KR101415997B1 - 인삼 열매 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인삼 열매 추출물을 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 인삼의 지상부 중에서 독특한 성분과 조성을 갖는 인삼 열매 추출물을 유효성분으로 함유함으로써 멜라닌생성을 억제하고 자외선에 의한 색소침착을 개선하는 효과를 통하여 피부 미백효과를 나타내는 조성물에 관한 것이다.

Description

인삼 열매 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물{Cosmetic composition for skin whitening containing ginseng fruit extracts}

본 발명은 인삼 열매 추출물을 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 인삼의 지상부 중에서 독특한 성분과 조성을 갖는 인삼 열매 추출물을 유효성분으로 멜라닌생성을 억제하고 자외선에 의한 색소침착을 개선하는 효과를 통하여 피부 미백효과를 나타내는 피부 미백용 화장료 조성물에 관한 것이다.

인삼(Panax ginseng C.A. Meyer)은 오가피과 인삼 속에 속하는 식물로서 한국, 중국 및 일본 등지에서 2,000여년 전부터 사용되어 온 생약이며, 경험적으로 질병을 예방하고 수명을 연장시킬 목적으로 사용되어 왔다. 지금까지 알려진 인삼의 효능 및 효과는 중추신경계에 대한 작용, 항발암 작용, 항암활성, 면역기능 조절작용, 항당뇨 작용, 간기능 항진효능, 심혈관 장해개선, 항동맥경화 작용, 혈압조절 작용, 갱년기 장애 개선, 골다공증에 미치는 효과, 항스트레스 및 항피로 작용, 항산화 활성 및 노화억제 효능 등이 있다(최신고려인삼 “성분 및 효능편”, 한국인삼연초연구원, 56-112, 1996).

인삼의 대표적 생리활성 성분인 진세노사이드(Ginsenoside)는 인삼의 지상 및 지하부에 고르게 분포되어 있으며, 특히 인삼 근(뿌리), 인삼엽 및 인삼 열매 등 부위에 따라 진세노사이드 함량뿐만 아니라 조성도 다른 것으로 알려져 있다(Attele AS et al, Biochem Pharmacol, 58; 1685-1693, 1999). 특히 인삼 열매는 인삼 근(뿌리)과 다른 진세노사이드의 성분과 그 함량을 바탕으로 항당뇨 효능에 있어서 인삼근 보다 우수한 결과를 나타내는 것으로 보고되었다(Dey L. et al., Phytomedicine, 10; 600-605, 2003).

최근 천연 화장품에 대한 소비자의 관심이 증대되고 동시에 한방 소재를 활용하는 많은 화장품들이 출시되면서 인삼도 화장품의 중요한 피부효능을 가진 식물소재로 연구되고 있으나, 대부분 인삼근을 이용한 추출물 또는 인삼근의 진세노사이드 성분과 인삼다당체를 활용한 것일 뿐 인삼 열매의 성분에 의한 것은 전무한 실정이다.

또한 인삼 열매는 예로부터 인삼보다도 귀하게 여겨지는 것으로서 종자 획득을 목적으로 선별되어 수확되어 왔다. 인삼 열매는 인삼의 재배기간 중 4년생에 한해서 1회만 채종하게 되며, 3년생에서 채종하면 종자가 너무 작기 때문에 좋은 묘삼을 생산하기가 어렵고 5년생 이상에서 채종하면 종자는 충실하고 좋으나 인삼뿌리의 비대발육을 억제할 뿐만 아니라 조직이 치밀하지 못하여 홍삼을 제조할 때 홍삼품질이 크게 저하될 수 있다. 또 채종횟수를 재배기간 중에 2회 이상으로 채종하면 수량 및 홍삼품질이 크게 저하된다(최신고려인삼 “재배편”, 한국인삼연초연구원, 130-131, 1996).

사람의 피부색을 결정하는 데는 여러 가지 요인들이 관여하는데, 그 중에서도 멜라닌 색소를 만드는 멜라노사이트(melanocyte)의 활동성, 혈관의 분포, 피부의 두께 및 카로티노이드와 빌리루빈 등의 인체 내외의 색소 함유 유무 등의 요인들이 중요하다.

이중 특히 가장 중요한 요인은 인체 내의 멜라노사이트에서 타이로시나제 등의 여러 효소가 작용하여 생성되는 멜라닌이라는 흑색 색소이다. 이 멜라닌 색소의 형성에는 유전적 요인, 호르몬 분비, 스트레스 등과 관련된 생리적 요인 및 자외선 조사 등과 같은 환경적 요인 등이 영향을 미친다.

신체 피부의 멜라닌 세포에서 생성되는 멜라닌 색소는 검은 색소와 단백질의 복합체 형태를 갖는 페놀계 고분자 물질로서, 태양으로부터 조사되는 자외선을 차단하여 진피 이하의 피부기관을 보호해주는 동시에 피부 생체 내에 생겨난 자유 라디칼 등을 잡아주는 등 피부 내 단백질과 유전자들을 보호해주는 유용한 역할을 담당한다.

이와 같이 피부 내, 외부의 스트레스적 자극에 의해 생겨난 멜라닌은 스트레스가 사라져도 피부 각질화를 통해서 외부로 배출되기 전까지는 없어지지 않는 안정한 물질이다. 그러나 멜라닌이 필요 이상으로 많이 생기게 되면 기미, 주근깨 및 점 등과 같은 과색소 침착증을 유발하여 미용상으로 좋지 않은 결과를 가져오게 된다.

오늘날 동양권의 여성들은 백옥같이 하얗고 깨끗한 피부를 선호하며 이를 미의 중요한 기준으로 삼고 있기 때문에 과색소 침착에 대한 치료 및 미용상 문제를 해결하고자 하는 요구가 늘어나게 되었다.

이와 같은 요구에 부응하여 종전부터 아스코르빈산, 코지산, 알부틴, 하이드로퀴논, 글루타치온 또는 이들의 유도체, 또는 타이로시나제 저해활성을 가진 물질들을 화장료나 의약품에 배합하여 사용하여 왔으나, 이들의 불충분한 미백효과, 피부에 대한 안전성 문제, 화장료에 배합 시 나타나는 제형 및 안정성의 문제 등으로 인해 그 사용이 제한되고 있다.

이에, 본 발명자들은 인삼의 지상부인 인삼 열매를 이용하여 피부 효능을 갖는 화장품을 연구하던 중 인삼 열매 추출물이 일반적인 인삼 및 홍삼과는 다른 성분과 조성으로 인한 피부효능이 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 상기 인삼 열매 추출물을 유효성분으로 함유함으로써 멜라닌생성 억제 및 색소침착 개선을 통한 피부 미백용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 인삼 열매 추출물을 유효성분으로 함유함으로써 멜라닌생성 억제 및 색소침착 개선을 통한 피부 미백 효과를 나타내는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에서는 인삼의 지상부 중에서 인삼근과 차별적 성분과 조성을 갖는 인삼 열매 추출물을 유효성분으로 함유시킴으로써 피부 미백 효과를 가지는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공할 수 있었다.

도 1은 실시예 1의 인삼 열매 추출물과 비교예 1의 인삼 추출물의 진세노사이드 성분을 분석한 그래프이다.
도 2는 시험물질의 활성산소 제거 활성을 보여주는 그래프이다.
도 3은 실시예 1의 인삼 열매 추출물의 콜라겐 생성량을 측정한 그래프이다.
도 4는 실시예 1의 인삼 열매 추출물의 MMP-1 생합성 저해 효과를 측정한 그래프이다.
도 5는 실시예 1의 인삼 열매 추출물과 홍삼 추출물의 일산화질소 저해 효과를 비교한 그래프이다.
도 6은 실시예 1의 인삼 열매 추출물에 의한 NO 생성량을 보여주는 그래프이다.
도 7은 홍삼 추출물에 의한 NO 생성량을 보여주는 그래프이다.

본 발명에 있어서, 상기 인삼 열매 추출물은 화장료 조성물의 형태에 따라 조성물 총 중량에 대하여 0.001~50중량%로 혼합될 수 있다. 인삼 열매 추출물은 0.001중량% 이상 혼합되는 것이 효과를 고려하였을 때 바람직하고, 50중량% 이하를 혼합하는 것이 제형화를 고려하였을 때 바람직한 수치이다.

본 발명에 의한 인삼 열매 추출물은 종자를 분리하여 제거한 인삼 열매의 과육과 과피를 일광건조 또는 열풍건조한 후 물 또는 에탄올로 추출하여 제조한 것이다.

본 발명에 따른 화장품의 외형은 화장품학 또는 피부과학적으로 허용가능한 매질 또는 기제를 함유한다. 이는 국소적용에 적합한 모든 제형으로, 예를 들면, 용액, 겔, 고체, 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구, 또는 이온형(리포좀) 및 비이온형의 소낭 분산제의 형태로, 또는 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 이들 조성물은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 또한 포말(foam)의 형태로 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 사용될 수 있다.

본 발명의 화장품은 지방 물질, 유기용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 상기 보조제는 화장품학 또는 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입된다.

본 발명의 인삼 열매 추출물을 포함하는 화장료 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며, 예를 들면, 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 아이에센스, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 파우더, 바디로션, 바디크림, 바디오일 및 바디에센스 등의 화장료로 제형화될 수 있다.

이하, 실시예 및 시험예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 실험예 및 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 하기 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

[실시예 1] 인삼 열매 추출물 제조

1) 인삼 열매 전처리: 생(生)인삼 열매를 수확하여 종자를 분리하여 제거한 후 인삼 열매의 과육과 과피를 일광건조 또는 열풍건조를 통하여 인삼 열매 건조원료를 제조하였다.

2) 인삼 열매 추출물 제조: 인삼 열매 건조물 1kg에 물 3L를 가하여 환류 추출한 다음 여과한 후 40~45℃에서 감압농축하여 인삼 열매 추출물 300g을 얻었다.

[비교예 1] 인삼근 추출물 제조

상기 실시예 1에서 인삼 열매 대신에 인삼근(뿌리)을 사용한 것을 제외하고 실시예 1과 동일한 방법으로 제조하였다.

[시험예 1] 인삼 열매 추출물의 성분비교

<인삼 열매와 인삼근의 진세노사이드(인삼사포닌) 성분분석>

실시예 1 및 비교예 1에서 각각 인삼 열매와 인삼근 추출물을 제조한 다음 이들 추출물에 에테르(ether)를 처리하여 지용성 성분을 제거한 후 부탄올(BuOH)로 조사포닌을 추출, 농축하여 HPLC를 통한 진세노사이드 성분분석을 실시하였으며, 그 결과를 도 1 및 표 1에 나타내었다.

	실시예 1	비교예 1
조사포닌함량 (건조중량)	33.42%	16.70%
PD/PT 비율	0.73	3.23

실시예 1에서 제조한 인삼 열매 추출물은 조사포닌 함량에 있어서 비교예 1에서 제조한 인삼근 추출물의 약 2배 함량을 가지고 있었으며, 진세노사이드를 PD(Protopanaxadiol)계-“진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc 및 Rd” 및 PT(Protopanaxatriol)계-“진세노사이드 Re, Rg1 및 Rg2”의 비율로 구분하였을 때 각각 0.73과 3.23으로 그 조성에 있어서 인삼 열매와 인삼근은 뚜렷한 차이 및 특징을 나타내었다.

<인삼 열매 추출물의 미네랄 성분분석>

실시예 1에서 제조한 인삼 열매 추출물이 인삼과는 다른 “과실”로서의 특징을 가짐을 구분하기 위하여 비타민을 비롯한 미네랄 성분 분석을 실시하였으며, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

성분	함량	성분	함량
칼륨(mg/100g)	5865.57	마그네슘(mg/100g)	354.38
칼슘(mg/100g)	819.26	아연(mg/100g)	178.49
철(mg/100g)	59.31	비타민 A(μg/100g, RE )	213.11
인(mg/100g)	187.17	비타민 B1(mg/100g)	12.29
비타민 B2(mg/100g)	8.45	비타민 B6(mg/100g)	10.50
비타민C(mg/100g)	4.91	비타민 E(mg/100g, α-TE)	23.61
비타민 K(μg/100g)	232.12	나이아신(mg/100g, NE)	5.76
판토텐산(mg/100g)	5.87	엽산(μg/100g)	349.97

이상과 같이 본 발명에서 사용하는 인삼 열매의 성분적 특성은 인삼근보다 많은 인삼사포닌을 함유함과 동시에 사포닌 조성의 성질이 정반대이고, 또한 인삼근과 달리 열매로서 비타민과 미네랄 16종의 함량이 풍부함을 확인할 수 있었으며, 이를 바탕으로 피부효능에 대한 하기 실험들을 진행하였다.

[시험예 2] 피부 노화 억제 및 주름 개선 효과

1) 인삼 열매 추출물의 항산화 효과

자외선(UV) 조사에 의하여 세포에서 발생하는 활성산소(ROS; Reactive oxygen species)를 제거하는 능력을 비교하는 실험을 통하여 항산화 효과를 조사하였다. 양성대조군으로서 일반적으로 항산화 효과를 비교하는데 사용하는 트롤록스(trolox)를 사용하였으며, 이를 백삼 및 홍삼 추출물과도 비교하였다(도 2). 또한 시험물질을 처리하지 않은 군을 대조군으로 사용하였다.

도 2의 결과에서, 본 발명에 의한 실시예 1의 인삼 열매 추출물은 인간 HaCaT 각질형성세포 단층 배양 시스템(human HaCaT keratinocytes monolayer culture system)에서 대조군에 비하여 UV에 의해 생성된 활성 산소를 유의적으로 소거하는 효과를 나타내었다. 이는 항산화 물질의 활성지표로 사용되는 트롤록스와 유사한 정도의 우수한 활성이며, 유의적인 소거 활성이 없는 백삼, 홍삼 추출물과 대조되는 결과이다. 즉, 본 발명의 실시예 1에 의한 인삼 열매 추출물은 피부 노화의 원인이 되는 활성 산소를 유의적으로 소거함으로써 주름 생성, 탄력 저하 및 색소 침착 등을 예방하는 효과를 가질 수 있음을 확인하였다.

2) 단 세포 겔 전기영동(Single cell gel electrophoresis; SCGE, Comet assay)에 의한 DNA 산화적 손상에 대한 억제 활성

사람의 정상 섬유아세포를 24시간 배양한 후 실시예 1의 인삼 열매 추출물과 비타민 E를 각각 농도별로 처리하고, 12시간 후에 양성대조군인 H₂O₂(최종농도 10^-3M)를 처리한 다음 전기영동법으로 염색한 결과를 형광현미경으로 관찰하였다. 이때 이미지 분석기(image analyzer)인 KOMET 3.1(Kinetic Imaging, England)를 사용하여 25개의 각 세포에서 DNA 절단의 결과로 나타난 테일(tail)의 길이(um)를 분석하였으며, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

인삼 열매 추출물 및 비타민 E의 DNA 산화적 손상에 대한 억제작용

시험물질	테일 길이(㎛)	저해율(%)
H2O2	115.6	-
H2O2 + 실시예 1(10 ppm)	75.8	34.4
H2O2 + 실시예 1(50 ppm)	65.7	43.2
H2O2+ 실시예 1(100 ppm)	52.1	54.9
H2O2 + 비타민 E 10 ppm	70.6	38.9

상기 표 3의 결과에서, 세포 겔 전기영동에 의한 실시예 1의 인삼 열매 추출물은 유의성 있는 산화적 DNA 손상 억제 활성을 나타내었으며, 이로 인해 본 발명에 의한 인삼 열매 추출물이 히드록실 라디칼(.OH)에 의한 DNA 싱글 스트랜드 브레이크(single strand break)를 억제하는 DNA 산화적 손상억제제로서 작용함을 확인할 수 있었다.

3) I형 프로콜라겐 분석(Type I Procollagen assay)

인체 섬유아세포를 10⁵ 개의 농도로 12공 평판배양기에서 배양한 다음 실시예 1의 인삼 열매 추출물 1ppm 및 10ppm을 포함한 배지로 교체하였다. 배양 3일째 세포를 수확해서(harvest) ELISA 방법으로 생성된 I형 프로콜라겐(type I procollagen)의 양을 정량하였다. 그 결과는 실시예 1의 인삼 열매 추출물을 포함하지 않은 대조군을 100으로 하여 측정한 값과의 비교치로 산출하였고, 양성대조군으로 TGF-b를 사용하였다. 또한 인삼근 추출물로서 백삼 및 홍삼 추출물과도 비교하였다.

인간 정상 섬유아세포 단층 배양 시스템(Normal human fibroblast monolayer culture system)에서 실시예 1의 인삼 열매 추출물은 대조군에 비하여 I형 프로콜라겐 생성을 뚜렷하게 촉진시키는 효과를 나타내었다. 즉, 실시예 1의 인삼 열매 추출물은 인체 피부의 노화에 의해 발생하는 콜라겐 생성량 감소 현상을 억제할 수 있었고, 주름 개선 효과를 나타내었다(도 3).

4) MMP-1 발현 억제 분석

인체 섬유아세포를 10⁵ 개의 농도로 12공 평판배양기에서 배양한 다음 자외선 B를 40mJ/㎠로 조사한 후, 실시예 1의 인삼 열매 추출물 1ppm 및 10ppm을 포함한 배지로 교체하였다. 배양 2일째 세포를 수확해서(harvest) ELISA 방법으로 생성된 MMP-1(matrix metalloproteinase I)의 양을 정량하였다. 그 결과는 시험물질을 포함하지 않는 자외선 대조군을 100으로 하여 측정한 값과의 비교치로 산출하였고, 양성대조군은 TGF-b를 사용하였다. 또한 인삼근 추출물로서 백삼 및 홍삼 추출물과도 비교하였다.

인간 정상 섬유아세포 단층 배양 시스템에서 본 발명에 의한 실시예 1의 인삼 열매 추출물은 UVB 40mJ/㎠에 의해서 유도되는 MMP-1의 발현을 유의적으로 억제하였다. 따라서, 본 발명에 의한 실시예 1의 인삼 열매 추출물은 내적 노화 또는 외적 환경요인에 의하여 발생하는 피부조직 분해효소인 MMP-1의 생합성을 저해하여 피부 노화를 억제하고 주름개선에 효과가 있음을 확인하였다(도 4).

5) 자외선에 의한 사이클로옥시게나제-2(COX-2)의 생합성 억제 효과

인체 섬유아세포를 10⁵ 개의 농도로 12공 평판배양기에서 배양한 다음 자외선A를 15J/㎠로 조사한 후, 실시예 1의 인삼 열매 추출물 및 비교예 1의 인삼근 추출물을 각각 0.1ppm, 1ppm 및 10ppm 포함한 배지로 교체하였다. 배양 2일째 세포를 수확해서(harvest) 웨스턴블랏(Westren blot) 방법을 사용하여 생성된 사이클로옥시게나제-2(cyclooxygenase-2, COX-2)의 양을 정량하였다. 시험물질을 함유하지 않은 자외선 대조군을 100으로 하여 농도계(densitometer)로 측정한 값과의 비교치로 산출하였고, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

시험물질(농도:ppm)		COX-2 생합성(%)
실시예 1	10	11
	1	38
	0.1	63
비교예 1	10	72
	1	91
	0.1	99
대조군		100

상기 표 4의 결과로부터, 실시예 1의 인삼 열매 추출물은 자외선에 의한 사이클로옥시게나제-2의 생합성을 농도 의존적으로 감소시켰으며, COX-2의 산물인 프로스타글란딘 E2(PGE2)에 의한 피부조직분해를 방지하는 것을 확인할 수 있었다.

6) 자외선에 의한 종양괴사인자알파(TNF-α)의 생합성 억제 효과

인체 각질형성세포를 10⁵개의 농도로 12공 평판배양기에서 배양한 다음 자외선 B를 30mJ/㎠로 조사한 후, 실시예 1의 인삼 열매 추출물 및 비교예 1의 인삼근 추출물을 각각 0.1ppm, 1ppm 및 10ppm 포함한 배지로 교체하였다. 배양 6-24시간 후 세포를 수확해서(harvest) ELISA(Pharmingen 555212) 방법을 사용하여 생성된 종양괴사인자알파(TNF-α)의 양을 정량하였으며, 시험물질을 처리하지 않은 자외선 대조군을 100으로 하여 측정한 값과의 비교치로 산출한 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

시험물질(농도:ppm)		TNF-α 생합성(%)
실시예 1	10	16
	1	38
	0.1	72
비교예 1	10	74
	1	85
	0.1	92
대조군		100

상기 표 5의 결과로부터, 본 발명에 의한 실시예 1의 인삼 열매 추출물이 자외선에 의한 종양괴사인자알파(TNF-α)의 생합성을 농도 의존적으로 감소시킴으로써 종양괴사인자알파의 생합성으로 인해 발생할 수 있는 피부 노화를 미연에 방지할 수 있음을 확인하였다.

7) 인체 피부를 대상으로 한 피부 주름 개선 효과

30-50세의 안면주름이 있는 시험대상자 40명에 대하여, 하기 표 6에 기재된 조성을 갖는 실시예 1의 인삼 열매 추출물을 함유한 실시예 2 및 함유하지 않은 비교예 2의 영양크림을 제조한 후 이들의 피부 주름 개선 효과를 비교평가하였다(단위: 중량%).

성 분	실시예 2	비교예 2
인삼 열매 추출물	0.1	-
밀납	10	10
폴리솔베이트60	1.5	1.5
피이지 60 경화피마자유	2	2
솔비탄세스퀴올레이트	0.5	0.5
유동파라핀	10	10
스쿠알란	5	5
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드 (Estasan: Uniqema(제조사))	5	5
글리세린	5	5
부틸렌글리콜	3	3
프로필렌글리콜	3	3
트리에탄올아민	0.2	0.2
방부제, 색소, 향료	적량	적량
정제수	잔량	잔량

피검자의 안면 좌부에는 실시예 2를, 우부에는 비교예 2를 3개월간 사용하였다. 크림 사용 이전의 안면 양쪽부의 피부 상태를 측정해 놓은 다음 크림 사용 3개월 후 동일 부위를 재측정하여 피부 주름의 변화를 측정하였다. 24℃, 상대습도 40%의 항온항습실에서 눈꼬리 부위의 주름을 레플리카(replica)로 떠서 비시오메타 시스템(Visiometer system; C+K사)으로 피부 주름을 측정하였다. 피부 주름의 변화량은 하기 수학식 1에 따라 계산하였다.

상기 수학식 1에서, “Tdi”는 D90에서의 측정부위 값이며, “Tdo”는 D0에서의 측정부위 값이다.

상기 수학식 1에 따라 계산한 결과, 비교예 2를 사용한 부위의 피부 주름은 6.5±4%(평균±표준편차)의 감소치를 나타낸 반면, 실시예 2를 사용한 부위의 피부 주름은 39±11%의 감소치를 보여 우수한 피부 주름 개선 효과를 나타내었다.

8) 인체에서 피부 탄력 개선 효과

상기 표 6의 조성으로 제조한 실시예 2 및 비교예 2의 피부 탄력 개선 효과를 측정하였다. 30세 이상의 여성 40명을 대상으로 2개 조로 나누어, 각 조에 상기 실시예 2 및 비교예 2의 영양크림을 매일 2회씩 12주간 안면에 도포한 후 피부 탄력 측정기(Cutometer SEM 575, C+K Electronic Co., Germany)를 이용하여 피부 탄력을 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 7에 나타내었다. 표 7의 결과 값은 피부 탄력 측정기의 피부 점탄성(viscoelasticity)의 성질을 의미한다.

시험물질	피부 탄력효과
실시예2	0.46±0.12
비교예2	0.29±0.09

상기 표 7의 결과에서 보여지는 바와 같이, 실시예 1의 인삼 열매 추출물이 함유된 실시예 2의 영양크림을 사용한 경우 150% 가량 피부 탄력 증진 효과를 나타내었다.

[시험예 3] 피부 미백 효과

1) 쥐의 색소세포를 이용한 멜라닌 생성 억제 효과

실시예 1의 인삼 열매 추출물의 멜라닌 생성 억제 효과를 알아보기 위하여 쥐의 색소세포를 이용하였다.

먼저, C57BL/6 마우스 유래의 쥐 색소세포(Mel-Ab cell)(Dooley, T.P. et al, Skin pharmacol, 7, pp. 188-200)를 DMEM(Dulbeccos modified Eagles media)에 10% 우태반 혈청, 100nM 2-O-테트라데카노일포르볼(tetradecanoyphorbol)-13-아세테이트 및 1nM 콜레라 독소(cholera toxin)를 첨가한 배지에서 37℃, 5% CO₂의 조건에서 배양하였다. 배양한 Mel-Ab세포를 0.25% 트립신-EDTA로 떼어내고, 24공 평판배양기에 10⁵ 세포/공(cells/well)의 농도로 세포를 배양한 다음 이틀째부터 3일 연속으로 1ppm 및 10ppm의 인삼 열매 추출물을 가하여 배양하였다. 이 때, 홍삼 추출물과 하이드로퀴논은 양성대조군으로 사용하였다. 그 다음 배양액을 제거하고, PBS로 세척한 후, 1N 수산화나트륨으로 세포를 녹여 400nm에서 흡광도를 측정한 다음, 하기 수학식 2에 따라 멜라닌 생성 억제율을 계산하였으며, 그 결과를 하기 표 8에 나타내었다(Dooley의 방법).

시험물질	멜라닌 생성 억제율(%)
실시예 1(1ppm)	14.0
실시예 1(10ppm)	34.4
홍삼 추출물(10ppm)	5.3
하이드로퀴논(대조군)	41.1

상기 표 8에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 의한 실시예 1의 인삼 열매 추출물은 홍삼 추출물 보다 우수한 멜라닌 생성 억제율을 보였고, 하이드로 퀴논과는 유사한 정도의 멜라닌 생성 억제율을 보이는 것을 확인하였다. 이를 통해 본 발명에 의한 실시예 1의 인삼 열매 추출물이 우수한 미백 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

2) 인체 피부에 대한 미백 효과

실시예 1의 인삼 열매 추출물의 인체 피부에 대한 미백 효과를 알아보기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

먼저, 건강한 12명의 남자를 대상으로 피검자의 상박 부위에 직경 1.5㎝의 구멍이 뚫린 불투명 테이프를 부착한 뒤, 각 피검자의 최소 홍반량(Minimal Erythema Dose)의 1.5~2배 정도의 자외선(UVB)을 조사하여 피부의 흑화를 유도하였다.

상기 자외선 조사 후 시험물질인 실시예 1의 인삼 열매 추출물과 하이드로퀴논을 각각 바르고, 한곳은 아무 것도 바르지 않고 10주 동안 상태 변화를 관찰하였다. 1주 단위로 피부의 색깔을 색차계 CR2002(일본, 미놀타 사)로 측정하였다.

그 다음 상기 각 시험물질의 도포 개시시점과 도포 완료시점에서의 피부색의 차이(△L*)를 하기 수학식 3에 따라 계산하였고, 그 결과를 하기 표 9에 나타내었다. 한편, 미백 효과는 시료 도포 부위와 대조군 부위의 △L*의 비교로 판정하는데, △L* 값이 2정도일 경우는 침착된 색소의 미백화가 뚜렷한 경우이고, 1.5정도 이상이면 미백 효과가 있다고 판정할 수 있다.

시험물질	피부색 밝기 정도(△L*)
실시예 1	1.76±0.21
하이드로 퀴논(양성 대조군)	1.90 ±0.13
용매(Vehicle)(음성 대조군)	0.50 ±0.16

상기 표 9에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 의한 실시예 1의 인삼 열매 추출물은 하이드로 퀴논과 유사한 정도의 피부색 밝기 정도를 보임을 확인하였다. 이는 상기 인삼 열매 추출물이 자외선에 의해 생성된 색소 침착을 개선하여 피부색을 밝게 해주기 때문이다.

[시험예 4] 피부 보습 및 아토피 증상 개선 효과

1) 인간 각질형성세포의 분화유도

각질형성세포 및 인간피부세포주(HaCaT)의 분화시 생성되는 CE(Cornified Envelop)의 양을 측정하여 본 발명에 의한 실시예 1의 인삼 열매 추출물의 세포분화 촉진 효과를 알아보았다.

일차 배양한 인간의 각질형성세포를 배양용 플라스크에 넣어 바닥에 부착시킨 후, 하기 표 10에 기재된 시험물질들을 농도별로 배양액에 첨가하고, 세포가 바닥 면적의 70~80%정도 자랄 때까지 5일간 배양하였다. 이 세포를 수확(cell harvest)하여 PBS(phosphate buffered saline)로 세척한 다음, 2% SDS(Sodium Dodecyl Sulfate)와 20mM 농도의 DTT(Dithiot시간eitol)를 함유한 10mM 농도의 트리스-염산 완충액(Tris-HCl, pH 7.4) 1ml를 가하여 소니케이션(sonication), 보일링(boiling), 원심분리한 침전물을 다시 PBS 1ml에 현탁시켜 340nm에서의 흡광도를 측정하였다. 이와 별도로 상기 소니케이션 후의 용액 일부를 취하여 단백질 함량을 측정하여, 세포분화 정도의 평가 시 기준으로 삼았다. 저칼슘(0.03mM) 처리군과 고칼슘(1.2mM) 처리군을 각각 음성/양성 대조군으로 하고, 저칼슘 농도에 시험물질을 첨가하여 실시한 시험 결과를 하기 표 10에 나타내었다.

시험물질		각질형성세포에서의 분화능 (%)
대조군	저칼슘처리군(Ca2 + 0.03 mM)	100
	고칼슘처리군(Ca2 + 1.2 mM)	210
	홍삼 추출물(100 ppm)	104
실시예 1	1 ppm	115
	10 ppm	120
	100 ppm	124

상기 표 10의 결과를 통하여 본 발명에 의한 실시예 1의 인삼 열매 추출물은 각질형성세포에서 분화를 촉진하는 것을 확인할 수 있었다.

2) 인간 피부세포주의 트랜스 글루타미네이즈(transglutaminase)의 발현 효과

인간의 피부세포주를 96공 평판배양기에 각 공당 5×10⁴개를 넣고 24시간 동안 부착시켰다. 부착시킨 피부세포주에 시험물질을 처리한 후, 2일이 지난 다음, 배지를 제거하고, -20℃ 냉장고에 보관하였다. 동결-해동(Freeze-thawing)을 2회 반복하여 물질 처리한 세포를 파괴시킨 후, -20℃에 보관한 아세톤:에탄올(1:1, v/v)을 처리하여 4℃에서 30분간 방치하여 세포를 고정시켰다. 그 후, 실온에 방치하여 유기용매가 증발되게 하고, 블록킹(1% 소혈청알부민), 트랜스글루타미네이즈 항체(primary antibody), 시간P 안티-마우스 항체(secondary)를 수행하였으며, 발색은 OPD(o-phennyldiamine)를 첨가하여 수행하였다. 발현량은 490nm에서 흡광도를 측정하였고, 보정은 630nm에서 백그라운드(background)를 측정하여 수행하였다. 저칼슘(0.03mM) 처리군과 고칼슘(1.2mM) 처리군을 각각 음성/양성 대조군으로 하고, 저칼슘 농도에 시험물질을 첨가하여 실시한 결과를 하기 표 11에 나타내었다.

시험물질		트랜스글루타미네이즈 발현량(%)
대조군	저칼슘처리군(Ca2 + 0.03 mM)	100
	고칼슘처리군(Ca2 + 1.2 mM)	140
	홍삼 추출물(100 ppm)	131
실시예 1	1 ppm	135
	10 ppm	175
	100 ppm	210

상기 표 11의 결과에서, 본 발명에 의한 실시예 1의 인삼 열매 추출물은 대조군에 비해 두 배 정도의 증가 양상을 보였고, 대조군보다도 많은 양이 발현됨을 알 수 있었다. 따라서, 본 발명에 의한 실시예 1의 인삼 열매 추출물이 트랜스글루타미네이즈의 발현을 향상시키는 것을 알 수 있었다.

3) 인간 피부에서 표피지질(총 세라마이드) 생성량 증가 효과

실시예 1의 인삼 열매 추출물이 실제 인간 피부에서의 지질 합성 증가에 미치는 효과를 평가하기 위하여, Carbopol ETD 2020 0.5%, TEA 0.45%, 시험물질 5%, 및 탈이온화된 물로 100을 맞추어 사용하였다. 12명의 성인 남, 녀를 대상으로 팔뚝에 50ml 폴리프로필렌 코르니컬 튜브(polypropylene cornical tube)의 직경만큼의 영역을 표시한 후 매일 2회씩 대조군들과 실시예 1의 인삼 열매 추출물을 20μl씩 도포하면서 피검자를 2군으로 나누어 3일째와 11일째 생성 지질량을 하기와 같은 방법으로 지질을 추출하여 분석하였다. 팔뚝을 수돗물을 이용하여 씻은 다음 스카치 810 매직테입(Scotch 810 Magic tape)으로 1회 테입 스트립핑(tape stripping)한 후 자른 50ml 폴리프로필렌 코르니컬 튜브를 저장소(reservoir)로 사용하여 1ml의 사이클로핵산/에탄올(cyclohexane/ethanol)(4:1)을 첨가한 다음 약 1분간 섞어 준 뒤 이를 새로운 튜브에 옮기고 다시 1ml의 사이클로헥산/에탄올(1:1)을 위와 같은 방법으로 처리한 후 튜브에 모았다. 이 후 이를 50℃에서 질소 가스를 이용하여 건조시킨 다음 500μl의 클로로포름/메탄올(2:1)에 녹인 후 각 시험물질들을 CAMAG사의 자동화 TLC 샘플러-4(Automated TLC sampler-4)를 이용하여 실리카겔 TLC(Thin Layer chromatography) 판에 점적하고, AMD(Automated Multiple Development)를 이용하여 하기 표 12와 같은 조성비의 전개 용매로 전개하였다.

	클로로포름	메탄올	물	아세트산	헥산	디에틸에테르	페트롤리움에테르	용매이동거리 (cm)
1차	40	10	1					3.0
2차	190	9		1				6.5
3차				2	12	3		7.5
4차							100	Top

TLC 판을 전개시킨 후 TLC 스캐너-II(CAMAG 사: densitometer)를 이용하여 570nm 파장에서 각 밴드(band)의 크기를 측정하였다. 비처치군의 세라마이드 생성량을 100%로 환산한 각 처치군의 세라마이드 생성량은 하기 표 13에 나타내었다.

시험물질		3일 처리후 (%)	11일 처리후 (%)
대조군	무처리군	100	100
	운반제(Vehicle)	103	98
	글리세린(5%)	102	94
실시예 1(5%)		108	116

상기 표 13에 나타난 바와 같이, 실시예 1의 인삼 열매 추출물 처치 3일 후에 음성대조군(무처리군/비히클) 대비 약 5 내지 8% 정도의 증가 상태를 보였고 양성대조군(글리세린) 보다는 6% 정도의 증가를 보였다. 그리고 11일 후에는 지질 생성능이 음성대조군에 비해 약 16% 정도, 양성대조군에 비해 22% 정도 우수한 것으로 나타났다. 이는 본 발명에 의한 실시예 1의 인삼 열매 추출물에 의한 세라마이드 증가를 입증하는 것이다.

4) 인체에서의 피부 보습력 증가

피부 건조증을 나타내는 50-60대의 성인 남녀 50명을 2개조로 나누어, 각 조에 실시예 2와 비교예 2를 매일 2회씩 4주간 안면에 도포하였다. 도포 개시 전과, 도포 후 1주, 2주, 4주 경과한 시점 및 도포를 중지한 2주 경과(총 6주 경과) 후에 항온, 항습 조건(24℃, 상대습도 40%)에서 코니오미터로 피부 수분량을 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 14에 나타내었다. 시험결과는 시험개시 직전에 측정한 코니오미터 값을 기준으로 하여 일정기간 처치한 후의 측정값의 증가분을 백분율로 표시한 것이다.

시험물질	수분 증가율 (%)
	1주 경과	2주 경과	4주 경과	6주 경과
실시예 2	34	41	42	33
비교예 2	30	34	34	15

코니오미터는 표피의 전기전도도 값을 측정하여 피부에 존재하는 수분량을 측정하는 피부 수분 측정기이다. 상기 표 14에서 보여지는 바와 같이, 실시예 1의 인삼 열매 추출물이 함유된 실시예 2의 물질을 도포한 군에서는 비교예 2를 도포한 대조군에 비해서 피부수분량이 더 증가되었다. 또한, 실시예 2의 영양크림의 도포를 중지한 2주 후(총 6주 경과)에 피부수분을 측정한 수치가 1~2주 경과 후의 수치와 유사하게 나타나, 실시예 2를 도포하지 않아도 일정 기간 동안 본 발명에 의한 인삼 열매 추출물의 도포에 의한 피부 수분이 지속적으로 유지됨을 알 수 있었다.

5) 아토피성 피부염 개선 효과

아토피 증상 개선 효과를 다음과 같이 측정하였다. 아토피 증상(가려움, 진무름 또는 심한 건조증)으로 진단받았거나, 육안관찰로 아토피 유사 증상을 보이는 10~50대 사이의 50명을 대상으로 하여 2그룹으로 나누고, 각각 실시예 2와 비교예 2를 제공하여, 아토피 증상을 보이는 부위에 매일 2회씩 12주 동안 도포하게 하였다. 효능 평가는 12주 처치 후 설문 조사를 통해 개선 정도를 본인이 주관적으로 판단하게 하였다. 설문에서는 아토피성 피부염의 증상을 “가려움”, “건조함”, “각질발생”, “비듬”, “홍반”, “부어오름”, “피부 균열” 및 “진물과 습진” 등으로 나누고 상기 증상이 있는 경우 각각의 증상에 대하여 개선 정도를 평가한 후에 이를 평균하여 아토피 증상 개선 효과를 개인별로 평가하였으며, 그 결과를 하기 표 15에 나타내었다.

시험물질	응답자수 (인)
	현저히 개선	개선	변화없음	악화
실시예 2	2	4	14	0
비교예 2	6	8	6	0

표 15에서 나타난 바와 같이, 본 발명에 의한 실시예 1의 인삼 열매 추출물이 함유된 제형을 도포한 처치군이 대조군보다 전반적으로 아토피 증상이 더 개선되었음을 알 수 있다.

[시험예 5] 여드름 및 피부 트러블 완화

1) 피지 조절 효과: 5-알파-리덕타아제 활성 억제 효과

성숙한 SD(Sproque-Dawley) 웅성 랫트(생후 7-8주)를 디에틸에테르로 치사시킨 후, 복부 전립선을 떼내어 결합조직을 제거하고 완충액(0.32M 수크로오스, 0.1mm 디티오트레이톨(dithiothreitol) 및 20mM 아세트산 나트륨)을 첨가하여 잘게 자른 다음, 분쇄기로 현탁화하였다. 현탁액은 원심분리하여 상층액을 취해 5-알파-리덕타아제를 부분 정제하고, 이 효소의 활성도 억제 실험을 수행하였다.

위에서 얻은 상층액의 일부를 취하여 0.2M 일염기산과 0.2M 이염기산이 들어 있는 완충액에 넣은 후, 동위원소인 ³H가 붙어있는 기질(테스토스테론)과 함께 반응시켜 생성물인 디하이드로테스토스테론의 생성량을 측정하였다.

반응용액은 1mM 디티오트레이톨, 40mM 나트륨 포스페이트(pH 6.5), 50μM NADPH, [1,2,6,7-³H] 테스토스테론/테스토스테론(2.2×10⁹몰) 및 효소 현탁액(0.8㎎) 단백질을 565㎕ 포함하였다.

실시예 1의 인삼 열매 추출물을 10% 에탄올에 녹여 한 반응당 100㎍/10% 에탄올 10㎕ 상태로 가하고, 대조군으로는 동일한 부피의 용매를, 양성대조군으로는 리보플라빈을 사용하였다.

반응은 효소 현탁액을 부가하는 것과 동시에 시작하여 37℃에서 30분간 진행시킨 후, 1㎖의 에틸아세테이트를 가하여 추출하였으며, 100㎕의 에틸아세테이트상을 실리카 플라스틱 시트 카이젤겔 60 에프 254(Silica plastic sheet kieselgel 60 F254)상에서, 전개용매계는 아세테이트-사이클로헥산(1:1)으로 전개하였다.

플라스틱 시트를 공기 건조한 후, 동위원소의 양을 측정하기 위해 바스 시스템을 사용하였는데, 건조된 플라스틱 시트와 엑스레이 필름을 함께 바스 카세트에 넣어 1주일 후에 필름에 남아있는 테스토스테론과 디하이드로테스토스테론의 동위원소 양을 측정하였으며, 각각의 저해율에 대한 결과를 하기 표 16에 나타내었다.

시험물질	T(dpm)	DHT(dpm)	전환율(%)	저해율(%)
실시예 1	6878	2355	25.5	39.9
대조군	7520	5536	42.4	-
양성 대조군	6300	2530	28.7	32.4
(1) T : 테스토스테론 영역에서 나타난 3H 레디오 액티버티 (2) DHT : 디하이드로테스토스테론 영역에서 나타난 3H 레디오 액티버티 (3) 전환율 : DHT 영역의 레디오 액티버티/전체 레디오 액티버티 (4) 저해율 : 100 x (대조군의 전환율-시료의 전환율)/대조군의 전환율

상기 표 16으로부터, 인삼 열매 추출물은 5-알파 리덕타아제 억제 효과가 있음을 알 수 있었다.

2) 지질합성(lipogenesis) 억제 효과

지질 합성에 필요한 탄소 원소의 소비(uptake) 정도를 정량하여 지질합성 저해 정도를 평가하는 방법으로 피지선에서의 지질 합성 정도를 평가하였다.

즉, 피지선이 많은 햄스터 귀 조직을 생검(biopsy)하여 C14이 라벨된 배지에서 6시간 동안 방사능 측정기로 대조군과 시험물질들을 비교 정량하여 저해 정도를 평가하였다. 시험물질들은 햄스터 오른쪽 귀 조직을 이용, 배지에 시험물질 용액 0.01%를 가하여 사용하였고, 대조군은 햄스터 왼쪽 귀 조직을 이용, 배지에 생리 식염수 0.01%를 가하여 사용하였으며, 그 결과를 하기 표 17에 나타내었다.

한편, 표 17에서 저해율은 하기 수학식 4에 따라 계산한 것이고, 그 값은 4 마리의 햄스터에 대한 평균값이다.

시험물질	저해율(%)
실시예 1	47
양성 대조군(레티노인산)	52

상기 표 17의 결과로부터, 본 발명에 의한 실시예 1의 인삼 열매 추출물이 지질 생합성 억제 효과가 있음을 알 수 있다.

3) 면포 감소 효과

면포 감소 효과를 확인하기 위하여 본 발명에 사용된 실시예 1의 인삼 열매 추출물을 1,3-부틸렌글리콜에 용해시켜 1% 용액이 되도록 한 후, 토끼 임상실험용 시험물질로 사용하였다.

흰 토끼의 귀에 면포 유발 물질인 50% 올레인산/파라핀오일 0.2㎖를 오전에 도포하여 면봉으로 문질러 주었다. 하루 두 번 오전(50% 올레인산/파라핀오일), 오후(물질)에 도포하며 총 실험 기간인 한달 동안 도포하였다. 면포는 약 10일 전후부터 발생되는데, 실시예 1의 인삼 열매 추출물을 0.2㎖씩 오후에 도포해 준 결과 2주 후부터는 점차적으로 면포의 수 및 크기가 감소하였다.

각 조직을 생검하여 각질을 벗겨낸 다음, 면포 크기를 현미경 하에서 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 18에 나타내었다.

시험물질	평균 면포 크기 측정 (0.1mm) N=3
대조군(미처리군)	1.78
올레인산 (OA)	3.5
올레인산 (OA) + 실시예 1	2.3

상기 표 18의 결과로부터, 본 발명에 의한 실시예 1의 인삼 열매 추출물로 처리한 토끼의 면포가 현저히 감소되었다는 것을 알 수 있었다. 즉, 실시예 1의 인삼 열매 추출물에 의해 피지감소가 나타났고, 결과적으로 피부 과각질화를 감소시켜 면포가 감소되었음을 추정할 수 있다.

4) 피지 분비 억제 효과

지성피부 완화 효과를 측정하기 위해서 20-45세의 여성층으로 지성피부를 가진 20명에게 이마 부분에 10명은 실시예 2(인삼 열매 추출물 함유)를, 다른 10명에게는 비교예 2를 아침, 저녁으로 1일 2회 도포하여 사용하게 한 후에 1주, 2주, 3주 및 4주 후에 피부 유분 측정기(Sebumeter SM810)를 이용하여 피부의 피지 분비량을 측정하였다. 실험은 20℃, 상대습도 20%에서 이루어졌으며 측정 결과는 표 19에 나타내었다. 결과는 피검자 10명의 평균값으로 나타내었다. 지성 피부인 경우 측정값이 220 이상이고, 정상피부의 경우 100 내지 220 사이이다.

피지분비 억제 효과

시험물질	적용전	1주	2주	3주	4주
비교예 2	245	240	239	235	230
실시예 2	245	236	231	218	209

상기 표 19의 결과에서, 본 발명에 의한 실시예 1의 인삼 열매 추출물을 함유하는 실시예 2의 영양크림이 과다한 피지 분비를 억제하는 효과를 나타내어 피지 조절 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

5) 항염증 효과: 프로스타글란딘 E2(PGE2) 생성 억제 효과

본 발명에 의한 인삼 열매 추출물의 프로스타글란딘 E2 생성 억제 효과를 알아보기 위하여 하기와 같은 방법으로 실험하였다(참고문헌: Jeffrey, K. H., Anglea, S. W., Zoe, S., and Rhia C. M. Intracellular Measurement of Prostaglandin E2: Effect of Anti-inflammatory Drugs on Cyclooxygenase Activity and Prostanoid Expression, Analytical Biochemistry, 1999, 271, 18-28).

먼저, 사람의 표피 조직에서 분리한 섬유아세포를 CO₂ 배양기에서 24시간 동안 배양한 다음, FBS(fetal bovine serum)가 포함되지 않은 배지로 교체하여 2시간 동안 배양한 후, 실시예 1의 인삼 열매 추출물에 증류수를 혼합하여 각각 1㎍/mL, 10㎍/mL 및 100㎍/mL의 농도로 준비하여 처리한 다음, 37℃, 5 %(v/v)의 CO₂ 배양기에서 2 시간 동안 배양하였다.

그 다음, 프로스타글란딘 E2 자극원으로 칼슘 이오노포어 A23187(Calcium ionophore A23187)과 아라키돈산을 50㎛의 농도로 5분간 처리한 후, 세포를 용혈시키고 ELISA 판독기 450nm에서 흡광도를 측정하여 프로스타글란딘 E2를 정량하였으며, 그 결과를 하기 표 20에 나타내었다. 이때, 하기 표 20에 기재된 억제율은 아라키돈산 처리시 실시예 1의 인삼 열매 추출물을 처리하지 않은 피부 섬유아세포와 실시예 1의 인삼 열매 추출물을 처리한 섬유아세포의 프로스타글란딘 E2 생성량의 차이를 기준으로 계산하였으며, 5회 반복하여 평균값을 구하였다.

시험물질	농도 (㎍/mL)	프로스타글란딘 E2 (pg/105 cells)	억제율 (%)
음성대조군	-	25.2 ± 4.4	-
아라키돈산	-	385.1 ± 9.1	-
아라키돈산 + 실시예 1	1	289.6 ± 6.5	24.8
	10	246.4 ±8.6	36.0
	100	195.6 ±14.3	49.2

상기 표 20의 결과에서, 본 발명에 의한 실시예 1의 인삼 열매 추출물은 자극원에 의한 프로스타글란딘 E2 생성을 억제할 수 있음을 확인할 수 있었다.

6) 항염증 효과: LPS(Lipopolysaccharide)로 유도된 사이클로옥시게나제-2(COX-2)의 생합성 억제 효과

인체 섬유아세포를 10⁵ 개의 농도로 12공 평판배양기에서 배양한 다음 LPS 처리 후, 실시예 1의 인삼 열매 추출물을 1ppm, 10ppm 및 100ppm을 포함한 배지로 교체하였다. 배양 2일째 세포를 수확해서(harvest) 웨스턴 블랏(Westren blot) 방법을 사용하여 생성된 사이클로옥시게나제-2(cyclooxygenase-2, COX-2)의 양을 정량하였다. 대조군을 100으로 하여 농도계(densitometer)로 측정한 값과의 비교치를 하기 표 21에 나타내었다. 이때 대조군은 실시예 1의 인삼 열매 추출물을 처리하지 않고 배양한 미처리군이다.

시험물질(농도:ppm)		COX-2 생합성(%)
실시예 1	100	15
	10	35
	1	71
대조군		100

상기 표 21의 결과에서 알 수 있듯이, 본 발명에 의한 실시예 1의 인삼 열매 추출물은 염증반응 유발인자인 LPS로 유도된 사이클로옥시게나제-2의 생합성을 농도 의존적으로 감소시켜 염증반응을 억제함으로써 피부 트러블을 완화시킬 수 있는 효능을 나타내었다.

7) 항염증 효과: LPS(Lipopolysaccharide)로 유도된 종양괴사인자알파(TNF-α)의 생합성 억제 효과

인체 각질형성세포를 10⁵개의 농도로 12공 평판배양기에 배양하였고, LPS를 처리한 후, 실시예 1의 인삼 열매 추출물 1ppm, 10ppm 및 100ppm을 포함한 배지로 교체하였다. 6-24시간 배양한 다음 세포를 수확해서(harvest) ELISA(Pharmingen 555212) 방법을 사용하여 생성된 종양괴사인자알파(TNF-α)의 양을 정량하였다. 대조군을 100으로 하여 측정한 값과의 비교치를 표 22에 나타내었다. 이때 대조군은 실시예 1의 인삼 열매 추출물을 처리하지 않고 배양한 미처리군이다.

시험물질(농도:ppm)		TNF-α 생합성(%)
실시예 1	100	14
	10	41
	1	69
대조군		100

상기 표 22의 결과에서 알 수 있듯이, 본 발명에 의한 실시예 1의 인삼 열매 추출물은 염증유발인자 LPS에 의한 종양괴사인자알파(TNF-α)의 생합성을 농도 의존적으로 감소시켜 이로 인해 발생할 수 있는 염증반응을 억제하여 피부 트러블 개선에 기여할 수 있었다.

8) 대식세포(Macrophage)에 대하여 LPS로 유도시킨 NO(산화질소) 억제 효과

본 발명에 의한 인삼 열매 추출물의 항염증 효과를 알아보기 위하여 대식세포(Macrophage)에 대하여 LPS로 유도시킨 NO(산화질소) 억제 실험을 진행하였다.

10% 농도의 혈청을 첨가한 배지에서 5% CO₂ 조건 하에 대식세포(Raw 264.7 cell)를 배양하였다. 96공 평판배양기에서 2×10⁵개의 농도로 자라게 하고, LPS(1 ug/ml)로 자극한 후 실시예 1의 인삼 열매 추출물과 홍삼 추출물을 각각 처리하여 37℃에서 1시간 동안 보관한 후 NO 생성 정도를 측정하여 LPS로 유도시킨 NO 저해하는 효과를 비교하였다. NO 생성량의 측정은 Griess 반응법(Minghetti, L. et al., 1991, Glia 19. 152-160)을 이용하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5의 결과에서 보여지는 바와 같이, 본 발명에 의한 실시예 1의 인삼 열매 추출물은 염증유발인자(Cytokine)로서의 NO 생성을 효과적으로 억제하였으며, 그 효과가 홍삼 추출물보다 월등히 우수하였다. 따라서, 본 발명에 의한 실시예 1의 인삼 열매 추출물은 염증반응 조절을 통한 피부 트러블에 의한 상처를 치유하고 주름 생성을 억제하는 효과에 기여할 것으로 기대된다.

9) 여드름 및 피부 트러블 개선 효과

실험에 참여한 인원은 평소 여드름을 비롯한 피부 트러블이 심한 여성 10명으로, 항온 항습실에서 얼굴을 비누로 수세한 후 30분간 적응시키고, 여드름 개수 및 염증이 동반된 개수를 비교하여 피부 트러블 정도를 측정하였다.

상기 피시험자들에게 실시예 2 및 비교예 2의 영양크림을 각각 4주일 동안 사용하게 한 다음 여드름 및 피부 트러블 정도를 비교하였으며, 그 결과를 하기 표 23에 나타내었다.

	실시예1 (5명)	비교예1 (5명)
피부 트러블 개선비율	80%	20%

상기 표 23의 결과에서 보여지는 바와 같이, 본 발명에 의한 실시예 1의 인삼 열매 추출물을 포함한 실시예 2를 4주간 도포한 결과 기존 여드름 개수의 감소 및 염증 동반 트러블의 개선 효과가 나타났다.

[시험예 6] 피부 혈색 개선 효과

1) 인삼 열매 추출물의 HUVEC(Human umbilical vein endothelial cell)에서의 NO 생성능

사람의 혈관내피세포에는 eNOS(endothelial nitric oxide synthase)가 존재하며, 그 활성이 증가하는 것으로 NO(산화질소)를 생성시켜 혈관을 확장시키고, 혈행을 촉진하는 역할을 하게 된다. 사람의 혈관내피세포를 배양한 후 인삼 열매 추출물(도 6)과 일반홍삼 추출물(도 7)을 배지에 처리하여 생성되는 NO의 양을 비교하였다. 즉, 혈관내피세포는 젤라틴 코팅된 24공 평판배양기에서 2.5×10⁴ cells/well의 밀도로 부착시킨 다음 성장배지에서 12시간 동안 배양하였다. 혈관내피세포는 본 발명에 의한 실시예 1의 인삼 열매 추출물과 홍삼 추출물을 처리한 군, 무처리군을 12시간 동안 전처리하였다. 내피세포는 37℃에서 FBS가 없는 M199 배지에 10μmol/L DAF-FM 다이아세테이트(diacetate; Molecular Probe, OR)로 30분 동안 처리하였다. 혈관내피세포는 FBS가 없는 M199 배지로 3번 씻어준 후, 평행판 플로우 챔버(parallel plate flow chamber)에 넣고 수은 램프(mercury lamp)로부터 분리된 빛으로 자극하였다. 자극(Excitation) 파장은 488nm이고, NO가 결합된 DAF는 515nm에서 형광을 나타낸다. 사진은 공초점 레이저 현미경(Atto Bioscience, USA)으로 찍었고, 형광의 밝기는 이미지-프로 플러스 v4.5 소프트웨어(Media Cybernetics, San Diego, CA, USA)로 분석하여 무처리군 대비 형광의 강도로서 NO 생성 정도를 비교하였다.

도 6 및 도 7의 결과에서 볼 수 있듯이, 본 발명에 의한 실시예 1의 인삼 열매 추출물은 무처리군 대비 500~1300%의 NO 생성 정도를 나타내었고, 일반홍삼 추출물은 100~200%의 NO 생성 정도를 나타내었다(동일한 농도비교 50~100ug/ml). 따라서, 본 발명에 의한 실시예 1의 인삼 열매 추출물은 홍삼 추출물에 비하여 월등히 우수한 혈관내피세포에서의 NO 생성능을 나타내었다. 실시예 1의 인삼 열매 추출물의 위와 같은 뛰어난 NO(산화질소) 생성능은 결국 모세혈관을 확장시키고 혈액순환을 촉진시킴으로써 피부에 영양분을 원활하게 공급하고 피부 노화를 억제시키며, 피부의 혈색을 개선시킬 수 있는 효능에 기여하게 된다.

2) 인체 피부(얼굴)의 혈색 개선 효과

본 발명의 인삼 열매 추출물을 함유하는 조성물에 대하여 피부에서의 혈액순환 촉진 효과를 평가하기 위하여, LDPI(Laser Doppler Perfusion Imager)를 이용하여 피부에서의 혈액순환 정도를 측정하였다. LDPI는 피부에서의 혈액순환을 측정하는 기기로 널리 알려져 있고 현재도 사용되고 있는 기기로서, 피부의 모세혈관에서 혈액의 속도 및 양뿐만 아니라 소동맥과 소정맥에서의 흐름까지 측정해 낼 수 있는 매우 민감한 기기이다.

항온항습실에서 얼굴을 비누로 수세한 후 30분간 적응시키고, LDPI와 피부온도 측정기구인 IR(Infrad) 카메라를 이용하여 초기값을 측정하였다. 실험에 참여한 인원은 평소 손발이 차가운 여성 20명으로, LDPI로 이마 아래 부분의 초기 혈류량을 측정하였고, IR 카메라를 이용하여 이마, 눈밑 및 뺨의 피부 온도 초기값을 측정하였다.

실시예 2를 1주일 동안 피시험자들에게 사용하게 한 후 혈류량과 피부 온도를 초기 측정값과 비교하였으며, 그 결과를 하기 표 24 및 표 25에 나타내었다.

사용 전후 LDPI 결과

얼굴	사용전	1주 사용후
평균값	0.952	1.169

사용 전후 IR 결과

	이마	눈밑	뺨
사용 전	32.26	32.02	30.44
1주 사용 후	33.87	33.69	33.57

상기와 같이, 본 발명에 의한 인삼 열매 추출물을 함유한 실시예 2를 사용한 결과, 피시험자들의 얼굴에서 말초혈액순환 개선 효과로 인하여 혈색이 개선되는 것을 확인할 수 있었으며, 이는 궁극적으로 본 발명에 의한 인삼 열매 추출물을 함유하는 경우 피부의 영양분을 효과적으로 전달하고 피부 노화를 억제하며 지연시키는데 기여할 수 있음을 시사한다.

[제형예 1] 유연화장수(스킨로션)

배합성분	함량(중량%)
정제수	잔량
인삼열매 추출물	0.1
부틸렌글리콜	2.0
프로필렌글리콜	2.0
카르복시비닐폴리머	0.1
피이지-12 노닐페닐에테르	0.2
폴리솔베이트 80	0.4
에탄올	10.0
트리에탄올아민	0.1
방부제, 색소, 향료	적량

[제형예 2] 영양화장수(밀크로션)

배합성분	함량(중량%)
정제수	잔량
인삼열매 추출물	0.1
밀납	4.0
폴리솔베이트 60	1.5
솔비탄세스퀴올레이트	1.5
유동파라핀	0.5
Montana 202 (제조사:Seppic)	5.0
글리세린	3.0
부틸렌글리콜	3.0
프로필렌글리콜	3.0
카르복시비닐폴리머	0.1
트리에탄올아민	0.2
방부제, 색소, 향료	적량

[제형예 3] 마사지크림

배합성분	함량(중량%)
정제수	잔량
인삼열매 추출물	0.1
밀납	10.0
폴리솔베이트 60	1.5
피이지 60 경화피마자유	2.0
솔비탄세스퀴올레이트	0.8
유동파라핀	40.0
스쿠알란	5.0
Montana 202 (제조사:Seppic)	4.0
글리세린	5.0
부틸렌글리콜	3.0
프로필렌글리콜	3.0
트리에탄올아민	0.2
방부제, 색소, 향료	적량

[제형예 4] 팩

배합성분	함량(중량%)
정제수	잔량
인삼열매 추출물	0.1
폴리비닐알콜	13.0
소듐카르복시메틸셀룰로오스	0.2
글리세린	5.0
알란토인	0.1
에탄올	6.0
핑이지-12 노닐페닐에테르	0.3
폴리솔베이트 60	0.3
방부제, 색소, 향료	적량

Claims (3)

1. 인삼 열매 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 인삼 열매 추출물은 종자를 분리하여 제거한 인삼 열매의 과육과 과피를 일광건조 또는 열풍건조한 후 물 또는 에탄올로 추출하여 제조한 것임을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 화장료는 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 아이에센스, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 파우더, 바디로션, 바디크림, 바디오일 및 바디에센스로 이루어진 군으로부터 선택되는 제형을 가지는 것임을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.

Images