일성 겔, 액체, 페이스트성 또는 고체 무수 생성물, 소구체를 사용한 수성 상에서의 오일분산물의 형태일 수 있으며, 보다 바람직하게는 이온성 및/또는 비이온성 형태의 지질 소포체의 형태일 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 다소 유체일 수 있으며, 백색 또는 유색크림, 연고, 밀크로션, 유액(serum), 에센스, 페이스트 또는 무스의 외관을 가질 수 있다. 이는 선택적으로 에어로졸 형태로 피부에 적용될 수도 있고, 고체 형태 예컨대, 스틱의 형태일 수도 있다. 이는 피부용 케어 제품 및/또는 메이크업 제품으로서 사용될 수도 있다.

이와 같이 제조된 본 발명의 화장료 조성물은 피부 미백제, 노화방지제, 피부 자극 완화제로 사용될 수 있다.

또한, 본 발명에서는 NBT법과 DPPH법을 이용해 항산화 효과를 측정하고, 잔주름개선 효과를 측정하기 위해서 MMP 저해와 자외선 조사에 의한 MMP 발현 억제능을 측정하여 콜라겐 분해효소 활성을 측정하였다. 자외선 조사 후 야기되는 세포 독성 측정을 통해 피부자극 완화 정도를 측정하였다.

또한, 본 발명에서는 기미, 주근깨 및 피부 색소 침착의 원인이 되는 물질인 멜라닌 생성억제 효과 등을 측정하여 피부 미백작용을 평가하였다.

본 발명의 슈잔드린을 함유하는 오미자 추출물은 항산화 효과와 MMP 저해 효과와 자외선 조사에 의한 MMP 발현 조절효과, 항산화 효과, 콜라겐 분해효소 활성 조절 효과, 피부 잔주름 개선 효과 등 우수한 항노화 효과와 자외선 조사 후 야기되는 피부 자극을 완화시켜 주는 효과를 나타낼 수 있어 화장료 조성물로 제공할 수 있다.

또한, 본 발명의 슈잔드린을 함유하는 오미자 추출물은 기미, 주근깨 및 피부 색소 침착의 원인이 되는 물질인 멜라닌 생성억제 효과 등의 미백작용을 나타낼 뿐 아니라 여드름방지 효과를 갖는 여드름균 항균활성과 5알파-리덕타제 억제 효과를 제공할 수 있다.

도 1은 슈잔드린(Schizandrin) 분자구조를 나타내는 구조식이다.
도 2는 HPLC를 통한 슈잔드린(Schizandrin)의 정량분석을 나타낸 그래프이다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 좀더 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명의 예시적인 기재일뿐이며 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.

실시예 1: 오미자로부터 슈잔드린 분리, 및 슈잔드린을 함유하는 오미자 추출물의 제조

오미자나무의 열매인 오미자를 70 %(V/V) 에탄올 수용액으로 3시간씩 2회 초음파추출하고 냉침한 후, 와트만(Whatman) #5 여과지로 여과하였다. 여과된 추출물을 50℃ 이하에서 감압농축하여 감압농축물을 얻었다. 이를 분취 고속액체크로마토그라피로 정제하여 슈잔드린을 분리하였다.

또한, 슈잔드린을 함유하는 오미자 추출물은 상기 감압농축물에 슈잔드린이 10 내지 10000ppm 함유되게 정제수, 에탄올, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 중에서 선택된 1종 이상의 용매를 사용하여 분산/용해하여 제조하였다.

슈잔드린을 함유하는 오미자 추출물을 제조한 후 슈잔드린의 함량은 고속액체크로마토그라피를 이용하여 도 2에서 확인하였다.

실시예 2: NBT 법을 이용한 항산화 효과 측정 실험

본 실시예는 실시예 1에서 수득한 슈잔드린을 함유하는 오미자 추출물의 항산화 효과를 측정하기 위해 실험실 조건에서 레티놀과 BHT와 같은 항산화제를 비교샘플로 하여, NBT법을 이용, 항산화 활성을 측정하였다.

항산화 효과를 측정하기 위해서 크산틴과 크산틴옥시다제에 의해 생성되는 활성산소를 NBT법에 의해 측정하고 피검물질이 활성산소를 제거하는 효과, 즉 활성산소 소거효과를 평가하였다. 크산틴과 크산틴옥시다제에 의해 활성산소를 생성시키고, 이 활성산소가 니트로블루테트라졸리움(Nitro Blue Tetrazolium;NBT)과 반응하여 생성되는 청색을 파장 560nm에서 측정하는 것으로 활성산소 소거율을 측정하였다.

측정방법으로서,

1. 0.05M Na2CO3 ------------------------------------ 2.4ml

2. 3mM 크산틴 용액---------------------------------- 0.1ml

3. 3mM EDTA 용액------------------------------------ 0.1ml

4. BSA 용액----------------------------------------- 0.1ml

5. 0.72mM NBT 용액---------------------------------- 0.1ml

6. 크산틴 옥시다제 용액----------------------------- 0.1ml

7. 6mM CuCl2 용액----------------------------------- 0.1ml

① 바이엘병에 1,2,3,4,5를 가하고 여기에 시료용액 0.1ml을 첨가하고 25℃에서 10분간 방치하였다.

② 6을 가하여 빨리 교반하고 25℃에서 20분간의 배양을 개시하였다.

③ 그 후 7을 가하여 반응을 정지시키고 560nm에서의 흡광도 St를 측정하였다.

④ 공시험은 시료용액 대신에 증류수를 사용한 것을 상기와 똑같이 조작해 흡광도 Bt를 측정하였다.

⑤ 역시, 시료용액의 블랭크(Blank)는 6대신에 증류수를 사용해 똑같이 조작하여 흡광도 Bo를 측정하였다.

효과의 결과는 수학식 1에 의하여 산출하였으며, 결과는 표 1과 같다.

St : 시료용액의 효소 반응 후의 560nm에서의 흡광도

Bt : 공시험용액의 효소 반응 후의 560nm에서의 흡광도

So : 시료용액의 효소 무첨가시 반응 전의 560nm에서의 흡광도

Bo : 공시험용액의 효소 무첨가시 반응 전의 560nm에서의 흡광도

시험결과, 표 1과 같이 슈잔드린을 함유하는 오미자 추출물을 20ppm 처리농도에서 시험한 시료에서 우수한 항산화 효과를 확인할 수 있었고, 슈잔드린을 함유하는 오미자 추출물은 레티놀 및 BHT과 비슷한 우수한 항산화 효과가 있음이 확인되었다.

시료명	처리농도	항산화효과(%)
슈잔드린을 함유하는 오미자 추출물 (실시예 1)	20ppm	96
레티놀	0.1%	93
BHT	0.1%	90

실시예 3: DPPH 법을 이용한 항산화 효과 측정 실험

본 실시예는 실시예 1에서 수득한 슈잔드린을 함유하는 오미자 추출물의 항산화 효과를 측정하기 위해 실험실 조건에서 녹차추출물과 비타민 E와 같은 항산화제를 비교 샘플로 하여 DPPH법을 이용, 항산화 활성을 측정하였다.

DPPH법은 2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl free radical (DPPH)라는 유리기를 사용하여 환원력에 의한 항산화 활성을 측정한다. 피검물질에 의해 DPPH가 환원되어 흡광도가 감소하는 정도를 공시험액의 흡광도와 비교하여 파장 560nm에서 자유라디칼 소거율을 측정한다.

사용한 시약으로서는 2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl free radical (Aldrich Chem. Co., MW=618.76) 0.1mM 용액으로서 61.88mg을 메탄올에 용해하여 100ml로 하였다.

측정방법으로서

① 96-웰 플레이트에 0.1mM DPPH 용액 0.15ml에 시료용액 0.15ml를 가하여 빨리 교반하고 25℃에서 10분간의 배양을 개시하였다.

② 그 후 560nm에서의 흡광도 St를 측정하였다.

③ 공시험은 시료용액 대신에 증류수를 사용한 것을 상기와 똑같이 조작해 흡광도 Bt를 측정하였다.

④ 역시, 시료용액의 블랭크(Blank)는 0.1mM DPPH 용액 대신에 메탄올을 사용해 똑같이 조작하여 흡광도 Bo를 측정하였다.

효과의 결과는 수학식 2에 의하여 산출하였으며, 결과는 표 2에 나타내었다.

St : 시료용액의 자유라디칼 소거 후의 560nm에서의 흡광도

Bt : 공시험용액의 자유라디칼 소거 후의 560nm에서의 흡광도

So : 시료용액의 자유라디칼 무첨가시 반응 전의 560nm에서의 흡광도

Bo : 공시험용액의 자유라디칼 무첨가시 반응 전의 560nm에서의 흡광도

표 2에 나타난 바와 같이 슈잔드린을 함유하는 오미자 추출물은 20ppm 농도에서 녹차추출물과 비타민E 보다 우수한 항산화 효과를 가지고 있었다.

시료명	처리농도	항산화 효과 (%)
슈잔드린을 함유하는 오미자 추출물(실시예 1)	20ppm	87
녹차추출물	0.01%	35
비타민 E	0.01%	31

실시예 4: in vitro MMP -1 inhibition assay

기질 금속 단백질분해효소(MMP-1) 저해 활성은 생화학적 모델에서 측정하였는데 이는 정제된 콜라게나제 및 이의 기질인 플루오레세인에 접합된 콜라겐과 젤라틴의 이용을 기초로 한다(EnzChek(상표명) 젤라티나제/콜라게나제 키트(몰큘라 프루브스). 클로스트리디움 히스토리티컴으로부터 정제된 콜라게나제를 상기 EnzChek (상표명) 젤라티나제/콜라게나제 키트내에 공급하였다. 돼지 피부로부터 정제하고 플로오레세인에 접합된 DQ-콜라겐과 0.05M 트리스-HCl, 0.15M NaCl, 5mM CaCl2 및 0.2mM 나트륨 아지드(pH 7.6)로 이루어지는 반응 완충액은 EnzChek(상표명) 젤라티나제/콜라게나제 키트(몰큘라 프로브스)를 이용하였다. 슈잔드린을 함유하는 오미자 추출물은 상기 반응 완충액 내에 용해시켰다. 이는 4; 2; 0.4; 0.2; 0.1%(w/v)에서 테스트하였다. 테스트 추출물의 희석액은 25ug/ml의 DQ-콜라겐 및 0.1U/ml의 콜라게나제와 함께 실온에서 15분, 45분, 120분 동안 항온처리하였다.

각각의 실험조건에서 콜라게나제와 DQ-콜라겐 혼합물에 상응하는 대조용 혼합물 (control)도 동일하게 항온처리하였다.

또한 각각의 실험 조건에서 Blank, 이하 '효소 비함유 blank'이라 칭하는 샘플은 DQ-콜라겐의 존재 및 콜라게나제의 부재하에서 항온처리하였다. 각각의 실험은 3회 수행하였다.

15분, 45분, 120분 경과 후 DQ-콜라겐의 분해에 상응하는 신호는 형광측정기(여기:485nm, 방출 505nm)로 측정하였다.

'효소 비함유 blank' 형광값을 기준으로 하여 각각의 샘플의 형광값을 측정하였다. 결과는 샘플당 형광 단위 및 대조군에 대한 변이율(%)로 나타냈다.

결론적으로 선택된 실험 조건하에서 0.04 내지 4%(v/v)에서 테스트된 슈잔드린을 함유하는 오미자 추출물은 투여량 의존성으로 항콜라게나제/젤라티나제 활성을 보유하였다.

결과는 표 3에 나타난 바와 같이 슈잔드린을 함유하는 오미자 추출물은 20ppm 처리시 클로스트리디움 콜라게나제의 콜라겐 분해활성의 86%를 억제하였으며 이는 녹차추출물의 저해 효과보다 우수한 것으로 확인되었다.

실험샘플	저해율 % (처리농도)
슈잔드린을 함유하는 오미자 추출물	58 (10ppm)	86 (20ppm)
레티놀	0 (0.02%)	6 (0.04%)
녹차추출물	51 (0.02%)	63 (0.04%)

실시예 5: 자외선 조사 후 슈잔드린을 함유하는 오미자 추출물에 의한 MMP -1 발현억제 평가

본 실시예는 실시예 1에서 수득한 슈잔드린을 함유하는 오미자 추출물의 UV 조사 및 시료 첨가 후 MMP-1 농도를 측정하기 위해서 ELISA를 실시하였다.

UV 챔버를 이용하여 인간 진피 섬유아세포에 UVA를 5J/㎠의 에너지로 조사한다. 자외선 조사량과 배양시간은 예비 실험을 통하여 섬유아세포에서 MMP 발현량이 최대가 되는 조건을 확립하였다. 음성 대조군은 은박지로 싸서 UVA의 환경에 같은 시간 유지하였다. UVA 방출량은 UV 라디오미터를 이용하여 측정하였다. UVA가 조사되는 동안의 세포는 이전에 분주된 배지 그대로이고 UVA를 조사 한 후 샘플이 들어간 배지로 교환하여 24시간 배양 후 배지를 회수하여 96-웰 플레이트에 코팅한다. 일차항체(MMP-1 (Ab-5) 단일클론항체와 MMP-2(Ab-3) 단일클론항체)를 처리하고 37℃ 에서 60분 반응시킨다. 이차항체인 안티마우스 IgG(whole mouse, alkaline phosphatase conjugated)를 다시 60분 정도 반응시킨 후, 알카린 포스파타제 기질 용액(1mg/mlρ-nitrophenyl phosphate in diethanolamine 완충용액)을 상온에서 30분간 반응시키고 마이크로플레이트 리더로 405nm 에서 흡광도를 측정한다. 대조군으로는 시료를 첨가하지 않은 것을 사용한다.

결과는 표 4에 나타난 바와 같이, 자외선 조사시에 발현이 유도되는 MMP-1에 대하여, 시료를 처리하지 않은 대조군에 비하여 슈잔드린을 함유하는 오미자 추출물은 20% 이상의 억제율을 보였으며 이는 대조군으로 사용한 레티놀의 억제율보다 우수한 결과이다.

시험군	처리농도	MMP-1 발현억제율(%)
대조군	-	-
슈잔드린을 함유하는 오미자 추출물	20ppm	29
레티놀	0.1%	21

실시예 6: B16F1 멜라노싸이트를 이용한 멜라닌 생성 억제효과 측정 실험

본 실시예는 실시예 1에서 수득한 슈잔드린을 함유하는 오미자 추출물의 미백효과를 확인하기 위해 B16F1 멜라노싸이트에 대한 멜라닌 생성 억제 정도를 보고 미백 효과를 판단한 것이다.

본 실시예에 사용된 B16F1 멜라노싸이트는 마우스에서 유래한 세포균주이며, 멜라닌이라는 흑색색소를 분비하는 세포이다. 이 세포의 인공배양중에 시료를 처리하여 멜라닌 흑색색소가 감소하는 정도를 비교 평가하였다. 본 실시예에 사용된 B16F1 멜라노싸이트는 ATCC (American Type Culture Collection, 기탁번호 : 6323)로부터 분양받아 사용하였다.

B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 생합성 억제효과 측정은 다음과 같이 행하였다. B16F1 멜라노싸이트를 6-웰 플레이트에 각 웰당 2 x 10⁶ 농도로 분주하고 세포를 부착시킨 후 독성을 유발하지 않는 농도로 시료를 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 72시간 배양 후 세포를 trypsin-EDTA로 떼어 낸 후 세포수를 측정한 다음 원심분리하여 세포를 회수하였다.

세포내 멜라닌의 정량은 로탄(Lotan : Cancer Res ., 40: 3345-3350, 1980)의 방법을 약간 변형하여 실시하였다. 셀 펠릿을 PBS로 1회 세척한 후 균질화 버퍼액(50 mM 소듐 포스페이트, pH 6.8, 1% Triton X-100, 2 mM PMSF) 1 ml를 첨가하여 5분간 와류하여 세포를 파쇄하였다. 원심분리 (3,000 rpm, 10분)하여 얻은 세포 여액에 1N NaOH (10% DMSO)를 첨가하여 추출된 멜라닌을 용해한 후 마이크로 플레이트 판독기로 405 nm에서 멜라닌의 흡광도를 측정한 다음 멜라닌을 정량하여 시료의 멜라닌 생성 저해율(%)을 측정하였다. B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 생성 저해율(%)은 수학식 3에 의하여 계산하였으며, IC₅₀값은 멜라닌 생성을 50% 저해하는 물질의 농도이다.

A : 시료를 첨가하지 않은 웰의 멜라닌 양

B : 시료를 첨가한 웰의 멜라닌 양

B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 생성 억제효과를 시험한 결과, 하기 표 5에서와 같이 슈잔드린을 함유하는 오미자 추출물의 IC₅₀값은 0.06%로, 기존의 미백제인 하이드로퀴논, 알부틴, 유용성 감초 추출물, 상백피 추출물 등에 비해 비슷하거나 우수한 효과를 나타내는 것을 알 수 있었다.

시료명	처리농도	멜라닌 생성 억제효과(IC50)
슈잔드린을 함유하는 오미자 추출물 (실시예 1)	20ppm	0.06%
하이드로퀴논	0.1%	0.04%
알부틴	0.1%	0.18%
상백피 추출물	0.1%	0.04%
유용성 감초 추출물	0.1%	0.03%

실시예 7: 자외선조사에 의한 세포독성 완화 효과

본 실시예는 실시예 1에서 수득한 슈잔드린을 함유하는 오미자 추출물의 자외선 조사에 의한 세포독성의 완화효과를 평가하기 위하여 실시되었다. 섬유아세포(fibroblast)를 24-웰 시험 플레이트에 1x10⁵개씩 넣고 24시간 동안 부착시켰다. 각 웰을 PBS로 1회 세척하고 각 웰에 500ul의 PBS를 넣었다. 이 섬유아세포에 자외선 B(UVB) 램프(Model : F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki사, Japan)를 이용하여 자외선 10mJ/㎠를 조사한 후 PBS를 덜어내고 세포배양 배지(DMEM에 10% FBS가 첨가된 것) 1㎖을 첨가하였다. 여기에 평가하고자 하는 슈잔드린을 함유하는 오미자 추출물을 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 24시간이 지나면 배지를 제거하고, 각 웰 당 세포배양 배지 500㎕배지와 MTT 용액 (2.5㎎/㎖) 60㎕를 넣은 후 2시간 동안 37℃ CO₂ 배양기에서 배양하였다. 배지를 제거하고 이소프로판올-HCl(0.04 N)을 500㎕씩 넣어주었다. 5분간 진탕하여 세포를 용해시키고 상등액 100㎕씩을 96-웰 시험 플레이트에 옮긴 후, 마이크로플레이트 판독기에서 565nm 흡광도를 측정하였다. 수학식 4에 의해 세포생존율(%)을 측정하고, 자외선에 의한 세포독성 완화율은 수학식 5에 의하여 계산하였다.

Bo : 세포배양배지만을 발색 반응한 웰의 565 nm 흡광도

Bt : 시료를 처리하지 않은 웰을 발색 반응한 웰의 565 nm 흡광도

St : 시료를 처리한 웰을 발색 반응한 웰의 565 nm 흡광도

Bo : 자외선 조사하지 않고 시료 처리하지 않은 웰의 세포 생존율

Bt : 자외선 조사하고 시료를 처리하지 않은 웰의 세포생존율

St : 자외선 조사하고 시료를 처리한 웰의 세포생존율

실험결과, 표 6에 나타난 바와 같이 슈잔드린을 함유하는 오미자 추출물은 자외선에 의한 세포 독성을 10ppm 농도에서 53%의 세포독성을 완화하여 자외선에 의한 세포독성을 낮은 농도에서도 효과적으로 방어함을 알 수 있다.

시료명	처리농도(ppm)	세포독성 완화율 (%)
슈잔드린을 함유하는 오미자 추출물(실시예 1)	10	53
	20	78

실시예 8: 자외선 조사에 의한 염증성 사이토카인 발현 억제효과

본 실시예는 실시예 1에서 수득한 슈잔드린을 함유하는 오미자 추출물의 항염증효과를 확인하기 위해 자외선 조사에 의해 발현되는 염증성 사이토카인 발현 억제정도를 평가한 것이다.

사람의 표피조직에서 분리한 섬유아세포(Fibroblast)를 24-웰 시험 플레이트에 5X10⁴개씩 넣고 24시간동안 부착시켰다. 각 웰을 PBS로 1회 세척하고 각 웰에 500㎕의 PBS를 넣었다. 이 섬유아세포에 자외선B(UVB) 램프(Model : F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki사, Japan)를 이용하여 자외선 10mJ/㎠를 조사한 후 PBS를 덜어내고 세포배양 배지(DMEM에 FBS가 첨가되지 않은 배지) 350㎕를 첨가하였다. 여기에 평가하고자 하는 슈잔드린을 함유하는 오미자 추출물을 처리한 후 5시간 동안 배양하였다. 배양 상층액을 150㎕취하여 IL-1α를 정량함으로서 슈잔드린을 함유하는 오미자 추출물의 염증성 사이토카인 발현억제효과를 판단하였다. IL-1α의 양은 효소면역분석법(Enzyme-linked Immunosorbent Assay;ELISA)을 이용하여 정량화하였으며, IL-1α의 생성율은 수학식 6에 의해 계산하였다.

Bo : 자외선 조사하지 않고 시료 처리하지 않은 웰의 IL-1α 생성량

Bt : 자외선 조사하고 시료를 처리하지 않은 웰의 IL-1α 생성량

St : 자외선 조사하고 시료를 처리한 웰의 IL-1α 생성량

실험결과, 표 7에 나타난 바와 같이 슈잔드린을 함유하는 오미자 추출물은 자외선에 의한 염증성 사이토카인인 IL-1α의 생성을 10ppm 농도에서 52% 억제하여, 자외선에 의한 염증 발생을 낮은 농도에서 효과적으로 방어함을 알 수 있었다.

시료명	처리농도 (ppm)	염증 성사이토카인 발현 억제율 (%)
슈잔드린을 함유하는 오미자 추출물(실시예 1)	10	52
	20	80

실시예 9 및 비교예 1: 피부 탄력개선 효과

본 실시예는 실시예 1에서 수득한 슈잔드린을 함유하는 오미자 추출물을 함유한 화장료를 제조하여 사람을 대상으로 피부 탄력개선 효과를 비교예 1과 비교실험을 행하여 평가하였다.

비교실험에 사용된 화장료는 크림형태이고, 그 조성은 표 8에 나타낸 바와 같다. 우선 표 8에 기록되어 있는 나)상을 가열하여 70℃ 에 보존하였다. 이것에 가)상을 가하여 예비유화 후 호모믹서로 균일하게 유화하고 다음에 서서히 냉각하여 크림(실시예 9, 비교예 1)을 제조하였다. 실험자(20세-35세의 여성) 15명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 실시예 9에서 제조된 크림을 얼굴 왼쪽 부위에는 비교예 1에서 제조된 크림을 각각 1일 2회씩 연속 3개월간 도포하였다.

실험완료 후 피부 탄력 개선 효과는 제품 사용 전과 2개월간 사용 후에 피부탄력측정기(cutometer SEM 575, C+K Electronic Co., Germany)를 이용하여 측정하였다. 실험결과는 하기 표 9에 Cutometer SEM 575의 ΔR8값으로 기재하였는데 R8값은 피부의 점탄성(viscoelasticity)의 성질을 나타낸다.

표 9에서 나타난 바와 같이 슈잔드린을 함유하는 오미자 추출물을 함유한 크림을 도포한 실험자의 피부 탄력개선 효과가 우수함을 알 수 있다.

	원료	실시예 9	비교예 1
가	스테아릴 알콜	8	8
	스테아린산	2	2
	스테아린산 콜레스테롤	2	2
	스쿠알란	4	4
	2-옥틸도데실알콜	6	6
	폴리옥시에틸렌(25몰부가)알콜에스테르	3	3
	글리세릴모노스테아린산 아스테르	2	2
나	슈잔드린을 함유하는 오미자 추출물	20ppm	-
	프로필렌글리콜	5	5
	적량	적량	적량

주)단위: 중량%

실험제품	피부탄력효과(ΔR8)
실시예 9	0.27
비교예 1	0.14

n=15, p＜0.05

실시예 10 및 비교예 2

본 실시예는 실시예 1에서 수득한 슈잔드린을 함유하는 오미자 추출물을 함유한 화장료를 제조하여 사람을 대상으로 피부 미백효과를 비교예 2와 비교실험을 행하여 평가하였다.

비교실험에 사용된 화장료는 크림형태이고, 그 조성은 표 10에 나타낸 바와 같다. 우선 표 10에 기록되어 있는 나)상을 가열하여 70℃에 보존하였다. 이것에 가)상을 가하여 예비유화 후 호모믹서로 균일하게 유화하고 다음에 서서히 냉각하여 크림(실시예 10, 비교예 2)을 제조하였다. 실험자 (20세-35세의 여성) 15명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 실시예 10에서 제조된 크림을, 얼굴 왼쪽 부위에는 비교예 2에서 제조된 크림을 각각 1일 2회씩 연속 2개월간 도포하였다. 시험 완료 후 얼굴 좌우 양편의 도포 부위 피부를 화상분석기 및 피부색의 변화를 크로마메타 (Minolta CR300)를 이용하여 색의 밝기 변화(ΔL)를 측정하고, 복수의 숙련자에 의한 객관적 육안 관찰과 피검자에 의한 주관적 육안관찰을 실시하여 하기 등급 분류에 따라 효과를 측정하였다. 그 결과를 하기 표 11에 나타내었다. 이때 미백효능 정도를 다음의 7등급으로 분류하여 평가하였다.

미백효능 평가 기준

-3: 매우 악화

-2: 악화

-1: 약간 악화

0: 변화 없음

1: 약간 개선

2: 개선

3: 매우 개선

표 11에서 나타낸 바와 같이, 슈잔드린을 함유하는 오미자 추출물을 함유한 크림을 도포한 실험자의 안면 피부에서 미백효과가 우수함을 알 수 있었다.

	원료	실시예 10	비교예 2
가	스테아릴 알콜	8	8
	스테아린산	2	2
	스테아린산 콜레스테롤	2	2
	스쿠알란	4	4
	2-옥틸도데실알콜	6	6
	폴리옥시에틸렌(25몰부가)알콜에스테르	3	3
	글리세릴모노스테아린산 아스테르	2	2
나	슈잔드린을 함유하는 오미자 추출물	20ppm	-
	프로필렌글리콜	5	5
	적량	적량	적량

주)단위: 중량%

	피부색의 밝기 변화(ΔL)		숙련자의 객관적 평가		피검자의 주관적 평가
	실시예 10	비교예 2	실시예 10	비교예 2	실시예 10	비교예 2
평균값	5.24	2.23	2.9	1.8	2.9	1.5

Claims (1)

1. 피부주름개선용 화장료 조성물의 제조방법으로서,
   오미자(Schizandra chinensis Baillon)를 70%(V/V) 에탄올 수용액으로 초음파 추출하고 냉침한 후, 이를 여과하고 50℃ 이하에서 감압농축한 후, 얻어진 감압농축물을 정제수, 에탄올, 부틸렌글리콜 및 프로필렌글리콜로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 용매에 혼합시킴으로써, 슈잔드린을 함유하는 오미자 추출물을 제조하는 단계; 및
   상기 슈잔드린을 함유하는 오미자 추출물을 조성물 전체에 대하여 10ppm 내지 10000ppm 함유시키는 단계를 포함하고,
   상기 슈잔드린을 함유하는 오미자 추출물은 기질 금속단백질 분해효소의 활성을 저해하여 피부주름개선효과를 가지는 것을 특징으로 하는 피부주름개선용 화장료 조성물의 제조방법.

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