KR100697319B1 - 플라보노이드 함량이 증가된 마가목추출물의 제조방법과이를 함유하는 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

마가목추출물에 효소를 처리함으로써 당-가수분해 효소반응을 통해 플라보이드 함량이 증가한 마가목추출물을 제조하는 방법 및 이를 함유하는 화장료 조성물이 개시된다. 장미과(Rosaceae)의 낙엽활엽소교목인 마가목의 줄기와 수피 추출물에 당-가수분해 효소를 처리한 마가목추출물을 0.00001 - 5.0중량%, 바람직하게는 0.001 - 1.0중량%를 함유하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물은 피부흡수가 뛰어나며 종래의 마가목추출물보다 항산화효과,주름방지효과, 미백효과, 자극완화 효과가 우수하다.

마가목추출물, 당-가수분해효소, 플라보노이드, 항산화효과, 주름방지효과, 미백효과, 피부자극 완화 효과, 피부외용제.

Description

플라보노이드 함량이 증가된 마가목추출물의 제조방법과 이를 함유하는 화장료 조성물{METHOD FOR MANUFACTURING EXTRACT OF SORBUS COMMIXTA HAVING INCREASED AMOUNT OF FLAVONOID AND COSMETIC COMPOSITION CONTAINING SAME}

본 발명은 마가목(Sorbus commixta) 추출물을 제조하는 방법 및 이를 주요 활성성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

자외선에 노출된 피부는 프리라디칼과 활성산소종(ROS)을 생성시켜 피부암, 광독성, 자기면역장애, 광과민증과 피부노화 등을 유발하게 된다.(Norins, J. Invest. Dermatol., 39:445, 1962; Cadenas, Ann. Rev. Biochem., 58:79, 1989). 생체 내에서 콜라겐과 같은 세포외기질의 합성과 분해는 적절하게 조절되나 노화가 진행되면서 그 합성이 감소하며 콜라겐을 분해하는 효소인 기질 금속단백질 분해효소(MMP)의 발현이 촉진되어 피부의 탄력이 저하되고 주름이 형성된다. 또한 이러한 분해효소는 자외선 조사에 의해 활성화되기도 한다. 그러므로 세포내에서 활성화가 유도되는 MMP 발현을 조절하거나 그 활성을 억제할 수 있는 물질의 개발이 요구되고 있다.

다음으로, 멜라닌은 색소 세포 내에 존재하는 티로시나제 작용에 의해 티이 로신으로부터 도파(dopa), 도파퀴논(dopaquinone)으로 변환되어 도파크롬(dopachrome)등을 거쳐 생성되어진다. 이 멜라닌은 피부에 존재하여 자외선 등으로부터 신체를 보호하고 체내 호르몬 분비 조절에 중요한 기능을 가지고 있다. 그러나 멜라닌이 과잉생산됨으로써 기미, 주근깨 등을 형성하고, 피부노화를 촉진하며, 피부암 유발에 중요한 작용을 하는 것으로 알려져 멜라닌 과잉생산을 예방하는 연구개발이 활발히 진행되고 있다.

이미 아스코르빈산(일본특개평 4-9320), 하이드로퀴논(일본특개평 6-192062), 코직산(일본특개소 56-7710), 알부틴(일본특개평 4-93150) 및 일부의 추출물 등이 티로시나제 저해 활성을 가지고 있어 미백 화장료로 이용되고 있으나 화장품 제형 중에서의 안정성이 나빠 분해되어 착색되거나, 이취의 발생, 생체 레벨에서의 효능, 효과의 불분명 및 안전성 문제 등으로 그 사용이 제한되고 있는 실정이다.

따라서 보다 우수한 화장품 원료를 찾고자 하는 연구의 일환으로 여러 천연물을 검색한 결과 본 발명자들은 마가목추출물이 항산화제 및 미백활성이 우수하다는 것을 발견하였다(대한민국 특허출원: 제2004-0035048호). 그러나 마가목의 단순추출물의 경우 생체외에서는 유효한 효능을 나타내지만, 실제로 이를 함유하는 화장료를 피부에 도포하였을 때는 그 효과가 만족스럽지 못한 문제점이 있었다.

일반적으로, 효과적인 피부투과를 위해서는 친수성의 성질을 지니고 있는 물질보다는 소수성의 물질이 더 효과적이다. 왜냐하면, 피부의 각질층 중에 분포되어 있는 세라마이드 성분 사이를 통과하기 위해서는 친수성의 물질보다는 소수성의 물 질이 세라마이드와의 상호작용에 더 효과적이며, 보다 자유롭게 피부 최외각 층을 통과할 수 있기 때문이다.

따라서 본원 발명자들은 상기 마가목추출물의 효능효과를 나타내는 주요성분이 플라보노이드(Flavonoids)임을 확인하였으며, 식물에 풍부한 페놀성 화합물(Polyphenols)인 Flavonoids, tannins 그리고 anthocyanins 등은 자외선으로 인해 손상된 피부를 보호할 수 있는 우수한 항산화 후보물질이다(Shibamot, American Chem. Soc., 564:247-256, 1994). 특히, Flavonoids 또는 이들의 유도체 성분들은 항염증, 항알레르기, 항바이러스, 항암 및 당뇨병 등의 약리학적 효능이 알려져 있으며(Middleton et al., Pharmacol. Rev., 52:673, 2000), 자외선으로 인해 발생한 라디칼 소거능, 지질과산화생성 억제능 등의 항산화력과 미백작용인 티로시나제 활성 억제능이 우수한 것으로 보고되고 있다(Nijveldt et al., Am. J. Clin Nutr., 74:418, 2001).

플라보노이드는 대부분 당(sugar) 한 분자 이상이 결합된 배당체(glycosides)로서 자연계에 존재하고 분자량이 상대적으로 크며, 수용성의 성질도 일부 지니기 때문에 각직층을 쉽게 통과하지 못하고 이에 따라 피부 내부로의 유입이 어렵게 되어 효과적으로 흡수가 어렵다는 문제점이 있다.

이와 같이 자연 상태에서 대부분이 배당체의 형태로 존재하는 플라보노이드를 당이 제거된 어글리콘(aglycone)으로 전환시키는데는 크게 두 가지 방법이 있다. 첫째는 산을 이용하여 플라보노이드 배당체를 가수분해하는 방법인데, 가혹한 조건에서 반응이 이루어짐으로써 구조 변화가 예상될 수 있고, 공정 후 발생되는 폐수의 처리가 문제가 되며, 부가적인 정제공정 등의 번거로운 공정이 필요한 단점이 있다. 둘째는 효소를 이용한 가수분해 방법인데, 대두를 물에 넣고 일정량의 효소를 넣은 후 온도 40~60℃, pH 4~5에서 일정시간 반응시켜 어글리콘을 제조하는 방법(미국특허 제 6,015,785)과 콩추출물에 베타클루코시다제를 넣고 25~65℃에서 30분 내지 3시간 정도 반응시켜 어글리콘 이소플라본으로 전환시킨 후 일련의 공정을 거쳐 두유를 제조하는 방법(일본특허 공개 제 11169127호) 정도가 알려져 있을뿐이다.

이처럼 마가목추출물의 주요활성성분인 마가목 플라보노이드가 화장료 조성물에 포함되어 피부에 효과적으로 흡수될 수 있도록 효소처리한 경우는 없으며, 특히 마가목 추출물을 당-가수분해 효소처리한 경우는 없었다.

따라서, 본 발명자들은 상기의 단점을 극복하고자 연구한 결과, 당이 제거된 마가목 플라보노이드 성분이 피부 흡수력이 뛰어나고, 기존의 마가목추출물, 특히 플라보노이드 배당체를 함유하는 화장료 조성물보다 우수한 항산화력과 미백활성 효과를 제공할 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 마가목추출물 또는 이로부터 분리한 플라보노이드를 효소처리하여 당이 제거된 플라보노이드를 포함하는 마가목추출물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 효소처리를 통해 당이 제거된 플라보노이드를 다량 함유하여 항산화효과, 주름방지효과, 미백효과, 자극완화 효과 등의 종합적 노화방지 효과가 우수한 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

이와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은 마가목추출물을 효소처리하여 주요활성성분인 플라보노이드를 가수분해시킴으로써 플라보노이드 함량이 증가된 마가목추출물을 제조한다.

또한 본 발명에 따른 화장료 조성물은 기존에 개발된 마가목추출물(대한민국 특허출원: 제2004-0035048호)에서 당-가수분해 효소반응을 통해 플라보노이드 함량이 증가한 마가목추출물을 주요 활성성분으로 함유하는 것을 특징으로 한다.

상기 효소 가수분해반응에 사용되는 효소는 당결합을 가수분해하는 당-가수분해효소 및 이들을 함유하고 있는 복합 효소제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다. 상기의 당-가수분해효소에는 α-아밀레제(α-amylase), α,β-글루코시다제(α,β-glucosidase), β-글루카네이제(β-glucanase), 아밀로글루코시다제(amyloglucosidase) 등이 있으며, 이들 중 1종 이상을 선택하여 사용할 수 있다. 또한, 상기 복합효소제로는 나린지나제(naringinase), 셀루라제(cellulase), 펙티나제(pectinase) 등이 있으며, 이들 중 1종 이상을 선택하여 사용할 수 있다. 아울러, 상기 당-가수분해효소와 상기 복합효소를 동시에 사용할 수 있음은 물론이다.

이하 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.

마가목은 장미과의 낙엽활엽소교목으로 학명은 SORBUS COMMIXTA 이다. 우리나라를 비롯한 동양에서는 관절염과 성인병에 좋다 하여, 마가목 가지를 말려두었다가 달여 마시는 마가목 차가 알려져 있으며, 또한 열매를 이용한 마가목 술은 신 장염에 효과가 있는 것으로 알려져 오고 있다. 탄닌, 사과산, 구연산, 카로티노이드 및 플라보노이드 등의 단일성분과 플라보노이드 배당체 성분 등의 유효성분들이 풍부하여 항돌연변이, 항암, 세포독성 등에 관한 연구가 진행되고 있으며, 한방에서 마가목의 수피는 마아피라 하여 기관지염, 류마티스관절염, 중풍, 위염, 보신, 골통에 사용하며, 열매는 차로 이용하거나 생식할 수 있다.

본 발명의 마가목추출물은 마가목 천연물을 추출용매로서 정제수, 메탄올, 에탄올, 글리세린, 에틸아세테이트, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디클로로메탄 및 헥산 중에서 선택된 1종 이상의 용매를 사용하여 추출한 후, 마가목추출물에서 당이 제거된 것으로, 마가목추출물을 효소를 이용하여 가수분해하는 방법으로 제조한다.

먼저, 마가목추출물을 산완충액에 용해시키고, 여기에 효소 또는 효소 혼합물을 첨가하여 수욕상에서 교반시키면서, 박층 크로마토그래피에 의해 주기적으로 확인하여, 기질이 완전히 소실되면 열수 중에서 가열하여 반응을 종료시킨 다음, 반응액은 동량의 유기용매를 이용하여 추출, 여과, 농축하여 생성물 플라보노이드 물질을 얻는다.

예들 들어, 마가목추출물을 20mM 초산완충용액(pH 5.5)에 용해시키고, 여기에 단일효소(α-amylaseα, α,β-glucosidase, β-glucanase, amyloglucosidase, naringinase, cellulase, pectinase 등) 또는 이들의 혼합물을 첨가하고 25~55℃ 수욕상에서 24~72시간동안 교반시키면서, 박층 크로마토그래피에 의해 주기적으로 확인하여, 기질이 완전히 소실되면 열수 중에서 10분간 가열하여 반응을 종료시킨 다음, 반응액은 동량의 메탄올로 3회 추출, 여과, 농축하여 생성물 플라보노이드 물질을 얻는다.

또한, 상기의 방법으로 추출한 플라보노이드를 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에서는 또한 마가목추출물에서 상기 제조된 플라보노이드 화합물이 마가목추출물 자체보다 피부흡수가 우수하다는 것을 발견하고 이를 화장료에 적용하였다. 즉, 어떤 유효성분이 화장료에 적용되기 위해서는 안정성 및 안전성이 보장되어야 하고 피부 흡수가 우수하여야 하는데, 본 발명에 의한 플라보노이드는 마가목추출물의 플라보노이드 배당체로부터 예견되는 것보다 월등한 피부흡수효과를 나타낸다는 것을 발견 및 확인하고 이를 화장료에 적용한 것이다.

또한 본 발명의 주제는 항산화제, 주름방지제, 피부 미백제, 피부 자극 완화제로 사용되는 화장료 조성물의 용도이다.

또한, 본 발명에서 목적하는 효과를 얻기 위하여 상기 플라보노이드는 조성물 총 중량에 대하여 0.00001 - 5.0중량%, 바람직하게는 0.001 - 1.0중량%의 양으로 함유함을 특징으로 한다.

본 발명의 화장료 조성물은 그 제형에 특별히 한정되는 바가 없는데, 예를 들면, 주름개선 및 미백 기능성 화장품, 유연화장수, 영양화장수, 아이크림, 영양크림, 맛사지크림, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 에센스, 파우다, 팩 등의 제형을 가질 수 있다.

또한, 각 제형의 화장료 조성물에 있어서, 마가목추출물로부터 효소처리된 플라보노이드를 포함하여 주름개선 및 미백 원료로서 이외의 성분들을 화장료의 제형 또는 사용목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 좀더 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명의 예시적인 기재일 뿐이며 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되는 것은 아니다.

실시예 1: 마가목 추출물 제조

세절하여 음건한 마가목 2Kg을 유기용매로서 100% 메탄올로 24 시간 동안 환류추출하여 감압여과한 후 그 여액을 40℃의 수조에서 감압농축하여 농축된 메탄올 농축액을 2L의 증류수에 현탁하였다. 증류수에 현탁시킨 메탄올 추출물은 분액여두에서 2L의 부탄올로 진탕추출하여 부탄올 가용부를 추출하여 얻은 다음, 다시 추출액을 50℃의 수조에서 감압농축하였다. 농축 후 얻어진 엑기스는 엑기스 총량의 10배의 증류수로 3회 공비 농축하고 동량의 증류수를 가하여 균질하게 현탁시킨 뒤, 동결 건조시켜 분말 상태의 마가목추출물을 얻었다.

실시예 2: 효소분해방법을 통한 마가목추출물의 플라보노이드 제조

상기 실시예 1에서 수득한 마가목추출물 10g을 500ml의 20mM 초산완충용액(pH 5.5)에 용해시키고, 여기에 효소 5g(naringinase 2.0g, α-amylaseα 1.0g, β-glucanase 1.0g, β-glucosidase 0.5g, amyloglucosidase 0.5g ; Sigma)을 첨가하여 37℃ 수욕상에서 교반시키면서, 박층 크로마토그래피에 의해 8시간 간격으로 확 인하고, 기질이 완전히 소실된 48시간 후 열수중에서 10분간 가열하여 반응을 종료시켰다. 반응액을 동량의 메탄올로 3회 추출, 여과, 농축하여 생성물 4.4g을 얻었다.

실시예 3: 효소처리된 마가목추출물의 성분 확인 및 함량 실험

본 실시예는 실시예 1과 2에서 수득한 마가목추출물의 주요성분 중, 페놀성 물질, 플라보노이드, 플라보노이드 배당체 등의 정성분석 및 총 페놀 함량과 총 플라보노이드 함량 변화를 확인하기 위해 다음과 같이 수행하였다.

<정성분석>

(1) 페놀성 물질, 플라보노이드

: 추출액에 2.5% FeCl₃ 에탄올 용액을 1-2 방울 떨어뜨려 방치할 때, 암녹색으로 정색하거나 침전의 생성 여부를 관찰하였다.

(2) 플라보노이드 배당체

: 진한 황산법을 이용, 추출물 5ml에 진한황산을 점적하여 황색 및 황적색 침전의 생성을 관찰하였다.

(3) 당 : 추출액에 5% α-나프톨 알콜 시액 2-3 방울을 넣은 후 농황산을 기벽을 통하여 가할 때 경계면에 적자색이 나타나는지 관찰하였다.

<함량분석>

(1) 총 페놀 함량 : 추출액 1ml에 증류수 10ml을 첨가한 후, 2ml의 Folin- Ciocalteu phenol reagent(Sigma)첨가하여 혼합한 다음, 실온에서 5분간 반응시킨다. 이 반응물에 20% 소듐 카보네이트를 2ml 첨가하여 혼합한 다음, 상온에서 1시간 시킨 후 680nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 지표물질은 갈릭산(gallic acid)을 사용하였다.

(2) 총 플라보노이드 함량 : 추출액 1.5ml에 동량의 메탄올에 용해된 2% AlCl₃·6H₂O을 혼합한 다음 상온에서 10분간 반응을 시킨 후 367nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 지표물질은 카테킨(catechin)을 사용하였다.

총 페놀 및 총 플라보노이드 함량의 결과는 표 1과 같이 당-가수분해효소 처리된 마가목추출물이 총 페놀 함량이 높았으며, 특히 플라보노이드 함량은 2배 이상 증가하였다.

시료명	총 페놀함량 (gallic acid equivalents) (㎍/㎎ of extract)	총 플라보노이드 함량 (catechin equivalents) (㎍/㎎ of extract)
실시예 1	447.3	35.1
실시예 2	520.7	63.2

실시예 4: NBT법을 이용한 항산화 효과 측정 실험

본 실시예는 실시예 1과 2에서 수득한 마가목 추출물의 항산화 효과를 확인하기 위해 실험실 조건에서 다른 항산화제 즉, 레티놀과 BHT를 비교샘플로 하였으며, NBT법을 이용하여 항산화 활성을 측정하였다.

항산화 효과를 측정하기 위해서 크산틴과 크산틴옥시다제에 의해 생성되는 활성산소를 NBT법에 의해 측정하고 피검물질이 활성산소를 제거하는 효과, 즉 활성산소 소거효과를 평가한다. 크산틴과 크산틴옥시다제에 의해 활성산소를 생성시킨다. 이 활성산소가 니트로블루테트라졸리움(Nitro Blue Tetrazolium;NBT)과 반응하여 이것에 의해 생성되는 청색을 파장 560nm에서 측정하는 것으로 활성산소 소거율을 측정한다.

측정방법으로서

1. 0.05M Na₂CO₃ ------------------------------------ 2.4ml

2. 3mM 크산틴 용액---------------------------------- 0.1ml

3. 3mM EDTA 용액------------------------------------ 0.1ml

4. BSA 용액----------------------------------------- 0.1ml

5. 0.72mM NBT 용액---------------------------------- 0.1ml

6. 크산틴 옥시다제 용액----------------------------- 0.1ml

7. 6mM CuCl₂ 용액----------------------------------- 0.1ml

① 바이엘병에 1,2,3,4,5를 가하고 여기에 시료용액 0.1ml을 첨가하고 25℃에서 10분간 방치한다.

② 6을 가하여 빨리 교반하고 25℃에서 20분간의 배양을 개시한다.

③ 그 후 7을 가하여 반응을 정지시키고 560nm에서의 흡광도 St를 측정한다.

④ 공시험은 시료용액 대신에 증류수를 사용한 것을 상기와 똑같이 조작해 흡광도 Bt를 측정한다.

⑤ 역시, 시료용액의 블랭크(Blank)는 6대신에 증류수를 사용해 똑같이 조작하여 흡광도 Bo를 측정한다.

효과의 결과는 수학식 1에 의하여 산출하였으며, 결과는 표 2와 같다.

억제율(%) = [1-(St-So)/(Bt-Bo)] X 100

St : 시료용액의 효소 반응 후의 560nm에서의 흡광도

Bt : 공시험용액의 효소 반응 후의 560nm에서의 흡광도

So : 시료용액의 효소 무첨가시 반응전의 560nm에서의 흡광도

Bo : 공시험용액의 효소 무첨가시 반응전의 560nm에서의 흡광도

결과는 표 2와 같이 0.1% 농도에서 마가목 추출물은 retinol과 BHT과 유사한 우수한 항산화 효과를 가지고 있었으나, 효소처리된 마가목추출은 retinol과 BHT 보다 우수한 항산화 효과를 가지고 있었다.

시료명	처리 농도(%)	항산화효과(%)
실시예 1	0.1	81
실시예 2	0.1	98
retinol	0.1	93
BHT	0.1	90

실시예 5: DPPH법을 이용한 항산화 효과 측정 실험

본 실시예는 실시예 1과 2에서 수득한 마가목 추출물의 항산화 효과를 측정하기 위해 실험실 조건에서 녹차추출물과 비타민 E와 같은 항산화제를 비교 샘플로 하여 DPPH법을 이용, 항산화 활성을 측정하였다.

DPPH법은 2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl free radical (DPPH)라는 유리기를 사용하여 환원력에 의한 항산화 활성을 측정한다. 피검물질에 의해 DPPH가 환원되어 흡광도가 감소하는 정도를 공시험액의 흡광도와 비교하여 파장 560nm에서 자유라디칼 소거율을 측정한다.

사용한 시약으로서는 2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl free radical (Aldrich Chem. Co., MW=618.76) 0.1mM 용액으로서 61.88mg을 메탄올에 용해하여 100ml로 한다.

측정방법으로서

① 96-웰 플레이트에 0.1mM DPPH 용액 0.15ml에 시료용액 0.15ml를 가하여 빨리 교반하고 25℃에서 10분간의 배양을 개시한다.

② 그 후 560nm에서의 흡광도 St를 측정한다.

③ 공시험은 시료용액 대신에 증류수를 사용한 것을 상기와 똑같이 조작해 흡광도 Bt를 측정한다.

④ 역시, 시료용액의 블랭크(Blank)는 0.1mM DPPH 용액 대신에 메탄올을 사용해 똑같이 조작하여 흡광도 Bo를 측정한다.

효과의 결과는 수학식 2에 의하여 산출하였으며, 결과는 표 3과 같다.

억제율(%) = [1-(St-So)/(Bt-Bo)]X 100

St : 시료용액의 자유라디칼 소거 후의 560nm에서의 흡광도

Bt : 공시험용액의 자유라디칼 소거 후의 560nm에서의 흡광도

So : 시료용액의 자유라디칼 무첨가시 반응 전의 560nm에서의 흡광도

Bo : 공시험용액의 자유라디칼 무첨가시 반응 전의 560nm에서의 흡광도

결과는 표 3에 나타내었고 효소처리된 마가목 추출물은 0.01% 농도에서 녹차추출물과 비타민E 보다 우수한 항산화 효과를 가지고 있었다.

시료명	처리 농도 (%)	항산화효과(%)
실시예 1	0.01	82
실시예 2	0.01	96
녹차추출물	0.01	20
비타민 E	0.01	23

실시예 6: 경피 흡수량 측정 실험

피부 흡수는 헤어리스 마우스 피부를 대상으로 프란츠 투과셀을 이용하여 측정하였다. 시험 직전, 헤어리스 마우스의 복부 부분 피부를 채취하여, 평방 9cm²의 면적으로 절단한 후, 이를 투과경의 직경이 1.5cm인 투과셀에 장치하고, 클램프로 고정하였다. 피부의 한쪽면(donor 용기)은 아래의 제형예 1, 2의 영양크림 0.5g을 도포하고, 반대쪽면(receptor 용기)은 생리식염수와 에탄올 용매와 접촉하도록 하였으며, 시험시 온도는 실제 피부 온도인 37℃를 유지하였다. 시험 시작 후, 일정 시간 간격으로 용매의 일부를 채취한 후, HPLC를 이용하여 피부에 흡수된 마가목추출물과 효소처리된 마가목추출물의 양을 측정하여, 도포농도당 피부 흡수량(ug/cm²/중량%)으로 나타내었으며, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

표 4의 결과로부터, 단순추출물 형태의 마가목추출물을 함유한 화장료에 비해 플라보노이드 함량이 많은 효소처리된 마가목추출물을 함유한 화장료는 경피 흡수량이 최소 5배 이상 높음을 알 수 있다. 이 결과로부터 당이 제거된 마가목추출물이 피부 흡수에 훨씬 유리한 구조임을 알 수 있다.

<제형예 1, 제형예 2> 영양크림

배합성분	중량%
	제형예 1	제형예 2
실시예 1	5	-
실시예 2	-	5
스테아릴알콜	8	8
스테아린산	2	2
스테아린산 콜레스테롤	2	2
스쿠알란	4	4
2-옥틸도데실알콜	6	6
폴리옥시에틸렌(25몰부가)알콜에스테르	3	3
글리세릴모노스테아린산아스테르	2	2
프로필렌글리콜	5	5
적량	적량	적량

시간	제형예 1	제형예 2
0	0	0
2	0.45	1.2
4	0.68	2.98
8	1.12	7.82
12	2.89	12.5
24	14.6	35.65

실시예 7: in vitro MMP-1 inhibition assay

기질 금속단백질분해효소(MMP-1) 저해 활성은 생화학적 모델에서 측정하였는데, 이는 정제된 콜라게나제 및 이의 기질인 플루오레세인에 접한된 콜라겐과 젤라틴의 이용을 기초로 한다(EnzChek(상표명) 젤라티나제/콜라게나제 키트, 몰큘라프루브). 클로스트리디움 히스토리티컴으로부터 정제된 콜라게나제를 상기 EnzChek(상표명)젤라티나제/콜라게나제 키트내에 공급하였다. 돼지 피부로부터 정제하고 플로오레세인에 접합된 DQ-콜라겐과 0.05M 트리스-HCl, 0.15M NaCl, 5mM CaCl₂ 및 0.2mM 나트륨 아지드(pH 7.6)로 이루어지는 반응 완충액은 EnzChek(상표명)젤라티나제/콜라게나제 키트(몰큘라 프로브스)를 이용하였다. 실시예 1과 실시예 2의 추출물은 상기 반응 완충액 내에 용해시켰다. 이는 4; 2; 0.4; 0.2; 0.1%(w/v)에서 테스트하였다. 테스트 추출물의 희석액은 25ug/ml의 DQ-콜라겐 및 0.1U/ml의 콜라게나제와 함께 실온에서 15분, 45분, 120분 동안 항온처리하였다.

각각의 실험조건에서 콜라게나제와 DQ-콜라겐 혼합물에 상응하는 대조용 혼합물(control)도 동일하게 항온처리하였다. 또한 각각의 실험 조건에서 Blank, 이하 '효소 비함유 blank'이라 칭하는 샘플은 DQ-콜라겐의 존재 및 콜라게나제의 부재하에서 항온처리하였다. 각각의 실험은 3회 수행하였다.

15분, 45분, 120분 경과 후 DQ-콜라겐의 분해에 상응하는 신호는 형광측정기(여기:485nm, 방출 505nm)로 측정하였다. '효소 비함유 blank' 형광값을 기준으로 하여 각각의 샘플의 형광값을 측정하였다. 결과는 샘플당 형광 단위 및 대조군에 대한 변이율(%)로 나타냈다.

결론적으로 선택된 실험 조건하에서 0.04 내지 4%(v/v)에서 테스트된 실시예 1과 실시예 2의 추출물은 투여랑 의존성으로 항콜라게나제/젤라티나제 활성을 보유하였다.

결과는 표5에 나타내었고, 효소처리된 마가목 추출물은 0.04% 처리시 클로스트리디움 콜라게나제의 콜라겐 분해활성의 95%를 억제하였으며 이는 녹차추출물의 저해 효과보다 우수하게 나타났다.

실험샘플	저해율(%)
	처리농도 0.02(%)	처리농도 0.04(%)
실시예 1	55	80
실시예 2	68	95
레티놀	0	5
녹차추출물	52	56

실시예 8: 자외선 조사 후 마가목 추출물에 의한 MMP-1 발현억제 평가

본 실시예는 실시예 1과 2에서 수득한 마가목 추출물의 UV 조사 및 시료 첨가 후 MMP-1 농도를 측정하기 위해서 ELISA를 실시하였다.

UV 챔버를 이용하여 인간 진피 섬유아세포에 UVA를 5J/㎠의 에너지로 조사한다. 자외선 조사량과 배양시간은 예비 실험을 통하여 섬유아세포에서 MMP 발현량이 최대가 되는 조건을 확립하였다. 음성 대조군은 은박지로 싸서 UVA의 환경에 같은 시간 유지하였다. UVA 방출량은 UV 라디오미터를 이용하여 측정하였다. UVA가 조사되는 동안의 세포는 이전에 분주된 배지 그대로이고 UVA를 조사한 후 샘플이 들어간 배지로 교환하여 24시간 배양 후 배지를 회수하여 96-웰에 코팅한다. 일차항체(MMP-1(Ab-5) 단일클론항체와 MMP-2(Ab-3) 단일클론항체)를 처리하고 37℃에서 60분 반응시킨다. 이차항체인 안티마우스 IgG(whole mouse, alkaline phosphatase conjugated)를 다시 60분정도 반응시킨 후, 알카린 포스파타제 기질 용액(1mg/mlρ-nitrophenyl phosphate in diethanolamine 완충용액)을 상온에서 30분간 반응시키고 마이크로플레이트 리더로 405nm에서 흡광도를 측정한다. 대조군으로는 시료를 첨가하지 않은 것을 사용한다.

자외선 조사시에 발현이 유도되는 MMP-1에 대하여, 시료를 처리하지 않은 대조군에 비해 효소처리된 마가목 추출물은 약 30%의 억제율을 보였으며 이는 대조군으로 사용한 레티놀의 억제율 보다 우수한 결과이다(표 6).

시험군	처리농도(%)	MMP-1 발현억제율(%)
대조군	-	-
실시예 1	0.1	25
실시예 2	0.1	30
레티놀	0.1	18

실시예 9: B16F1 멜라노싸이트를 이용한 멜라닌 생성 억제효과 측정 실험

본 실시예는 실시예 1과 2에서 수득한 마가목 추출물의 미백효과를 확인하기 위해 B16F1 멜라노싸이트에 대한 멜라닌 생성 억제 정도를 보고 미백 효과를 판단한 것이다.

본 실시예에 사용된 B16F1 멜라노싸이트는 마우스에서 유래한 세포균주이며, 멜라닌이라는 흑색색소를 분비하는 세포이다. 이 세포의 인공배양중에 시료를 처리하여 멜라닌 흑색색소가 감소하는 정도를 비교 평가하였다. 본 실시예에 사용된 B16F1 멜라노싸이트는 ATCC (American Type Culture Collection, 기탁번호 : 6323)로부터 분양받아 사용하였다.

B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 생합성 억제효과 측정은 다음과 같이 행하였다. B16F1 멜라노싸이트를 6 웰 플레이트에 각 웰당 2 x 10⁶ 농도로 분주하고 세포를 부착시킨 후 독성을 유발하지 않는 농도로 시료를 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 72시간 배양 후 세포를 trypsin-EDTA로 떼어 낸 후 세포수를 측정한 다음 원심분리하여 세포를 회수하였다. 세포내 멜라닌의 정량은 로탄(Lotan: Cancer Res., 40: 3345-3350, 1980)의 방법을 약간 변형하여 실시하였다. 셀 펠릿을 PBS로 1회 세척한 후 균질화 버퍼액(50 mM 소듐 포스페이트, pH 6.8, 1% Triton X-100, 2 mM PMSF) 1 ml를 첨가하여 5분간 와류하여 세포를 파쇄하였다. 원심분리(3,000 rpm, 10분)하여 얻은 세포 여액에 1 N NaOH (10% DMSO)를 첨가하여 추출된 멜라닌을 용해한 후 마이크로 플레이트 판독기로 405 nm에서 멜라닌의 흡광도를 측정한 다음 멜라닌을 정량하여 시료의 멜라닌 생성 저해율(%)을 측정하였다. B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 생성 저해율(%)은 수학식 3에 의하여 계산하였으며, IC₅₀값은 멜라닌 생성을 50% 저해하는 물질의 농도이다.

저해율(%) = [(A-B)/A] x 100

A : 시료를 첨가하지 않은 웰의 멜라닌 양

B : 시료를 첨가한 웰의 멜라닌 양

B16F1 멜라노싸이트의 멜라닌 생성 억제효과를 시험한 결과 효소처리된 마가목 추출물의 IC₅₀값은 0.08%로 기존의 미백제인 하이드로퀴논, 알부틴, 유용성 감초 추출물, 상백피 추출물 등에 비해 유사하거나 우수한 효과를 나타내었다(표 5).

시료명	처리농도(%)	멜라닌 합성 저해효과(IC50)
실시예 1	0.1	0.08%
실시예 2	0.1	0.05%
하이드로퀴논	0.1	0.03%
알부틴	0.1	0.2%
상백피 추출물	0.1	5%
유용성 감초 추출물	0.1	0.03%

실시예 10: 자외선 조사에 의한 염증성 사이토카인 발현 억제효과

본 실시예는 실시예 1과 2에서 수득한 마가목 추출물의 자외선 조사에 의해 발현되는 염증성 사이토카인 발현 억제효과를 평가하기 위하여 사람의 표피조직에서 분리한 섬유아세포(Fibroblast)를 24-웰 시험 플레이트에 5 X 10⁴개씩 넣고 24시간동안 부착시켰다. 각 웰을 PBS로 1회 세척하고 각 웰에 500㎕의 PBS를 넣었다. 이 섬유아세포에 자외선B(UVB) 램프(Model : F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki사, Japan)를 이용하여 자외선 10mJ/㎠를 조사한 후 PBS를 덜어내고 세포배양 배지(DMEM에 FBS가 첨가되지 않은 배지) 350㎕를 첨가하였다. 여기에 평가하고자 하는 금등화 추출물 및 비자 추출물을 처리한 후 5시간 동안 배양하였다. 배양 상층액을 150㎕ 취하여 IL-1α를 정량함으로서 마가목 추출물의 염증성 사이토카인 발현억제효과를 판단하였다. IL-1α의 양은 효소면역분석법(Enzyme-linked Immunosorbent Assay)를 이용하여 정량화하였으며, IL-1α의 생성율은 수학식 4에 의해 계산하였다.

염증성 사이토카인 발현 억제율(%) =[1-(St-Bo)/(Bt-Bo)] X 100

Bo : 자외선 조사하지 않고 시료 처리하지 않은 웰의 IL-1α생성량

Bt : 자외선 조사하고 시료를 처리하지 않은 웰의 IL-1α생성량

St : 자외선 조사하고 시료를 처리한 웰의 IL-1α생성량

실험결과 효소처리된 마가목 추출물은 자외선에 의한 염증성 사이토카인인 IL-1α의 생성을 0.013% 농도에서 62% 억제하여, 자외선에 의한 염증 발생을 낮은 농도에서 효과적으로 방어함을 알 수 있다(표 8).

시료명	처리농도(%)	염증성 사이토카인 발현 억제율(%)
실시예 1	0.013	58
	0.025	80
실시예 2	0.013	62
	0.025	89

실시예 11 및 비교예 1

본 실시예는 실시예 1과 2에서 수득한 마가목 추출물을 함유한 화장료를 제조하여 사람을 대상으로 피부 탄력 개선 효과를 비교예 1과 비교실험을 행하여 평가하였다.

비교실험에 사용된 화장료는 크림형태이고, 그 조성은 표 10에 나타낸 바와 같다. 우선 표 10에 기록되어 있는 나)상을 가열하여 70℃에 보존한다. 이것에 가)상을 가하여 예비유화 후 호모믹서로 균일하게 유화하고 다음에 서서히 냉각하여 크림(실시예 11, 비교예 1)을 제조한다. 실험자(20세-35세의 여성) 20명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 실시예 11에서 제조된 크림을 얼굴 왼쪽 부위에는 비교예 1에서 제조된 크림을 각각 1일 2회씩 연속 3개월간 도포하였다.

실험완료 후 피부 탄력 개선 효과는 제품 사용 전과 2개월간 사용 후에 피부탄력측정기(cutometer SEM 575, C+K Electronic Co., Germany)를 이용하여 측정하였다. 실험결과는 하기 표 10에 Cutometer SEM 575의 △R8값으로 기재하였는데 R8값은 피부의 점탄성(viscoelasticity)의 성질을 나타낸다. 표 9에서 나타난 바와 같이 효소처리된 마가목 추출물을 함유한 크림을 도포한 실험자의 피부 탄력개선 효과가 우수함을 알 수 있다.

원료		실시예 11	비교예 1
가	스테아릴알콜	8	8
	스테아린산	2	2
	스테아린산 콜레스테롤	2	2
	스쿠알란	4	4
	2-옥틸도데실알콜	6	6
	폴리옥시에틸렌(25몰부가)알콜에스테르	3	3
	글리세릴모노스테아린산아스테르	2	2
나	실시예 2	1	-
	실시예 1	-	1
	프로필렌글리콜	5	5
	적량	적량	적량

주)단위: 중량%

실험제품	피부탄력효과(ΔR8)
실시예 11	0.24
비교예 1	0.12

n=20, p＜0.05

실시예 12 및 비교예 2

본 실시예는 실시예 1과 2에서 수득한 마가목 추출물을 함유한 화장료를 제조하여 사람을 대상으로 피부 미백효과를 비교예 2과 비교실험을 행하여 평가하였다.

비교실험에 사용된 화장료는 크림형태이고, 그 조성은 표 11에 나타낸 바와 같다. 우선 표 11에 기록되어 있는 나)상을 가열하여 70℃에 보존한다. 이것에 가)상을 가하여 예비유화 후 호모믹서로 균일하게 유화하고 다음에 서서히 냉각하여 크림 (실시예 12, 비교예 2)을 제조한다. 실험자 (20세-35세의 여성) 20명을 대상으로 얼굴 오른쪽 부위에는 실시예 12에서 제조된 크림을, 얼굴 왼쪽 부위에는 비교예 2에서 제조된 크림을 각각 1일 2회씩 연속 2개월간 도포하였다. 시험 완료 후 얼굴 좌우 양편의 도포 부위 피부를 화상분석기 및 피부색의 변화를 크로마메타(Minolta CR300)를 이용하여 색의 밝기변화(ΔL)를 측정하고, 복수의 숙련자에 의한 객관적 육안 관찰과 피검자에 의한 주관적 육안관찰을 실시하여 하기 등급 분류에 따라 효과를 측정하였다. 그 결과를 하기 표 12에 나타내었다. 이때 미백효능 정도를 다음의 7등급으로 분류하여 평가하였다.

<미백효능 평가 기준>

-3: 매우 악화, -2: 악화, -1: 약간 악화, 0: 변화 없음.

1: 약간 개선, 2: 개선, 3: 매우 개선.

표 12에서 나타낸 바와 같이 효소처리된 마가목 추출물을 함유한 크림을 도포한 실험자의 안면 피부에서 미백효과가 우수함을 알 수 있다.

원료		실시예 12	비교예 2
가	스테아릴알콜	8	8
	스테아린산	2	2
	스테아린산 콜레스테롤	2	2
	스쿠알란	4	4
	2-옥틸도데실알콜	6	6
	폴리옥시에틸렌(25몰부가)알콜에스테르	3	3
	글리세릴모모스테아린산아스테르	2	2
나	실시예 2	1	-
	실시예 1	-	1
	프로필렌글리콜	5	5
	적량	적량	적량

주)단위: 중량%

	피부색의 밝기변화(ΔL)		숙련자의 객관적 평가		피검자의 주관적 평가
	실시예 12	비교예 2	실시예 12	비교예 2	실시예 12	비교예 2
평균값	5.03	2.03	2.7	1.9	2.5	0.7

이하에 그 외의 실시예를 나타내었다. 즉, 실시예 2에서 수득한 마가목 추출물을 함유한 화장수, 유액 및 미용액을 실시예 13 내지 15에서 제조하였다. 이들 마가목 추출물을 함유한 화장수, 유액 및 미용액은 항산화 효과, 피부 잔주름 개선 효과, 미백효과, 피부자극 완화효과 등 피부개선에 우수한 효과를 나타내었다.

실시예 13: 실시예 2에서 수득한 마가목 추출물을 함유한 화장수의 제조

95% 에탄올 8g에 폴리피로리돈 0.05g, 올레일알콜 0.1g, 폴리옥시에틸렌모노올레이트 0.2g, 향료 0.2g, 파라옥시안식향산메틸에스테르 0.1g, 소량의 산화방지제, 소량의 색소를 혼합용해 한다. 실시예 2에서 수득한 마가목 추출물 0.05g, 글리세린 5g을 정제수 85.33g에 용해한 것에 상기 혼합액을 첨가한 후 교반하여 피부개선효과가 있는 화장수를 얻었다.

실시예 14: 실시예 2에서 수득한 마가목 추출물을 함유한 유액의 제조

세틸알콜 1.2g, 스쿠알란 10g, 바세린 2g, 파라옥시안식향산에틸에스테르 0.2g, 글리세린모노에스테아레이드 1g, 폴리옥시에틸렌(20몰부가)모노올레이트 1g 및 향료 0.1g을 70℃에서 가열혼합용해하고, 실시예 2에서 수득한 마가목 추출물 0.5g, 디프로필렌글리콜 5g, 폴리에틸렌글리콜-1500 2g, 트리에탄올아민 0.2g, 정제수 76.2g을 75℃로 가열해서 용해시킨다. 양자를 혼합하여 유화시킨 후 냉각하여 수중유(O/W)형의 피부개선효과가 있는 유액을 얻었다.

실시예 15: 실시예 2에서 수득한 마가목 추출물을 함유한 미용액의 제조

95% 에틸알콜 5g에 폴리옥시에틸렌솔비탄모노올레이트 1.2g, 키툴로오즈 0.3g, 히야론산나트륨 0.2g, 비타민 E-아세테이트 0.2g, 감초산 나트륨 0.2g, 파라옥시안식향산에틸에스테르 0.1g, 실시예 2에서 수득한 마가목 추출물 1g 및 적량의 색소를 혼합하여 피부개선효과가 있는 미용액을 얻었다.

이상에서 설명된 바와 같이, 본 발명에 따르면 마가목추출물을 당-가수분해효소 처리함으로써 기존의 마가목추출물의 플라보노이드 배당체로부터 당이 제거된 마가목 플라보노이드를 제공할 수 있고, 당이 제거된 마가목 플라보노이드 성분이 피부 흡수력이 뛰어나고, 기존의 마가목추출물, 특히 플라보노이드 배당체를 함유하는 화장료보다 우수한 항산화력과 미백활성 효과를 제공할 수 있다.

또한 당-가수분해효소 처리된 마가목추출물을 화장료에 함유함으로써, 종래의 단순 마가목추출물에 비해 피부흡수가 용이하고, 항산화 효과, MMP 저해 효과, 자외선 조사에 의한 MMP 발현 조절효과 그리고 잔주름 개선 효과 등 우수한 항노화 효과와 자외선 조사후 야기되는 피부 자극을 완화시켜 주는 효과가 있다.

또한, 당-가수분해효소 처리된 마가목추출물은 기미, 주근깨 및 피부 색소 침착의 원인이 되는 물질인 멜라닌 생성억제 효과 등의 미백작용을 나타낸다.

따라서, 이러한 당-가수분해효소 처리된 마가목추출물을 함유하는 화장수, 크림, 유액, 팩, 파우더 등의 화장료 조성물은 항산화 효과와 피부 잔주름 개선 효과, 피부자극 완화효과 등 우수한 피부 외용제 효과를 가진다.

Claims (10)

1. 마가목추출물을 초산완충용액(pH 5.5)에 용해시키고 당-가수분해 효소를 첨가하는 효소첨가단계;

   상기 효소가 첨가된 추출물을 37℃ 수욕상에서 48시간 동안 교반시키면서 기질을 완전히 소실시키는 당-가수분해 반응단계;

   상기 추출물을 열수중에서 10분간 가열하여 당-가수분해 반응을 종료하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 플라보노이드 함량이 증가된 마가목추출물을 함유하는 화장료조성물의 제조방법.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서,

   상기 당-가수분해효소 반응에서 사용되는 효소는 당결합 분해 효소 및 이들을 함유하고 있는 복합효소제로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 플라보노이드 함량이 증가된 마가목추출물을 함유하는 화장료조성물의 제조방법.
4. 제3항에 있어서,

   상기 당결합 분해 효소는 α-아밀레제(α-amylase), α,β-글루코시다제(α,β-glucosidase), β-글루카네이제(β-glucanase) 및 아밀로글루코시다제(amyloglucosidase)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 플라보노이드 함량이 증가된 마가목추출물을 함유하는 화장료조성물의 제조방법.
5. 제3항에 있어서,

   상기 복합효소제는 나린지나제(naringinase), 셀루라제(cellulase) 및 펙티나제(pectinase)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 플라보노이드 함량이 증가된 마가목추출물을 함유하는 화장료조성물의 제조방법.
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제